Macam - macam kromatografi Kering
Tugas Fitokimia
(macam-macam
kromatografi
Kelompok 11
Ani Hanifah 260110130101
Muhammad Nur Iqbal
260110130105
Alsya Utami Rahayu
260110130117
Kelas : Farmasi B 2013
Fakultas Farmasi
Universitas Padjadjaran
Nafrah Hayura Ivan
260110130143
BAB II
ISI
2.1 Definisi Kromatografi
Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran yang didasarkan atas perbedaan
distribusi dari komponen-komponen campuran tersebut diantara dua fase,yaitu fase diam dan
fase gerak.
Apabila fase diam berupa zat padat dikenal dengan istilah kromatografi penyerapan
(adsorption chromatography). Bila fase diam berupa zat cair, maka teknik ini
disebut
kromatografi pembagian (partition chromatography).
Ada dua fase dalam kromatografi, yaitu:
a.
Fasa diam (adsorben atau lapisan penyerap)
Bertindak sebagai pemisah campuran. Contoh pelrut yang digunakan adalah silika gel,
alumunium oksida, selulosa. Namun yamg paling banyak digunakan adalah slika gel dan
alumunium oksida karena kadar air yang digunakan berpengaruh nyata terhadap daya.
b.
Fasa gerak (Eluen)
Bertindak sebagai pembawa campuran. Komponen-komponen campuran akan bergerak
dengan kecepatan yang berbeda-beda akibat hambatan dari fase diam sehingga terjadi
pemisahaan.
2.2 Macam-macam Kromatografi
Berdasarkan teknik kerja yg digunakan, kromatografi ada bermacam-macam diantaranya
adalah Kromatografi lapis tipis, kromatografi kertas, kromatografi kolom, kromatografi cairvakum, dan kromatografi preparat
1
2.3 KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS
2.3.1 Teori Kromatografi Lapis Tipis
Kromatografi lapis tipis merupakan salah satu analisis kualitatif dari satu sampel yang
ingin dideteksi dengan memisahkan komponen-komponen sampel berdasarkan perbedaan
kepolaran.
Pelaksanaan kromatografi lapis tipis menggunakan sebuah silika atau alumina yang
seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam atau plastik yang keras. Gel silika atau alumina
meupakan fase diam. Fase diam untuk kromatografi lapis tipis seringkali mengandung substansi
yang mana dapat berpendar flour dalam sinar ultraviolet. Bahan adsorben sebagai fasa diam
dapat digunakan silika gel, alumina dan serbuk selulosa. Partikel silika gel mengandung
gugus hidroksil pada permukaannya yang akan membentuk ikatan hidrogen dengan molekul
polar air. Pada kromatografi lapis tipis, sebuah garis digambarkan dibagian atas dan bawah
lempengan dan setetes pelarut (fase gerak) dari campuran pewarna di tempatkan pada garis
yang telah ditentukan. Diberikan penandaan pada garis dilempengan untuk menunjukkan posisi
awal dari tetesan. Jika dilakukan dengan tinta, pewarna dari tinta akan bergerak selayaknya
kromatogram di bentuk.
Pada identifikasi noda atau penampakan noda, jika noda sudah bewarna dapat langsung
diperiksa dan ditentukan harga Rf. Rf merupakan nilai dari Jarak relatif f pada pelarut. Harga Rf
dihitung sebagai jarak yang ditempuh oleh komponen dibagi dengan jarak tempuh oleh eluen
(fase gerak) untuk setiap senyawa berlaku rumus sebagai berikut:
Rf = Jarak yang di tempuh komponen
Jarak yang ditempuh pelarut
Rf juga menyatakan derajat retensi suatu komponen dalam fase diam. Karena itu Rf juga disebut
faktor referensi.
Faktor yang mempengaruhi gerak dan harga Rf:
2
1. Sifat dari penyerap dan derajat aktivitas.
2.
Struktur kimia dari senyawa dipisahkan.
3.
Kerapan dari satu pasang penyerap.
4.
Pelarut (derajat kemurnian) fase bergerak.
Syarat-syarat pelarut yang diinginkan dalam KLT:
1.
Pelarut yang digunakan tergantung pada sifat zat yang akan dianalisa. Yang polar akan
larut pada pelarut polar.
2. Untuk komponen yang lebih polar.
Keuntungan KLT:
1
Waktu relatif singkat
2
Menggunakan inestasi yang kecil.
3
Paling cocok untuk analisis bahan alam dan obat.
4
Jumlah cuplikan yang dengan sedikit.
5
Kebutuhaan ruang minimum.
6
Penanganan sederhana.
7
Zat yang bersifat asam/basa kuat dapat dipisahkan dengan KLT.
Kelemahan KLT:
1
Hanya merupakan langkah awal untuk menentukan pelarut yang cocok dengan pada
kromatografi kolom
2
Noda yang terbetuk belum tentu senyawa murni.
2.3.2 Prinsip Kromatografi Lapis Tipis
Prinsip kerja dari kromatografi lapis tipis adalah dengan memisahkan sampel
berdasarkan perbedaan kepolaran antara sampel dengan pelarut yang digunakan.
3
2.3.3 Tahapan Kromatografi Lapis Tipis
Alat
1.
Plat KLT digunakan sebagai media pada noda
2.
Pipa kapiler digunakan sebagai alat untuk meneteskan hasil soklet pada KLT
3.
Chamber digunakan untuk tempat proses pendorongan noda oleh eluen
Bahan
1.
Hasil ekstrak soklet sebagai sampel yang akan di uji senyawanya
2.
Pelarut atau eluen digunakan untuk mendorong noda pada KLT
Tahapan
1. Fase diam ditempatkan pada penyangga berupa plat gelas, logam atau lapisan yang
cocok.
2. Campuran yang akan dipisah berupa larutan , ditotolkan berupa berupa bercak atau
pita (awal).
3. Setelah plat atau lapisan ditaruh didalam bejana/chamber tertutup rapat yang berisi
larutan pengembang yang cocok
4
4. Pemisahan terjadi selama perambatan kapiler. Karena pelarut bergerak lambat pada
lempengan, komponen-komponen yang berbeda dari campuran pewarna akan bergerak
pada kecepatan yang berbeda dan akan tampak sebagai perbedaan bercak warna.
2.4 KROMATOGRAFI KERTAS
2.4.1 Teori Kromatografi Kertas
Kromatografi kertas termasuk kromatografi cair-cair dengan kertas sebagai zat
pendukung (fase diam) karena kertas atau serat-serat selulosa merupakan adsorben lemah yang
hidrofil, adsorbs zat oleh kertas tidak terlalu kuat dan terdesak oleh air. Air atau bagian yang
lebih polar dari cairan yang di pakai sebagai eluen (fase gerak) akan berlaku sebagai fase
stasioner jadi kromatografi kertas dapat di golongkan sebagai jenis kromatografi cairan-cairan
dan mekanisme pemisahan yang dominan adalah partisi. Oleh gaya kapiler dari kertas, fase
mobil dapat bergerak naik, mendatar maupun menurun.
Eluen (pelarut, cairan pengelusi) pada kromatografi kertas biasanya merupakan
campuran 2 komponen atau lebih, yang berlaku sebagai fase mobil selanjutnya adalah bagian
campuran yang kurang polar.
Kromatografi kertas umumnya lebih bermanfaat untuk tujuan identifikasi, karena mudah
dan sederhana. Dalam kromatografi kertas perbandingan jarak rambat (di ukur sampai titik yang
5
memberikan intensitas maksimum pada bercak) suatu senyawa tertentu terhadap jarak rambat
fase gerak, di ukur dari titik penotolan, di nyatakan sebagai harga Rf suatu senyawa tersebut.
Harga Rf berubah sesuai dengan kondisi percobaan karena itu identifikasi sebaikanya di lakukan
dengan menggunakan baku pembanding yang sama dengan uji kromatogram yang sama. Jika zat
uji yang di identifikasi dan baku pembanding itu sama, terdapat kesesuaian dalam warna dan
harga Rf pada semua kromatogram dan kromatogram dari campuran menghasilkan harag Rf
adalah 1,0
2.4.2 Prinsip Kromatografi Kertas
Prinsip dasar kromatografi kertas adalah partisi multiplikatif suatu senyawa antara dua
cairan yang saling tidak bercampur. Jadi partisi suatu senyawa terjadi dalam pelarut yang
bergerak lambat pada kertas, komponen-komponen
bergerak pada laju yang berbeda dan
campuran dipisahkan berdasarkan pada perbedaan bercak warna.
2.4.3 Tahapan Kromatografi Kertas
Tahapan kromatografi kertas adalah sebagai berikut cuplikan yang mengandung
campuran yang akan dipisahkan diteteskan/diletakkan pada daerah yang diberi tanda di atas
sepotong kertas saring dimana ia akan meluas membentuk noda yang bulat. Bila noda telah
kering, kertas dimasukkan dalam bejana tertutup yang sesuai dengan satu ujung, dimana tetesan
cuplikan ditempatkan, tercelup dalam pelarut yang dipilih sebagai fasa bergerak (jangan sampai
noda tercelup karena berarti senyawa yang akan dipisahkan akan terlarut dari kertas).
Pelarut bergerak melalui serat dari kertas oleh gaya kapiler dan menggerakkan komponen
dari campuran cuplikan pada perbedaan jarak dalam arah aliran pelarut. Bila permukaan pelarut
telah bergerak sampai jarak yang cukup jauhnya atau setelah waktu yang telah ditentukan, kertas
diambil dari bejana dan kedudukan dari permukaan pelarut diberi tanda dan lembaran kertas
dibiarkan kering. Jika senyawa-senyawa berwarna maka mereka akan terlihat sebagai pita atau
noda yang terpisah. Jika senyawa tidak berwarna harus dideteksi dengan cara fisika dan kimia.
Yaitu dengan menggunakan suatu pereaksi-pereaksi yang memberikan sebuah warna terhadap
beberapa atau semua dari senyawa-senyawa. Bila daerah dari noda yang terpisah telah dideteksi,
maka perlu mengidentifikasi tiap individu dari senyawa. Metoda identifikasi yang paling mudah
6
adalah berdasarkan pada kedudukan dari noda relatif terhadap permukaan pelarut, menggunakan
harga Rf.
Misalnya memisahkan (mengidentifikasi) zat warna pada tinta berwarna hitam.
Tinta berwarna hitam ini merupakan campuran dari berbagai macam zat yang berwarna.
Cara mengidentifikasinya adalah sampel tinta diteteskan pada kertas saring yang telah
diberi tanda garis dengan pensil sebagai titik awal. Kertas saring (sebagai fasa diam)
kemudian ditempatkan di dalam gelas beaker yang telah berisi pelarut (sebagai fasa
gerak), misalnya aseton. Pelarut tidak boleh mengenai sampel tinta.
Pelarut akan meresap pada kertas saring dan bergerak naik, kemudian memisahkan tinta
menjadi beberapa zat warna. Zat warna yang paling mudah larut dalam fase gerak akan
bergerak lebih cepat ke atas daripada zat warna yang terabsorb kuat pada fase diam.
Setelah fase gerak mencapai bagian atas, kertas saring kemudian dapat diambil dan
dikeringkan, menghasilkan kromatogram.
2.5 KROMATOGRAFI KOLOM
2.5.1 Teori Kromatografi Kolom
Kromatografi kolom adalah kromatografi yang menggunakan kolom sebagai alat untuk
memisahkan komponen-komponen dalam campuran.
Kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok:
7
a. Kolom analitik : garis tengah dalam 2 – 6 nm. Panjang bergantung pada jenis
kemasan,untuk kemasan pelikel biasanya panjang kolom 50 – 100 cm. Untuk kemasan
mikropartikel berpori, biasanya 10 – 30 cm;
b. Kolom preparatif : umumnya bergaris tengah 6 mm atau lebih besar dan panjang
kolom 25 – 100 cm.
Pembagian fase dalam kromatografi kolom:
1. Fasa diam
Fasa diam yang digunakan dalam kromatografi kolom adalah suatu adsorben
padat. Biasanya berupa silika gel atau alumina. Dahulu juga sering digunakan bubuk
selulosa. Fasa diam berbentuk serbuk microporus untuk meningkatkan luas permukaan.
2. Fasa gerak
Fasa gerak atau eluen adalah campuran cairan murni. Eluen dipilih sedemikian
rupa sehingga faktor retensi senyawa berkisar antara 0,2-0,3 supaya meminimalisir
penggunaan waktu dan jumlah eluen melewati kolom. Jenis eluen yang digunakan dapat
dicoba terlebih dahulu menggunakan kromatografi lapis tipis. Setelah dirasa cocok, eluen
yang sama digunakan untuk mengelusi komponen dalam kolom.
Metode kromatografi kolom:
1. Metode kering
Pada metode kering kolom diisi dengan fasa diam kering, diikuti dengan penambahan
fasa gerak yang disiramkan pada kolom sampai benar-benar basah.
2. Metode basah
Pada metode basah bubur (slurry) disiapkan dengan mencampurkan eluen pada serbuk
fasa diam dan dimasukkan secara hati-hati pada kolom. Dalam langkah ini harus benarbenar hati-hati supaya tidak ada gelembung udara. Larutan senyawa organik dipipet di
bagian atas fasa diam, kemudian eluen dituangkan pelan-pelan melewati kolom.
Pembagian Kromatografi Kolom:
1.
Kromatografi Fase Normal
Kromatografi dengan kolom yang fase diamnya bersifat polar, misalnya silika gel,
alumina, sedangkan fase geraknya bersifat non polar seperti heksan.
8
2.
Kromatografi Fase Terbalik
Pada kromatografi fase terbalik, fase diamnya bersifat non polar, yang banyak dipakai
adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan oktilsilan (C8). Sedangkan fase geraknya
bersifat polar, seperti air, metanol dan asetonitril
2.5.2 Prinsip Kromatografi Kolom
Prinsip dari kromatografi kolom adalah adsorpsi dan partisi. Adsorpsi adalah
mekanisme berupa komponen sample secara selektif diadsorpsi oleh permukaan fasa diam.
Partisi adalah mekanisme berupa komponen sample secara selektif terpartisi antara eluen dan
lap. Cair tipis yang terikat pada padatan pendukung inert.
2.5.3 Tahapan Kromatografi Kolom
Tahapan kromatografi kolom adalah sebagai berikut: Komponen tunggal ditahan pada fasa
diam berupa adorben karena telah terikat. Ketika eluen dialirkan, maka senyawa akan melakukan
migrasi, terbawa oleh eluen sesuai dengan kesesuaian kepolaran. Masing-masing senyawa dalam
komponen mempunyai kecepatan yang berbeda-beda dalam melewati kolom. Selama proses
berlangsung, akan didapatkan beberapa fraksi. Masing-masing fraksi kemungkinan mengandung
senyawa yang berbeda. Untuk mengujinya, fraksi hasil kromatografi kolom dapat diamati
menggunakan KLT. Fraksi dengan Rf yang mirip, kemungkinan mengandung senyawa yang
sama. Fraksi dapat diamati leih lanjut menggunakan spektroskopi.
Gambar kromatografi kolom
9
2.6 KROMATOGRAFI CAIR – VAKUM
2.6.1 Teori Kromatografi Cair-Vakum
Kromatografi vakum cair merupakan salah satu jenis dari kromatografi kolom.
Kromatografi kolom merupakan suatu metode pemisahan campuran larutan dengan
perbandingan pelarut dan kerapatan dengan menggunakan bahan kolom. Kromatografi kolom
lazim digunakan untuk pemisahan dan pemurnian senyawa .
Kromatografi vakum cair dilakukan untuk memisahkan golongan senyawa metabolit
sekunder secara kasar dengan menggunakan silika gel sebagai absorben dan berbagai
perbandingan pelarut n-heksana : etil asetat : metanol (elusi gradien) dan menggunakan
pompa vakum untuk memudahkan penarikan eluen .
Beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam pengerjaan kromatografi kolom vakum cair
meliputi :
Biasanya jenis adsorben digunakan silika gel F60. Adsorban ini cocok untuk fraksinasi
senyawa yang terdapat pada ekstrak nonpolar atau semipolar, tetapi tidak cocok untuk komponen
senyawa yang polar karena senyawa tersebut akan diikat kuat oleh adsorben .
Digunakan corong G3 dalam pembuatan kolom. corong ini diisi dengan adsorben sampai
setinggi 2,5 cm, kemudian bagian luar corong diketuk-ketuk dengan jari sambil dihisap dengan
pompa vakum dan permukaan diratakan.
Pelarut yang digunakan adalah pelarut organik tertentu yang mudah menguap yaitu
umumnya untuk ekstrak nonpolar digunakan eter minyak bumi, sedangkan untuk ekstrak polar
digunakan metil klorida atau kloroform .
Pengelusian dan penampungan fraksi. Pengelusian diawali dengan komposisi pelarut yang
nonpolar, kemudian dilanjutkan komposisi pelarut berdasarkan yang meningkat. Jumlah pelarut
yang digunakan setiap kali elusi harus dapat membasahi isi kolom (Kusmardiyani dan Nawawi,
1992).
Kromatografi Vakum Cair mempunyai keuntungan yang utama dibandingkan
dengan kolom konvensional yaitu :
1. Konsumsi fase gerak KCV hanya 80% atau lebih kecil dibanding
dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan
alir fase gerak lebih lambat (10-100μl/menit)
10
2. Adanya aliran fase gerak lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih
ideal jika digabung dengan spectrometer massa
2.6.2 Prinsip Kromatografi Cair-Vakum
Prinsip dari kromatografi vakum cair adalah untuk pemisahan komponen senyawa yang
terkandung dalam suatu ekstrak kedalam beberapa fraksi berdasarkan kepolaran .
2.6.3 Tahapan Kromatografi Cair-Vakum
Adapun cara kerja kromatografi cair vakum yaitu kolom kromatografi dikemas kering
(biasanya dengan penjerap mutu KLT 10-40 μm) dalam keadaan vakum agar diperoleh kerapatan
kemasan maksimum. Vakum dihentikan, pelarut yang kepolarannya rendah dituangkan ke
permukaan penjerap lalu divakumkan lagi. Kolom dipisah sampai kering dan sekarang siap
dipakai .
Gambar kromatografi volum
11
2.7 KROMATOGRAFI PREPARATIF
2.7.1 Teori Kromatografi Preparatif
Kromatografi mungkin preparatif atau analitis. Tujuan dari kromatografi preparatif
adalah untuk memisahkan komponen campuran untuk digunakan lebih lanjut (dan dengan
demikian suatu bentuk pemurnian). Analisis kromatografi dilakukan biasanya dengan jumlah
yang lebih kecil bahan dan untuk mengukur proporsi relatif dari analit dalam campuran.
Keduanya tidak saling eksklusif.
Pada kromatografi preparative, proses isolasi yang terjadi berdasarkan perbedaan daya
serap dan daya partisi serta kelarutan dari komponen-komponen kimia yang akan bergerak
mengikuti kepolaran eluen, oleh karena daya serap adsorben terhadap komponen kimia tidak
sama, maka komponen bergerak dengan kecepatan yang berbeda sehingga hal inilah yang
menyebabkan pemisahan. Kromatografi preparatif hanya dilakukan jika diperlukan fraksi murni
dari campuran
2.7.3 Prinsip Kromatografi Preparatif
Prinsip kromatografi preparatif adalah memurnikan jumlah senyawa yang cukup dari
bahan untuk digunakan lebih lanjut.
2.7.4 Tahapan Kromatografi Preparatif
Komponen tunggal ditahan pada fasa diam berupa adorben karena telah terikat. Ketika
eluen dialirkan, maka senyawa akan melakukan migrasi, terbawa oleh eluen sesuai dengan
kesesuaian kepolaran. Masing-masing senyawa dalam komponen mempunyai kecepatan yang
berbeda-beda dalam melewati kolom. Selama proses berlangsung, akan didapatkan beberapa
fraksi. Masing-masing fraksi kemungkinan mengandung senyawa yang berbeda. Untuk
mengujinya, fraksi hasil kromatografi kolom dapat diamati menggunakan KLT. Fraksi dengan
Rf yang mirip, kemungkinan mengandung senyawa yang sama. Fraksi dapat diamati leih lanjut
menggunakan spektroskopi.
12
Daftar Pustaka
Anonim. 2011. Tersedia online di repository.usu.ac.id/bitstream/123456789/28697/4/Chapter
%20II.pdf [Diakses pada 24/02/2015]
Anonim. 2011. Tersedia online di staff.uny.ac.id/sites/...Si./PPT-KA%20II-KROM.KOLOMSUSI.pdf [Diakses pada 24/02/2015]
Anonim.
2013.
Kromatografi
Kolom.
Tersedia
online
di
http://www.ilmukimia.org/2013/05/kromatografi-kolom.html [Diakses pada 24/02/2015]
Erma,
Yunita.
2012.
Isolasi
Flavonoid.
Tersedia
online
di
http://yunitaerma.blogspot.com/2012/02/isolasi-flavonoid.html [Diakses pada 24/02/2015]
Nadjeb.
2009.
Kromatografi.
Tersedia
online
di
https://nadjeeb.files.wordpress.com/2009/10/kromatografi.pdf [Diakses pada 24/02/2015]
Underwood. 1998. Analisis Kimia Kuantitatif. Jakarta: Erlangga
13
(macam-macam
kromatografi
Kelompok 11
Ani Hanifah 260110130101
Muhammad Nur Iqbal
260110130105
Alsya Utami Rahayu
260110130117
Kelas : Farmasi B 2013
Fakultas Farmasi
Universitas Padjadjaran
Nafrah Hayura Ivan
260110130143
BAB II
ISI
2.1 Definisi Kromatografi
Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran yang didasarkan atas perbedaan
distribusi dari komponen-komponen campuran tersebut diantara dua fase,yaitu fase diam dan
fase gerak.
Apabila fase diam berupa zat padat dikenal dengan istilah kromatografi penyerapan
(adsorption chromatography). Bila fase diam berupa zat cair, maka teknik ini
disebut
kromatografi pembagian (partition chromatography).
Ada dua fase dalam kromatografi, yaitu:
a.
Fasa diam (adsorben atau lapisan penyerap)
Bertindak sebagai pemisah campuran. Contoh pelrut yang digunakan adalah silika gel,
alumunium oksida, selulosa. Namun yamg paling banyak digunakan adalah slika gel dan
alumunium oksida karena kadar air yang digunakan berpengaruh nyata terhadap daya.
b.
Fasa gerak (Eluen)
Bertindak sebagai pembawa campuran. Komponen-komponen campuran akan bergerak
dengan kecepatan yang berbeda-beda akibat hambatan dari fase diam sehingga terjadi
pemisahaan.
2.2 Macam-macam Kromatografi
Berdasarkan teknik kerja yg digunakan, kromatografi ada bermacam-macam diantaranya
adalah Kromatografi lapis tipis, kromatografi kertas, kromatografi kolom, kromatografi cairvakum, dan kromatografi preparat
1
2.3 KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS
2.3.1 Teori Kromatografi Lapis Tipis
Kromatografi lapis tipis merupakan salah satu analisis kualitatif dari satu sampel yang
ingin dideteksi dengan memisahkan komponen-komponen sampel berdasarkan perbedaan
kepolaran.
Pelaksanaan kromatografi lapis tipis menggunakan sebuah silika atau alumina yang
seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam atau plastik yang keras. Gel silika atau alumina
meupakan fase diam. Fase diam untuk kromatografi lapis tipis seringkali mengandung substansi
yang mana dapat berpendar flour dalam sinar ultraviolet. Bahan adsorben sebagai fasa diam
dapat digunakan silika gel, alumina dan serbuk selulosa. Partikel silika gel mengandung
gugus hidroksil pada permukaannya yang akan membentuk ikatan hidrogen dengan molekul
polar air. Pada kromatografi lapis tipis, sebuah garis digambarkan dibagian atas dan bawah
lempengan dan setetes pelarut (fase gerak) dari campuran pewarna di tempatkan pada garis
yang telah ditentukan. Diberikan penandaan pada garis dilempengan untuk menunjukkan posisi
awal dari tetesan. Jika dilakukan dengan tinta, pewarna dari tinta akan bergerak selayaknya
kromatogram di bentuk.
Pada identifikasi noda atau penampakan noda, jika noda sudah bewarna dapat langsung
diperiksa dan ditentukan harga Rf. Rf merupakan nilai dari Jarak relatif f pada pelarut. Harga Rf
dihitung sebagai jarak yang ditempuh oleh komponen dibagi dengan jarak tempuh oleh eluen
(fase gerak) untuk setiap senyawa berlaku rumus sebagai berikut:
Rf = Jarak yang di tempuh komponen
Jarak yang ditempuh pelarut
Rf juga menyatakan derajat retensi suatu komponen dalam fase diam. Karena itu Rf juga disebut
faktor referensi.
Faktor yang mempengaruhi gerak dan harga Rf:
2
1. Sifat dari penyerap dan derajat aktivitas.
2.
Struktur kimia dari senyawa dipisahkan.
3.
Kerapan dari satu pasang penyerap.
4.
Pelarut (derajat kemurnian) fase bergerak.
Syarat-syarat pelarut yang diinginkan dalam KLT:
1.
Pelarut yang digunakan tergantung pada sifat zat yang akan dianalisa. Yang polar akan
larut pada pelarut polar.
2. Untuk komponen yang lebih polar.
Keuntungan KLT:
1
Waktu relatif singkat
2
Menggunakan inestasi yang kecil.
3
Paling cocok untuk analisis bahan alam dan obat.
4
Jumlah cuplikan yang dengan sedikit.
5
Kebutuhaan ruang minimum.
6
Penanganan sederhana.
7
Zat yang bersifat asam/basa kuat dapat dipisahkan dengan KLT.
Kelemahan KLT:
1
Hanya merupakan langkah awal untuk menentukan pelarut yang cocok dengan pada
kromatografi kolom
2
Noda yang terbetuk belum tentu senyawa murni.
2.3.2 Prinsip Kromatografi Lapis Tipis
Prinsip kerja dari kromatografi lapis tipis adalah dengan memisahkan sampel
berdasarkan perbedaan kepolaran antara sampel dengan pelarut yang digunakan.
3
2.3.3 Tahapan Kromatografi Lapis Tipis
Alat
1.
Plat KLT digunakan sebagai media pada noda
2.
Pipa kapiler digunakan sebagai alat untuk meneteskan hasil soklet pada KLT
3.
Chamber digunakan untuk tempat proses pendorongan noda oleh eluen
Bahan
1.
Hasil ekstrak soklet sebagai sampel yang akan di uji senyawanya
2.
Pelarut atau eluen digunakan untuk mendorong noda pada KLT
Tahapan
1. Fase diam ditempatkan pada penyangga berupa plat gelas, logam atau lapisan yang
cocok.
2. Campuran yang akan dipisah berupa larutan , ditotolkan berupa berupa bercak atau
pita (awal).
3. Setelah plat atau lapisan ditaruh didalam bejana/chamber tertutup rapat yang berisi
larutan pengembang yang cocok
4
4. Pemisahan terjadi selama perambatan kapiler. Karena pelarut bergerak lambat pada
lempengan, komponen-komponen yang berbeda dari campuran pewarna akan bergerak
pada kecepatan yang berbeda dan akan tampak sebagai perbedaan bercak warna.
2.4 KROMATOGRAFI KERTAS
2.4.1 Teori Kromatografi Kertas
Kromatografi kertas termasuk kromatografi cair-cair dengan kertas sebagai zat
pendukung (fase diam) karena kertas atau serat-serat selulosa merupakan adsorben lemah yang
hidrofil, adsorbs zat oleh kertas tidak terlalu kuat dan terdesak oleh air. Air atau bagian yang
lebih polar dari cairan yang di pakai sebagai eluen (fase gerak) akan berlaku sebagai fase
stasioner jadi kromatografi kertas dapat di golongkan sebagai jenis kromatografi cairan-cairan
dan mekanisme pemisahan yang dominan adalah partisi. Oleh gaya kapiler dari kertas, fase
mobil dapat bergerak naik, mendatar maupun menurun.
Eluen (pelarut, cairan pengelusi) pada kromatografi kertas biasanya merupakan
campuran 2 komponen atau lebih, yang berlaku sebagai fase mobil selanjutnya adalah bagian
campuran yang kurang polar.
Kromatografi kertas umumnya lebih bermanfaat untuk tujuan identifikasi, karena mudah
dan sederhana. Dalam kromatografi kertas perbandingan jarak rambat (di ukur sampai titik yang
5
memberikan intensitas maksimum pada bercak) suatu senyawa tertentu terhadap jarak rambat
fase gerak, di ukur dari titik penotolan, di nyatakan sebagai harga Rf suatu senyawa tersebut.
Harga Rf berubah sesuai dengan kondisi percobaan karena itu identifikasi sebaikanya di lakukan
dengan menggunakan baku pembanding yang sama dengan uji kromatogram yang sama. Jika zat
uji yang di identifikasi dan baku pembanding itu sama, terdapat kesesuaian dalam warna dan
harga Rf pada semua kromatogram dan kromatogram dari campuran menghasilkan harag Rf
adalah 1,0
2.4.2 Prinsip Kromatografi Kertas
Prinsip dasar kromatografi kertas adalah partisi multiplikatif suatu senyawa antara dua
cairan yang saling tidak bercampur. Jadi partisi suatu senyawa terjadi dalam pelarut yang
bergerak lambat pada kertas, komponen-komponen
bergerak pada laju yang berbeda dan
campuran dipisahkan berdasarkan pada perbedaan bercak warna.
2.4.3 Tahapan Kromatografi Kertas
Tahapan kromatografi kertas adalah sebagai berikut cuplikan yang mengandung
campuran yang akan dipisahkan diteteskan/diletakkan pada daerah yang diberi tanda di atas
sepotong kertas saring dimana ia akan meluas membentuk noda yang bulat. Bila noda telah
kering, kertas dimasukkan dalam bejana tertutup yang sesuai dengan satu ujung, dimana tetesan
cuplikan ditempatkan, tercelup dalam pelarut yang dipilih sebagai fasa bergerak (jangan sampai
noda tercelup karena berarti senyawa yang akan dipisahkan akan terlarut dari kertas).
Pelarut bergerak melalui serat dari kertas oleh gaya kapiler dan menggerakkan komponen
dari campuran cuplikan pada perbedaan jarak dalam arah aliran pelarut. Bila permukaan pelarut
telah bergerak sampai jarak yang cukup jauhnya atau setelah waktu yang telah ditentukan, kertas
diambil dari bejana dan kedudukan dari permukaan pelarut diberi tanda dan lembaran kertas
dibiarkan kering. Jika senyawa-senyawa berwarna maka mereka akan terlihat sebagai pita atau
noda yang terpisah. Jika senyawa tidak berwarna harus dideteksi dengan cara fisika dan kimia.
Yaitu dengan menggunakan suatu pereaksi-pereaksi yang memberikan sebuah warna terhadap
beberapa atau semua dari senyawa-senyawa. Bila daerah dari noda yang terpisah telah dideteksi,
maka perlu mengidentifikasi tiap individu dari senyawa. Metoda identifikasi yang paling mudah
6
adalah berdasarkan pada kedudukan dari noda relatif terhadap permukaan pelarut, menggunakan
harga Rf.
Misalnya memisahkan (mengidentifikasi) zat warna pada tinta berwarna hitam.
Tinta berwarna hitam ini merupakan campuran dari berbagai macam zat yang berwarna.
Cara mengidentifikasinya adalah sampel tinta diteteskan pada kertas saring yang telah
diberi tanda garis dengan pensil sebagai titik awal. Kertas saring (sebagai fasa diam)
kemudian ditempatkan di dalam gelas beaker yang telah berisi pelarut (sebagai fasa
gerak), misalnya aseton. Pelarut tidak boleh mengenai sampel tinta.
Pelarut akan meresap pada kertas saring dan bergerak naik, kemudian memisahkan tinta
menjadi beberapa zat warna. Zat warna yang paling mudah larut dalam fase gerak akan
bergerak lebih cepat ke atas daripada zat warna yang terabsorb kuat pada fase diam.
Setelah fase gerak mencapai bagian atas, kertas saring kemudian dapat diambil dan
dikeringkan, menghasilkan kromatogram.
2.5 KROMATOGRAFI KOLOM
2.5.1 Teori Kromatografi Kolom
Kromatografi kolom adalah kromatografi yang menggunakan kolom sebagai alat untuk
memisahkan komponen-komponen dalam campuran.
Kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok:
7
a. Kolom analitik : garis tengah dalam 2 – 6 nm. Panjang bergantung pada jenis
kemasan,untuk kemasan pelikel biasanya panjang kolom 50 – 100 cm. Untuk kemasan
mikropartikel berpori, biasanya 10 – 30 cm;
b. Kolom preparatif : umumnya bergaris tengah 6 mm atau lebih besar dan panjang
kolom 25 – 100 cm.
Pembagian fase dalam kromatografi kolom:
1. Fasa diam
Fasa diam yang digunakan dalam kromatografi kolom adalah suatu adsorben
padat. Biasanya berupa silika gel atau alumina. Dahulu juga sering digunakan bubuk
selulosa. Fasa diam berbentuk serbuk microporus untuk meningkatkan luas permukaan.
2. Fasa gerak
Fasa gerak atau eluen adalah campuran cairan murni. Eluen dipilih sedemikian
rupa sehingga faktor retensi senyawa berkisar antara 0,2-0,3 supaya meminimalisir
penggunaan waktu dan jumlah eluen melewati kolom. Jenis eluen yang digunakan dapat
dicoba terlebih dahulu menggunakan kromatografi lapis tipis. Setelah dirasa cocok, eluen
yang sama digunakan untuk mengelusi komponen dalam kolom.
Metode kromatografi kolom:
1. Metode kering
Pada metode kering kolom diisi dengan fasa diam kering, diikuti dengan penambahan
fasa gerak yang disiramkan pada kolom sampai benar-benar basah.
2. Metode basah
Pada metode basah bubur (slurry) disiapkan dengan mencampurkan eluen pada serbuk
fasa diam dan dimasukkan secara hati-hati pada kolom. Dalam langkah ini harus benarbenar hati-hati supaya tidak ada gelembung udara. Larutan senyawa organik dipipet di
bagian atas fasa diam, kemudian eluen dituangkan pelan-pelan melewati kolom.
Pembagian Kromatografi Kolom:
1.
Kromatografi Fase Normal
Kromatografi dengan kolom yang fase diamnya bersifat polar, misalnya silika gel,
alumina, sedangkan fase geraknya bersifat non polar seperti heksan.
8
2.
Kromatografi Fase Terbalik
Pada kromatografi fase terbalik, fase diamnya bersifat non polar, yang banyak dipakai
adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan oktilsilan (C8). Sedangkan fase geraknya
bersifat polar, seperti air, metanol dan asetonitril
2.5.2 Prinsip Kromatografi Kolom
Prinsip dari kromatografi kolom adalah adsorpsi dan partisi. Adsorpsi adalah
mekanisme berupa komponen sample secara selektif diadsorpsi oleh permukaan fasa diam.
Partisi adalah mekanisme berupa komponen sample secara selektif terpartisi antara eluen dan
lap. Cair tipis yang terikat pada padatan pendukung inert.
2.5.3 Tahapan Kromatografi Kolom
Tahapan kromatografi kolom adalah sebagai berikut: Komponen tunggal ditahan pada fasa
diam berupa adorben karena telah terikat. Ketika eluen dialirkan, maka senyawa akan melakukan
migrasi, terbawa oleh eluen sesuai dengan kesesuaian kepolaran. Masing-masing senyawa dalam
komponen mempunyai kecepatan yang berbeda-beda dalam melewati kolom. Selama proses
berlangsung, akan didapatkan beberapa fraksi. Masing-masing fraksi kemungkinan mengandung
senyawa yang berbeda. Untuk mengujinya, fraksi hasil kromatografi kolom dapat diamati
menggunakan KLT. Fraksi dengan Rf yang mirip, kemungkinan mengandung senyawa yang
sama. Fraksi dapat diamati leih lanjut menggunakan spektroskopi.
Gambar kromatografi kolom
9
2.6 KROMATOGRAFI CAIR – VAKUM
2.6.1 Teori Kromatografi Cair-Vakum
Kromatografi vakum cair merupakan salah satu jenis dari kromatografi kolom.
Kromatografi kolom merupakan suatu metode pemisahan campuran larutan dengan
perbandingan pelarut dan kerapatan dengan menggunakan bahan kolom. Kromatografi kolom
lazim digunakan untuk pemisahan dan pemurnian senyawa .
Kromatografi vakum cair dilakukan untuk memisahkan golongan senyawa metabolit
sekunder secara kasar dengan menggunakan silika gel sebagai absorben dan berbagai
perbandingan pelarut n-heksana : etil asetat : metanol (elusi gradien) dan menggunakan
pompa vakum untuk memudahkan penarikan eluen .
Beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam pengerjaan kromatografi kolom vakum cair
meliputi :
Biasanya jenis adsorben digunakan silika gel F60. Adsorban ini cocok untuk fraksinasi
senyawa yang terdapat pada ekstrak nonpolar atau semipolar, tetapi tidak cocok untuk komponen
senyawa yang polar karena senyawa tersebut akan diikat kuat oleh adsorben .
Digunakan corong G3 dalam pembuatan kolom. corong ini diisi dengan adsorben sampai
setinggi 2,5 cm, kemudian bagian luar corong diketuk-ketuk dengan jari sambil dihisap dengan
pompa vakum dan permukaan diratakan.
Pelarut yang digunakan adalah pelarut organik tertentu yang mudah menguap yaitu
umumnya untuk ekstrak nonpolar digunakan eter minyak bumi, sedangkan untuk ekstrak polar
digunakan metil klorida atau kloroform .
Pengelusian dan penampungan fraksi. Pengelusian diawali dengan komposisi pelarut yang
nonpolar, kemudian dilanjutkan komposisi pelarut berdasarkan yang meningkat. Jumlah pelarut
yang digunakan setiap kali elusi harus dapat membasahi isi kolom (Kusmardiyani dan Nawawi,
1992).
Kromatografi Vakum Cair mempunyai keuntungan yang utama dibandingkan
dengan kolom konvensional yaitu :
1. Konsumsi fase gerak KCV hanya 80% atau lebih kecil dibanding
dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan
alir fase gerak lebih lambat (10-100μl/menit)
10
2. Adanya aliran fase gerak lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih
ideal jika digabung dengan spectrometer massa
2.6.2 Prinsip Kromatografi Cair-Vakum
Prinsip dari kromatografi vakum cair adalah untuk pemisahan komponen senyawa yang
terkandung dalam suatu ekstrak kedalam beberapa fraksi berdasarkan kepolaran .
2.6.3 Tahapan Kromatografi Cair-Vakum
Adapun cara kerja kromatografi cair vakum yaitu kolom kromatografi dikemas kering
(biasanya dengan penjerap mutu KLT 10-40 μm) dalam keadaan vakum agar diperoleh kerapatan
kemasan maksimum. Vakum dihentikan, pelarut yang kepolarannya rendah dituangkan ke
permukaan penjerap lalu divakumkan lagi. Kolom dipisah sampai kering dan sekarang siap
dipakai .
Gambar kromatografi volum
11
2.7 KROMATOGRAFI PREPARATIF
2.7.1 Teori Kromatografi Preparatif
Kromatografi mungkin preparatif atau analitis. Tujuan dari kromatografi preparatif
adalah untuk memisahkan komponen campuran untuk digunakan lebih lanjut (dan dengan
demikian suatu bentuk pemurnian). Analisis kromatografi dilakukan biasanya dengan jumlah
yang lebih kecil bahan dan untuk mengukur proporsi relatif dari analit dalam campuran.
Keduanya tidak saling eksklusif.
Pada kromatografi preparative, proses isolasi yang terjadi berdasarkan perbedaan daya
serap dan daya partisi serta kelarutan dari komponen-komponen kimia yang akan bergerak
mengikuti kepolaran eluen, oleh karena daya serap adsorben terhadap komponen kimia tidak
sama, maka komponen bergerak dengan kecepatan yang berbeda sehingga hal inilah yang
menyebabkan pemisahan. Kromatografi preparatif hanya dilakukan jika diperlukan fraksi murni
dari campuran
2.7.3 Prinsip Kromatografi Preparatif
Prinsip kromatografi preparatif adalah memurnikan jumlah senyawa yang cukup dari
bahan untuk digunakan lebih lanjut.
2.7.4 Tahapan Kromatografi Preparatif
Komponen tunggal ditahan pada fasa diam berupa adorben karena telah terikat. Ketika
eluen dialirkan, maka senyawa akan melakukan migrasi, terbawa oleh eluen sesuai dengan
kesesuaian kepolaran. Masing-masing senyawa dalam komponen mempunyai kecepatan yang
berbeda-beda dalam melewati kolom. Selama proses berlangsung, akan didapatkan beberapa
fraksi. Masing-masing fraksi kemungkinan mengandung senyawa yang berbeda. Untuk
mengujinya, fraksi hasil kromatografi kolom dapat diamati menggunakan KLT. Fraksi dengan
Rf yang mirip, kemungkinan mengandung senyawa yang sama. Fraksi dapat diamati leih lanjut
menggunakan spektroskopi.
12
Daftar Pustaka
Anonim. 2011. Tersedia online di repository.usu.ac.id/bitstream/123456789/28697/4/Chapter
%20II.pdf [Diakses pada 24/02/2015]
Anonim. 2011. Tersedia online di staff.uny.ac.id/sites/...Si./PPT-KA%20II-KROM.KOLOMSUSI.pdf [Diakses pada 24/02/2015]
Anonim.
2013.
Kromatografi
Kolom.
Tersedia
online
di
http://www.ilmukimia.org/2013/05/kromatografi-kolom.html [Diakses pada 24/02/2015]
Erma,
Yunita.
2012.
Isolasi
Flavonoid.
Tersedia
online
di
http://yunitaerma.blogspot.com/2012/02/isolasi-flavonoid.html [Diakses pada 24/02/2015]
Nadjeb.
2009.
Kromatografi.
Tersedia
online
di
https://nadjeeb.files.wordpress.com/2009/10/kromatografi.pdf [Diakses pada 24/02/2015]
Underwood. 1998. Analisis Kimia Kuantitatif. Jakarta: Erlangga
13