IDENTIFIKASI DAN UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI FRAKSI TERAKTIF DAUN SIRIH MERAH (Piper crocatum Ruiz & Pav)

commit to user

i

IDENTIFIKASI DAN UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI FRAKSI TERAKTIF DAUN SIRIH MERAH

(Piper crocatum Ruiz & Pav.)

Disusun oleh : RINA SEPTIANA S

M0305052

SKRIPSI

Ditulis dan diajukan untuk memenuhi sebagian persyaratan mendapatkan gelar Sarjana Sains Kimia

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS SEBELAS MARET

SURAKARTA April, 2011

commit to user

ii

HALAMAN PENGESAHAN

Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sebelas Maret telah mengesahkan skripsi mahasiswa:

Rina Septiana Sumadi NIM M0305052, dengan judul ” Identifikasi dan Uji Aktivitas Antibakteri Fraksi Teraktif Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.)”

Skripsi ini dibimbing oleh:

Pembimbing I Pembimbing II

Ahmad Ainurofiq, M.Si. Apt. Soerya Dewi Marliyana, M.Si. NIP. 19780319 200501 1003 NIP. 19690313 199702 2001

Dipertahankan di depan Tim Penguji Skripsi pada: Hari :

Tanggal : Anggota tim Penguji :

1. Nestri Handayani, M.Si, Apt. 1. ... NIP. 19701211 200501 2001

2. Dr. Sayekti Wahyuningsih, M.Si. 2. ... NIP. 19711211 199702 2001

Ketua Jurusan Kimia

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sebelas Maret Surakarta

Prof. Drs. Sentot Budi Rahardjo, Ph.D. NIP. 19560507 198601 1001

commit to user

iii

PERNYATAAN

Dengan ini saya menyatakan bahwa dalam skripsi saya yang berjudul “Identifikasi dan Uji Aktivitas Antibakteri Fraksi Teraktif Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.)” adalah benar – benar hasil penelitian sendiri dan tidak terdapat karya yang pernah diajukan untuk memperoleh gelar kesarjanaan di suatu perguruan tinggi dan sepanjang pengetahuan saya juga tidak terdapat kerja atau pendapat yang pernah ditulis atau diterbitkan oleh orang lain, kecuali yang secara tertulis diacu dalam naskah ini dan disebutkan dalam daftar pustaka.

Surakarta, Maret 2011

commit to user

iv

IDENTIFIKASI DAN UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI FRAKSI TERAKTIF DAUN SIRIH MERAH (Piper crocatum Ruiz & Pav.)

Rina Septiana S

Jurusan Kimia. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Universitas Sebelas Maret.

ABSTRAK

Identifikasi dan uji aktivitas antibakteri fraksi teraktif daun sirih merah telah dilakukan. Pembuatan ekstrak menggunakan metode maserasi menggunakan pelarut etanol, kemudian dilanjutkan dengan heksana. Pemisahan ekstrak etanol menggunakan Kromatografi Vakum Cair (KVC) dengan pelarut organik, yaitu heksana, etil asetat, dan etanol. Uji antibakteri fraksi-fraksi dilakukan dengan metode difusi. Fraksi yang mempunyai aktivitas antibakteri tertinggi ditentukan komponen kimianya dengan skrinning fitokimia menggunakan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dan analisis Kromatografi Gas-Spektroskopi Massa (GC-MS). Selanjutnya, ditentukan Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) dan uji banding terhadap standar amoksisilin.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa fraksi heksana, etil asetat dan etanol daun sirih merah mempunyai aktivitas antibakteri terhadap Escherichia coli, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus dan Pseudomonas aeruginosa. Fraksi heksana memiliki aktivitas antibakteri tertinggi terhadap E. coli, B. cereus, S. aureus dan P. aeruginosa. Fraksi heksana diidentifikasi dengan analisis skrinning fitokimia dan analisis GC-MS. Hasil skrinning fitokimia menunjukkan golongan senyawa terpenoid, steroid, asam lemak dan analisis GC-MS menunjukkan 14 senyawa golongan terpenoid teridentifikasi dengan komponen utamanya antara lain trans-kariofilen (19,21%), beta-farnesen (15,18%), germakren-D (13,86%) dan ar-kurkumen (9,93%). KHM fraksi heksana terhadap E. coli adalah 10% dan terhadap B. cereus, S. aureus, dan P. aeruginosa adalah 5%. Nilai uji banding fraksi heksana terhadap B. cereus 4,7.10-3%, terhadap P. aeruginosa 6,61.10-3%, terhadap S. aureus 4,19.10-3% dan terhadap E. coli 3,51.10-3% dibandingkan dengan amoksisilin.

commit to user

v

IDENTIFICATION AND ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF SELECTED FRACTION FROM Piper crocatum Ruiz & Pav. LEAVE

Rina Septiana S

Department of Chemistry. Mathematics and Natural Sciences Faculty. Sebelas Maret University.

ABSTRACT

Identification and antibacterial activity of selected fraction from Piper crocatum Ruiz & Pav. leave have been done. The extracts of Piper crocatum Ruiz & Pav. were prepared by maceration using ethanol and then continued by hexane. Liquid vacuum chromatography with organic solvent; hexane, ethyl acetate, and ethanol was used to separate ethanol extract. The antibacterial activity of fractions were determined by using diffusion method. The composition of the highest active fraction was investigated by phytochemical screening method and Gass Chromatography-Mass Spectroscopy (GC-MS) analysis. Then, the minimum inhibitory concentration (MIC) and equivalent value were evaluated. The equivalent value was compared to amoxicilin.

The result of this research showed that hexane, ethyl acetate and ethanol fractions had antibacterial activity against Escherichia coli, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa. The hexane fraction was the highest antibacterial activity. This fraction was identified by phytochemical screening and GC-MS analysis. The phytochemical screenings analysis showed terpenoids, steroids, and fatty acids compounds and the GC-MS analysis contained 14 terpenoid compounds with the major compounds were trans caryophyllene (19,21%), beta-farnesene (15,18%), germacrene-D (13,86%), and ar-curcumene (9,93%). The MIC of hexane fraction against E.coli was 10%, while B.cereus, S. aureus and P. aeruginosa were 5%. The equivalent value of hexane fraction compared to amoxicilin standards was 4,7.10-3%; 6,61.10-3%; 4,19.10-3%; 3,51.10-3% for B.cereus, P. aeruginosa, S. aureus, and E.coli, respectively.

commit to user

vi MOTTO

“Sesungguhnya sesudah kesulitan itu ada kemudahan” (Q.S. Al-Insyirah : 6)

“Orang yang berhenti untuk menjadi lebih baik berarti dia berhenti untuk menjadi orang yang baik”

( W. Churcil)

“maka apabila kamu telah selesai (mengerjakan urusan), kerjkanlah dengan sungguh-sungguh (urusan) yang lain, dan hanya kepada

Tuhanmu-lah hendaknya kamu brharap” (Q.S. Alam Nasyrah : 7-8)

“rasa ingin tahu akan mengalahkan rasa takut, bahkan melebihi keberanian yang kita kehendaki”

(H. Bergson)

“you don’t choose your family, they are God’s gift to you, as you are to them” (Desmont Tutu)

commit to user

vii

PERSEMBAHAN

Puji syukur kehadirat Allah SWT sehingga aku dapat menyelesaikan karya kecil ini.

Aku persembahkan karya sederhanaku ini untuk:

v Bapak (alm) yang tempatnya takkan tergantikan

dihatiku

v Ibu yang selalu menyayangiku sepanjang waktu

v Mba yuli sekeluarga (Mas Gufron & Opang) terima

kasih untuk doa, pengertian dan kesabarannya

v Mas dodo,terima kasih untuk segalanya. Darimu aku

belajar banyak hal..

commit to user

viii

KATA PENGANTAR

Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT yang telah memberikan segala nikmat dan karunia-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “ Isolasi dan Identifikasi Fraksi Teraktif Uji Antibakteri Ekstrak Etanol Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.)”

Penulis menyadari bahwa penulisan skripsi ini tidak akan selesai tanpa adanya bantuan dari berbagai pihak. Untuk itu, penulis menyampaikan rasa terima kasih kepada:

1. Bapak Prof. Drs. Sentot Budi Rahardjo, Ph.D. selaku Ketua Jurusan Kimia. 2. Bapak Achmad Ainurofiq, M.Si., Apt. selaku Dosen Pembimbing I dan Ibu

Soerya Dewi Marliyana, M.Si. selaku Dosen Pembimbing II, yang telah meluangkan waktunya dan selalu sabar memberikan arahan dalam membimbing penulis selama menyelesaikan skripsi.

3. Bapak Patiha, MS selaku Pembimbing Akademik yang telah memberikan saran dan motivasi kepada penulis selama masa studi.

4. Para laboran di Laboratorium Kimia dan Laboran di Sub Laboratorium Biologi terimakasih atas bantuan dan kerjasamanya dengan baik.

5. Keluarga Pondok 18 : mbak2q (tanti, nurul, ema, maxi). Terimakasih atas hari-hari bersama yang selalu menyenangkan. “I love you all”. Pondok 18 (new) : ornella, nita, wulan, farida, tia, uun, ayu, grecia..terimakasih atas doa dan dukungannya.

6. Teman-teman kimia’05. Terimakasih atas bantuan, doa dan dorongannya. Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih jauh dari kesempurnaan. Oleh sebab itu, saran dan kritik yang membangun sangat diharapkan untuk perbaikan di masa mendatang. Semoga skripsi ini dapat bermanfaat dan berguna bagi yang membacanya.

Surakarta, Maret 2011

commit to user

ix DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ... i

HALAMAN PENGESAHAN ... ii

HALAMAN PERNYATAAN KEASLIAN ... iii

ABSTRAK ... iv

ABSTRACT ... v

MOTTO ... vi

HALAMAN PERSEMBAHAN... vii

KATA PENGANTAR ... viii

DAFTAR ISI ... x

DAFTAR TABEL ... xii

DAFTAR GAMBAR ... xiii

DAFTAR LAMPIRAN ... xiv

BAB I. PENDAHULUAN ... 1

A. Latar belakang masalah ... 1

B. Perumusan masalah ... 2

1. Identifikasi masalah ... 2

2. Batasan masalah ... 3

3. Rumusan masalah ... 4

C. Tujuan Penelitian ... 4

D. Manfaat penelitian ... 5

BAB II. LANDASAN TEORI ... 6

A. Tinjauan pustaka ... 6

1. Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.)... 6

a. Klasifikasi tanaman... 6

b. Deskripsi tanaman... 7

c. Kandungan dan manfaat tanaman……… 7

2. Bakteri... 8

a. Definisi………... 8

commit to user

x

c. Bakteri uji………. 9

3. Media Pertumbuhan Bakteri... 11

4. Antibakteri... 12

5. Senyawa-senyawa metabolisme sekunder yang mempengaruhi aktivitas antibakteri……… 13

6. Ekstraksi……….. 22

7. Kromatografi lapis tipis………... 23

8. Kromatografi vakum cair (KVC)……….. 24

9. GC-MS.……….... 25

10. Metode pengujian aktivitas antibakteri……… 28

11. Konsentrasi Hambat Minimum dan Uji banding…………. 30

B. Kerangka Pemikiran... 31

C. Hipotesis... 32

BAB III. METODOLOGI PENELITIAN... 33

A. Metode Penelitian... 33

B. Waktu dan tempat penelitian... 33

C. Alat dan bahan... 33

1. Alat... 33

2. Bahan... 34

D. Prosedur penelitian ... 35

1. Persiapan sampel sirih merah………... 35

2. Ekstraksi maserasi sampel daun sirih merah ... 35

3. Pengujian golongan senyawa ekstrak etanol... 35

4. Pengujian aktivitas antibakteri ekstrak etanol………. 37

5. Pemisahan ekstrak etanol………. 38

6. Pengujian aktivitas antibakteri terhadap fraksi-fraksi…… 39

7. Pengujian golongan fraksi teraktif antibakteri………. 39

8. GC-MS………. 39

E. Teknik Pengumpulan dan Analisis Data ... 39

BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ... 41

A. Identifikasi sampel ... 41

commit to user

xi

C. Pengujian golongan senyawa ekstrak etanol……… 42

D. Pengujian aktivitas antibakteri ekstrak etanol……….. 43

E. Pemisahan ekstrak etanol………..… 45

F. Pengujian aktivitas antibakteri fraksi-fraksi hasil pemisahan….. 46

G. Penetapan KHM dan Nilai Banding……….…. 48

a. Penetapan KHM fraksi heksana……… 48

b. Penetapan KHM amoksisilin………. 49

c. Penetapan nilai banding fraksi heksana……….…………... 51

H. Identifikasi Fraksi Teraktif Antibakteri……… 52

a. Skrining fitokimia fraksi heksana……….…………..…….. 53

b. Hasil analisis GC-MS……… 54

BAB V. PENUTUP ... 62

A. Kesimpulan ... 62

B. Saran ... 63

DAFTAR PUSTAKA ... 64

commit to user xii DAFTAR TABEL Tabel 1. Tabel 2. Tabel 3. Tabel 4. Tabel 5. Tabel 6. Tabel 7. Tabel 8.

Klasifikasi terpenoid... Hasil skrinning fitokimia senyawa kimia ekstrak etanol daun sirih merah... Hasil pengujian aktivitas antibakteri ekstrak etanol sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) ... Hasil kromatografi vakum cair ekstrak etanol sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.)... Hasil uji aktivitas antibakteri ekstrak etanol dan fraksi-fraksi hasil KVC terhadap 4 bakteri... Hasil pengujian penentapan KHM fraksi heksana terhadap 4 bakteri uji... Hasil pengujian penetapan KHM amoksisilin terhadap 4 bakteri uji ... Hasil penetapan nilai banding fraksi heksana untuk keempat bakteri uji terhadap amoksisilin...

Halaman 16 42 43 46 47 48 51 52 53 55 Tabel 9.

Tabel 10.

Tabel 11.

Tabel 12.

Tabel 13.

Tabel 14.

Hasil skrining fitokimia senyawa kimia fraksi heksana daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.)…...….………… Fragmentasi senyawa puncak 5 dibandingkan standar trans kariofilen... Fragmentasi senyawa puncak 6 dibandingkan standar β -farnesen... Fragmentasi senyawa puncak 10 dibandingkan standar ar-kurkumen... Fragmentasi senyawa puncak 11 dibandingkan standar germakren D... Komponen fraksi heksana daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) ...

56

57

58

commit to user xiii DAFTAR GAMBAR Gambar 1. Gambar 2. Gambar 3. Gambar 4. Gambar 5. Gambar 6. Gambar 7. Gambar 8. Gambar 9. Gambar 10. Gambar 11. Gambar 12. Gambar 13. Gambar 14. Gambar 15. Gambar 16. Gambar 17. Gambar 18. Gambar 19.

Tanaman sirih merah... Senyawa-senyawa golongan flavonoid... Struktur senyawa patuloside A... Struktur senyawa phytadiene dan 1,2 secocladiellan...

Struktur smilagenin... Struktur asam glisiretat...

Struktur beberapa alkaloid... Struktur ramiflorin A dan B... Struktur golongan fenolik... Struktur beberapa tanin... Struktur epilogatekin galat... Skema alat GC-MS... Kromatogram fraksi heksana daun sirih merah... a. Spektra massa senyawa puncak 5... b. Spektra massa senyawa trans kariofilen... a. Spektra massa senyawa puncak 6... b. Spektra massa senyawa β-farnesen... a. Spektra massa senyawa puncak 10... b. Spektra massa senyawa ar kurkumen... a. Spektra massa senyawa puncak 11... b. Spektra massa senyawa germakren D... Struktur seskuiterpenoid daun Piper crocatum Ruiz & Pav………. Struktur diterpenoid daun Piper crocatum Ruiz & Pav..…..

Halaman 7 14 15 17 17 18 19 19 20 21 22 28 54 55 55 56 56 57 57 58 58 61 61

commit to user DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1. Lampiran 2. Lampiran 3. Lampiran 4. Lampiran 5. Lampiran 6. Lampiran 7. Lampiran 8. Lampiran 9. . Lampiran 10. Lampiran 11. Lampiran 12. Lampiran 13. Lampiran 14.

Diagram alir prosedur penelitian………..……. Hasil determinasi sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.)………....

Perhitungan rendemen ekstrak etanol ………...

Hasil pengujian aktivitas antibakteri ekstrak etanol terhadap 4 bakteri uji………..……… Analis one-way anova pengaruh variasi bakteri pada masing-masing konsentrasi ekstrak etanol………... Hasil pengujian aktivitas antibakteri fraksi-fraksi hasil

kromatografi vakum cair………...………….. Analisa one way-anova pengaruh variasi fraksi pada masing-masing bakteri pada uji aktivitas antibakteri fraksi-fraksi hasil kromatografi vakum cair……….……… Hasil pengujian penetapan KHM fraksi heksana…... Analisa one way anova pengaruh variasi bakteri pada masing-masing konsentrasi fraksi pada penentuan KHM fraksi heksana………...… Penentuan KHM amoksisilin…….………. Analisa pengaruh one way anova pengaruh variasi bakteri amoksisilin pada masing-masing konsentrasi pada uji aktivitas antibakteri amoksisilin…….…….. Hasil pengujian penentuan nilai banding fraksi heksana terhadap amoksisilin………... Hasil skrining fitokimia dengan KLT... Analisis GC-MS fraksi heksana daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav...

Halaman 68 69 70 71 73 79 81 83 84 86 87 90 97 98 xiv

commit to user

1 BAB I PENDAHULUAN

A.Latar Belakang Masalah

Penggunaan tanaman untuk pengobatan telah lama dikenal oleh masyarakat. Usaha pengembangan tanaman untuk pengobatan perlu dilakukan mengingat bahwa tanaman mudah diperoleh dan murah. Tetapi penggunaan tanaman untuk pengobatan perlu ditunjang oleh data-data penelitian dari tanaman tersebut sehingga khasiatnya secara ilmiah tidak diragukan lagi dan dapat dipertanggungjawabkan. Hal ini tentu akan mendorong penggunaan tanaman sebagai obat secara meluas oleh masyarakat (Soemiati, 2002).

Sebagian besar simplisia yang digunakan untuk obat tradisional adalah suku Piperaceae. Pada umumnya tanaman yang termasuk suku Piperaceae mengandung senyawa golongan alkaloid, terpenoid, flavonoid, lignin dan minyak atsiri (Sumarni, 1999). Banyak spesies dari suku Piperaceae digunakan sebagai obat tradisional dan menunjukkan fungsi aktivitas antibakteri, antijamur, insektisidal dan antitumor. Tanaman dari suku Piperaceae juga digunakan untuk pengobatan batuk, bronchitis, penyakit pernapasan dan reumatik. Sejumlah senyawa seskuiterpen telah diisolasi dari Piper cubeba (kemukus). Dari penelitian tersebut menunjukkan bahwa kemukus dapat menghambat penyakit tumor, antileukimia dan aktivitas antibiotik (Bos, 2007). Secara tradisional daun sirih merah dapat digunakan untuk pengobatan berbagai macam penyakit diantaranya obat sakit gigi dan mulut, sariawan, abses rongga mulut, luka bekas cabut gigi, penghilang bau mulut, batuk dan serak, hidung berdarah, keputihan, wasir, tetes mata, gangguan lambung, gatal-gatal, kepala pusing dan jantung berdebar (Sudewo, 2005).

Sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) mengandung beberapa senyawa aktif, antara lain flavonoid, alkaloid, saponin, polifenolat, tanin, terpenoid dan minyak atsiri. Senyawa-senyawa tersebut memiliki aktivitas antibakteri (Juliantina, 2008). Kandungan kimia lainnya yang terdapat di daun sirih merah adalah minyak atsiri, hidroksikavikol, kavikol, kavibetol, allilprokatekol,

commit to user

karvakrol, eugenol, p-cimene, sineol, kariofelen, kadimen estragol, terpenena dan fenil propana (Manoi, 2007).

Banyak obat telah digunakan untuk melawan infeksi bakteri dan penelitian masih berlangsung sampai sekarang. Beberapa penelitian uji aktivitas antibakteri ekstrak tanaman pada tumbuhan telah banyak dilakukan. Ekstrak etanol sirih merah mempunyai kemampuan antibakteri bakteri gram positif dan bakteri gram negatif khususnya terhadap Staphylococcus aureus dengan KHM 25 % dan Eschericia coli dengan KHM 6,25 % (Juliantina, 2008). Ekstrak heksana dan petroleum eter buah tanaman Piper sp mempunyai aktivitas antibakteri terhadap Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Eschericia coli dan Pseudomonas pseudomallei pada konsentrasi 25% (Sumarni, 1999). Minyak atsiri daun sirih merah mempunyai aktivitas antibakteri terhadap Bacillus cereus dengan KHM 1% serta terhadap Eschericia coli dan Pseudomonas aeruginosa dengan KHM sebesar 0,75% (Ngaisah, 2010).

Berdasarkan informasi kandungan kimia sirih merah di atas, sirih merah mengandung golongan senyawa yang mempunyai aktivitas antibakteri. Adapun penelitian yang dilakukan ini untuk mengisolasi dan mengidentifikasi komponen kimia yang terdapat dalam ekstrak daun sirih merah, kemudian menguji aktivitasnya sebagai antibakteri terhadap bakteri yaitu Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Eschericia coli dan Pseudomonas aeruginosa sehingga nantinya diketahui senyawa aktif antibakteri apa saja yang ada di dalam ekstrak daun sirih merah. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi kepada masyarakat tentang pemanfaatan tanaman berkhasiat obat yaitu tanaman sirih merah.

B. Perumusan Masalah 1. Identifikasi Masalah

Sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) mempunyai kandungan kimia yang berbeda pada tiap bagiannya. Bagian yang biasa digunakan sebagai bahan obat adalah daunnya. Selain itu tempat pengambilan tanaman daun sirih merah juga sangat mempengaruhi kandungan kimia di dalamnya.

commit to user

Isolasi komponen kimia dari suatu bahan alam dapat dilakukan dengan metode ekstraksi, destilasi dan kromatografi. Pada tiap metode menggunakan berbagai macam pelarut menurut kebutuhan. Pelarut yang digunakan untuk isolasi perlu diperhatikan sebagai contoh senyawa yang kurang polar dapat diisolasi dengan menggunakan pelarut heksana, petroleum eter, benzene dan toluen dan senyawa yang lebih polar dapat diperoleh dengan pelarut etil asetat, butanol, metanol, dan air. Hasil isolasi dengan pelarut yang berbeda akan menghasilkan ekstrak dengan senyawa yang berbeda sehingga akan mempengaruhi aktivitas antibakteri dari ekstrak. Dari hal diatas perlu diperhatikan cara isolasi senyawa daun sirih merah dengan pelarut yang tepat. Senyawa-senyawa antibakteri biasanya dapat diisolasi dengan pelarut organik polar yaitu metanol atau etanol.

Sirih merah mengandung berbagai macam komponen senyawa kimia sehingga diperlukan suatu metode yang tepat untuk mengidentifikasi senyawa kimia tersebut. Identifikasi komponen kimia dalam bahan alam dapat dilakukan dengan berbagai metode seperti Kromatografi Lapis Tipis (Thin Layer Chromatography), Kromatografi Gas (Gas Chromatography), Kromatografi Gas-Spektrofotometer Massa (Gas Chromatography-Mass Spectrometry).

Pengujian aktivitas antibakteri dapat dilakukan dengan menggunakan metode difusi dan dilusi. Pada metode difusi dapat dilakukan dengan difusi agar yaitu dengan menggunakan lubang (perforasi) dan gores silang. Pemilihan metode pengujian aktivitas antibakteri harus tepat dan disesuaikan dengan jenis bakteri yang diuji. Jenis bakteri yang digunakan untuk pengujian aktivitas antibakteri adalah bakteri patogen. Beberapa bakteri patogen yang dapat digunakan adalah Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Eschericia coli dan Pseudomonas aeruginosa.

2. Batasan Masalah

Berdasarkan identifikasi masalah tersebut maka dibuat batasan masalah sebagi berikut:

a. Daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) didapat dari daerah Magelang dengan ketinggian 500 m di atas permukaan air laut.

commit to user

b. Isolasi ekstrak polar daun sirih merah dari daerah Magelang dilakukan dengan cara maserasi menggunakan pelarut etanol dilanjutkan dengan ekstraksi partisi menggunakan pelarut heksana kemudian dilanjutkan dengan pemisahan dengan Kromatografi Vakum Cair (KVC) menggunakan pelarut secara berurutan yaitu heksana, etil asetat, dan etanol.

c. Identifikasi komponen senyawa kimia daun sirih merah dari fraksi hasil pemisahan yang aktif antibakteri dilakukan dengan menggunakan analisis skrining fitokimia dan analisis data GC-MS.

d. Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan terhadap empat bakteri patogen, yaitu bakteri gram positif: Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, dan bakteri gram negatif: Eschericia coli dan Pseudomonas aeruginosa.

3. Rumusan Masalah

Rumusan masalah penelitian ini adalah sebagai berikut:

a. Apakah ekstrak etanol dan fraksi hasil pemisahan mempunyai aktivitas antibakteri?

b. Komponen senyawa kimia apa sajakah yang terkandung dalam ekstrak etanol dan fraksi hasil pemisahan yang mempunyai aktivitas antibakteri tertinggi pada empat bakteri uji?

c. Bagaimanakah potensi fraksi yang mempunyai aktivitas antibakteri tertinggi dilihat dari nilai uji bandingnya terhadap pembanding amoksisilin?

C. Tujuan Penelitian Tujuan penelitian ini adalah:

a. Mengetahui aktivitas antibakteri ekstrak etanol dan fraksi hasil pemisahan daun sirih merah.

b. Mengetahui komponen senyawa kimia yang terkandung dalam ekstrak etanol dan fraksi hasil pemisahan yang mempunyai aktivitas antibakteri tertinggi. c. Mengetahui potensi fraksi yang mempunyai aktivitas antibakteri tertinggi

commit to user

D. Manfaat Penelitian

Manfaat yang dapat diambil dari penelitian ini adalah:

a. Dapat memberikan informasi mengenai komposisi kimia daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) yang aktif antibakteri sebagai salah satu tanaman obat.

b. Dapat memberikan sumbangan tentang manfaat daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) dan membuka kemungkinan pembudidayaan daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) sebagai sumber obat yang dapat digunakan sebagai obat alternatif dalam pengobatan moderen.

commit to user BAB II

LANDASAN TEORI

A. Tinjauan Pustaka

1. Sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav)

Sirih merah adalah salah satu tanaman obat potensial yang diketahui secara empiris memiliki khasiat untuk menyembuhkan berbagai jenis penyakit dan memiliki nilai spiritual tinggi. Sirih merah termasuk dalam satu elemen penting yang harus disediakan dalam setiap upacara adat, khususnya Yogyakarta (Juliantina, 2008).

a. Klasifikasi Tanaman

Tanaman sirih merah merupakan famili Piperaceae. Kedudukan tanaman sirih merah dalam taksonomi tumbuhan adalah sebagai berikut:

Kingdom : Plantae

Sub Kingdom : Tracheobionta Super Divisio : Spermatophyta

Divisio : Magnoliophyta

Kelas : Magnoliopsida

Sub Kelas : Magnolidae

Ordo : Piperales

Familia : Piperaceae

Genus : Piper

Species : Piper crocatum Ruiz & Pav. (www.plantamor.com)

b. Deskripsi Tanaman

Tanaman sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) termasuk dalam famili Piperaceae. Sirih merah merupakan tanaman merambat yang berbatang bulat berwarna hijau keunguan dan tidak berbunga. Daunnya bertangkai membentuk jantung hati dan bagian ujung daun meruncing. Daun tumbuh berselang-seling dari batangnya, dan daun berwarna merah keperakan dengan permukaan daun mengkilap dan tidak merata. Yang membedakan dengan sirih hijau adalah selain

commit to user

daunnya berwarna merah keperakan, bila daunnya disobek maka akan berlendir serta aromanya lebih wangi (Manoi, 2007).

Tanaman sirih merah menyukai tempat teduh, berhawa sejuk dengan sinar matahari 60-75%, sehingga dapat tumbuh subur dan bagus di daerah pegunungan. Bila tumbuh pada daerah panas, sinar matahari langsung, batangnya cepat mengering. Selain itu, warna merah daunnya akan pudar (Juliantina, 2008). Tanaman sirih merah dapat dilihat pada Gambar 1.

Gambar 1. Tanaman Sirih Merah

c. Kandungan dan Manfaat Tanaman

Dalam daun sirih merah terkandung senyawa fitokimia yakni alkaloid, saponin, polifenolat, tanin dan flavonoid. Kandungan kimia lainnya yang terdapat di daun sirih merah adalah minyak atsiri, hidroksikavikol, kavikol, kavibetol, allilprokatekol, karvakrol, eugenol, p-cimene, sineol, kariofelen, kadimen estragol, terpenena dan fenil propada.

Karena banyaknya kandungan zat atau senyawa kimia bermanfaat inilah, daun sirih merah memiliki manfaat yang sangat luas sebagai bahan obat. Karvakrol bersifat desinfektan, anti jamur, sehingga bisa digunakan untuk obat antiseptik pada bau mulut dan keputihan. Eugenol dapat digunakan untuk mengurangi rasa sakit, sedangkan tanin dapat digunakan untuk mengobati sakit

commit to user

perut. Banyak pengalaman bahwa menggunakan sirih merah dalam bentuk segar, simplisia maupun ekstrak kapsul dapat menyembuhkan penyakit diabetes melitus, hepatitis, batu ginjal, menurunkan kolesterol, mencegah stroke, asam urat, hipertensi, radang liver, radang prostat, radang mata, keputihan, maag, kelelahan, nyeri sendi dan memperhalus kulit (Sudewo, 2005).

2. Bakteri a. Definisi

Bakteri merupakan mikroba prokariotik uniseluler, berkembang biak secara aseksual dengan pembelahan sel. Semua bakteri memiliki struktur sel yang relatif sederhana. Berdasarkan komposisi dan struktur dinding sel, maka bakteri dibagi ke dalam dua golongan yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang terdiri atas lapisan peptidoglikan yang tebal dan asam teikoat yang mengandung alkohol. Ada dua asam teikoat, yaitu asam lipoteikoat yang merentang di lapisan peptidiglikon dan terikat pada membran plasma dan asam teikoat dinding yang terikat pada lapisan peptidiglikon. Sedangkan dinding sel bakteri gram negatif mengandung satu atau beberapa lapis peptidoglikan dan membaran luar (outer membrane). Peptidoglikan terikat pada membran luar dan periplasma terdapat diantara membran plasma dan membran luar (Pratiwi, 2008).

Beberapa bakteri gram negatif adalah Enterobacter cloacae, Legionella pneumophila, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Moraxella catarrhalis, Haemophilus parainfluenzae, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, sedangkan bakteri gram positif adalah Enterococcus faecalis, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes.

b. Klasifikasi bakteri

Berdasarkan bentuknya bakteri dibagi menjadi tiga golongan besar, yaitu: 1) Kokus (Coccus) adalah bakteri yang berbentuk bulat seperti bola dan

mempunyai beberapa variasi antara lain Mikrococcus, Diplococcus dan Tetracoccus.

commit to user

2) Basil (Bacillus) adalah kelompok bakteri yang berbentuk batang atau silinder dan mempunyai variasi antara lain Diplobacillus dan Streptobacillus.

3) Spiril (Spirilum) adalah bakteri yang berbentuk lengkung dan mempunyai variasi yaitu Vibrio dan Spiral.

(Pratiwi, 2008) c. Bakteri uji

1) Staphylococcus auerus

Klasifikasi Staphylococcus auerus adalah sebagai berikut: Divisi : Protophyta

Kelas : Schizomycetes Bangsa : Eubacteryales Suku : Mycrococcaceae Marga : Staphylococcus Jenis : Staphylococcus aureus

(Salle, 1961) Staphylococus aureus merupakan bakteri gram positif yang berasal dari genus Staphylococcus. Staphylococcus aureus merupakan agen infeksi yang dapat menyerang setiap jaringan dan organ tubuh. Timbulnya penyakit dengan tanda-tanda yang khas yaitu peradangan, nekrosis dan pembentukan abses.

2) Bacillus cereus

Klasifikasi Bacillus cereus adalah sebagai berikut: Kingdom : Bacteria

Fillum : Firmicutes Kelas : Bacilli Order : Bacillales Famili : Bacillaceae Genus : Bacillus Spesies : Bacillus cereus

commit to user

Bacillus cereus merupakan bakteri gram-positif, aerob fakultatif, dan dapat membentuk spora. Selnya berbentuk batang besar dan sporanya tidak membengkakkan sporangiumnya. Bacillus cereus dapat tumbuh dalam makanan dan menghasilkan enterotoksin yang menyebabkan keracunan makanan. Bakteri ini juga merupakan penyebab infeksi mata, keratis berat, endoftalmitis dan panoftalmitis (Jawetz, et al, 2005).

3) Escherichia coli

Klasifikasi Escherichia coli adalah sebagai berikut:

Divisi : Protophyta

Subdivisi : Schizomycetea Kelas : Schizomycetes Bangsa : Eubacteriales Suku : Enterobacteriaceae Marga : Escherichia

Jenis : Escherichia coli

Escherichia coli adalah bakteri gram negatif, berbentuk batang pendek, berderet seperti rantai, dapat memfermentasi glukosa dan laktosa membentuk asam dan gas (Pelczar dan Chan, 1998). Bakteri ini dapat menyebabkan penyakit seperti diare, infeksi saluran kemih, pneumonia, meningitis pada bayi yang baru lahir dan infeksi luka (Jawetz, et al, 2005). 4) Pseudomonas aeroginosa

Klasifikasi pseudomonas aeruginosa adalah sebagai berikut: Kingdom : Bacteria

Fillum : Proteobacteria

Kelas : Gamma Proteobacteria Order : Pseudomonadales Famili : Pseudomonadaceae Marga : Pseudomonas

Spesies : Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa merupakan bakteri gram negatif yang berbentuk batang, berukuran sekitar 0,6 x 2 µ. Bakteri ini terlihat sebagai

commit to user

bakteri tunggal, berpasangan dan kadang-kadang membentuk rantai yang pendek, tidak mempunyai spora, tidak mempunyai selubung serta mempunyai flagel monotrik (flagel tunggal pada kutub) sehingga selalu bergerak (Mayasari, 2005).

Bakteri ini bersifat oksidase positif dan tidak meragikan karbohidrat. Tetapi banyak strain yang mengoksidasi glukosa. Pengenalan biasanya berdasarkan morfologi, sifat oksidase positif, adanya pigmen yang khas dan pertumbuhan pada suhu 42°C. Untuk membedakan P. aeruginosa dari Pseudomonas yang lain berdasarkan pada aktivitas biokimiawinya yang membutuhkan berbagai substrat (Jawetz et al., 2005).

Pseudomonas aeruginosa adalah bakteri patogen oportunistik, yaitu memanfaatkan kerusakan pada mekanisme pertahanan inang untuk memulai suatu infeksi. Bakteri ini dapat menyebabkan infeksi saluran kemih, infeksi saluran pernapasan, dermatitis, infeksi jaringan lunak, bakteremia, infeksi tulang dan sendi, infeksi saluran pencernaan dan bermacam-macam infeksi sistemik, terutama pada penderita luka bakar berat, kanker dan penderita AIDS yang mengalami penurunan sistem imun (Mayasari, 2005).

Pseudomonas aeruginosa lebih resisten terhadap disinfektan dari pada kuman lain. Kebanyakan antibiotik dan antimikroba tidak efektif terhadap kuman ini. Fenol dan β-glutaradelhid biasanya merupakan disinfektan yang efektif. Selain itu, air mendidih juga dapat membunuh kuman ini (Syahruracman et al., 1994).

3. Media Pertumbuhan Bakteri

Media adalah bahan yang terdiri atas campuran nutrisi yang dipakai untuk menumbuhkan mikroba. Selain untuk menumbuhkan mikroba, media dapat digunakan untuk mengisolasi mikroba, memperbanyak mikroba, pengujian sifat-sifat fisiologi mikroba dan perhitungan jumlah populasi mikroba.

Pembuatan media harus memenuhi syarat antara lain harus steril, mengandung semua nutrisi yang diperlukan mikroba, mempunyai tekanan

commit to user

osmosa, tekanan permukaan, dan pH yang sesuai. Berdasarkan keadaan isi, media dapat dibedakan menjadi dua, yaitu:

a. Media basal

Media ini digunakan sebagai bahan dasar untuk membuat media lain yang lebih komplek. Media basal dibedakan menjadi 2, yaitu:

1) Media basal padat: kaldu agar, TSA (Tryptone Soya Agar). 2) Media basal cair: air peton, kaldu pepton, NA (Nutrien Agar).

Komposisi dari Nutrien Agar adalah ekstrak beef, pepton, agar, NaCl, air desitilat dan berada pada PH 6,8-7,0.

b. Media campuran

Media campuran adalah media selain media basal juga ditambahkan berbagai macam zat baik organik maupun anorganik sesuai dengan kebutuhan bakteri.

4. Antibakteri

Antibakteri adalah zat yang membunuh atau menekan pertumbuhan atau reproduksi bakteri (Dorland, 2002). Secara umum, mekanisme kerja antimikroba dapat dibagi menjadi lima cara, yaitu:

a. Denaturasi protein

Struktur protein dalam keadaan tiga dimensi ditentukan oleh ikatan disulfida kovalen intramolekuler dan sejumlah ikatan hidrogen. Keadaan ini mudah terganggu oleh sejumlah unsur fisik atau kimia sehingga protein mengalami denaturasi.

b. Gangguan selaput atau dinding sel

Selaput sel berguna sebagai penghalang yang selektif meloloskan zat terlarut lain. Konsentrasi beberapa zat yang diangkut secara aktif melalui sel menjadi tinggi dalam sel. Zat-zat yang terkonsentrasi pada permukaaan mungkin merubah sifat-sifat fisik normalnya serta membasmi dan menghambat sel. Dinding sel sebagai struktur pemberi bentuk pada sel, melindungi terhadap lisis osmotik. Dengan demikian, bila ada unsur yang merusak dinding sel atau menghalangi sintesis normalnya akan menyebabkan lisis sel.

commit to user

c. Pemindahan gugus sulfihidril bebas

Protein-protein enzim yang mengandung sistein memiliki rantai samping yang berakhir dalam gugus sulfihidril. Enzim yang terpenting terdiri dari gugus sulfhidril bebas seperti koenzim A memerlukan sulfihidril untuk pemindahan gugus etil. Enzim dan koenzin tidak dapat berfungsi kecuali jika gugus sulfihidril dalam keadaan bebas dan dalam bentuk tereduksi. Zat pengoksidasi mengganggu metabolisme dengan mengikat sulfihidril yang berdekatan dengan ikatan disulfida. d. Antagonis kimiawi

Antagonis kimiawi adalah bahan kimia yang menggunakan reaksi normal antar enzim spesifik dengan menggabungkan bagian-bagian holoenzim yang dapat mencegah pertambahan hasil metabolisme secara normal. Beberapa holoenzim memasukkan salah satu mineral sebagai jembatan antar enzim dan substrat. Bahan atau senyawa kimia yang bergabung dalam mineral-mineral ini akan mencegah penambahan enzim atau substrat lagi.

e. Degradasi DNA

Sejumlah unsur antimikroba bekerja dengan merusak DNA. Unsur ini meliputi radiasi pengion, sinar UV dan zat kimia reaktif DNA. Kerusakan DNA yang ditimbulkan karena penyinaran atau secara kimiawi akan mematikan sel terutama karena mengganggu replikasi DNA.

(Jawetz, et al, 2005)

5. Senyawa-Senyawa Metabolisme Sekunder yang Mempunyai Aktivitas Antibakteri

Senyawa-senyawa metabolisme sekunder yang mempunyai aktivitas antibakteri, antara lain:

a. Flavonoid

Flavonoid adalah suatu kelompok senyawa fenol yang terbesar yang ditemukan di alam (Kristanti, 2008). Dalam tumbuhan flavonoid pada umumnya merupakan pigmen-pigmen yang tersebar luas dalam bentuk senyawa glikon dan aglikon. Flavonoid-flavonoid yang terdapat di alam antara lain adalah flavon, isoflavon, antosianin, leuko-antosianin dan kalkon (Rusdi, 1988).

commit to user

Sifat fisika dan kimia senyawa flavonoid antara lain adalah larut dalam air, sedangkan dalam bentuk glikosida yang termetilasi larut dalam eter. Sebagai glikosida maupun aglikon, senyawa flavonoid tidak dapat larut dalam petroleum eter. Dari tumbuhan, glikosida dapat ditarik dengan pelarut organik yang bersifat polar (Rusdi, 1988).

Flavonoid memiliki kerangka dasar karbon yang terdiri dari 15 atom karbon dan digambarkan sebagai deretan senyawa C6-C3-C6. Artinya kerangka karbonnya terdiri atas dua gugus C6 yang dihubungkan dengan rantai alifatik tiga-karbon. Susunan ini dapat menghasilkan tiga jenis struktur, yaitu 1, 3-diarilpropan atau neoflavonoid, 1, 2-diarilpropan atau isoflavon, dan 1, 1-diarilpropan atau neoflavonoid. Contoh golongan senyawa flavonoid dapat dilihat pada Gambar 2.

O

flavan

O

OH

flavonol (katecin)

OH O

O

flavanonol

O

O

flavon

Gambar 2. Senyawa–senyawa golongan flavonoid (Kristanti, 2008)

Senyawa-senyawa ini merupakan zat warna merah, ungu, dan biru, serta sebagian zat warna kuning yang terdapat dalam tanaman. Sebagai pigmen bunga, flavonoid jelas berperan dalam menarik serangga untuk membantu proses penyerbukan. Beberapa kemungkinan fungsi flavonoid yang lain bagi tumbuhan adalah sebagai zat pengatur tumbuh, pengatur proses fotosintesis, sebagai zat antimikroba, antivirus dan antiinsektisida. Beberapa flavonoid sengaja dihasilkan jaringan tumbuhan sebagai respon terhadap infeksi atau luka yang kemudian

commit to user

berfungsi menghambat fungi penyerangnya. Telah banyak flavonoid yang diketahui memberikan efek samping fisiologi tertentu. Oleh karena itu, tumbuhan yang mengandung flavonoid banyak dipakai dalam pengobatan tradisional (Kristanti, 2008).

Patuloside A adalah senyawa glikosida xanton yang diisolasi dari tanaman famili Piperaceae yaitu Peperomia pellucid. Patuloside A mampu menghambat pertumbuhan bakteri gram positif maupun gram negatif, dimana penghambatan terhadap bakteri gram positif lebih baik dibandingkan dengan penghambatan terhadap bakteri gram negatif (Khan, 2010). Struktur kimia patuloside A dapat dilihat pada Gambar 3.

O H

OH H

H

OH H

OH CH2OH

H

O

O O

OH

OH

OH

Gambar 3. Struktur senyawa Patuloside A (Khan, 2010)

b. Terpenoid

Terpenoid adalah kelompok senyawa metabolit sekunder yang terbesar dilihat dari jumlah senyawa maupun variasi kerangka dasar strukturnya. Terpenoid ditemukan berlimpah dalam tanaman tingkat tinggi, meskipun demikian, dari penelitian diketahui bahwa jamur, organisme laut, dan serangga juga menghasilkan terpenoid. Selain dalam bentuk bebasnya, terpenoid di dalam juga dijumpai dalam bentuk glikosida, glikosil ester dan iridoid. Terpenoid juga merupakan komponen utama penyusun minyak atsiri (Kristanti, 2008).

Terpenoid adalah senyawa yang mengandung karbon dan hidrogen, atau karbon, hidrogen dan oksigen yang tidak bersifat aromatis. Terpenoid merupakan

commit to user

senyawa-senyawa yang mudah menguap terdiri dari 10 atom C dan penyusun minyak atsiri (Achmad, 1986).

Senyawa terpenoid tersusun atas karbon-karbon dengan jumlah kelipatan atom lima. Diketahui juga bahwa sebagian besar terpenoid mempunyai kerangka karbon yang dibangun oleh dua atau lebih unit C5 yang disebut unit isoprene (Kristanti, 2008). Senyawa terpenoid terdiri atas beberapa unit isoprene, mempunyai struktur siklik dengan satu atau lebih gugus fungsional berupa gugus hidroksil dan gugus karbonil (Rusdi, 1988). Klasifikasi terpenoid dapat dilihat pada Tabel 1.

Tabel 1. Klasifikasi Terpenoid

Kelompok Terpenoid Jumlah atom C

Monoterpen Seskuiterpen

Diterpen Triterpen Tetraterpen

Politerpen

10 15 20 30 40 >40

(Kristanti, 2008)

Secara kimia terpenoid larut dalam lemak dan terdapat di dalam sitoplasma sel tumbuhan. Biasanya terpenoid diekstrasi dari jaringan tumbuhan dengan memakai eter atau kloroform, dan dapat dipisahkan secara kromatografi pada silika gel atau alumina menggunakan pelarut eter atau kloroform (Harborne, 1996). Kebanyakan peneliti berpendapat bahwa fungsi terpenoid rendah dalam tumbuhan, lebih bersifat ekologi daripada fisiologi. Banyak senyawa ini yang menghambat pertumbuhan tumbuhan pesaingnya dan dapat bekerja sebagai insektisida atau berdaya racun terhadap hewan tinggi (Robinson, 1991). Penelitian Gunawan (2007) terpenoid yang diisolasi dari herba meniran (Phyllanthus niruri Linn), yaitu jenis phytadiene dan 1,2-seco cladiellan menunjukkan penghambatan terhadap pertumbuhan bakteri S. aureus dan E.coli. Struktur kimia phytadiene dan 1, 2-seco cladiellan dapat dilihat pada Gambar 4.

commit to user

(i)

O

O

OH OCH3

(ii)

Gambar 4. Struktur senyawa (i) phytadiene dan (ii) 1, 2-seco-cladiellan (Gunawan, 2007)

c. Saponin

Saponin adalah senyawa aktif permukaan yang menimbulkan busa jika dikocok dalam air dan pada konsentrasi yang rendah sering menyebabkan hemolisis sel darah merah. Dalam larutan yang sangat encer, saponin sangat beracun untuk ikan, dan tumbuhan yang mengandung saponin telah digunakan sebagai racun ikan selama beratus-ratus tahun. Beberapa saponin juga bekerja sebagai antimikroba (Padmawinata, 1995). Contoh senyawa saponin yang dapat bertindak sebagai antibakteri adalah smilagenin. Adapun strukturnya dapat dilihat pada Gambar 5.

O O

OH

commit to user

Saponin dapat dibedakan menjadi dua jenis yaitu glikosida triterpenoid dan glikosida struktur steroid tertentu yang mempunyai rantai samping spiroketal. Kedua jenis saponin ini larut dalam air dan etanol tetapi tidak larut dalam eter. Contoh senyawa yang termasuk saponin adalah asam glisiretat. Adapun strukturnya dapat dilihat pada Gambar 6.

Saponin mempunyai bagian utama berupa turunan triterpen dengan sedikit steroid. Residu gula dihubungkan oleh satu gugus –OH biasanya C3-OH dari

aglikon (monodesmoside saponin) dan jarang dengan dua gugus OH atau satu gugus –OH dan gugus karboksil (bis-desmiside saponin) (Wagner, 1983).

O

COOH

OH

Gambar 6. Struktur asam glisiretat (Padmawinata, 1995)

d. Alkaloid

Alkaloid adalah suatu golongan senyawa organik yang terbanyak ditemukan di alam. Hampir seluruh alkaloid berasal dari tumbuh-tumbuhan dan tersebar luas dalam berbagai jenis tumbuhan. Ciri khas alkaloid adalah bahwa semua alkaloid mengandung paling sedikit satu atom N yang bersifat basa dan pada umumnya merupakan bagian dari cincin heterosiklik. Alkaloid dapat ditemukan dalam berbagai bagian tumbuhan, tetapi sering kali kadar alkaloid kurang dari 1% (Kristanti, 2008).

Senyawa alkaloid diklasifikasikan menurut jenis cincin heterosiklik nitrogen yang merupakan bagian dari struktur molekul. Menurut klasifikasi ini, alkaloid dapat dibedakan atas beberapa jenis, seperti alkaloid piridin, pirolidin, indol, piperidin, kuinolin dan isokuinolin (Kristanti, 2008). Struktur dari senyawa-senyawa tersebut dapat dilihat pada Gambar 7.

commit to user N

H N

Pirolidin Piperidin Piridin

N H

N

N

N

H

indol kuinolin isokuinolin

Gambar 7. Struktur beberapa alkaloid (Kristanti, 2008)

Semua alkaloid mengandung paling sedikit satu atom nitrogen yang biasanya bersifat basa dan dalam sebagian besar atom nitrogen ini merupakan cincin aromatis (Achmad, 1986). Berdasarkan penyusun asam aminonya alkaloid dibedakan menjadi alkaloid asiklis yang berasal dari asam amino ornitin dan lisin. Alkaloid aromatis jenis fenilalanin berasal dari fenilalanin, tirosin dan 3, 4-dihidroksifenilalanin (Achmad, 1986). Salah satu senyawa alkaloid yang aktif antibakteri adalah ramiflorin A dan ramiflorin B. Struktur ramiflorin A dan B dapat dilihat pada Gambar 8.

HN

H N N

N H

H₁₇ H H H₃CO

H-17α, ramiflorin A H-17β, ramiflorin B

commit to user

e. Senyawa fenol

Senyawa-senyawa fenol yang terdapat dalam tumbuhan dapat merupakan senyawa monohidroksi atau polihidroksi fenolik. Terikat sebagai senyawa glikosida dimana terikat dengan protein, alkaloid atau terdapat sebagai senyawa terpenoida. Senyawa ini pada proses ekstraksi akan dapat ditemukan dalam fraksi air ataupun dalam fraksi pelarut-pelarut polar lainnya.

Jika murni, senyawa fenol berupa zat padat tak berwarna tetapi biasanya teroksidasi dan berwarna gelap jika terkena udara. Kelarutan dalam air bertambah jika gugus hidroksil makin banyak, tetapi kelarutan dalam pelarut organik yang polar umumnya tinggi. Fenol yang kelarutannya dalam air kecil mudah larut dalam natrium hidroksida encer, tetapi dalam suasana basa laju oksidasi sangat meningkat, sehingga pada setiap perlakuan penggunaan basa kuat dihindari (Padmawinata, 1995).

Senyawa fenolik mempunyai aktivitas antiinflamasi, karena senyawa ini menghambat sintesis prostaglandin (Padmawinata, 1995). Tingkatan gugus fungsi hidroksil pada golongan fenol berhubungan dengan toksisitas pada mikroorganisme, dengan bukti bahwa bertambahnya hidroksilasi menghasilkan penambahan toksisitas. Semakin tinggi fenol teroksidasi semakin kuat menghambat pertumbuhan organisme. Mekanisme yang berhubungan dengan toksisitas fenol terhadap mikroorganisme adalah penghambatan enzim oleh senyawa teroksidasi kemungkinan lewat reaksi dengan gugus sulfihidril atau dengan interaksi yang tidak spesifik oleh protein (Cowan, 1999). Contoh struktur senyawa fenol dapat dilihat pada Gambar 9.

COOH OH H

COOH

Asam Benzoat Asam Salisilat

commit to user

f. Tanin

Tanin merupakan senyawa kimia komplek, terdiri dari beberapa senyawa polifenol. Tanin tersebar luas pada seluruh bagian tumbuhan, terutama pada daun, buah yang belum masak dan kulit kayu. Tanin berbentuk amorf dan tidak dapat dikristalkan. Dalam air membentuk larutan kolodial, bereaksi asam dan mempunyai rasa sepat (Rusdi, 1988). Berta molekul tanin antara 500 sampai 28000 dan ditemukan pada bagian tanaman kuncup, batang, daun, buah dan akar (Cowan, 1999).

Tanin dibagi menjadi dua yaitu tanin terkondensasi dengan berat molekul besar (1900-28000) dan tanin terhidrolisis yang mempunyai berat molekul rendah (500-3000) (Padmawinata, 1995). Contoh senyawa tanin dapat dilihat pada Gambar 10.

CHOH OH O

OH

OH

OH

HO

katekin/epikatekin

CHOH O

OH

OH OH

OH OH

OH

Leukoantosianin

Gambar 10. Struktur beberapa tanin (Cowan, 1999)

Contoh senyawa tanin yang mempunyai aktivitas antibakteri antara lain katekin dan epigalotekin galat. Kedua senyawa ini diisolasi dari daun teh hijau (Camellia sinensis) dan dapat menghambat pertumbuhan bakteri H. pylori dan E. coli (Funatogawa et al., 2004)). Struktur epigalotekin galat dapat dilihat pada Gambar 11.

commit to user O

OCO OH

OH

OH OH OH OH

HO

HO

OH

Gambar 11. Struktur epigalotekin galat (Funatogawa et al, 2004)

6. Ekstraksi

Ekstraksi merupakan salah satu metode pemisahan kimia berdasarkan atas kelarutan komponen dengan pelarut yang digunakan. Ekstraksi pada padatan digunakan untuk memisahkan senyawa hasil alam dari jaringan kering tumbuhan, nikroorganisme dan hewan. Metode ekstraksi yang tepat ditentukan oleh tekstur, kandungan air bahan-bahan yang akan diekstrak dan senyawa-senyawa yang akan diisolasi. Jika substansi yang akan diekstrak terdapat di dalam campurannya yang berbentuk padat, maka dilakukan proses ekstraksi padat-cair (Rusdi, 1988).

Maserasi merupakan contoh metode ekstraksi padat-cair bertahap yang dilakukan dengan jalan membiarkan padatan terendam dalam suatu pelarut. Proses perendaman dalam usaha mengekstraksi suatu substansi dari bahan alam ini bisa dilakukan tanpa pemanasan (temperatur kamar), dengan pemanasan atau bahkan pada suhu pendidihan. Salah satu keuntungan metode maserasi adalah cepat, terutama jika maserasi dilakukan pada suhu didih pelarut. Waktu rendam bahan dalam pelarut bervariasi antara 15-30 menit tetapi terkadang bisa sampai 24 jam. Jumlah pelarut yang diperlukan juga cukup besar, berkisar antara 10-20 kali jumlah sampel (Kristanti, 2008).

Ekstraksi biasanya dimulai dengan menggunakan pelarut organik secara berurutan dengan kepolaran yang semakin meningkat. Digunakan pelarut heksana, eter, petroleum eter atau kloroform untuk mengambil senyawa yang kepolarannya rendah. Selanjutnya digunakan pelarut yang lebih polar seperti alkohol dan etil

commit to user

asetat untuk mengambil senyawa-senyawa yang lebih polar. Pemilihan pelarut berdasarkan kaidah “like dissolve like“, yang berarti suatu senyawa polar akan larut dalam pelarut polar dan juga sebaliknya, senyawa non polar akan larut dalam pelarut non polar. Pada proses maserasi, jika dilakukan dengan pelarut air, maka diperlukan proses ekstraksi lebih lanjut, yaitu ekstraksi fasa air yang diperoleh dengan pelarut organik (Padmawinata, 1995). Jika maserasi dilakukan dengan pelarut organik maka filtrat hasil ekstraksi dikumpulkan menjadi satu kemudian dievaporasi atau didestilasi. Selanjutnya dapat dilakukan proses pemisahan dengan kromatografi atau rekristalisasi langsung (Kristanti, 2008).

7. Kromatografi Lapis tipis

Kromatografi merupakan salah satu metode pemisahan komponen dalam suatu sampel dimana komponen tersebut didistribusikan di antara dua fasa yaitu fasa gerak dan fasa diam. Fasa gerak adalah fasa yang membawa cuplikan, sedangkan fasa diam adalah fasa yang menahan cuplikan secara efektif (Sastrohamidjojo, 2004).

Ditinjau secara fisik, kromatografi lapis tipis merupakan salah satu jenis kromatografi planar. KLT memiliki banyak kesamaan dengan kromatografi kertas dalam penotolan sampel, pengembangan kromatogram dan cara deteksinya, tapi proses pemisahan yang terjadi pada KLT dan kromatografi kertas berbeda. Pada KLT, pemisahan yang terjadi secara adsorpsi sedangkan dalam kromatografi kertas proses pemisahan terjadi secara partisi.

Fase diam dalam KLT berupa padatan penyerap yang dihasilkan pada sebuah plat datar dari gelas, plastik atau alumina sehingga membentuk lapisan tipis dengan ketebalan tertentu. Fase diam atau penyerap yang bisa digunakan sebagai pelapis plat adalah silika gel (SiO2), selulosa, alumina (Al2O3) dan

kieselgur (tanah diatome). Kebanyakan penyerap yang digunakan adalah silika gel, dimana telah tersedia plat yang siap pakai (Stahl, 1985).

Pelarut sebagai fasa gerak atau eluen merupakan faktor yang menentukan gerakan komponen-komponen dalam campuran. Pemilihan pelarut tergantung pada sifat kelarutan komponen tersebut terhadap pelarut yang digunakan. Fasa

commit to user

gerak yang bersifat lebih polar digunakan untuk mengelusi senyawa-senyawa yang adsorbsinya kuat, sedangkan fasa gerak yang kurang polar digunakan untuk mengelusi senyawa yang adsorbsinya lemah (Sastrohamidjojo, 2004).

Analisis suatu senyawa dalam KLT biasanya dilakukan dengan dibandingkan terhadap senyawa standarnya. Pengamatan yang lazim berdasarkan pada kedudukan noda relatif terhadap batas pelarut yang dikenal sebagai Rf (Retardation factor) yang didefinisikan sebagai berikut :

Rf = Jarak komponen yang bergerak Jarak pelarut yang bergerak

Identifikasi senyawa pada kromatogram dapat dilakukan dengan melihat warna noda di bawah sinar UV atau dengan menyemprotkan pereaksi warna sesuai dengan jenis atau kelas senyawa yang dianalisis (Stahl, 1985).

8. Kromatografi Vakum Cair (KVC)

Kromatografi vakum cair merupakan salah satu kromatografi kolom khusus yang biasanya juga menggunakan silika gel sebagai adsorben (silika gel G60 62-200 µm). Alat yang digunakan adalah corong Buchner atau pompa vakum dengan diameter yang cukup besar untuk mempercepat laju alir fasa gerak selama proses pemindahan zat terlarut. Pada kromatografi vakum cair, fraksi-fraksi yang ditampung biasanya bervolume jauh lebih besar dibandingkan dengan fraksi-fraksi yang diperoleh dari kromatografi kolom biasa (Kristanti, 2008).

Prinsip kerja dari Kromatografi Vakum Cair (KVC) adalah adsorpsi atau serapan, sedangkan pemisahannya didasarkan pada senyawa-senyawa yang akan dipisahkan terdistribusi di antara fasa diam dan fasa gerak dalam perbandingan yang berbeda-beda (Sastrohamidjojo, 2004). Kolom kromatografi dikemas kering dalam keadaan vakum agar diperoleh kerapatan kemasan maksimum. Pompa vakum dihentikan dan pelarut yang kepolarannya rendah dituangkan ke permukaan penyerap lalu divakumkan kembali. Kolom dihisap sampai kering dan setelah itu siap dipakai. Sampel dilarutkan dalam pelarut yang cocok, dimulai

commit to user

dengan pelarut yang kepolarannya rendah lalu kepolarannya ditingkatkan perlahan-lahan. Kolom dihisap sampai kering pada setiap pengumpulan fraksi. Oleh karena itu, kromatografi vakum cair menggunakan tekanan rendah untuk meningkatkan laju aliran fase gerak (Pedersen, 2001)

9. Kromatografi Gas – Spektroskopi Massa (GC-MS)

Perkembangan teknologi instrumentasi menghasilkan alat yang merupakan gabungan dari dua sistem dengan prinsip dasar yang berbeda satu sama lainnya tetapi dapat saling melengkapi, yaitu gabungan kromatografi gas dan spektrofotoskopi massa. Peubah utama dalam GC adalah sifat fasa diam dalam kolom dan suhu kerja. Keduanya diubah menurut keatsirian senyawa yang dipisahkan. Pada fasa diam terjadi pemisahan komponen-komponen dan cuplikan. Dasar kerjanya adalah partisi antara fase diam dan fase gerak (gas). Jadi untuk pemisahan senyawa-senyawa organik berlaku aturan “like dissolve like”. Polaritas dari komponen cuplikan harus sama dengan fase diam untuk memperoleh pemisahan terbaik, sehingga senyawa polar akan terpisah pada fasa diam yang polar dan senyawa non polar akan terpisah pada senyawa diam yang non polar (Sudjadi, 1988).

Analisis kualitatif yang dilakukan dalam Kromatografi Gas adalah analisa terhadap waktu retensi (tR) yaitu jarak dalam cm sepanjang garis dasar antara titik penyuntikan sampel dan titik proyeksi puncak kurva yang dihasilkan oleh standar internal yang tertera pada kromatogram, sedangkan analisis kuantitatif dengan perhitungan luas puncak (Sastrohamidjojo, 2004).

Spektroskopi massa tidak seperti metode spektroskopi lainnya, tidak melibatkan interaksi antara cahaya dengan materi. Spektroskopi massa dikembangkan berdasarkan prinsip dengan memutus sesuatu menjadi bagian-bagiannya untuk dilihat dari apa suatu materi tersusun. Pada spektroskopi massa, sampel pada keadaan uap diionisasi dengan bombardir elektron yang berenergi tinggi (10-70 eV). Elektron bertumbukan dengan materi sampel dan menyebabkan pelepasan elektron dari kulit terluar suatu sampel.

commit to user

Molekul yang kekurangan satu elektron akan menjadi kation radikal yang mengandung semua atom dari molekul awalnya, dan dinamakan ion molekul. Sebagai akibat dari tumbukan elektron berenergi tinggi membuat ion molekul mempunyai kelebihan energi yang memungkinkan untuk terjadinya pemutusan ikatan menghasilkan kation yang lebih kecil, radikal, dan molekul netral. Kation yang dibebaskan pada peristiwa ini dipisahkan dan dianalisis berdasarkan perbandingan massa terhadap muatan (m/z) dengan menggunakan kombinasi medan magnet dan medan listrik. Molekul tidak terpecah secara acak, tetapi mengikuti beberapa prinsip. Kemudian hanya fragmen tertentu saja yang dapat diberikan ion molekul.

Senyawa yang menguap dalam ruang hampa di dalam MS ditembak dengan elektron sehingga elektron dalam molekul akan terlempar keluar dan akan didapat kation molekul bermuatan positif tunggal dan ganda. Bagian dari kation molekul ini pada waktu bertemu dengan elektron akan menerima energi yang tinggi yang akan menyebabkan penguraian lebih lanjut kation molekul menjadi fragmen yang lebih kecil (fragmentasi). Kation molekul dan fragmen yang bermuatan positif akan dipercepat oleh tegangan tarikan dan dibelokkan dalam ruang pengurai. Bagian ini terdiri dari tabung logam yang terdapat diantara dua kutub magnet. Medan magnet akan membelokkan bagian yang bermuatan dari arah garis lurus aliran menjadi pita yang melengkung yang dengan perubahan kontinyu medan magnet atau tegangan tarikan kation sesuai dengan massanya akan diregristrasi berurutan sebagai spektrum massa (Roth, 1988).

Instrumen GC-MS terdiri dari gas pengangkut (Carrier Gas), pengatur aliran dan pengatur tekanan, tempat injeksi, kolom serta detektor.

a. Gas pengangkut

Gas pengangkut yang sering dipakai dalam GC-MS adalah H2, N2, Ar dan

He. Gas ini berfungsi sebagai fase gerak, gas membawa cuplikan yang telah teruapkan untuk masuk ke dalam kolom, dalam GC-MS gas pengangkut yang digunakan harus memenuhi persyaratan dan dasar pemilihannya antara lain: inert atau tidak bereaksi dengan sampel, pelarut dan material dalam kolom, murni dan

commit to user

mudah diperoleh serta murah, sesuai dengan detektor dan harus dapat mengurangi difusi gas (Sastrohamidjojo, 2004).

b. Pengatur aliran dan tekanan

Pengatur aliran dan tekanan berfungsi untuk mengalirkan uap sampel masuk ke dalam kolom.

c. Tempat injeksi

Pemisahan dengan GC sampel harus berada dalam fase uap. Teknik menginjeksi tergantung pada jenis sampel, adapun jenis teknik injeksi sampel dalam GC antara lain: split, dalam teknik injeksi ini sampel tidak langsung dimasukkan dalam kolom tetapi sebagian besar dibuang, sampel yang dimasukkan hanya sekitar 0,1-1 %. Secara umum teknik ini banyak digunakan. Split less, dalam teknik injeksi ini sampel semuanya dimasukkan ke dalam kolom, biasanya digunakan untuk sampel yang tidak diisolasi dalam jumlah yang besar serta memiliki konsentrasi rendah. On colum, pada teknik ini merupakan tempat injeksi untuk sampel yang mudah rusak atau sampel yang tidak tahan pada suhu tinggi dimana sampel tidak melewati suhu injektor yang tinggi tetapi hanya melewati suhu kolom. Wet needle merupakan salah satu teknik injeksi dimana sampel diuapkan di dalam injektor sehingga sampel yang masuk ke dalam kolom sudah berada dalam bentuk gas.

d. Kolom

Kolom merupakan jantung kromatografi, keberhasilan atau kegagalan analisis tergantung dari pemilihan kolom dan kondisi kerja yang tepat. Kolom GC dibedakan menjadi 2 yaitu: Packed dan capillary. Pada kolom jenis packed sangat bagus untuk sampel dalam skala besar namun kelemahannya lambat dan tidak efisien, diameter partikel berukuran < 100-300 µm sedangkan pada capillary keuntungannya adalah cepat dan efisien karena menggunakan sampel dalam jumlah yang sedikit.

e. Detektor

Detektor berfungsi sebagai pendeteksi komponen-komponen cuplikan yang telah terpisah. Detektor yang baik memiliki sensitivitas yang tinggi, respon linier yang lebar bersifat non destruktif serta memiliki respon yang sama terhadap

commit to user

semua jenis senyawa. Jenis-jenis detektor antara lain: 1) Flame Ionization Detector (FID), detektor jenis ini efluen gas yang keluar dan kolom dicampur dengan gas H2 serta dibakar dengan O2, sehingga menjadi ion. Ion-ion tersebut akan menyebabkan peningkatan arus, perubahan arus selanjutnya diukur dan dikonversikan dalam GC-MS. Dalam FID ini memiliki sifat tidak sensitif terhadap H2O, CO2 dan SO2. Selain itu, destruktif dan respon dipengaruhi oleh jumlah

atom C, FID ini memiliki sensitivitas 10-13 g/s, 2) Thermal Conductivity Detector (TCD) detektor jenis ini memiliki sifat nondestruktif dan tidak sensitif dengan sensivitas 10-8 g/s, 3) Mass Spektrometri (MS) detektor jenis ini diset untuk mendeteksi ion fragmen tunggal yang spesifik untuk senyawa yang dianalisa. Berdasarkan kecepatan pompa dari MS, lebih kurang 1-5% efluen GC displit ke dalam MS, selanjutnya komponen yang telah terpisah ditembaki dengan elektron terfragmentasi menjadi ion-ion radikal. Pada MS bagian molekul paling mudah terfragmentasi adalah yang memiliki kerapatan elektron yang paling tinggi (Sastrohamidjojo, 2004). Skema alat GC-MS digambarkan dalam Gambar 12 berikut:

Gambar 12. Skema alat GC-MS

10.Metode Pengujian Aktivitas Antibakteri

Prinsip umum untuk menentukan aktivitas antibakteri adalah dengan melihat adanya hambatan pertumbuhan bakteri. Zat antibakteri dapat diperoleh dari hasil fermentasi, sintetik dan dapat diperoleh dari hasil isolasi dari tanaman.

commit to user

Penapisan zat antibakteri dilakukan secara in vitro. Metode ini dibagi menjadi 2 bagian yaitu metode difusi agar dan metode dilusi.

a. Metode difusi

Metode ini dibagi menjadi tiga yaitu metode perforasi, metode gores silang dan metode cakram kertas.

1) Metode perforasi

Bakteri uji yang umurnya 18-24 jam disuspensikan kedalam media agar pada suhu sekitar 45 oC. Suspensi bakteri dimasukkan ke dalam cawan petri, kemudian dicampur dengan 15 mL media agar steril. Campuran tersebut dihomogenkan dengan cara gerakan memutar. Setelah agar membeku, dibuat lubang dengan menggunakan perforator berdiameter 6 mm, tiap lubang diisi dengan 20 µL sampel ekstrak yang sebelumnya telah dilarutkan dalam larutan DMSO dengan konsentrasi 10%, kemudian cawan diinkubasi pada suhu 37oC selama 18-24 jam. Aktivitas antibakteri dapat dilihat daerah bening yang mengelilingi lubang perforasi.

2) Metode Gores Silang

Zat yang akan diuji diserapkan ke dalam kertas saring (empat persegi panjang) dengan cara meneteskan pada kertas saring kosong larutan antibakteri sejumlah volume tertentu dengan kadar tertentu pula. Kertas saring tersebut diletakkan dipermukaan agar padat, kemudian digores dengan suspensi bakteri melalui kertas saring dan diinkubasikan selama 18-24 jam pada suhu 37oC. Aktivitas antibakteri dapat dilihat dari daerah bening yang tidak ditumbuhi bakteri dekat kertas saring.

3) Metode Cakram Kertas

Zat yang akan diuji diserapkan ke dalam cakram kertas dengan cara meneteskan pada cakram kertas kosong larutan antibakteri sejumlah volume tertentu dengan kadar tertentu pula. Cakram kertas diletakkan di atas permukaan agar padat yang telah dituangkan bakteri sebelumnya. Cawan petri diinkubasi pada suhu 30°C selama 2 hari sampai 4 hari. Aktivitas antibakteri dapat dilihat dari daerah hambat di sekeliling cakram kertas.

commit to user

b. Metode dilusi

Metode dilusi dibedakan menjadi dua yaitu dilusi cair (broth dilution) dan dilusi padat (solid dilution).

1) Metode dilusi cair

Cara yang dilakukan adalah dengan membuat seri pengenceran agen antibakteri pada medium cair yang ditambahkan dengan bakteri uji. Larutan uji agen antibakteri pada kadar terkecil yang terlihat jernih tanpa adanya pertumbuhan bakteri uji ditetapkan sebagai KHM. Larutan yang ditetapkan sebagai KHM tersebut selanjutnya dikultur ulang pada media cair tanpa penambahan bakteri uji ataupun agen antibakteri dan diinkubasi selama 18-24 jam.

2) Metode dilusi padat

Metode ini serupa dengan metode dilusi cair namun menggunakan media padat (solid). Keuntungan metode ini adalah suatu konsentrasi agen antibakteri yang diuji dapat digunakan untuk menguji beberapa bakteri uji (Pratiwi, 2008).

11. Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) dan Uji Banding

Konsentrasi hambat minimum (KHM) adalah konsentrasi terkecil (pengenceran terbesar) suatu obat yang masih menghambat pertumbuhan bakteri. KHM sangat penting untuk menentukan dosis efektif terkecil dari obat dan memberikan indek perbandingan dengan obat yang lain.

Uji potensi suatu sampel (zat antibakteri) bertujuan untuk mengetahui sejauh mana kekuatan atau daya aktivitas antibakteri sampel tersebut bila dibandingkan terhadap suatu zat pembanding. Metode yang digunakan adalah dengan cara membandingkan respon yang dihasilkan oleh zat antibakteri yang diperiksa terhadap respon suatu zat antibakteri pembanding. Respon tersebut berupa hambatan terhadap pertumbuhan bakteri uji.

Uji potensi suatu sampel dapat dilakukan dengan cara membuat suatu grafik atau kurva standart dari zat pembanding, dimana logaritma konsentrasi zat pembanding diplotkan terhadap sumbu x dan diameter daerah hambat diplotkan terhadap sumbu y, sehingga diperoleh persamaan garis linier. Berdasarkan

commit to user

persamaan garis linier tersebut, nilai diameter daerah hambat pada konsentrasi yang telah ditetapkan disubtitusikan ke y maka akan diperoleh nilai x. Antilog dari nilai x merupakan nilai konsentrasi sampel yang setara dengan zat pembanding, sehingga dapat ditetapkan nilai uji banding sampel terhadap zat pembanding, yaitu dengan menggunakan rumus sebagai berikut.

% 100 x sebenarnya sampel

i Konsentras

kurva dari sampel i

Konsentras banding

uji

Nilai =

(Permana, 2009)

B. Kerangka Pemikiran

Daun sirih merah ( Piper crocatum Ruiz & Pav ) dari suku Piperaceae berdasarkan literatur cukup berkhasiat untuk obat tradisional, antara lain dapat mengobati keputihan, infeksi pada kulit, kuku dan telinga. Namun sampai saat ini masih sedikit informasi tentang kandungan kimia serta aktivitas antibakteri terhadap bakteri patogen dari ekstrak daun sirih merah.

Pada umumnya tanaman yang termasuk suku Piperaceae mengandung golongan senyawa golongan alkaloid, terpenoid, flavonoid dan minyak atsiri. Sirih merah termasuk dalam suku Piperaceae, sehingga dalam sirih merah mengandung flavonoid, alkaloid, saponin, polifenolat, tanin dan minyak atsiri. Senyawa-senyawa tersebut merupakan senyawa yang mempunyai aktivitas antibakteri. Hal ini diperkuat dengan hasil penelitian Juliantina (2008) yaitu ekstrak etanol sirih merah mempunyai kemampuan antibakteri bakteri gram positif dan bakteri gram negatif khususnya terhadap Staphylococcus aureus dengan KHM 25 % dan Eschericia coli dengan KHM 6,25 %, sehingga dalam penelitian ini bertujuan mengidentifikasi komponen kimia yang terdapat dalam ekstrak daun sirih merah, kemudian menguji aktivitasnya sebagai antibakteri terhadap bakteri gram positif yaitu Staphylococcus aureus, Bacillus cereus dan bakteri gram negatif yaitu Eschericia coli dan Pseudomonas aeruginosa sehingga nanti akan diketahui senyawa aktif antibakteri apa saja yang ada di dalam ekstrak daun sirih merah.

commit to user

Isolasi ekstrak daun sirih merah dilakukan dengan menggunakan maserasi dengan pelarut etanol karena etanol dapat melarutkan sebagian besar senyawa organik. Ekstrak etanol yang diperoleh kemudian diekstraksi partisi menggunakan pelarut heksana dengan corong pisah untuk mendapatkan ekstrak polar dari daun sirih merah yang telah terpisah dari ekstrak non polar. Ekstrak polar tersebut dilakukan pemisahan dengan KVC untuk mendapatkan fraksi heksana, fraksi etil asetat dan fraksi etanol. Metode pengujian aktivitas antibakteri dapat dilakukan dengan metode lubang terhadap ekstrak etanol dan fraksi-fraksi hasil KVC untuk mengetahui aktivitas antibakterinya. Komponen kimia ekstrak etanol daun sirih merah digunakan analisa skrining fitokimia, sedangkan fraksi hasil KVC yang memiliki akivitas antibakteri tertinggi diidentifikasi dengan skrining fitokimia dan analisis GC-MS, dimana dari data GC-MS ini akan didapatkan informasi struktur senyawa kimia yang terdeteksi dalamnya. Pengobatan secara medis banyak menggunakan antibiotik sintetik seperti amoksisilin untuk pengobatan penyakit akibat infeksi bakteri. Oleh karena itu, dilakukan penentuan Konsentrasi Hambat Minimum untuk mengetahui potensi fraksi yang mempunyai aktivitas antibakteri tertinggi terhadap keempat bakteri uji serta dilakukan uji potensi antibakteri fraksi tersebut dibandingkan dengan potensi antibakteri amoksisilin.

C. Hipotesis

1. Ekstrak etanol daun sirih merah dan fraksi-fraksi hasil pemisahan yaitu fraksi heksana, fraksi etil asetat dan fraksi etanol mempunyai aktivitas antibakteri. 2. Ekstrak etanol mengandung senyawa alkaloid, flavonoid, terpenoid, saponin

dan senyawa fenol, sedangkan fraksi yang mempunyai aktivitas antibakteri tertinggi mengandung senyawa terpenoid.

3. Potensi fraksi yang mempunyai aktivitas antibakteri tertinggi dapat dibandingkan dengan amoksisilin.

commit to user BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

A. Metode Penelitian

Penelitian dilakukan dengan menggunakan metode eksperimental di laboratorium. Tahap pertama adalah pembuatan serbuk simplisia sampel. Serbuk simplisia sampel diekstraksi maserasi menggunakan pelarut etanol dan diekstraksi partisi menggunakan pelarut heksana. Terhadap ekstrak etanol yang diperoleh dilakukan pengujian aktivitas antibakteri dan dilakukan uji skrinning fitokimia. Ekstrak etanol kemudian dipisahkan dengan menggunakan kolom Kromatografi Vakum Cair (KVC) berdasarkan tingkat kepolaran, yaitu secara berurutan heksana, etil asetat dan etanol.

Fraksi-fraksi hasil Kromatogravi Vakum Cair kemudian dilakukan pengujian antibakteri. Terhadap fraksi aktif kemudian dilakukan skrining fitokimia. Fraksi aktif yang memiliki aktivitas antibakteri tertinggi kemudian dilakukan uji golongan senyawa dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dan data analisis Gas Cromatography-Mass Spectroscopy (GC-MS). Penentuan potensi antibakteri dilakukan dengan mencari nilai Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) ekstrak dan nilai banding fraksi terhadap standar amoksisilin.

B. Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian dilaksanakan mulai bulan April 2010-November 2010 di Laboratorium Kimia Dasar FMIPA Universitas Sebelas Maret dan Sub Lab Biologi Laboratorium Pusat Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sebelas Maret Surakarta.

C. Alat dan Bahan 1. Alat-alat yang digunakan

Alat – alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah neraca timbang (Denver INST.TL603D dan Mettler Toledo AT400), heating mantel (J.P. SELETA., s.a), vortex mixer (VM 300), water pump, statif dan klem, penyaring

commit to user

Buchner, oven (Memmert Model 500), Kromatografi Vakum Cair (KVC), corong pisah, evaporator (Bibby RE 200B), bejana KLT, semprot KLT, perforator diameter 6 mm, pembakar spirtus, pendeteksi UV (PUV/BDH), autoklaf (Presoclave 75 P-Selecta), hotplate-stirer (RCT Basic Labortechnik), pipa kapiler, mikropipet 10-100 µL, cawan petri, jarum ose, laminar air flow (Minihelik II), inkubator (Hotcold M P-Selecta), GC-MS (QP2010S SHIMADZHU), spatula logam, selang air, lemari asam, lemari pendingin dan peralatan gelas.

2. Bahan-bahan yang digunakan a. Bahan yang diteliti

Daun Sirih Merah dari daerah Magelang yang dibuat simplisia b. Bahan Kimia

Bahan kimia yang digunakan dalam penelitian ini adalah pelarut organik yaitu etanol (96%), heksana (redestilasi), etil asetat (redestilasi), aseton teknis, asam formiat (Pro analisis), anhidrida asam asetat (Pro analisis), H2SO4 pekat, asam asetat (Pro analisis), metanol (Pro analisis), toluena

(Pro analisis), dietil amin (Pro analisis), akuades, metanol, DMSO (Pro analisis), akuades, silika gel F254 (E. merck) dan plat KLT silika gel F254.

Larutan pereaksi yang digunakan adalah KOH, FeCl3 1% dalam air, SbCl3

20% dalam kloroform, Dragendorff dan Lieberman Buchard. c. Bakteri Uji

Bakteri uji yang digunakan adalah E. coli, B.cereus, S. aureus, dan P. aeruginosa yang diperoleh dari Universitas Setiabudi, Surakarta.

d. Media Pembenihan

Media pembenihan untuk bakteri adalah Nutrien Agar (E. Merck) dengan kandungan bahan per liter adalah 5 g pepton, 3 g ekstrak daging dan 12 g agar.

e. Zat Pembanding Antibakteri

Zat pembanding yang digunakan sebagai standar antibakteri dalam penelitian ini adalah amoksisilin (standar farmasi).

commit to user

D. Prosedur Penelitian 1. Persiapan sampel sirih merah

Sampel daun sirih merah diperoleh dari daerah Magelang. Daun sirih merah sebelumnya diidentifikasi oleh Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada. Daun sirih merah dibersihkan, dicuci, kemudian dikeringkan pada suhu kamar atau diangin-anginkan kurang lebih 1 hari dan dioven pada 40°C. Selanjutnya daun sirih merah diblender sampai berbentuk serbuk. Bahan kering simplisia disimpan dalam wadah tertutup.

2. Ekstraksi Maserasi Sampel Daun Sirih Merah

Daun sirih merah dimaserasi dengan pelarut etanol selama 2x24 jam. Selanjutnya ekstrak etanol diekstraksi partisi menggunakan pelarut heksana dengan corong pisah untuk mendapatkan ekstrak polarnya. Ekstrak etanol hasil partisi kemudian diuapkan pelarutnya dengan penguap vakum putar dengan suhu 50°C hingga diperoleh ekstrak etanol kental.

3. Pengujian Golongan Senyawa Ekstrak Etanol

Skrining fitokimia dilakukan terhadap ekstrak etanol awal. Hal ini bertujuan untuk mengetahui golongan senyawa yang telah terisolasi. Penapisan fitokimia dilakukan dengan metode uji Kromatografi Lapis Tipis (KLT).

a. Uji Flavonoid

Ekstrak sampel ditotolkan pada lempeng plat Silika Gel F254. Elusi

dilakukan dengan fase gerak etil asetat : asam formiat : asam asetat : air (100 : 11 : 11 : 27) dalam 2 ml. Kemudian plat diamati pada cahaya tampak, UV 254 nm, dan UV 365 nm. Flavonoid akan memberikan warna fluorosens biru tua pada UV 254 nm dan pada UV 365 nm akan memberikan warna kuning, biru dan hijau.

b. Uji Antrakuinon

Uji Antrakuinon menggunakan fase diam Silika Gel F254. Elusi dilakukan

dengan fase gerak eril asetat : metanol : air (100 : 13,5 : 10) dalam 2 ml. Plat dikeringkan kemudian disemprot dengan pereaksi KOH etanolik 5%. Kemudian plat diamati pada cahaya tampak, UV 254 nm, dan UV 365 nm. Antrakuinon akan

commit to user

(a)

(b)

Gambar 17.(a). Spektra senyawa 11, (b). Spektra germakren D Spektra tersebut diatas dapat dibuat tabel fragmentasi sebagai berikut: Tabel 13. Fragmentasi senyawa puncak 11 dibandingkan standar germakren D

No Senyawa Puncak Fragmentasi

1 Senyawa puncak 11

4 1

55 6 9

8 1

9 1

105 119 133 147 161 189 204 2 Standar

Germakren D

4 1

55 6 7

7 9

9 1

105 119 133 147 161 - 204

Tampak pada gambar 17a dan tabel 13, spektra massa senyawa puncak 11 mirip dengan gambar 17b yang merupakan spektra massa dari senyawa germakren D, dengan Similiarity Indeks 89%. Spektra massa germakren D diatas memiliki kemiripan dengan spektra massa dari germakren D yang diisolasi dari tanaman Heliothis virescens (Rostelien, 2000). Germakren D merupakan golongan senyawa seskuiterpenoid dengan rumus molekul C15H24 dan m/z 204.

Analisis spektra massa senyawa lainnya dilakukan dengan cara yang sama seperti analisis empat senyawa yang telah dilakukan diatas. Hasil analisis spektra massa diperoleh 14 senyawa yang memiliki puncak dasar dan pola fragmentasi yang mirip dengan senyawa standar dari WILEY 229.LIB. Data 14 komponen fraksi heksana daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) yang teridentifikasi disajikan pada Tabel 14.

commit to user

Tabel 14. Komponen fraksi heksana daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.)

Senyawa

SI (Similiarity

Indeks)

Puncak Berat Molekul

tR (menit)

Luas area (%)

Perkiraan Senyawa

1. 92 1 204 26,602 1,03 α-cubeben

2. 94 2 204 27,391 1,64 β-bourbonen

3. 93 3 204 27,667 2,26 β-elemen

4. 94 4 204 28,454 4,64 Zingiberen

5. 95 5 204 30,202 19,21 Trans-kariofilen

6. 94 6 204 32,482 15,18 β-farnesen

7. 93 7 204 32,733 8,10 β-seskuifelandren

8. 95 8 204 33,025 6,83 β-humulen

9. 92 9 204 34,766 5,6 Diepi α-cedren

10. 92 10 202 35,026 9,93 ar-kurkumen

11. 89 11 204 35,362 13,86 Germakren-D

12. 90 12 204 37,650 1,92 Metanoazulen

13. 86 13 204 38,880 6,04 α-copaen

14. 94 14 278 69,675 3,78 Neopitadien

Total senyawa teridentifikasi 100%

Aktivitas antibakteri fraksi heksana ini sulit dihubungkan dengan komponen atau senyawa yang khusus. Hal ini dikarenakan kompleksitas dan variabilitas senyawa-senyawa yang terkandung di dalamnya. Secara umum aktivitas antibakteri berhubungan dengan struktur terpen C10 dan C15 serta gugus

hidroksil yang memiliki kemampuan untuk membentuk ikatan hidrogen dengan sisi aktif enzim target meskipun senyawa aktif lain seperti alkohol, aldehid, dan ester juga dapat berkontribusi sebagai antibakteri (Bulleti, 2004).

Aktivitas penghambatan yang ditunjukkan oleh fraksi heksana dapat disebabkan oleh adanya aktivitas kerja gabungan dari senyawa yang terdapat di dalamnya sehingga menunjukkan aktivitas penghambatan yang efektif. Pengujian ekstrak etanol awal juga menunjukkan aktivitas kerja antibakteri yang lebih besar dibandingkan fraksi heksana, karena ekstrak etanol awal mengandung gabungan senyawa-senyawa yang memiliki aktivitas antibakteri yaitu senyawa fenolat, saponin, alkaloid, flavonoid, dan terpenoid. Aktivitas kerja gabungan dari beberapa senyawa-senyawa antibakteri dapat mengakibatkan aktivitas kerja yang lebih efektif bila dibandingkan dengan daya kerja masing-masing senyawa

commit to user

(Jawetz, 2005). Namun dimungkinkan juga senyawa trans kariofilen yang memiliki persentasi paling besar dibandingkan dengan senyawa lainnya mempengaruhi keefektifan dari fraksi heksana tersebut.

Senyawa trans kariofilen mempunyai efek anti inflamasi, anti bakteri, anti endemik, dan dapat mencegah tumor (Erindyah, 2003). Senyawa trans kariofilen dan germakren D merupakan penyusun utama minyak atsiri daun dan bunga Phlomis crinita Cav. dengan komposisi trans kariofilen (40,8%) dan germakren D (39,1%). Minyak atsiri daun dan bunga Phlomis crinita Cav. dengan konsentrasi antara 2,5 µg/ml sampai 625 µg/ml dapat mengambat pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, dan Salmonella typhimurium. Selain memiliki aktivitas antibakteri, senyawa trans kariofilen juga dapat menghambat aktivitas sitotoksin pada sel tumor (Neffati, 2008). Senyawa germakren D dapat digunakan untuk obat dan dapat berfungsi sebagai penunjang aktivitas antibakteri (Bulleti, 2004; Neffati, 2008).

Komponen lain yang yang diduga memiliki aktivitas antibakteri adalah α-humulen, zingiberen dan farnesen. Zingiberen dan farnesen merupakan komponen utama penyusun dari minyak atsiri, ekstrak etanol, dan ekstrak petroleum eter rimpang jahe (Zingiber officinale). Zingiberen dan farnesen dalam rimpang jahe (Zingiber officinale) dapat menghambat pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus, Bacillus cereus dan Listeria monocytogenes (Norajit, 2007).

Struktur 13 senyawa yang tergolong seskuiterpenoid dan satu senyawa diterpenoid digambarkan pada Gambar 18 dan dan Gambar 19, sebagai berikut:

commit to user

CH2

CH3

H3C

H3C

Trans-Kariofilen a-Humulen Metanoazulen CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3

H3C

ar-Kurkumen CH3 b-Elemen CH=CH2 CH3 H2C=CCH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3

H3C

Zingiberen b-seskuifelandren

CH3

CH2

CH3

H3C

CH3 CH3 CH3 CH3 b-farnesen CH3

H3C

CH2 H CH3 H H b-bourbon

Germakren D _a-copaen

a-cubeben diepi a-cedren

Gambar 18. Struktur seskuiterpenoid daun Piper crocatum Ruiz & Pav.

neopitadien

commit to user

BAB V PENUTUP

A. Kesimpulan

1. Ektrak etanol, fraksi heksana, fraksi etil asetat dan fraksi etanol daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) mempunyai aktivitas antibakteri terhadap bakteri S. aureus, B. cereus, E. coli, dan P. aeruginosa. Fraksi heksana mempunyai aktivitas antibakteri tertinggi dibandingkan dengan fraksi etil asetat dan fraksi etanol dengan KHM 10% terhadap E. coli dan 5% terhadap S. aureus, B. cereus dan P. aeruginosa. Ekstrak etanol memiliki aktivitas antibakteri tertinggi dibandingkan dengan ketiga fraksi hasil pemisahan.

2. Golongan senyawa kimia yang terkandung dalam ekstrak etanol adalah golongan senyawa fenolik, alkaloid, flavonoid, steroid, alkaloid, antrakuinon, asam lemak dan terpenoid. Identifikasi komponen kimia fraksi heksana dengan analisis data GC-MS menunjukkan adanya 14 puncak. Senyawa yang teranalisis merupakan senyawa golongan seskuiterpenoid yaitu α-cubeben (1,03%), β-bourbonen (1,64%), β-elemen (2,26%), zingiberen (4,64%), trans-kariofilen (19,21%), β-farnesen (15,18%), β-seskuifelandren (8,1)%, β -humulen (6,83%), diepi α-cedren (5,6%), ar-kurkumen (9,93%), germakren-D (13,86%), metanoazulen (1,92%), α-copaen (6,04%) dan golongan diterpenoid yaitu neoptadien (3,78%).

3. Nilai uji banding fraksi heksana daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) terhadap B. cereus 4,7.10-3%, terhadap P. aeruginosa 6,61.10-3%, terhadap S. aureus 4,19.10-3% dan terhadap E. coli 3,51.10-3% dibandingkan dengan amoksisilin. Fraksi heksana memiliki potensi yang lebih baik untuk menghambat pertumbuhan bakteri P. aeruginosa > B. cereus > S. aureus > E. coli.

commit to user

B. Saran

1. Perlu dilakukan pemisahan fraksi heksana daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) beserta uji aktivitas antibakteri komponen utamanya.

2. Perlu dilakukan uji khasiat lain untuk mengetahui manfaat daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) secara ilmiah.