BAHAN DAN METODE Infeksi Buatan dengan Vibrio Berpendar Patogen

  Jurnal Riset Akuakult ur, 11 (4), 2016, 363-371

Tersedia online di: ht t p://ej ournal-balit bang.kkp.go.id/index.php/j ra

  

SENSITIVITAS DETEKSI PENYAKIT VIBRIOSIS PADA UDANG PENAEID DENGAN

PENANDA M OLEKULER SPESIFIK HAEM OLYSIN (IAVh)

_#

Ince Ayu Khairana Kadriah , Koko Kurniawan, Endang Susianingsih, dan M uharijadi At mom arsono

  

Balai Penelitian dan Pen gembangan Bu didaya Air Payau

ABSTRAK

Pen yakit vib riosis pada bu didaya ud an g d ap at m e nyeb ab kan p en uru nan pro du ksi yan g cu ku p b esar.

  

Metode deteksi cepat akan sangat membantu dalam penanganan dan pencegahan awal untuk mengurangi

kematian udang. Upaya untuk deteksi cepat adalah dengan menggunakan penanda molekular yang spesifik.

Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengukur sensitivitas metode deteksi vibriosis pada udang penaeid

(windu dan vaname) menggunakan penanda m olekuler spesifik haemolysin (IAVh). Pengujian dilakukan

untuk sampel udang yang diinfeksi buatan melalui injeksi maupun pada sampel yang dikoleksi dari tambak

udang. Sampel organ udang hasil infeksi buatan ditanam pada media TCBSA untuk melihat koloni bakteri

yang tumbuh. Selanjutnya koloni bakteri tersebut diuji secara biokimia dan molekuler. Deteksi vibriosis

untuk sampel dari tambak budidaya hanya dilakukan secara molekuler menggunakan primer spesifik IAVh.

Lokasi pengambilan sampel udang dari Provinsi Sulawesi Selatan (Kabupaten Takalar, Kabupaten Maros,

Kabupaten Pangkep, Kabupaten Bulukumba, Kabupaten Barru, dan Kabupaten Pinrang), Provinsi Lampung

(De sa Bakau he n i d an Kaliand a), Pro vin si Jawa Tim ur (Kabu pat en Situ b on do ) d an Pro vin si Jawa Barat

(Kabupaten Karawang). Hasil uji biokimia untuk sampel dengan infeksi buatan dapat menentukan spesies

bakteri, namun waktu yang diperlukan relatif lama. Hasil uji menggunakan penanda molekuler haemolysin

_{2 3} IAVh dapat secara spesifik mendeteksi vibrio patogen pada kepadatan bakteri 10 –10 CFU/mL dari organ udang, baik pada sampel hasil infeksi buatan maupun pada sampel dari tambak.

  KATA KUNCI: deteksi cepat; haemolysin ; uji biokimiawi udang penaeid; vibriosis

ABSTRACT: Sensitivity of the specific molecular marker of haemolysin (IAVh) for vibriosis detection on black

tiger shrimp. By: Ince Ayu Khairana Kadriah, Koko Kurniawan, Endang Susianingsih, and M uharijadi

  At momarsono

  V

ibriosis disease may cause a significant production losses in shrimp culture. The rapid detection met hod will be be very

effect ive as earlier prevent ive measures t o avoid mass mort alit y of shrimp. Effort for t he rapid det ect ion was done by

specific molecular marker. The aim of t his research was t o evaluat e t he sensit ivit y of t he specific molecular marker of

haemolysin (IAVh) for vibriosis det ect ion. Vibriosis det ect ion was carried-out for bot h nat urally infect ed shrimp and

art ificially infect ed t hrough inject ion. Several organs of art ificially-infect ed shrimp grown on TCBS media t o find

ident ify colonies of bacteria. Aft er t his, colonies of bact eria were t est ed biochemically and molecularly. Penaeid shrimp

samples were collect ed from t he shrimp brackishwat er ponds in t he Sout h Sulawesi Province (Takalar Regency, M aros

Regency, Pangkep Regency, Bulukumba Regency, Barru Regency, and Pinrang Regency). Lampung Province (Bakauheni

and Kalianda Dist rict ), East Java Province (Sit ubondo Regency) and West Java Province (Karawang Regency). The

result s of biochemical assay for art ificially-infect ed shrimp could det ermine t he species of vibrioses, but it t ook a

relat ively long t ime. The furt her result s showed t hat specific molecular marker of haemolysin (IAVh) could det ect

_{2 3} Vibriosis direct ly from t he shrimp organs in at densit y of 10 -10 CFU/mL on bot h nat ural and art ificial infect ed vibrioses shrimp.

  KEYW ORDS: biochemical test; early detection; haemolysin; penaeid shrimp; vibriosis

PENDAHULUAN dunia, dan t elah berkembang pesat karena met o de

  ku lt u r in t e n sif (Hai, 2 0 1 5 ). Se p e r t i h aln ya u s ah a Akuakult ur dipandang sebagai salah sat u sumber p e r t a n ia n , in d u s t r i a k u a k u lt u r ju g a m e n g a la m i pangan yang cukup pent ing bagi po pulasi manusia di hambat an yang cukup serius akibat adanya serangan

  Vibr io har veyi _#

  p en yakit . adalah pat o ge n p e n yeb ab

  Ko r esp o n d e nsi: Balai Pe n elit ian d an Pe ng e m b an gan Bu d id aya

  p e n yakit ku n an g-ku n an g yan g b an yak m e n yeran g

  Air Payau . Jl. Makm u r Dg . Sit akka No . 12 9 , Mar o s 9 0 51 2 ,

  komodit as budidaya yang menyebabkan kerugian besar

  Su lawesi Se lat an , In d o n e sia. Te l. + (0 4 1 1 ) 3 7 1 5 4 4 i nceayu@ gmai l .com

  E-m ail: dalam indust ri akuakult ur (Aust in & Zhang, 2006).

  Co p yrig ht @ 20 16, Jurnal Riset Akuakultur (JRA), p -ISSN 190 7-6 754, e-ISSN 25 02-6534

  Co p yright @ 2 016 , Jurnal Riset Akuaku ltu r (JRA), p -ISSN 1 907 -675 4, e-ISSN 250 2-65 34 Sensivitas det eksi penyakit vibriosis pada udang penaeid dengan penanda ..... (Ince Ayu Khairana Kadriah)

  Vibr io

  pato gen yang berasal dari udang penaeid yang t eramplifikasi, sedangkan DNA dari bakt eri

  Vibrio

  no n-pat o gen, sert a bakt eri pat o gen no n- Vibrio t idak dapat t eramplifikasi (Kadriah

  et al

  ., 2013b). Hasil uji sensit ivit as menunjukkan ko nsent rasi t erendah yang d ap a t d id e t e ks i ad a la h 1 0 ² h in gg a 1 0 ³ CFU/m L. Pengujian sensit ivit as dan spesifisit as ini dilakukan pada skala labo rat o rium.

  Tujuan pe ne lit ian ini ad alah u nt uk m en ge t ahu i sensit ivit as penanda mo lekuler spesifik IAVh (Kadriah

  et al.

  , 20 1 3 a) d alam m e n de t e ksi

  b e rpe n d ar p at o ge n ik yan g m e n jad i age n vib rio sis b aik p ad a sampel hasil infeksi buatan maupun pada sampel yang diko leksi dari t ambak udang. Hasil dari penelit ian ini diharapkan dapat memperbaiki met o de det eksi Vibrio p at o gen d e n gan leb ih ce p at pad a u d an g pe n ae id (udang windu dan vaname).

  Spesifisit as dan sensit ivit as dari penanda mo lekuler merupakan dua hal yang sangat pent ing unt uk diuji. Hasil pengujian spesifisit as dari penanda mo lekuler yang didesain menunjukkan bahwa hanya DNA dari bakteri

  BAHAN DAN M ETODE Infeksi Buatan dengan Vibrio Berpendar Patogen

  Udang yang digunakan unt uk uji ini adalah udang windu ukuran t o ko lan berumur sat u bulan di t ambak. Udang uji t erlebih dahulu t elah didepurasi selama sat u minggu dalam bak t erko nt ro l unt uk meminimalisasi adan ya ko nt amin asi dari b akt e ri p at o gen lain n ya. Se la m a s e m in g g u m a s a k a r a n t in a , s is t e m ya n g digunakan adalah sistem air mengalir. Sebelumnya telah d ila k u k a n p r o s e s s t e r ilis a s i a ir m e d ia d e n g a n menggunakan kapo rit Ca(OCl) ₂ 150 mg/L selama 24 jam .

  Sebelum melakukan uji det eksi Vibrio sis, t erlebih dahulu dilakukan infeksi buat an menggunakan

  Vibrio h ar veyi

  b e r p e n d a r p a t o g e n d e n g a n m e t o d e pe nyunt ikan. Bakt e ri

  V. har veyi

  p at o gen yan g akan d iin fe k s ik a n t e r le b ih d a h u lu d ik u lt u r d i m e d ia

  nut rient brot h

  (NB) selama 24 jam. Set elah 2 4 jam, biakan bakt eri dipindahkan ke me dia NB b aru dan dikult ur selama empat jam sebelum diinfeksikan ke hewan uji. Ko nsentrasi bakteri set elah re-kultur empat jam adalah 10 ⁸ CFU/mL (Kadriah, 2012). Ko nsent rasi b ak t e ri ya n g ak an d iin fe ks ika n ke u d an g d ia t u r menggunakan met o de pengenceran dengan larut an

  Vibrio

  haemolysin sebagai gen t arget (Kadriah et al ., 2013a).

  Se la m a in i id e n t ifik a si d a n d e t e k s i p e n ya k it kunang-kunang udang dilakukan dengan pengamat an berdasarkan gejala klinis yang t erlihat di t ambak dan dilanjutkan dengan pengujian di laborat orium. Kejadian penyakit t ersebut selalu dit andai dengan t erjadinya feno mena udang dan air bercahaya (

  et al

  bioluminescence ).

  Gejala lain nya ad alah u d ang t e rlih at lem ah d alam pergerakannya dan mengalami nekro sis (Karunasagar, 19 94). Le ano (1 998 ) m enyat akan bah wa pada saat udang telah mengalami gejala-gejala klinis sepert i yang disebut kan di at as, maka ko nsent rasi bakt eri Vibrio pada hepat o pankreas sudah mencapai kepadat an 10 ⁵ -

  10 ⁶ CFU/mL. Kepadat an di at as at au sama dengan 10 ⁵ CFU/mL menurut Leano (1998), adalah kepadatan yang cu k u p u n t u k m e n ja d ik an b a k t e r i

  Vibr io

  b e r s ifa t pat ogen di alam. Hal inilah yang menyebabkan sulit nya un t u k me laku kan up aya pe ncegah an p en yakit jika berdasarkan munculnya gejala klinis sepert i adanya p e nd aran cahaya d i air t am b ak karen a kep ad at an bakt eri pat o gen sudah t inggi.

  Me t o d e b io k im ia ya n g d ig u n a k a n u n t u k mendet eksi memerlukan wakt u beberapa hari unt uk dapat memperoleh hasil. Di samping hasil meto de agar sebar seringkali t idak dapat mendet eksi keberadaan bakt eri pat o gen di ant ara bakt eri no n-pat o gen. Hal in i m e n jad i ke n d ala d alam me n ge nd alikan wab ah e p id e m i. Pe sa t n ya p e r ke m b an ga n t e kn ik b io lo gi mo lekuler memberikan peluang baru yang signifikan unt uk penelit ian diagno sis penyakit ikan dan udang. Beberapa t eknik mo lekuler unt uk ident ifikasi sepert i

  Random Amplified Polymorhic

  DNA (RAPD) dan analisis sekuensing gen 16s-rRNA (Do rsch

  ., 1992) t et ap belum mampu secara spesifik membedakan antra Vibrio patogen dan non-patogen. Menggunakan asam nukleat sebagai t arget , dan met o de baru yang menganalisis polimorfisme dalam asam nukleat, dapat meningkat kan spe sifisit as, sen sit ivit as, dan kecep at an diagn o sis, sert a cara baru u nt uk me meriksa hubun gan an t ara g e n o t ip e d a n fe n o t ip e d a r i b e r b a g a i p a t o g e n . Kemajuan dalam t eknik PCR sangat membant u st udi e p id e m io lo gi, s e rt a id e n t ifikasi p e n ye b ab wa b ah penyakit at au det eksi pat o gen (Cunningham, 2002).

  (u d an g win d u d a n van am e ). Pe n an d a sp e sifik in i d id e sa in m e n ggu n aka n m e t o d e PCR d e n g an g e n

  Ge n sp e sifik yan g d im ilik i o le h b a kt e r i

  Vi br io

  berpendar dapat digunakan sebagai penanda molekular dalam d iagno sis cepat penyakit ini. Gen

  haemolysin

  dike t ahu i m erup akan salah sat u ge n sp esifik yang dimiliki bakt eri pat o gen t ermasuk bakt eri Vibrio . Gen

  haemolysin

  adalah gen yang bert anggung jawab pada p e n g h a n cu r a n m e m b r a n s e l d a r a h a t a u p r o s e s hemo lisis (Co nejero & Hedreyda, 2004). Selain gen

  haemol ysi n

  , p ad a b e b e rap a p u s t ak a r u ju kan ju ga disebutkan gen t oxR (Pang et al ., 2006). Pada penelit ian sebelumnya t elah berhasil didesain penanda spesifik mo lekuler unt uk Vibrio pat o gen pada udang penaeid

  saline solut ion (SS). Co p yrig ht @ 20 16, Jurnal Riset Akuakultur (JRA), p -ISSN 190 7-6 754, e-ISSN 25 02-6534 Jurnal Riset Akuakult ur, 11 (4), 2016, 363-371

  Penyunt ikan bakt eri V. har veyi dilakukan pada ruas

  Vi br i o

  Vibrio

  Hasil PCR kemudian diseparasi pada gel agaro sa 2% unt uk dio bse r vasi dan dido kume nt asikan. Hasil visualisasi d ari ge l e le kt ro fo re sis bila t erlihat pit a ( band ) pada panjang basa 151 bp unt uk gen haemolysin menunjukkan adanya infeksi bakt eri

  63°C selama sat u menit 30 det ik, dan elo ngasi 6 8°C selama sat u me nit 30 de t ik, se rt a t ah ap ekst ra elo ngasi 72°C selam a 10 menit . Pro ses PCR ini dilakukan dua kali (re-PCR) untuk meningkat kan sensit ivit as hasil det eksi.

  annealing

  diat ur sebanyak 25 siklus pada suhu denat urasi 94°C selama sat u menit ,

  haemolysin

  ., 1 9 8 2 ). Ge n o m DNA u d an g yan g dipero leh selanjut nya diamplifikasi dengan mesin PCR d an m e n g gu n a k an p rim e r s p e s ifik IAVh se b a ga i pendet eksi keberadaan bakt eri pat o gen pada sampel udang. Pro ses PCR dilakukan menggunakan met o de Kadriah (2012). Pro gram PCR unt uk primer

  et al

  ) (Mam iat is

  Dodecyl Trimet hyl Ammonium Bromide/Cet yl Trimet hyl Ammonium Bromide

  Se b e lu m d ila k u k an d e t e ks i s e ca ra m o le ku le r dengan amplifikasi DNA menggunakan PCR, t erlebih dahu lu dilakukan ekst raksi gen o m DNA dari o rgan u d a n g ya n g d ik o le k s i. Ek s t r a k s i g e n o m DNA menggunakan met o de DTAB-CTAB (

  Det eksi vibrio sis secara mo lekuler dilakukan pada s a m p e l u d a n g h a s il u ji in fe k s i b u a t a n s k a la labo rat o rium dan sampel udang yang diko leksi dari beberapa t ambak pembesaran di daerah-daerah sentra p e ru d an gan n asio n al. Uji d e t e ksi vib rio sis se cara mo lekuler menggunakan met o de PCR dengan primer spesifik IAVh (Kadriah, 2012). Pro ses det eksi dilakukan di Labo rat o rium Kesehat an Ikan dan Lingkungan Balai Penelit ian dan Pengembangan Budidaya Air Payau.

  Det eksi Vibriosis Secara M olekuler

  berpendar, dat a hasil uji biokimia yang diperoleh diolah dengan menggunakan perangkat lunak Fo rt ran Co m- pu t e r Pro gram (Muir, 19 96 b). Analisis u ji bio kim ia dilakukan 48 jam set elah pengujian, kecuali unt uk uji asam amino xant hine yang membut uhkan wakt u lima hari unt uk mendapat kan hasil.

  Un t u k m e n e n t u k a n s p e s ie s d a r i b a k t e r i

  terakhir kaki jalan dengan volume 100 µL biakan

  et al . (1994); Muir (1996a).

  . (1994); Bro ck

  et al

  Set elah ko lo ni bakt eri t umbuh pada media TCBSA, ke m u d ian d ilaku kan u ji b io kim ia t e rh ad ap iso lat t erpilih dengan 25 macam uji unt uk mengident ifikasi je nis b akt eri yan g t um buh . Uji b io kim ia dilakukan berdasarkan met ode yang dilakukan oleh Austin (1991); Au st in & Au st in (1 9 9 3 ); Alsin a & Bla n ch (1 9 9 4 ); Baumann

  De t e ksi Vib rio sis se cara ko n ve n sio n al d e n gan me t o d e bio kimia ini hanya dilaku kan pada samp el udang hasil infeksi buat an. Det eksi vibrio sis dengan met o de bio kimia menggunakan 25 macam uji. Pada t ahapan ini t erlebih dahulu dilakukan penumbuhan bakt eri pada media spesifik TCBSA dari o rgan udang yang t elah diinfeksi secara bu at an den gan met o de injeksi. Organ udang yang diko leksi adalah eko r dan kaki ren an g. Se lain dari o rgan u d an g sakit iso lasi bakt eri juga dilakukan dari haemo lim. Haemo lim dari u d a n g s a k it d iam b il d e n g an s yr in g e 1 m L ya n g dilengkapi jarum 25 Gauge dan kemudian dit et eskan di at as media TCBSA, sedangkan o rgan udang sakit d it e m p e lk a n la n g s u n g k e a t a s m e d ia TCBSA. Pengamat an mo rfo lo gi ko lo ni bakt eri yang t umbuh di TCBSA dilakukan set elah 24 jam. Bakteri berpendar d ap at d iamat i se t e lah 1 8-2 0 jam se t elah d iku lt ur. Ko lo n i b akt eri yan g t um b u h selanju t nya d ise le ksi berdasarkan bent uk ko lo ni, warna, dan pendarannya unt uk dilakukan uji lanjut an secara biokimia. Dari hasil seleksi secara mo rfo lo gi dipero leh lim a iso lat yang akan diuji sifat sifat fisio lo gisnya secara bio kimia.

  Deteksi Vibriosis Secara Biokimiawi

  Sampe l d iawet kan di dalam larut an TNES se belum dibawa ke labo rat o rium.

  Sampel udang diko leksi dari t ambak budidaya di Pro vinsi Sulawesi Selat an (Kabupat en Takalar: enam sampel udang vaname, Kabupat en Maro s: 10 sampel u d an g win d u , Kab up at e n Pan gke p : e m p at samp e l udang windu, Kabupat en Bulukumba: empat sampel udang win du, Kabupat e n Barru: t iga sam pel ud ang windu, dan Kabupat en Pinrang: t ujuh sampel udang windu d an udang van ame. Pro vinsi Lampung (De sa Bakauheni dan Kalianda: enam sampel udang vaname), Pro vinsi Jawa Timur (Kabupat en Sit ubo ndo : sembilan s a m p e l u d a n g w in d u ), d a n Pr o vin s i Ja w a Ba r a t (Kabupat en Karawang: empat sampel udang windu). Organ udang yang diko leksi adalah kaki renang, kaki jalan, t ut up insang, insang, hepat o pankreas, dan eko r.

  Koleksi Sam pel Udang

  Wadah penelit ian yang digunakan adalah akuarium kapasit as 10 L sebanyak 12 buah. Set iap wadah diisi air laut dengan salinit as 28 ppt yang t elah dist erilkan d en gan kapo rit 1 50 mg/L se lam a sat u m alam dan ke m u d ian d in e t ra lis ir d e n gan n a t riu m t h io s u lfat 75 mg/L. Vo lume air laut yang diisikan ke dalam wadah sebanyak 5 L.

  ) sebelum mat i. Organ udang yang diambil unt uk keperluan det eksi vibrio sis adalah kaki jalan, kaki renang, insang, dan eko r.

  moribund

  10 ⁶ CFU/mL. Jumlah udang yang diinfeksi unt uk set iap p e rlak u a n ad alah lim a e ko r. Pe n g am b ila n u d an g dilakukan setiap ada udang yang mengalami gejala sakit (

  bakt eri dengan t iga ko nsent rasi yait u 10 ² , 10 ⁴ , dan

  berpendar pat o genik pada sampel udang yang diko leksi. Co p yright @ 2 016 , Jurnal Riset Akuaku ltu r (JRA), p -ISSN 1 907 -675 4, e-ISSN 250 2-65 34 Sensivitas det eksi penyakit vibriosis pada udang penaeid dengan penanda ..... (Ince Ayu Khairana Kadriah) HASIL DAN BAHASAN

  Se la m a in i d e t e k s i

  ) menunjukkan akt ivitas Gambar 1. Ko lo ni bakteri yang tumbuh pada media TCBSA dari organ (kaki renang dan eko r) dan haemo lim udang sakit hasil infeksi buat an

  pat o gen pada sampel yang diuji. Pada penelitian yang dilakukan oleh Liu et al . (1996), iso lat bakt e ri

  Vibr io

  dari udan g wind u (

  P. monodon

  ) dan udang kuruma (

  P. japonicus

  

Figure 1. Colony of bact eria growing on TCBSA media from organs (pleiopoda and

t ail) and haemolimph of art ifically infect ed shrimps

  pat o gen secara mo lekuler dengan penanda spesifik hemo lisin lebih sensit if dibandingkan met o de bio kimia. Keberadaan bakt eri pat o gen dapat didet eksi dengan spesifik dan sensit if secara langsung t erhadap gen hemo lisin pada o r g a n u d a n g s a k it . Ke b e r a d a a n g e n h e m o lis in menunjukkan adanya infeksi bakt eri

  Kaki renang

  Pleiopoda

  Ko lo ni vibrio

  Vibrio colony

  Warna kuning

  Yellow color Eko r udang Shrimp uropod

  Kultur bakteri dari haemolim udang

  Vibrio

  Vibrio

  Vi b r i o

  Hasil uji bio kimia mengindikasikan bahwa spesies bakteri yang t umbuh pada media TCBSA adalah bakt eri

  b e r p e n d a r m a s ih menggunakan t eknik mikro bio lo gi st andar. Namun, m et o d e in i t id ak dapat m e nd et e ksi p at o ge n p ad a t ahap awal infeksi at au mungkin memiliki sensit ivit as det eksi.yang lebih rendah (Christ o pher

  et al ., 2011).

  De n gan d e m ikian , m e t o d e lain t e ru t am a m e t o d e det eksi berbasis mo lekul sepert i

  polymerase chain re- act ion

  (PCR) t elah dikembangkan unt uk memberikan penent uan cepat dan akurat dari pat o gen pada t ahap aw al in fe ks i. Me t o d e d e t e k si m e n g gu n ak an g e n spe sifik IAVh d iharap kan dap at le b ih sp e sifik dan sensit if mendet eksi keberadaan bakt eri pat o gen pada m e d ia d a n u d a n g ya n g d ib u d id a ya k a n s e b e lu m munculnya gejala klinis di t ambak.

  Hasil Det eksi Vibriosis untuk Sampel Infeksi Buat an

  Ha s il d e t e k s i vib r io s is d e n g a n m e t o d e ko nvensio nal menggunakan media agar TCBS dan uji biokimia dapat dilihat pada Gambar 1. Hasil penanaman bakt eri dari o rgan udang sakit menunjukkan bahwa b akt e ri yan g t u m b u h p ad a m e d ia se le kt if TCBSA hamp ir semuanya ber warna ku ning. Demikian pula bakt eri yang t umbuh dari haemo lim t idak dit emukan a d a n ya k o lo n i b a k t e r i ya n g b e r w a r n a h ija u . Pe n g a m a t a n b a k t e r i b e r p e n d a r s e t e la h 2 0 ja m menunjukkan tidak ada kolo ni bakt eri yang berpendar baik yang berasal dari o rgan maupun haemolim udang sakit . Dari hasil ini dapat disimpulkan bahwa bakt eri pat o ge n yang diinfeksikan t idak be rhasil did et eksi kembali dengan met o de ko nvensio nal Ko lo ni bakt eri yang dipilih unt uk uji bio kimia hanya ada lima ko lo ni yan g m e m ilik i p e r b e d a an m o r fo lo g i d ar i s e m u a ko nsent rasi bakt eri yang diinfeksikan secara buat an.

  V. mimicus

  Hasil deteksi vibrio sis secara molekuler pada udang yang diinfeksi buat an dapat dilihat pada Gambar 2. Det eksi ini menggunakan met o de mo lekuler dengan primer sp eisifk IAVh . Pada Gamb ar 2, t erlihat je las pit a-p it a DNA h asil am plifikasi PCR d an dise parasi dengan elekt rofo resis pada panjang basa 151 bp. Hasil ini menunjukkan bahwa det eksi

  ,

  V. har veyi

  ,

  V. mimicus/har veyi

  , dan

  V. campbelli

  (Ta b e l 1 ). Be rd a s a r ka n h a s il u ji b io k im ia d a p a t d it e ran gkan b ah wa m e t o d e d e t e ksi ko n ve nsio n al hanya dapat mengident ifikasi spesies bakt eri set elah lima hari wakt u pengamat an. Wakt u yang cukup lama bila dibandingkan me t o de de t eksi mo lekuler yang hanya membut uhkan wakt u 1-2 hari. Ketidakmampuan met o de b io kimia unt uk me ndet eksi secara spesifik keberadaan bakteri Vibrio pat ogen pada sampel menjadi acuan unt uk selanjut nya melakukan det eksi vibrio sis pada sampel dari t ambak hanya menggunakan met ode det eksi mo lekuler.

  

Bacterial culture from shrimps haemolimph Co p yrig ht @ 20 16, Jurnal Riset Akuakultur (JRA), p -ISSN 190 7-6 754, e-ISSN 25 02-6534 Jurnal Riset Akuakult ur, 11 (4), 2016, 363-371 pr ot ease , phospholipase , d an h ae m o lis in . Akt ivit as

  en zim-en zim in i pada

  ₊ ₊ ₊ −

  ₊ ₊ ₊ −

  Serine −

  − − − − −

  Et hanol

  ₊ − − − −

  Put rescine

  Ornit hine decarb −

  − − − ₊ −

  − − − − −

  Indole

  − − − − −

  Sucrose

  ₊ ₊ ₊ ₊ ₊

  Amylase

  Hept anoat e

  Xanthine

  − − − ₊

  Leucine

  

Species V. campbellii V. mimicus V. mimi/harveyi V. harveyi V. mimicus

Kode isolat ( Isolates code ) Uji biokim ia

  ₊ −

  ₊ ₊ −

  Propionat e

  − ₊

  − ₊ ₊

  ₊ ₊ ₊ ₊ −

  − − − − −

  Ket oglut arat e − − − − − L-alanine

  − ₊ ₊ ₊ ₊

  Glucoronate

  − ₊ ₊ ₊ −

  Arabinose − − − − − Cellubiose

  ₊ − − − −

  Aminobut yrat e

  −

  Pigmentation

  Vibr io

  p at o gen dap at dide t eksi walaupun pada konsent rasi yang rendah. Hal ini dapat kit a lihat pada hasil PCR dari sampel Takalar (enam sa m p e l), Pin r an g, Ma ro s (s e m b ilan s am p e l), d an Lampung (enam sampel) (Gambar 3) t erinfeksi

  p a t o g e n . Ha s il PCR p o sit if d it e m u kan p ad a s am p e l d ari Kab u p a t e n Pin ra n g (Gambar 6). Terdapat pit a DNA pada hasil visualisasi dengan elekt ro fo resis pada panjang basa 151 bp.

  Vi br i o

  p a t o g e n a d a lah sa m p e l ya n g b e r as a l d ar i Kabupat en Pinrang, Takalar, Maro s, dan Lampung. Hasil in i m e n ggam b ark an ko n d isi u d a n g yan g dibudidayakan di daerah-daerah t ersebut cukup aman d a ri s e r a n g an

  Vi br io

  Walaupun demikian ko ndisi udang dinyat akan t et ap aman karena ko nsent rasi bakt eri hanya berada pada kisaran 10 ¹ CFU/mL. Hal ini dapat dilihat dari ket ebalan pit a DNA hasil elekt ro fo resis (Kadriah, 2012). Tidak t erdapat pit a DNA pada hasil PCR unt uk sampel yang b e ra sal d a ri Kara wan g, Sit u b o n d o , Pa n gke p , d an Bu lu k u m b a (Ga m b a r 4 -6 ). Ha s il a n a lis is PCR menunjukkan sampel yang t erdet eksi positif t erinfeksi

  Vibrio .

  Vibrio

  Vibrio

  Has il d e t e ksi vib r io sis se cara m o le ku le r p ad a sampel yang dikumpulkan dari berbagai daerah dapat dilihat pada Gambar 3-6. Dari hasil yang dipero leh dapat diketahui bahwa kemampuan primer IAVh untuk d e t e ksi vib rio sis p ad a u d an g yan g d ip e ro le h d ari t am b ak cu ku p b aik. Pad a h am p ir se m u a sam p e l, ke beradaan bakt eri

  Hasil Det eksi Vibriosis untuk Sampel dari Tam bak Udang

  dapat dilakukan secara lebih cepat sebagai upaya pencegahan penyakit vibrio - s is .

  quorum

  berpendar akan sangat membant u dalam penanganan dan pencegahan awal unt uk mengurangi kemat ian udang. Mengingat ke m am p u an b akt e ri d ala m m e n gin fe ksi in an gn ya d ipe n garuh i o leh ke pad at an b akt e ri d alam m ed ia budidaya, maka det eksi keberadaan bakt eri sebelum jumlahnya mencapai

  Vibrio

  yan g d it em ukan p ad a udang penaeid lebih virulen dibandingkan pada spesies lainnya (Liu et al ., 1996). Adanya met o de det eksi dini ya n g d a p a t d e n g a n c e p a t m e n d e t e k s i a d a n ya ko nt aminasi bakt eri pat o gen

  Tabel 1. Hasil uji bio kimia lima ko lo ni bakt eri

  t erpilih

  ₊ ₊ ₊ ₊ ₊

  VP Test

  Lysine decarb

  ₊ ₊ ₊ ₊ ₊

  Gas f orm glucose − − − − − Growt h at 40 °C

  ₊ − − − −

  Arginine dihydr

  − − − − −

  ₊ ₊ ₊ ₊ ₊

  Table 1. Result of biochemical t est of five Vibrio colony select ed

  Luminescence

  − − − − −

  5 Swarming

  4

  3

  2

  1

  Biochemical test Co p yright @ 2 016 , Jurnal Riset Akuaku ltu r (JRA), p -ISSN 1 907 -675 4, e-ISSN 250 2-65 34 Sensivitas det eksi penyakit vibriosis pada udang penaeid dengan penanda ..... (Ince Ayu Khairana Kadriah)

  Gambar 2. Hasil amplifikasi PCR dari o rgan udang windu sakit dari infeksi buat an menggunakan primer

  100 bp 300 bp M 1 KP 2 3 4 KP 5 6 7 KP 8 9 10 KP M 11 12 13 14 KP 15 16 17 KP 18 19 20 KP 21 22

  Figure 4. PCR result s for vibriosis det ect ion; line 1-6= t emplat e from shrimp farms in Sit ubondo (Paras Duwet ): operculum, gill, hepat opancreas, periopoda, pleiopoda, and t elson; line 7-10= t em-

plat e from shrimp Pangkep: hepat opancreas, periopoda, pleiopoda, and t elson

  dari sampel udang Pangkep: hepato pankreas, kaki jalan, kaki renang, e ko r

  template

  dari sampel udang Sit ubo ndo (Paras Duwet ): t ut up insang, insang, hepat o pankreas, kaki jalan, kaki renang, eko r; lajur 7-10=

  t emplat e

  Gambar 4. Hasil PCR unt uk det eksi vibrio sis; lajur 1-6=

  200 bp 100 bp 300 bp 200 bp

  IAVh; A) ko nsent rasi bakt eri 10 ⁴ CFU/mL dengan

  ladder Figure 3. PCR result s for vibriosis det ect ion from shrimp; line 1-6= DNA t emplat e from Pacific whit e shrimp Takalar ; line 7-16= DNA t emplat e from black t iger shrimp M aros; and line 17-22= DNA t emplat e from Pacific whit e shrimp Lampung; KP= posit ive cont rol, M = 100 bp DNA ladder marker

  Gambar 3. Hasil det eksi vibrio sis menggunakan PCR u nt uk sampel udang dari t ambak; laju r 1-6= sam pel u dang vanam e dari Takalar; laju r 7-16 = sam pel u dang windu dari Maro s; lajur 17-22= sampel udang vaname dari Lampung; KP= ko nt ro l po sit if; M= marker 100 bp DNA

  M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

  200 bp 100 bp A B C

  ladder Figure 2. The PCR amplificat ion result of black t iger shrimp organ collect ed from art icial infect ion using primary IAVh; A) bact eria concent rat ion of 10 ² CFU/mL wit h DNA t emplat e from periopod, t elson, gill, pleopod; B) bact eria concent rat ion of 10 ⁴ CFU/mL; C) bact eria concent rat ion of 10 ⁶ CFU/mL); M = is 100 bp DNA ladder marker

  DNA dari jaringan kaki jalan, eko r, insang, kaki renang; B) ko n sent rasi bakt eri10 ⁴ CFU/mL; C) ko nsent rasi 10 ⁶ CFU/mL; M= marker 100 bp DNA

  t emplat e

  M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 200 bp 100 bp 300 bp Co p yrig ht @ 20 16, Jurnal Riset Akuakultur (JRA), p -ISSN 190 7-6 754, e-ISSN 25 02-6534 Jurnal Riset Akuakult ur, 11 (4), 2016, 363-371

  Be rdasarkan h asil uji b io kimia diket ahui bah wa keberadaan bakt eri

  

Figure 6. PCR result s for t iger shrimp samples collect ed from Barru (A), t iger shrimps samples from

Pinrang (B), Vannamei shrimps samples from Pinrang (C)

  

4

Situ b on d o

  

6

6 1 0 0 Kar awan g (Su n g ai Bu n tu + BLUPPB)

  

4

Lamp u n g

  

4

Bu lu ku mb a

  

7

7 1 0 0 Pan g kep

  

3

Pinr ang

  

6

6 1 0 0 Mar o s 1 0 4 4 0 Bar ru

   (%) Takalar

  Persent ase Per centage

  Sam pel posi t i f Sam ple infected (positive)

  

Jum lah sam pel

Number of Sample

  Lokasi Location

  M 1 2 3 KP M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M A B C

  A B C 200 bp 100 bp

  Gambar 6. Hasil PCR sampel udang Windu dari Kabupat en Barru (A), udang windu dari Kabupat en Pinrang (B), udang vaname dari Kabupat en Pinrang (C)

  Vibrio

  Vibrio

  berpendar pat o genik t idak berhasil didet eksi secara spesifik. Walaupun t erdapat ko lo ni yang t erident ifikasi sebagai

  V. har veyi

  namun t idak ada ko lo ni bakt eri berpendar yang dit emukan. Hasil ini t idak coco k dengan bakt eri yang diinfeksikan.

  Bakt e ri yan g d iin fe ksikan ad alah ko lo n i

  Vibr io

  berpendar sehingga seharusnya t erdapat ko lo ni

  b e rpe n d ar p ad a h asil iso lasi ke m b ali b akt e ri d ari organ udang sakit. Meto de konvensional menggunakan m e d ia agar s e le kt if (TCBSA) t e rb u kt i t id ak d ap at mendet eksi keberadaan

  

Figure 5. PCR result s for shrimp colect ed for various farms from different areas; A) sample collect ed from

Village of Panarukan Sit ubondo, B) t iger shrimp sample collect ed from Bulukumba, C) t iger shrimp sample collect ed from Karawang

  Vibrio

  berpendar pat o genik dari jaringan udang dan media pemeliharaan. Diduga pert umbuhan bakt eri Vibrio berpendar pat ogenik pada media TCBSA t idak mampu bersaing dengan bakt eri

  Vibrio

  no n-pat o ge nik yang secara alami hidup pada m e d ia p e m e lih a ra an d a n d i d a la m o rg an u d an g. Biasanya ko lo ni bakteri berpendar yang dapat diamat i di media TCBSA kepadat annya lebih dari 10 ⁴ CFU/mL. Tabel 2. Hasil det eksi vibrio sis menggunakan penanda mo lekuler spesifik IAVh

  Table 2. Vibriosis det ect ion result s using molecular markers specific of IAVh

  Gambar 5. Hasil uji det eksi vibrio sis dengan PCR pada udang di t ambak dari beberapa daerah; A) Desa Panarukan Sit ubo ndo , B) udang windu dari Bulukumba, C) udang windu dari Karawang

  

9 Co p yright @ 2 016 , Jurnal Riset Akuaku ltu r (JRA), p -ISSN 1 907 -675 4, e-ISSN 250 2-65 34 Sensivitas det eksi penyakit vibriosis pada udang penaeid dengan penanda ..... (Ince Ayu Khairana Kadriah)

  Pro ses diagno sa secara bio kimia, membut uhkan wakt u sekit ar 3-7 hari dengan po pulasi bakt eri yang dapat dihit ung lebih dari 10 ⁴ CFU/mL. Pada ko ndisi sepert i ini sudah t erlambat unt uk melakukan usaha pencegahan penyakit , karena po pulasi bakt eri sudah t e rlalu m e lim p ah . Hal in ilah yan g m en jad i alasan sulit nya unt uk melakukan upaya pencegahan penyakit jika berdasarkan munculnya gejala klinis di t ambak b u did aya u d ang, kare n a ke p adat an b akt eri sud ah t in ggi.

  in- fect io n.

  Journal Applied M icrobiology , 119, 917-935.

  Kadriah, I.A.K. (2012).

  Pengembangan met ode det eksi cepat Vi br i o ber pendar pat og eni k pada udang penaeid . Disert asi. Inst it ut Pert anian Bo go r.

  Kadriah, I.A.K., Su sianin gsih, E., Suke nda., Yu han a, M., & Harris, E. (2013a). Desain primer sp esifik unt uk det eksi dini penyakit vibrio sis pada udang penaeid. J. Ris. Akuakult ur , 8(1), 131–143. Kadriah, I.A.K., Suke nda, Yuhana, M., Su sianin gsih,

  E., & At mo marso no , M. (2 01 3b ). Sp ecificit y o f

  Haemolysin and Gyrase gene marker fo r rapid de- t e ct io n o f vibrio sis o n pe nae id sh rim p.

  Indone- sian Aquacult ure Journal

  , 8(1), 47–64. Karunasagar, I., Pai, R., Malat hi, G.R., & Karunasagar,

  I. (1994). Mass mo rt alit y o f

  Penaeus monodon

  lar- vae due t o ant ibio t ic-resist ant

  Vibr io harveyi

  Aquacult ure , 128, 203–209.

  Int . J. Syst . Bact eriol

  Leano , E.M., Lavilla-Pit o go , C.R., & Paner, M.G. (1998).

  Bact erial flo ra in t he h ep at o p an creas o f p o n d- reared

  Penaeus monodon

  juveniles wit h lumino us Vibrio sis.

  Aquacult ure , 164, 367–374.

  Liu, P.C., Lee, K.K., & Chen, S.N. (1996). Pat ho genic- it y o f different iso lat es o f

  Vibrio harveyi

  in t iger prawn,

  Penaeus monodon .

  Let t . Appl. M icrobiol

  ., 22, 413-416. Mam iat is, T., Frit sch , E.F., Samb ro o k, J., & Engel, J.

  (1982). Mo lecular clo ning; A labo rat o r y manaual. Co ld Sping Harbo r. New Yo rk, 545 pp. Mu ir, P. (1 9 9 6 a ). Me d ia u s e d in

  Vi b r i o

  ., 42, 58– 63. Hai, N.V. (20 15). Th e use o f pro bio t ics in aq uacu l- t ure.

  based o n 16S rRNA sequences.

  Pe n a n d a m o le k u le r s p e s ifik h e m o lys in IAVh t erbukt i mampu mendet eksi keberadaan bakteri

  Ho lt , J.G., Krieg, N.R., Sneat h, P.H.A., St aley, J.T., & Wilins, S.T. (Eds.). Bergey’s manual of det erminat ive bact eri-

  Vibrio

  berpendar pat o genik dari o rgan udang secara lebih sensit if dan spesifik, baik pada sampel hasil infeksi buat an maupun pada sampel dari t ambak udang. Hasil an alisis PCR m en un ju kkan samp el yan g t e rd et eksi po sit if t erinfeksi Vibrio pat o gen adalah sampel yang berasal dari Kabupat en Pinrang, Takalar, Maro s, dan Lampung.

  UCAPAN TERIM A KASIH

  Pe ne lit ian ini dibiayai o le h DIPA BPPBAP Maro s t ahu n 20 15 . Te rima kasih kam i samp aikan ke pada pe nelit i d an t eknisi Kelo m po k Kese hat an Ikan d an Lin gk u n g an , Balai Pe n e lit ia n d an Pe n g e m b an g an Budidaya Air Payau, Maro s yang t elah berpart isipasi, berperan akt if, dan membant u selama penelit ian ini berlangsung.

  DAFTAR ACUAN

  Alsina, M., & Blanch, AR. (199 4). A set o f keys fo r bio chemical ident ificat io n o f enviro nment al

  Vibrio species. J. Appl. Bact eriol ., 76, 79-85.

  Aust in, B. (1991). Met ho ds in aq uat ic bact erio lo gy.

  Jo h n Wille y an d So n s. Ch ich e st e r. Ne w Yo rk. Brisbane. To ro nt o . Singapo re, 425 pp. Aust in, B., & Aust in, D.A. (1993). Bact erial fish pat ho - gens. Disease in Farmed and Wild Fish. Seco nd

  Edit io n. New Yo rk. Lo ndo n. Aust in, B., & Zhang, X.H. (2006). Vibrio harveyi : a sig- nificant pat ho gen o f marine vert ebrat es and in- vert ebrat es.

  Let t . Appl. M icrobiol ., 43, 119–124.

  Baumann, P., Furniss, A.L., & Lee, J.V. (1994). Facult a- t ive anaero bic gram negat ive ro ds.

  In

  ology . Th e William and Wilkin s. Nint h Ed it io n.

  Vibrio

  Balt imo re.

  Bro ck, T.D., Madigan, M.T., Mart inko , J.M., & Parker, J. (1994). Bio lo gy o f Micro o rganism. Sevent h Edi- t io n. Prent ice Hall Int ernat io nal, Inc.

  Co n ejero , M.J.U., & Hedre yda, C.T. (20 04). PCR de- t ect io n o f

  hemolysin

  (vhh) gene in

  Vibrio harveyi .

  J. Gen. Appl. M icrobiol ., 50, 137–142.

  Cunningham, C.O. (2002). Mo lecular diagno sis o f fish and shellfish diseases: present st at us and po t en- t ial use in disease co nt ro l. Aquacult ure , 206, 19- 55. Christ o ph e r, M., Caip an g, A., & Agu an a Mar y, P.N.

  (20 11). Co nve nt io n al PCR assays fo r t h e det ec- t io n o f pat ho genic

  Vibrio

  spp. in shrimp aquacul- t ure in t he Philippines.

  Int ernat ional Journal of t he Bioflux Societ y , 4(3).

  Do rsch, M., Lane, D., & St ackebrandt , E. (1992). To - wards a phylo geny o f t he genus

  a n d pho t obact erium ident ificat io n. Depart ment of Mi-

  Jurnal Riset Akuakult ur, 11 (4), 2016, 363-371

  crobio lo gy, Bio medical and Tropical Veterinar y Sci- medical and Tro pical Vet erinar y Sciences. James e n c e s . Ja m e s Co o k Un ive r s it y o f No r t h Co o k Universit y o f No rt h Queensland. Aust ralia. Queensland. Aust ralia.

  Pang, L., Zhang, X.H., Zho n g. Y., Ch en , J., Li, Y., &

   Vibrio Pseudomo- Vibrio harveyi

  Muir, P. (1996b). Ident ificat io n o f and Aust in, B. (2006). Ident ificat io n o f

  nas toxR Let t. Appl.

  b act eria. De part me nt o f Micro bio lo gy, Bio - using PCR amplificat ion o f t he gene.

  M icrobiol ., 43, 249–255.

  Co p yrig ht @ 20 16, Jurnal Riset Akuakultur (JRA), p -ISSN 190 7-6 754, e-ISSN 25 02-6534