ANALISIS SEKUEN POLIKETIDA SINTASE DOMAIN KETOSINTASE PADA BAKTERI ENDOFIT AKAR AGERATUM CONYZOIDES L.

Susadi Nario Saputra, 2013

Analisis Sekuen Poliketida Sintase Domain Ketosintase Pada Bakteri Endofit Akar Ageratum conyzoides L.

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu

ANALISIS SEKUEN POLIKETIDA SINTASE DOMAIN KETOSINTASE PADA BAKTERI ENDOFIT AKAR Ageratum conyzoides L.

SKRIPSI

Disusun untuk Memenuhi Sebagian dari Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Sains Program Studi Biologi

Jurusan Pendidikan Biologi

Oleh

Susadi Nario Saputra 0800664

PROGRAM STUDI BIOLOGI JURUSAN PENDIDIKAN BIOLOGI

FAKULTAS PENDIDIKAN MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS PENDIDIKAN INDONESIA

Analisis Sekuen Poliketida Sintase

Domain ketosintase pada Bakteri

Endofit Akar Ageratum conyzoides L

Oleh

Susadi Nario Saputra

Sebuah skripsi yang diajukan untuk memenuhi salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana pada Fakultas Pendidikan Biologi

Susadi Nario Saputra, 2013

Analisis Sekuen Poliketida Sintase Domain Ketosintase Pada Bakteri Endofit Akar Ageratum conyzoides L.

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu © Susadi Nario Saputra 2013

Universitas Pendidikan Indonesia Oktober 2013

Hak Cipta dilindungi undang-undang.

Skripsi ini tidak boleh diperbanyak seluruhya atau sebagian, dengan dicetak ulang, difoto kopi, atau cara lainnya tanpa ijin dari penulis.

SUSADI NARIO SAPUTRA

ANALISIS SEKUEN POLIKETIDA SINTASE DOMAIN KETOSINTASE PADA BAKTERI ENDOFIT AKAR Ageratum conyzoides L

DISETUJUI DAN DISAHKAN OLEH: Pembimbing I

Dr. Hj. Any Fitriani, M.Si. NIP. 196502021991032001

Pembimbing II

Any Aryani, M.Si. NIP. 197105302001122001

Mengetahui,

Ketua Jurusan Pendidikan Biologi FPMIPA UPI

Dr. Riandi, M.Si. NIP. 196305011988031002

Susadi Nario Saputra, 2013

Analisis Sekuen Poliketida Sintase Domain Ketosintase Pada Bakteri Endofit Akar Ageratum conyzoides L. Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu

Analisis Sekuen Poliketida Sintase Domain Ketosintase pada Bakteri Endofit Akar

Ageratum conyzoides L

Abstrak

Polyketida synthase (PKS) merupakan kelompok enzim multi kompleks yang bertanggungjawab dalam proses biosintesis berbagai macam senyawa poliketida. Poliketida sintase mempunyai beberapa modul yang terdiri atas beberapa domain dengan fungsi yang berbeda. Ketosintase (KS) merupakan salah satu domain yang diperlukan untuk proses elongasi atau pemanjangan rantai poliketida. Ketersediaan dan diversitas domain ketosintase di alam penting dalam usaha penemuan obatan – obatan baru. Telah dilakukan kloning gen ketosintase bakteri endofit akar Ageratum conyzoides L ke dalam vektor pGEMT – Easy. Gen ketosintase diperoleh dari bakteri endofit akar Ageratum conyzoides dengan metode isolasi DNA secara lansung melaui proses enrichment. Primer DKF/DKR dan HGLF/HGLR digunakan untuk mengamplifikasi domain ketosintase secara lansung dari berbagai sampel lingkungan. Amplikon diklon kedalam plasmid pGEMT – Easy dan ditransformasikan kedalam bakteri Escherichia coli DH5α. Seleksi transforman dilakukan dengan metode seleksi biru putih. Efesiensi transformasi diperoleh sebesar 6.68 X 103 CFU/µg untuk gen ketosintase heterokyst glicolipid dan 3.12 X 103 CFU/µg untuk gen ketosintase non heterokyst glicolipid. Hasil analisis filogenetik menunjukkan bahwa telah berhasil teridentifikasi domain ketosintase dari berbagai kelompok bakteri meliputi, Actinobacteria, Cyanobacteria, Proteobacteria, dan beberapa mikroorganisme yang belum teridentifikasi.

ABSTRACT

Polyketide synthase (PKS) are known to produce a class of medically and industrially include a broad range of bioactive compound such antibiotics. PKSs are multifungsional enzyme that organized into module and consist of several domain. KS domain is responsible for the condensation of an extender unit onto the growing polyketide chain during polyketide biosynthesis. The diversity of modular polyketide synthase (PKS) gene in root of Ageratum conyzoides were studied by sequencing analysis than before clone in DH5α bacteria. Primer for the amplification of PKS domain were DKF and DKR for non heterocyst glicolipid and HGLF and HGLR for heterocyst glikolipid. The eficience of transformation 6.68 X 103 CFU/µg for heterokyst glicolipid gene and 3.12 X 103 CFU/µg for heterokyst glicolipid gene. Phylogenetic analysis of 20 amino acid (AA) sequences indicates that the identified ketosynthase (KS) domains were clustered with those from diverse bacterial groups, including Cyanobacteria, Proteobacteria, Actinobacteria and some unidentified microorganisms. Phylogenetic result show DK10 DK8 and DK3 include protobacteria group, DK6 DK7 and DK9 include Cyanobacteria, DK4 DK7 include Actinobacteria group. Phylogentic analysis of heterocyst glycolipid biosynthetic ketoshynthase region with respect to diverse range of ketosynthase domain, including type I and II

v

Susadi Nario Saputra, 2013

Analisis Sekuen Poliketida Sintase Domain Ketosintase Pada Bakteri Endofit Akar Ageratum conyzoides L.

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu DAFTAR ISI

Hal

ABSTRAK... ... i

KATA PENGANTAR... ii

DAFTAR ISI... iii

DAFTAR TABEL... viii

DAFTAR GAMBAR... ix

DAFTAR LAMPIRAN... x

BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang... 1

B. Rumusan Masalah... 4

C. Pertanyaan Penelitian... 4

D. Batasan Masalah... 4

E. Tujuan Penelitian... 4

F. Manfaat Penelitian... 5

BAB II Ageratum conyzoides, MIKROBA ENDOFIT, METAGENOMIK, POLIKETIDA, KLONING DAN STUDI FILOGENETIK A. Morfologi Ageratum conyzoides L... 6

B. Manfaat dan Kandungan metabolit sekunder A. conyzoides... 7

C. Mikroba Endofit... 10

1. Mikroba endofit penghasil zat anti malaria... 11

2. Mikroba endofit yang menghasilkan metabolit sebagai antikanker... 11

3. Mikroba endofit yang menghasilkan antibiotika... 12

D. Metagenomik... 13

E. Poliketida, Poliketida Sintase dan Domain Ketosyntase... 14

F. Kloning... 16

1. Sumber DNA... 17

2. Vektor... 17

3. Plasmid... 17

BAB III METODE PENELITIAN

A. Jenis Penelitian... 21

B. Populasi dan Sampel... 21

C. Objek Penelitian... 21

D. Tempat Penelitian... 21

E. Alat dan Bahan... 21

F. Cara Kerja... 21

1. Pengambilan sampel... 22

2. Enrichment media... 22

3. Isolasi DNA... 22

4. Polymerase Chain Reaction (PCR)... 24

5. Elektroforesis hasil PCR... 24

6. Purifikasi Hasil PCR... 24

7. Kloning Gen Ketosintase... 25

8. Transformasi Hasil Kloning... 25

9. Isolasi DNA Plasmid Rekombinan... 25

10.Sekuensing Plasmid Rekombinan... 26

11.Alur Penelitian... 26

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN A. Hasil Isolasi DNA Genom dan Spektrofotometer ... 28

B. Hasil Amplifikasi DNA dan Elektroforesis... 29

C. Hasil Purifikasi DNA... 30

D. Ligasi Insert Kedalam Vektor... 30

E. Transformasi... 31

F. Analisis Sekuen Domain Ketosintase... 36

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN A. Kesimpulan... 48

B. Saran... 48

vii

LAMPIRAN RIWAYAT HIDUP

BAB I PENDAHULUAN A.Latar Belakang

Pemanfaatan tanaman sebagai obat sudah seumur dengan peradaban manusia. Dari zaman nenek moyang kita dahulu tanaman sudah dipercaya sebagai gudang bahan kimia yang memiliki manfaat sebagai obat dari berbagai macam penyakit. Berdasarkan bukti sejarah, produk alam berupa tanaman telah menjadi basis utama penemuan obat baru dan berbagai jenis senyawa bioaktif, peran ini tergambar keberlansungannya pada sistem pengobatan tradisional yang saat ini masih ada pada berbagai macam kebudayaan (Miller et al., 2012). WHO memperkirakan 80% penduduk negara berkembang masih mengandalkan pemeliharaan kesehatan pada pengobatan tradisional, dan 85% dari pengobatan tradisional tersebut dalam prakteknya masih melibatkan tumbuh-tumbuhan (Suganda, 2008).

Kemampuan tanaman menyembuhkan berbagai macam penyakit disebabkan salah satunya adanya bahan kimia (fitokimia) tertentu yang dihasilkan tanaman sebagai bentuk adaptasi perlindungannya terhadap lingkungan (Vickrey & Vickrey, 1981). Salah satu bentuk bahan kimia yang dihasilkan oleh tumbuhan disebut dengan metabolit sekunder, metabolit sekunder didefenisikan sebagai senyawa dengan berat molekul rendah yang tidak diperlukan untuk pertumbuhan dan dihasilkan sebagai bentuk adaptasi terhadap lingkungannya (Prasetyoputri & Armosukarto, 2006).

Dalam perkembangannya, pada awalnya peneliti mengira bahwa kemampuan menghasilkan metabolit sekunder ini murni hanya dimiliki oleh tumbuhan itu sendiri namun dalam penelitian lebih lanjut ditemukanlah mikroba yang mampu bersimbiosis dengan tumbuhan, baik yang hidup sebagai endofit pada jaringannya maupun yang epifit pada permukaannya (Ikeda et al., 2010). Mikroba endofit adalah mikroba yang hidup pada jaringan tumbuhan dan dapat membentuk koloni tanpa menyebabkan penyakit pada tumbuhan itu sendiri (Strobel et al., 2003). Saat ini mikroba endofit mendapat perhatian lebih dari para peneliti dikarenakan kemampuan mikroba ini memproduksi senyawa metabolit sekunder sesuai dengan metabolit yang dihasilkan tanaman inangnya. Menurut Tan & Zao (2001) kemampuan ini didapatkan oleh

2

Susadi Nario Saputra, 2013

Analisis Sekuen Poliketida Sintase Domain Ketosintase Pada Bakteri Endofit Akar Ageratum conyzoides L.

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu

mikroba endofit sejalan dengan adanya koevolusi atau rekombinasi genetik alami yang dilakukan inangnya sepanjang waktu evolusinya.

Berbagai senyawa metabolit sekunder yang memilki berat molekul rendah dengan berbagai tingkatan struktur yang sangat beranekaragam telah dihasilkan oleh bakteri endofit dan beberapa senyawa itu termasuk dalam kelompok senyawa penting diantaranya poliketida, berbagai macam senyawa turunanan asam amino, dan terpen. Potensi mikroba endofit menghasilkan senyawa metabolit sekunder memang cukup potensial, hasil dari sekuensing genom Streptomycetes saja misalnya menunjukkan bahwa kapasitas genetik mikroba ini paling tidak mampu menghasilkan lebih dari 25 senyawa metabolit sekunder yang berbeda (Curtis et al., 2005). Tentu saja mempelajari mikroba endofit terkait kemampuannya yang bisa menghasilkan senyawa metabolit sekunder yang sama dengan inangnya penting dilakukan terkait sifat mikroba yang mudah dipelajari, pertumbuhannya yang cepat dan sifat genetiknya yang mudah dinalisis atau dimanipulasi. Penggunaan mikroba endofit dalam menghasilkan senyawa metabolit sekunder ini juga akan mengurangi ketergantungan kita dalam menghasilkan senyawa bioaktif dengan bahan baku berupa tumbuhan herbal itu sendiri, dengan demikian sumberdaya hayati yang berharga ini bisa dilestarikan (Radji, 2005). Tidak hanya itu mikroba endofit ternyata juga mampu menghasilkan senyawa metabolit sekunder yang memiliki manfaat ekologi bagi tanaman inangnya diantaranya menghasilkan hormon pertumbuhan (Compant et al., 2005), menghasilkan senyawa yang menyebabkan tanaman inangnya resisten terhadap berbagai serangan predator dan patogen (Arnold, 2003); (Maynard, 2008), dan resisten terhadap kekeringan (Kannadan, 2008).

Salah satu tanaman obat yang cukup populer dalam kajian etnobotani dan cukup dikenal di kalangan masyarakat Indonesia adalah Ageratum conyzoides L, tanaman ini di Indonesia diantaranya disebut dengan nama babadotan. Tumbuhannya ini tumbuh tersebar didaerah tropis dan sudah banyak digunakan sebagai pengobatan di berbagai belahan dunia, misalnya saja : di Afrika Tengah A.conyzoides L. digunakan sebagai obat pneumonia. Di India species ini digunakan sebagai bakteri, fungi, anti-disentri dan anti-lisis. Di Asia, Amerika Selatan dan Afrika, ekstrak aqueous dari tumbuhan ini digunakan untuk anti-mikroba (Ming, 1999).

3

Menurut Pari et al., (1998) akar A. Conyzoides mengandung senyawa kimia yang mengandung terpenoid yang terdiri dari Ageratochromene (precocene 2), dan 7-methoxy-2,2-dimethylchromene (precocene 1). Selain itu, ekstrak akar A. conyzoides L. Juga mengandung senyawa fenolik yang terdiri dari Flavonoid : 1-(7-hydroxy-5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-1-benzopyran-6-yl) disamping senyawa di atas akar A. conyzoides L juga mengandung metanol dan alkaloid yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba patogen seperti Staphylococcus aures (Desiariyanti, 2009). Adanya senyawa metabolit sekunder yang bermanfaat secara medis yang dihasilkan A. conyzoides L menjadi ketertarikan tersendiri untuk diteliti secara lebih lanjut khususnya dalam kaitannya dengan mikroba endofitnya.

Akan tetapi, mikroba endofit sebagai bagian dari komunitas mikroba memiliki keanekaragaman spesies yang sangat tinggi saat ini diperkirakan mikroba yang hidup di bumi berjumlah 4 – 6 × 1030 (Johri, 2005), dan menurut Dreyfus dan Hoffman (2006) untuk spesies kapang saja yang hidup sebagai mikroba endofit paling tidak berjumlah satu juta jenis. Sebagaimana kita tahu metode konvensional dalam mempelajari dan mengetahui potensi suatu mikroba masih mengandalkan proses pengkulturan. Dengan mengkultur mikroba dari suatu lingkungan peneliti bisa mempelajari bentuk morfologi, struktur sel, maupun berbagai macam sifat biokimia mikroba itu sendiri. Akan tetapi metode ini tidak cukup menjadi dasar dalam mempelajari keanekaragaman maupun potensi suatu komunitas mikroba dilingkungan dikarenakan sedikitnya mikroba dialam yang mampu dikulturkan. Padahal dari total mikroba yang ada dialam hanya 1% yang mampu dikulturkan. Kegagalan ini ini disebabkan sangat beragamnya kebutuhan nutrisi dan kondisi fisologi berbagaimacam mikroba yang ada dilingkungan (Yusuf et al., 2002). Padahal mikroba yang belum di kulturkan bisa jadi merupakan salah satu komunitas utama dalam suatu lingkungan (Kusharyoto 2006).

Atas dasar pemikiran itulah perlu diadakan penelitian “Analisis Sekuen Poliketida Sintase Domain Ketosintase pada Bakteri Endofit Akar Ageratum conyzoides” dengan metode isolasi DNA secara lansung untuk melihat hubungan kekerabatan domain ini yang mempunyai potensi besar dalam penemuan obat baru kedepannya.

4

Susadi Nario Saputra, 2013

Analisis Sekuen Poliketida Sintase Domain Ketosintase Pada Bakteri Endofit Akar Ageratum conyzoides L.

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu

Bagaimanakah hasil analisis sekuen poliketida sintase domain ketosintase pada bakteri endofit akar Ageratum conyzoides L?

C.Pertanyaan Penelitian

1. Bagaimanakah efisiensi transformasi gen ketosintase yang di transformasikan pada bakteri E.coli DH5α

2. Bagaimanakah verifikasi hasil kloning bakteri endofit akar Ageratum conyzoides yang telah ditransformasikan kedalam bakteri E.coli DH5α?

3. Berapakah jumlah koloni hasil transforman yang positip mengandung gen ketosintase yang sudah ditransformasikan kedalam bakteri E.coli DH5α?

4. Bagaimanakah bentuk pohon filogenetik dan hubungan kekerabatan hasil analisis sekuen DNA gen ketosintase?

D. Batasan Masalah

1. Metode isolasi DNA yang digunakan adalah metode isolasi DNA lansung dari alam melalui proses enrichment

2. Vektor yang digunakan dalam penelitian ini adalah plasmid pGEMT - Easy

3. Amplifikasi gen poliketida sintase dilakukan dengan menggunakan primer DKF dan DKR serta HGLF dan HGLR

4. Bakteri yang digunakan dalam proses transformasi adalah DH5α

5. Software yang digunakan untuk membuat pohon filogenetik adalah Mega 5

E.Tujuan Penelitian

Untuk mengetahui, mengidentifikasi, menganalisis, dan membandingkan hasil analisis sekuen poliketida sintase domain ketosintase pada bakteri endofit akar Ageratum conyzoides L untuk kemudian dapat dijadikan acuan dalam menemukan suatu senyawa bioaktif tertentu.

5

1. Memberikan informasi dalam bidang kesehatan maupun industri dalam upaya eksplorasi senyawa bioaktif baru khususnya poliketida yang berpotensi digunakan sebagai antibiotik baru.

2. Mengetahui hubungan kekerabatan dan peran ekologis spesifik dari suatu gen tertentu pada mikroba dalam suatu lingkungan.

21

Susadi Nario Saputra, 2013

Analisis Sekuen Poliketida Sintase Domain Ketosintase Pada Bakteri Endofit Akar Ageratum conyzoides L.

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu BAB III

METODE PENELITIAN A.Jenis Penelitian

Jenis penelitian yang digunakan adalah penelitian dasar dengan metode deskriptif (Nazir, 1983).

B.Populasi dan Sampel

Populasi dalam penelitian ini adalah populasi mikroba endofit yang terdapat dalam akar tumbuhan Ageratum conyzoides L. sedangkan untuk sampel yang diamati adalah DNA mikroba endofit yang positif mengandung gen poliketida sintase khususnya domain ketosintase pada akar A.conyzoides L

C.Objek Penelitian

Objek penelitian ini adalah materi genetik (DNA) terutama domain gen ketosintase pada mikroba endofit akar A. conyzoides L.

D.Tempat Penelitian

Penelitian ini dimulai pada bulan Maret 2012 sampai bulan Agustus 2012 yang dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi, dan Laboratorium Fisiologi Fakultas FPMIPA Universitas Pendidikan Indonesia.

E. Alat dan Bahan

Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini terdapat dalam laboratorium Mikrobiologi, adapun daftar alat dan bahan yang digunakan selama penelitian ini dapat dilihat dalam Lampiran 2 dan Lampiran 3.

F. Cara Kerja

1. Pengambilan sampel

Isolasi mikroba endofit dilakukan menurut metode F. Tomita Akar tanaman A. conyzoides dikoleksi dari Kebun Botani Universitas Pendidikan Indonesia dan

22

kemudian sampel tanaman dibersihkan dari kotoran dengan cara mencucinya dengan air mengalir. Kemudian akar tanaman dipotong-potong agar tidak terlalu panjang, selanjutnya disterilisasi permukaan menggunakan larutan etanol 75% selama 1 menit, bayclin 25% selama 5 menit, dan terakhir dengan etanol kembali selama 30 detik. Setelah itu sampel dibilas dengan air steril beberapa kali. Selanjutnya, potongan tadi direndam dalam larutan fisiologis sambil divortex untuk mengeluarkan bakteri endofit dalam jaringan tumbuhan (Modifikasi Lumyong et al., 2001).

2. Enricment Media

Sebanyak 1 ml larutan hasil vortex diambil kemudian dimasukkan kedalam medium LB (LB) Broth. Medium diinkubasi sambil dihomogenkan dengan shaker dengan kecepatan 125 rpm selama 16 jam dalam suhu ruang (Modifikasi Sambrook & Russel ; Wahyudi et al., 2010).

3. Isolasi DNA

Isolasi DNA dilakukan dengan mengambil 1.5 ml kultur hasil enrichment dimasukkan kedalam tabung eppendorf selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 7500 rpm selama 3 menit. Selanjutnya supernatan dibuang dan pellet diisolasi dengan metode yang tersedia pada katalog “FERMENTAS DNA Purification KIT”. Pellet hasil sentrifugasi ditambahkan 200 µl larutan TE buffer lalu diresuspensikan hingga homogen. Selanjutnya, ditambahkan 400 µl larutan lysis solution ke dalam tabung eppendorf. Tabung tersebut kemudian diinkubasi dalam waterbath pada suhu 65°C selama 10 menit. Setelah diinkubasi, kemudian ditambahkan 600 µl kloroform ke dalam tabung tersebut dan dihomogenkan dengan cara dibolak-balik 3-5 kali. Sentrifugasi suspensi pada tabung tersebut pada kecepatan 10.000 rpm selama 2 menit. Setelah sentrifugasi, fasa cair atas yang terbentuk dipindahkan pada tabung mikrosentrifugasi yang baru dan ditambahkan 800 µl larutan presipitasi (80 µ l larutan precipitation solution dilarutkan dengan 720 µl ddH2O steril) lalu disentrifugasi pada

kecepatan 10.000 rpm selama 2 menit. Supernatan yang terbentuk dibuang secara hati-hati lalu ditambahkan 100 µl NaCl solution (1,2 M) pastikan pelet DNA larut. Kemudian ditambahkan RNAse A free DNAse sebanyak 10 µl lalu diinkubasi pada suhu 37°C selama 10 menit. Setelah itu ditambahkan 300 µl etanol absolut dingin,

23

Susadi Nario Saputra, 2013

Analisis Sekuen Poliketida Sintase Domain Ketosintase Pada Bakteri Endofit Akar Ageratum conyzoides L.

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu

kemudian disimpan pada suhu -20°C selama 1-20 jam. Sampel kemudian disentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm selama 5 menit. Supernatan pada lapisan atas dibuang secara hati-hati sampai habis. Tutup tabung mikrosentrifugasi dibiarkan terbuka sampai alkohol menguap dan pelet DNA mengering. Pelet DNA kemudian dilarutkan dalam 20 µl ddH2O steril dan disimpan pada suhu -20°C untuk digunakan pada proses

amplifikasi.

4. Polymerase Chain Reaction (PCR)

Proses amplifikasi KS domain non heterokits glikolipid dilakukan dengan memasukkan 3µl DNA sampel kedalam tabung PCR yang sudah berisi 5 µl 10x Taq Buffer, 5 µl dNTP Mix 2mM, 2.5 µl primer DKF 10 mM, 2.5 µl primer DKR 10 mM, 0.25 µl Taq Polimerase 5U dan 32.75 µl ddH2O (Fermentas, 2011). Selanjutnya

dilakukan perbanyakkan sampel DNA dengan menggunakan mesin PCR eppendorf tube dengan kondisi : pre start pada suhu 94°C selama 5 menit, denaturasi 94°C selama 1 menit, annealing 51°C selama 1 menit, extention 720C selama 1 menit, post PCR 720C selama 10 menit, dilakukan perbanyakkan sebanyak 35 siklus (Jing et al., 2011).

Sedangkan amplifikasi KS domain heterokits glikolipid dilakukan dengan memasukkan 2µl DNA sampel kedalam tabung PCR yang berisi 5 µl Buffer A, 5 µl 5x KAPA Enhancer, 0.5 µldNTP Mix 10 mM, 1.25 µl primer HGLF 10 mM, 1.25 µl primer HGLR 10 mM, 0.2 µl Taq Polimerase 1U dan 9.8 µl ddH2O (Kapabiosystem,

2012). Selanjutnya juga dilakukan perbanyakkan dengan menggunakan mesin PCR eppendorf tube dengan siklus : pre start pada suhu 94°C selama 5 menit, denaturasi 94°C selama 1 menit, annealing 47°C selama 1menit, extention 720C selama 1 menit, post PCR 720C selama 10 menit, juga dilakukan perbanyakkan sebanyak 35 siklus.

940C 940C

720C 720C

1 min 510C 1 min

940C 5 min

940C

1 min _{10 min}

24

5. Elektroforesis hasil PCR

Elektroforesis dilakukan secara horizontal pada agarose 2% dengan tegangan 75 volt dan di running selama 45 menit dalam buffer TBE 1× dengan menggunakan alat elektroforesis BIORAD.

6. Purifikasi Hasil PCR

Proses purifikasi dilakukan dengan metode sentrifugasi dimana hasil amplikon atau potongan gel agarose yang positif mengandung gen yang diinginkan dipotong selanjutnya dilakukanlah proses purifikasi berdasarkan protokol yang sudah tersedia didalam katalog WIZARD DNA Purification System (Promega, USA). Dimana tabung eppendorf dan potongan gel yang positif mengandung gen yang diinginkan ditimbang untuk mengetahui berat masing – masing, selanjutnya tambahkan membrane binding solution dengan perbandingan berat gel sama dengan volume yang ditambahkan, campuran divortex dan diinkubasi pada suhu 50 - 600 C sampai potongan gel terlarutkan semuanya. Tabung disentrifugasi secara singkat untuk memastikan DNA berada pada dasar tabung. Masing – masing SV minicolumb diambil dan diletakkan pada collection tube kemudian diinkubasi 1 menit pada suhu kamar untuk selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 14.000 rpm selama 1 menit, cairan yang yang terdapat pada collection tube dibuang kemudian SV minicolumb dikembalikan pada collection tube, kemudian tambahkan 700 µl membrane wash solution. Sentrifugasi lagi dengan kecepatan 14.000 rpm selama 1 menit, buang lagi cairan pada collection tube untuk kemudian ditambahkan lagi 500 µl membrane wash solution. Sentrifugasi lagi SV minicolumb dengan kecepatan 14.000 rpm selama 5 menit. Kosongkan collection tube dan sentrifugasi SV minicolumb bersama collection tube dalam keadaan kosong dengan kecepatan 14.000 rpm selama 1 menit untuk menguapkan residu etanol. Selanjutnya SV minicolumb dipindahkan ke tabung eppendorf yang baru untuk kemudian ditambahkan 50 µl nuclease free water, sentrifugasi 14.000 rpm selama 1 menit. Selanjutnya DNA hasil purifikasi disimpan pada suhu - 200C..

5 min 72

0

C 720C

470C

Gambar 3.2 : Kondisi PCR KS domain heterocyst glikolipid 1 min

1 min 10 min 1 min

25

Susadi Nario Saputra, 2013

Analisis Sekuen Poliketida Sintase Domain Ketosintase Pada Bakteri Endofit Akar Ageratum conyzoides L.

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu 7. Kloning Gen Ketosintase

Gen ketosintase dikloning kedalam pGEM – T Easy vector (Promega, USA). Dimana sebanyak 11 µl ddH2O, 2 µl 2X Buffer ligasi, 1 µl vektor PGEM-T Easy, 5 µl

insert dan 1 µl enzim T4 Ligasi di masukkan kedalam tabung eppendorf steril. Setelah itu sampel disimpan pada suhu 4oC dan diamkan bermalam. Besok paginya sampel dipindahkan ke freezer bersuhu -20oC.

8. Transformasi Hasil Kloning

DNA yang sudah dikloning selanjutnya ditransformasikan kedalam bakteri E.coli

DH5α yang sebelumnya sudah dibuat kompetent dengan teknik CaCl2 dingin

(Sambrook & Russel 2001). Selanjutnya dilakukan seleksi biru – putih dimana sampel disebarkan diatas medium LA yang sudah ditambahkan X-gal (40µg/µl) dan Ampisilin (100 µg/µl) kemudian di inkubasi pada suhu 370C selama 24 jam.

9. Isolasi DNA Plasmid Rekombinan

Isolasi DNA plasmid dilakukan berdasarkan metode yang tersedia dalam Sambrook & Russel 2001. Sebanyak 1.5 kultur bakteri yang telah berumur 16 jam dimasukkan kedalam tabung eppendorf kemudian sisentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 2 menit. Supernatan dibuang selanjutnya pellet diresuspensikan dengan 100 µl solution I dingin kemudian di vortex sampai homogen. Tambahkan 200 µl solution II segar homogenkan dengan membalik tabung secara cepat. Tambahkan 150 µl solution III dingin vortex halus dan simpan tabung diatas es selama 3-5 menit. Sentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama 5 menit pindahkan supernatan ketabung eppendorf yang baru. Tambahkan etanol absolut 2X volume inkubasi pada suhu ruang selama 2 menit. Sentrifugasi lagi dengan kecepatan 10000 rpm selama 5 menit buang supernatan dan keringkan tabung, tambahkan lagi 1 ml etanol 70% kemudian keringkan diudara selama ± 10 menit. Selanjutnya resuspensikan plasmid dengan menambahkan 20 µl ddH2O.

26

Susadi Nario Saputra, 2013

Proses sequensing dilakukan dengan mengirimkan sampel pada perusahaan Macrogen Sequensing Order System,Macrogen Inc. Geumchen-gu Seoul, Korea. Selanjutnya hasil sequensing dianalisis berdasarkan analisis bioinformatika.

11.Alur Penelitian

Skema alur penelitian “Analisis Hasil Kloning Domain Kethosynthase pada

Mikroba Endofit Akar Ageratum conyzoides L

Isolasi DNA Mikroba Endofit Akar A.conyzoides

PCR dengan Menggunakan Primer DKF - DKR dan HGLF - HGLR

Elektroforesis Hasil PCR dengan Agarose 2 %

Purifikasi DNA

Kloning

Pembuatan Sel Kompeten

Transformasi dengan Menggunakan Metode Heat Shock

Seleksi Biru - Putih

Isolasi Plasmid Rekombinan Studi Pustaka

Pembuatan Proposal

27

Susadi Nario Saputra, 2013

Analisis Sekuen Poliketida Sintase Domain Ketosintase Pada Bakteri Endofit Akar Ageratum conyzoides L.

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

Berdasarkan hasil penelitian diatas didapatkan kesimpulan bahwa gen ketosintase bakteri endofit akara Ageratum conyzoides L berhasil diklon kedalam vektor pGEMT – Easy dengan efisiensi transformasi sebesar 6.68 X 103 CFU/µg dan 3.12 X 103 CFU/µg. Selain itu hasil sekuensing dan pembuatan pohon filogenetiknya menunjukkan bahwa gen ketosintase untuk primer degenerate nucleotida telah berhasil mengamplifikasi ketosintase tipe I dari berbagai jenis taksa bakteri dengan kekerabatan yang juga bervariasi, sedangkan primer heterocyst glicolipid telah berhasil mengamplifikasi gen ketosintase tipe II dan tipe I yang digunakan sebagai pembanding diversitas berbagai tipe ketosintase dalam suatu lingkungan.

B. Saran

Berdasarkan hasil penelitian dan kesimpulan di atas, terdapat saran untuk lebih mengembangkan pengetahuan dan menambah informasi yang lebih banyak mengenai penelitian yang terkait, yaitu:

1. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai jenis protein yang diekspresikan oleh beberapa bakteri endofit akar Ageratum conyzoides L yang telah terdeteksi memiliki gen domain Ketosynthase tipe I

2. Gen yang berhasil dikloning ke dalam vector pGEMT – Easy perlu diisolasi lagi untuk kemudian dikloning kedalam vector ekpresi untuk kemudian protein hasil ekpresi diuji apakah termasuk senyawa baru atau tidak.

3. Perlu dilakukan analisis hasil cloning yang lebih besar untuk mengetahui keaneragaman yang sesungguhnya dari bakteri akar Ageratum conyzoides.

4. Penambahan waktu penelitian dan pengulangan untuk memastikan ke validan dan kecermatan hasil penelitian.

41

Susadi Nario Saputra, 2013

Analisis Sekuen Poliketida Sintase Domain Ketosintase Pada Bakteri Endofit Akar Ageratum conyzoides L.

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu DAFTAR PUSTAKA

Arnold, F.H., (2001). “Combinatorial and Computational Challenges for Biocatalyst Design Nature” 409, : 253-258.

Baldwin, B.G., M.J. Sanderson, J.M. Porter, M.F. Wojciechowski, C.S. campbell, and M.J. Donoghue. (1995).“The ITS region of nuclear ribonsomal DNA: Avaluable source of evidence on Angiosperm phylogeny” Annual Missouri Botanic Garden 82 : 247-277.

Bills, G., A. Dombrowski, F. Pelaez, J. Polishook, and Z. An. (2002).” Recent and future discoveries of pharmacologically active metabolitis from tropical fungi”, p. 165-194. In R. Watling, J. C. Frankland, A. M. Ainsworth, S. Issac, and C. H. Robinson. (ed.), “Tropical mycology: micromycetes”, 2. CABI Publishing, New York, N.Y.

Burkill, H.M. (1985). “The Useful Plants of West Tropical Africa”. 1. Royal Botanic Gardens, Kew.

Castillo UF., GA. Strobel, EJ. Ford, WM Hess, H. Poter, JB. Jenson, H. Albert, R. Robinson, MA. Condron, DB. Teplow, D. Stevens and D. Yaver. (2002). “Munumbicins, wide spectrum antibiotics produced by Streptomyces NRRL 30562, endophytic on Kennedia nigriscans”. Microbiology 148 :2675-2685.

C.Moffitt, M and A. Neilan, B. (2003). “Evolusionary Affiliation the Superfamily of Ketosyntase Reflect Complex Pathway Assosiation” Molecular Evolution.,65: 446-457.

Chase, M.W., D.E. Soltis, and R.G. Olmstead. (1993). “Phylogenetics of seed plants: An analysis of nucleotide sequences from the plastid gene rbcL”. Annual Missouri Botanic Garden 80 :528-580.

Chelius, M. K., & Triplett, E. W. (2000). “Immunolocalization of dinitrogenase reductase produced by Klebsiella pneumoniae in association with Zea mays L”. Applied and Environmental Microbiology, 66 (2), 783-787

Cronquist, A. (1981). An Integral System of Clasification of Flowering Plants. New York: Colombia University Press

42

D.Hranueli, J. Cullum, (2001) “Molecular Biology of polyketide Biosynthesis” Kem. Ind. 50 381-412.

Desiarianty, R. (2009). Aktivitas Antibakteri Ekstrak Agertaum conyzoides L. Terhadap Bakteri Staphylococcus aureus Secara In Vitro. Skripsi Sarjana. UPI : tidak diterbitkan

Donadio S, Staver MJ, Mc Alpine JB, Swanson SJ, Katz L. (1991) “Modular Organisation of Gene Require for complex polyketide biosintesis”. Science 252: 675-679.

Dreyfuss, M.E., H.H. Hoffman, H. Kobel, W.Pache, and H. Tsecherter. C.Cyclosporin, (1986). “New Metabolites from Trichoderma polysporum”. Appl. Environ. Microbiol .3:125-133.

Dung, N.X. and D.T. Loi. (1991). “Selection of traditional medicines for study”.Journal of Ethnopharmacology 32: 57-70.

Ekundayo, O., S. Sharma and E.V. Rao. (1988). “Essential oil of Ageratum conyzoides”.Planta Med. 54: 55-57.

Entcheva, P., Liebl, W., Johann, A., Hartsch, T., and Streit, W.R (2001) “Direct cloning from enrichment culture, a reliable strategy for isolation of complete operons and genes from microbial aoncortia”. Appl. Environ. Micrbiol. 67: 89

Funa, N Ohnishi, Y Fuji, I Shibuya, M Ebizuka, Y Horinouchi, S (1999) “A new pathway for polyketide synthesis in microorganism” 400:798-799.

Glick, B.R. and J.J. Pasternak. 1994. Molekuler Biotechnology, Principles and applications of Recombinan DNA. ASM Press. Washinton D.C.

Hallam, S.J.,Girguis.,P.R., Preston C.M.,Richardson “identification of methyl coenzim M reductase A (mcr A) genes associated with methane-oxidizing archae” .APP.

43

Susadi Nario Saputra, 2013

Analisis Sekuen Poliketida Sintase Domain Ketosintase Pada Bakteri Endofit Akar Ageratum conyzoides L.

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu

Hardiksari, F.(2009). Aktifitas Antifungi Ekstrak Tumbuhan Ageratum conyzoides L. Terhadap candida albicans Seacara In Vitro. Skripsi sarjana pada FPMIPA UPI Bandung : tidak diterbitkan.

Harrison L., C.Teplow., M. Rinaldi., and GA Strobel., (1991) “Pseudomycins, a family of novel peptides from Pseudomonas Syringae, possessing broad spectrum antifungal activity”. J.Gen.Microbiol.137 : 2857-2865.

Hill, D.M., Moritz, C. and Mable, B.K (1996). Molecular Systematic 2 and Edition. Massachussetts, USA: Sinauer Assosiaciates Insc

Hongsachum, B.(2008). PhytochemiStry and bioassay fornatural weed control compounds from Ageratum conyzoides L.Thesis. KASETSART UNIVERSITY.

Horn WS., MSJ.Simmonds, RE. Schartz, and WM. Blaney. (1995). “Phomopsichalasin, a novel antimicrobial agent from an endophytic Phomopsis Spp. Tetrahedron” 14: 3969-3978.

Hui, W.H. and W.K. Lee. (1971). “Triterpenoid and steroid constituents of some Lactuca and Ageratum species of Hong Kong”. Phytochemistry 10: 899-901.

Hutchinson, C (1999) “Polyketide and non-ribosomal peptide synthases”: Falling together by coming apart. 100:3010–3012

Ikeda,s.Okubo,T.Anda,M. Nakashita, H. (2010) “Community- and Genome-Based Views of Plant-Associated Bacteria: Plant–Bacterial Interactions in Soybean and Rice”, Plant Cell Physiol. 51 (9): 1398–1410

Jaccoud, R.J.S. (1961). Contribuição para o estudo formacognóstico do Ageratum conyzoides L. Rev. Bras. Farm. 42(11/12): 177–197. Cited L.C. Ming.(1999). Ageratum conyzoides: “a tropical source of medicinal and agricultural products. In J. Janick, ed. Perspectives on New Crops and New Uses. ASHS Press, Alexandria.

44

Johnson, M.F. (1971). “A monograph of the genus Ageratum L”. (Compositae, Eupatorieae). Ann. Missouri Bot. Gard. 58: 6-88. Diambil dari L.C. Ming. 1999. A Tropical Source of Medicinal and Agricultural Products. In J. Janick, ed. Perspectives on New Crops and New Uses. ASHS Press, Alexandria.

Johri, B.M.(2005) “Microbial Diversty”. Current Science 89:3-4

Kissmann, G. and D. Groth. (1993). “Plantas infestantes e nocivas. Sau Paulo, Basf Brasileira”. Cited A.L. Okunade. 2002. Review: Ageratum conyzoides L. (Asteraceae). Fitoterapia 73: 1-16.

Kostla, C. Gokhale, S Rajesh. R. Jacobsen, J. E. Cane, D. (1999). “Tolerance and Specificity of Polyketide Synthetase”. Biochem. 68:219-253.

Kusharyoto, W. (2006). “Metagenomik, lebih besar dari sekedar pencarian biokatalis dan antibiotik baru”. Biotrend. 68:16-18.

Li JY., JK. Harper, DM. Grant, BO. Tombe, B. Basyal, WM. Hess, and GA.Srobel. “Ambuic acid, a highly functionalized cyclohexenone with antifungal activity from Pestalotiopsis spp. And Monochaetia spp”. Pytochemistry 56:463-468.

Lu H., WX. Zou, JC. Meng, J. Hu, and RX Tan. (2000). “New Bioactive metabolites produced by Colletotrichum sp., an endophytic fungus in Artemisia annua”. Plant Sci.151: 76-73.

Miller,Kristin.,Qing,Chin.,Man-Yuen-Sze,Daniel.,A-Neilan,Brett.,’Investigation of the Biosynthetic Potential of Endophytesin Traditional Chinese Anticancer Herbs”,PLoSONE 7(5):1-12

Moritz, C. And D.M. hilis. (1996). Molecular systematics: Context and controversies. In Hilis, D.M., C. Moritz, B.K. Mable. (Eds.). Molecular Systematics, 2nd edition, Sinauer Associate, Sunderland, MA, USA. P. 1-13.

45

Susadi Nario Saputra, 2013

Analisis Sekuen Poliketida Sintase Domain Ketosintase Pada Bakteri Endofit Akar Ageratum conyzoides L.

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu

Pari, K., P.J. Rao, B. Subrahmanyam, J.N. Rasthogi and C. Devakumar. Benzofuran and other constituents of the essential oil of Ageratum conyzoides. 1998.Phytochemistry 49(5): 1385-1388.

P.Ridley, C, Young Lee, h and Khostla, C. (2008). “Evolution of Polyketide Sunthasein Bacteria. PNAS Ecology, 105, No. 12, p. 4595-4600.

Pelezar, M.J. dan Chan, E.C.S. (2005). Dasar-dasar Mikrobiologi 1. Jakarta: UI-Press.

Prasetyoputri, A dan Ines Atmosukarto. (2006). “Biotrend”. Mikroba Endofit Sumber Acuan Baru yang Berpotensi. Vol I, No.2, p. 13-15

Promega. (2006) Life Science Catalog. Promega Coorporation. USA: Woods Hollow Road Madison.

Radji, M. (2005). “Peranan Bioteknologi dan Mikroba Endofit Dalam Pengembangan Obat Herbal”. Majalah Ilmu Kefarmasian, Vol. II, No. 3, p. 113 – 126.

Rao, J.T. & S.S. Nigam. (1973). “Chemical investigation of ether oils recovered from Ageratum conyzoides”. Riechstoffe Aromen Koerperpflegemittel 23(7): 209-212.

Robert, U, A, Fawzyah, Y & Chasana, E. (2005). “Eksplorasi Enzim Mikroba dari Lingkungan Laut Melalui Pendekatan Metagenaomika. WPPI. Vol. 11, No. 7, p. 17-24.

Sambrook J dan Russel. (2001). “Molecular Cloning - A Laboratory Manual”. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.

Schwecke T, et al,. (1995) “The biosyntesis gene clustar for polyketide immunosupresant rapamycin”. Proc natl Acad Sci USA 92:7839-7843.

Strobel, Gary & Bryn Daisy. (2003). “Bioprospecting for Microbial Endophytes and Their Natural products”. Microbiology and Molecular Biology Reviews, p. 491-502.

46

Suganda, A. G. (2008). Standardisasi dari Hulu sampai Hilir Syarat Tegaknya Keamanan, Manfaat dan Kualitas Obat Bahan Alam. Orasi Ilmiah Profesor. ITB: Tidak diterbitkan.

Sultana, A. (2006). “Mecanistics insghts into the biosyntesis of polyketide antibiotics:. Sweeden”. Karolinka Institute.

Tan.R.X and W.X.Zou, (2001). “Endophyte : A rich source of fungtional metabolite”. Nat. Prod, Rep., 18:448-459

Topik, H & Pancoro, A. (2006). “Sistematika dan Filogenetika Molekuler” makalah kursus singkat aplikasi perangkat lunak PAUP dan Mr Bayes untuk penelitian filogenetika Molekuler. Bandung : Institut Teknologi Bandung.

Tsen et al. (2002). “Natural Plasmid transformation in Eschericia coli”. Journal of Biomedical Science 9, 246 – 252

Tu et al. (2004). “An improved system for competent cell preparation and high efficiency plasmid transformation using different Escherichia coli strain”. Electronic Journal of Biotechnology : 8 : 0717 - 3458

Vicrey,M & Vicrey. B (1981). Secondary Plant Metabolism, Maryland: University Park Press

Wong et al . (1995). “Genome organization of Ageratum yellow veon virus, a monopartite whitefly-transmited geminivirus isolated from a common weed”. Journal of general virology.76.2915-292.

Wahyudi, A.T., Prasodjo, B.J & Mubarik, N.R (2010).” Diversity of Antifungal Compounds-Producing Bacillus spp. Isolated from Rhizosphere of Soybean Plant Based on ADRA and 16S rRNA”. Hayati journal of Bioscience. 17, (3), 145 - 150

47

Susadi Nario Saputra, 2013

Analisis Sekuen Poliketida Sintase Domain Ketosintase Pada Bakteri Endofit Akar Ageratum conyzoides L.

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu

Yusuf, Muhammad, et al. (2002). “Keragaman Gengetika bakteri Tanah Dan Rizosfer Kapas Transgenik di Soppeng, Sulawesi Selatan”. Jurnal Mikrobiologi Indonesia vol. 7, No. 2, hlm. 39-43 ; Borneman, et al. (1996). “Molecular Microbial Diversity of An Agricultural Soil In Wisconsin”. Appl Environ Microbiol. 62: 1935

D.Hranueli, J. Cullum, (2001) “Molecular Biology of polyketide Biosynthesis” Kem.

Ind. 50 381-412.

Desiarianty, R. (2009). Aktivitas Antibakteri Ekstrak Agertaum conyzoides L. Terhadap Bakteri Staphylococcus aureus Secara In Vitro. Skripsi Sarjana. UPI : tidak diterbitkan

Donadio S, Staver MJ, Mc Alpine JB, Swanson SJ, Katz L. (1991) “Modular

Organisation of Gene Require for complex polyketide biosintesis”. Science 252: 675-679.

Dreyfuss, M.E., H.H. Hoffman, H. Kobel, W.Pache, and H. Tsecherter. C.Cyclosporin, (1986). “New Metabolites from Trichoderma polysporum”. Appl. Environ.

Microbiol .3:125-133.

Dung, N.X. and D.T. Loi. (1991). “Selection of traditional medicines for study”.Journal of Ethnopharmacology 32: 57-70.

Ekundayo, O., S. Sharma and E.V. Rao. (1988). “Essential oil of Ageratum conyzoides”.Planta Med. 54: 55-57.

Entcheva, P., Liebl, W., Johann, A., Hartsch, T., and Streit, W.R (2001) “Direct cloning from enrichment culture, a reliable strategy for isolation of complete operons and genes from microbial aoncortia”. Appl. Environ. Micrbiol. 67: 89

Funa, N Ohnishi, Y Fuji, I Shibuya, M Ebizuka, Y Horinouchi, S (1999) “A new pathway for polyketide synthesis in microorganism” 400:798-799.

Glick, B.R. and J.J. Pasternak. 1994. Molekuler Biotechnology, Principles and

applications of Recombinan DNA. ASM Press. Washinton D.C.

Hallam, S.J.,Girguis.,P.R., Preston C.M.,Richardson “identification of methyl coenzim M reductase A (mcr A) genes associated with methane-oxidizing archae” .APP.

Hardiksari, F.(2009). Aktifitas Antifungi Ekstrak Tumbuhan Ageratum conyzoides L.

Terhadap candida albicans Seacara In Vitro. Skripsi sarjana pada FPMIPA UPI

Bandung : tidak diterbitkan.

Harrison L., C.Teplow., M. Rinaldi., and GA Strobel., (1991) “Pseudomycins, a family of novel peptides from Pseudomonas Syringae, possessing broad spectrum antifungal activity”. J.Gen.Microbiol.137 : 2857-2865.

Hill, D.M., Moritz, C. and Mable, B.K (1996). Molecular Systematic 2 and Edition. Massachussetts, USA: Sinauer Assosiaciates Insc

Hongsachum, B.(2008). PhytochemiStry and bioassay fornatural weed control

compounds from Ageratum conyzoides L.Thesis. KASETSART UNIVERSITY.

Horn WS., MSJ.Simmonds, RE. Schartz, and WM. Blaney. (1995). “Phomopsichalasin, a novel antimicrobial agent from an endophytic Phomopsis Spp. Tetrahedron”

14: 3969-3978.

Hui, W.H. and W.K. Lee. (1971). “Triterpenoid and steroid constituents of some Lactuca and Ageratum species of Hong Kong”. Phytochemistry 10: 899-901.

Hutchinson, C (1999) “Polyketide and non-ribosomal peptide synthases”: Falling

together by coming apart. 100:3010–3012

Ikeda,s.Okubo,T.Anda,M. Nakashita, H. (2010) “Community- and Genome-Based Views of Plant-Associated Bacteria: Plant–Bacterial Interactions in Soybean and Rice”, Plant Cell Physiol. 51 (9): 1398–1410

Jaccoud, R.J.S. (1961). Contribuição para o estudo formacognóstico do Ageratum

conyzoides L. Rev. Bras. Farm. 42(11/12): 177–197. Cited L.C. Ming.(1999).

Ageratum conyzoides: “a tropical source of medicinal and agricultural products. In J. Janick, ed. Perspectives on New Crops and New Uses. ASHS

Johnson, M.F. (1971). “A monograph of the genus Ageratum L”. (Compositae, Eupatorieae). Ann. Missouri Bot. Gard. 58: 6-88. Diambil dari L.C. Ming. 1999. A Tropical Source of Medicinal and Agricultural Products. In J. Janick,

ed. Perspectives on New Crops and New Uses. ASHS Press, Alexandria.

Johri, B.M.(2005) “Microbial Diversty”. Current Science 89:3-4

Kissmann, G. and D. Groth. (1993). “Plantas infestantes e nocivas. Sau Paulo, Basf Brasileira”. Cited A.L. Okunade. 2002. Review: Ageratum conyzoides L. (Asteraceae). Fitoterapia 73: 1-16.

Kostla, C. Gokhale, S Rajesh. R. Jacobsen, J. E. Cane, D. (1999). “Tolerance and Specificity of Polyketide Synthetase”. Biochem. 68:219-253.

Kusharyoto, W. (2006). “Metagenomik, lebih besar dari sekedar pencarian biokatalis dan antibiotik baru”. Biotrend. 68:16-18.

Li JY., JK. Harper, DM. Grant, BO. Tombe, B. Basyal, WM. Hess, and GA.Srobel.

“Ambuic acid, a highly functionalized cyclohexenone with antifungal activity from Pestalotiopsis spp. And Monochaetia spp”. Pytochemistry 56:463-468.

Lu H., WX. Zou, JC. Meng, J. Hu, and RX Tan. (2000). “New Bioactive metabolites produced by Colletotrichum sp., an endophytic fungus in Artemisia annua”.

Plant Sci.151: 76-73.

Miller,Kristin.,Qing,Chin.,Man-Yuen-Sze,Daniel.,A-Neilan,Brett.,’Investigation of the Biosynthetic Potential of Endophytesin Traditional Chinese Anticancer Herbs”,PLoSONE 7(5):1-12

Moritz, C. And D.M. hilis. (1996). Molecular systematics: Context and controversies.

In Hilis, D.M., C. Moritz, B.K. Mable. (Eds.). Molecular Systematics, 2nd edition, Sinauer Associate, Sunderland, MA, USA. P. 1-13.

Muladno, A (2002). Teknik Rekayasa Genetika. Pustaka Wirausaha Muda. Bogor.

Pari, K., P.J. Rao, B. Subrahmanyam, J.N. Rasthogi and C. Devakumar. Benzofuran

and other constituents of the essential oil of Ageratum conyzoides. 1998.Phytochemistry 49(5): 1385-1388.

P.Ridley, C, Young Lee, h and Khostla, C. (2008). “Evolution of Polyketide Sunthasein

Bacteria. PNAS Ecology, 105, No. 12, p. 4595-4600.

Pelezar, M.J. dan Chan, E.C.S. (2005). Dasar-dasar Mikrobiologi 1. Jakarta: UI-Press.

Prasetyoputri, A dan Ines Atmosukarto. (2006). “Biotrend”. Mikroba Endofit Sumber Acuan Baru yang Berpotensi. Vol I, No.2, p. 13-15

Promega. (2006) Life Science Catalog. Promega Coorporation. USA: Woods Hollow Road Madison.

Radji, M. (2005). “Peranan Bioteknologi dan Mikroba Endofit Dalam Pengembangan

Obat Herbal”. Majalah Ilmu Kefarmasian, Vol. II, No. 3, p. 113 – 126.

Rao, J.T. & S.S. Nigam. (1973). “Chemical investigation of ether oils recovered from

Ageratum conyzoides”. Riechstoffe Aromen Koerperpflegemittel 23(7): 209-212.

Robert, U, A, Fawzyah, Y & Chasana, E. (2005). “Eksplorasi Enzim Mikroba dari Lingkungan Laut Melalui Pendekatan Metagenaomika. WPPI. Vol. 11, No. 7, p. 17-24.

Sambrook J dan Russel. (2001). “Molecular Cloning - A Laboratory Manual”. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.

Schwecke T, et al,. (1995) “The biosyntesis gene clustar for polyketide immunosupresant rapamycin”. Proc natl Acad Sci USA 92:7839-7843.

Strobel, Gary & Bryn Daisy. (2003). “Bioprospecting for Microbial Endophytes and

Their Natural products”. Microbiology and Molecular Biology Reviews, p.

Suganda, A. G. (2008). Standardisasi dari Hulu sampai Hilir Syarat Tegaknya

Keamanan, Manfaat dan Kualitas Obat Bahan Alam. Orasi Ilmiah Profesor.

ITB: Tidak diterbitkan.

Sultana, A. (2006). “Mecanistics insghts into the biosyntesis of polyketide antibiotics:.

Sweeden”. Karolinka Institute.

Tan.R.X and W.X.Zou, (2001). “Endophyte : A rich source of fungtional metabolite”.

Nat. Prod, Rep., 18:448-459

Topik, H & Pancoro, A. (2006). “Sistematika dan Filogenetika Molekuler” makalah

kursus singkat aplikasi perangkat lunak PAUP dan Mr Bayes untuk penelitian filogenetika Molekuler. Bandung : Institut Teknologi Bandung.

Tsen et al. (2002). “Natural Plasmid transformation in Eschericia coli”. Journal of Biomedical Science 9, 246 – 252

Tu et al. (2004). “An improved system for competent cell preparation and high efficiency plasmid transformation using different Escherichia coli strain”.

Electronic Journal of Biotechnology : 8 : 0717 - 3458

Vicrey,M & Vicrey. B (1981). Secondary Plant Metabolism, Maryland: University Park Press

Wong et al . (1995). “Genome organization of Ageratum yellow veon virus, a monopartite whitefly-transmited geminivirus isolated from a common weed”.

Journal of general virology.76.2915-292.

Wahyudi, A.T., Prasodjo, B.J & Mubarik, N.R (2010).” Diversity of Antifungal

Compounds-Producing Bacillus spp. Isolated from Rhizosphere of Soybean

Plant Based on ADRA and 16S rRNA”. Hayati journal of Bioscience. 17, (3),

Yusuf, Muhammad, et al. (2002). “Keragaman Gengetika bakteri Tanah Dan Rizosfer Kapas Transgenik di Soppeng, Sulawesi Selatan”. Jurnal Mikrobiologi

Indonesia vol. 7, No. 2, hlm. 39-43 ; Borneman, et al. (1996). “Molecular Microbial Diversity of An Agricultural Soil In Wisconsin”. Appl Environ