ANALISIS MOLEKULER REGIO PRE-S1, PRE-S2, DAN S ISOLAT VIRUS HEPATITIS B 09IDSKAB-3 SKRIPSI Untuk Memenuhi Persyaratan Memperoleh Gelar Sarjana Kedokteran

  ANALISIS MOLEKULER REGIO PRE-S1, PRE-S2, DAN S ISOLAT

  VIRUS HEPATITIS B 09IDSKAB-3 SKRIPSI Untuk Memenuhi Persyaratan Memperoleh Gelar Sarjana Kedokteran ANGGA DWI PRASETYO G.0009014 FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS SEBELAS MARET Surakarta 2012

  ABSTRAK Angga Dwi Prasetyo, G0009014, 2012, Analisis Molekuler Regio Pre-S1, Pre-

  S2, dan S Isolat Virus Hepatitis B 09IDSKAB-3. Skripsi, Fakultas Kedokteran, Universitas Sebelas Maret, Surakarta.

  Latar Belakang: Virus Hepatitis B (VHB) diketahui sebagai salah satu penyakit

  menular paling berbahaya di dunia. VHB merupakan jenis virus untai ganda sirkuler Deoxyribonucleic acid (DNA) yang bereplikasi dengan transkripsi balik. Mutasi genetik regio pre-S1, pre-S2, dan S VHB sering terjadi selama proses trankripsi balik tersebut. Studi ini bertujuan untuk menganalisis genotipe, subtipe, dan variasi genetik pada regio pre-S1, pre-S2, dan S isolat VHB 09IDSKAB-3 yang diperoleh dari komunitas Man Who Have Sex With Man di Surakarta.

  Metode: Produk ekstraksi DNA VHB 09IDSKAB-3 digunakan sebagai cetakan

  untuk amplifikasi regio pre-S1, pre-S2, dan S. Sekuens yang diperoleh selanjutnya disejajarkan dengan metode Clustal W dengan reference sequences (genotipe A- H) yang dilaporkan di GenBank/DDBJ/EMNL. Genotipe VHB ditentukan dengan analisis phylogenetic. Subtipe VHB ditentukan berdasarkan beberapa asam amino yang berada pada sekuens HBsAg. Variasi genetik di regio pre-S1, pre-S2, dan S diidentifikasi dengan MEGA 4.0.

  Hasil: Berdasarkan hasil BLAST dari GenBank, isolat VHB 09IDSKAB-3

  diklasifikasikan ke dalam genotipe B3. Phylogenetic tree menunjukkan bahwa isolat VHB 09IDSKAB-3 diklasifikasikan ke dalam genotipe B3. Berdasarkan beberapa asam amino yang berada pada sekuens HBsAg, isolat VHB 09IDSKAB- 3 diklasifikasikan ke dalam subtipe adw2. Variasi D27E ditemukan pada regio pre-S1 dan tidak ditemukan adanya variasi genetik pada regio pre-S2 maupun S.

  Simpulan: Secara keseluruhan, isolat VHB 09IDSKAB-3 termasuk ke dalam genotipe B3 dan subtipe adw2. Di dalam studi ini hanya ditemukan variasi D27E.

  Variasi tersebut diindikasikan dapat merubah proses replikasi VHB, oleh karena itu diperlukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui pengaruh variasi tersebut.

  Kata kunci: Regio pre-S1, Regio pre-S2, Regio S, VHB

  iv

  ABSTRACT Angga Dwi Prasetyo, G0009014, 2012, Molecular Analysis of Pre-S1, Pre-S2,

  and S Region of 09IDSKAB-3 Hepatitis B Virus Isolate. Mini Thesis, Faculty of Medicine, Sebelas Maret University, Surakarta.

  Background: Hepatitis B Virus (HBV) is known as one of the most dangerous

  infectious disease in the world. HBV is a partially double stranded DNA which replicates through reverse transcription. Genetic mutation frequently found in pre- S1, pre-S2, and S region during such the reverse transcription process. The aim of this study is to analyze genotype, subtype, and genetic variation in pre-S1, pre-S2, and S region of 09IDSKAB-3 HBV isolate from Man Who Have Sex With Man community in Surakarta.

  Methods: 09IDSKAB-3 HBV DNA extraction was used as a template for

  amplication of pre-S1, pre-S2, and S region. The sequence results was then aligned by Clustal W with all of reference sequences (genotype A-H) reported in GenBank/DDBJ/EMNL. HBV genotype was identified by phylogenetic analysis. HBV subtype was deduced on the basis of the predicted amino acid sequences of HBsAg. Genetic variations in pre-S1, pre-S2, and S region were identified using MEGA 4.0.

  Results: Based on BLAST search in GenBank, 09IDSKAB-3 HBV isolate was

  classified into genotype B3. Phylogenetic tree showed that 09IDSKAB-3 HBV isolate was classified into genotype B3. Based on the basis of predicted amino acid sequences of HBsAg, 09IDSKAB-3 HBV isolate was classified into subtype

  adw2 . D27E variation was found in pre-S1 region, and there were not genetic variations in pre-S2 and S region.

  Conclusion: Overall, 09IDSKAB-3 HBV isolate was classified into genoytpe B3

  and subtype adw2. In this study, only D27E variation was found. The amino acid variation may have relevant changes the HBV replication efficiency, therefore, the amino acid variation found in the present report need further study .

  Keywords : Pre-S1 region, Pre-S2 region, S region, HBV

  v

  DAFTAR ISI

  Halaman PRAKATA ......................................................................................................... vi DAFTAR ISI...................................................................................................... vii DAFTAR TABEL ............................................................................................. ix DAFTAR GAMBAR ........................................................................................ x DAFTAR LAMPIRAN ..................................................................................... xi

  BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang ...............................................................................

  1 B. Perumusan Masalah .......................................................................

  3 C. Tujuan Penelitian ...........................................................................

  3 D. Manfaat Penelitian .........................................................................

  3 BAB II LANDASAN TEORI A. Tinjauan Pustaka ............................................................................

  5 1. Virus Hepatitis B (VHB) ...........................................................

  5 2. Hepatitis B Surface Antigen .....................................................

  8 3. Regio Pre-S1, Pre-S2, dan S .....................................................

  9 B. Kerangka Pem ikiran ......................................................................

  11 BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis Penelitian ...............................................................................

  12 B. Lokasi Penelitian ............................................................................

  12 C. Subjek Penelitian ...........................................................................

  12 D. Objek Penelitian .............................................................................

  12 E. Rancangan Penelitian.....................................................................

  13 F. Instrumen Penelitian ......................................................................

  13 1. Alat Penelitian ............................................................................

  13 2. Bahan Penelitian ........................................................................

  14 G. Cara Kerja.......................................................................................

  14 1. Ekstraksi DNA VHB .................................................................

  14 2. Amplifikasi dan Sekuensi PCR.................................................

  16 vii

  3. Sekuensing dan Analisis data....................................................

  17 BAB IV HAS IL PENELITIAN A. Isolasi DNA VHB ..........................................................................

  18 B. Amplifikasi PCR ............................................................................

  18 C. Sekuensing Regio Pre-S1, Pre-S2, dan S Isolat VHB 09IDSKAB-3..................................................................................

  18 D. Proses Analisis Data Molekuler Regio Pre-S1, Pre-S2, dan S Isolat VHB 09IDSKAB-3 .............................................................

  19 E. Hasil Analisis Data dari Isolat VHB 09IDSKAB-3 ....................

  24 BAB V PEMBAHASAN ..................................................................................

  25 BAB VI PENUTUP A. SIMPULAN ...................................................................................

  33 B. SARAN...........................................................................................

  33 DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................

  35 LAMPIRAN viii

BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang Masalah Virus Hepatitis B (VHB) adalah salah satu penyakit menular paling

  berbahaya di dunia. Lebih dari dua miliar orang di dunia yang terinfeksi

  VHB, 400 juta di antaranya berlanjut menjadi kronis, dan 600 ribu orang di antaranya meninggal setiap tahun akibat VHB terkait sirosis dan atau karsinoma hepar (WHO, 2009; Hepatitis B Foundation, 2009). Sedangkan penderita hepatitis B di Indonesia, diperkirakan ada 13 juta orang yang terinfeksi hepatitis B (Depkes RI, 2011). Jumlah tersebut termasuk dalam jumlah terbanyak ketiga di dunia setelah Cina dan India. Oleh karena itu Indonesia digolongkan termasuk ke dalam negara endemis VHB di dunia dengan kategori Intermediate to High (Hwang dan Cheung, 2011).

  Virus Hepatitis B (VHB) merupakan jenis virus untai ganda sirkuler

  

Deoxyribonucleic acid (DNA) dengan gap untai tunggalnya antara 600-2100

  nukleotida (Rodes et al., 2007). Saat VHB bereplikasi melalui transkripsi balik sangat memungkinkan untuk terjadinya mutasi genetik. Mutasi genetik pada proses transkripsi balik tersebut dapat terjadi dengan perkiraan 1,4 s.d

• 5

  3,2 x 10 basa/nukleotida/tahun (Ie et al., 2010). Selain akibat proses transkripsi balik tersebut, respon kekebalan pejamu dan terapi antiviral dapat juga meningkatkan risiko terjadinya mutasi genetik ( Sheldon dan Soriano, 2008 ).

  1 Salah satu mutasi genetik VHB yang paling sering ditemukan adalah mutasi pada regio pre-S1, pre-S2, dan S . Mutasi yang terjadi akibat terjadinya

  delesi pada regio pre-S1 dan pre-S2 merupakan salah satu faktor yang meningkatkan risiko terjadinya karsinoma hepatoseluler bagi penderita VHB

  (Liu et al., 2009) . Sedangkan pada regio S, mutasi yang sering terjadi adalah

  adanya subtitusi G145R pada determinan ‘a’ VHB, yang dikaitkan dengan resistensi terhadap vaksin bagi penderita VHB (Sch iff et al., 2007) . Selain itu

  regio pre-S1, pre-S2, dan S juga sangat menentukan genotipe, subgenotipe, maupun subtipe VHB sehingga apabila terjadi mutasi pada regio tersebut sangat memungkinkan untuk ditemukannya genotipe, subgenotipe, maupun subtipe VHB baru (Schaefer, 2007).

  

Sampai saat ini penelitian mengenai mutasi pada regio pre-S1, pre-S2,

dan S VHB terus berkembang karena analisis molekuler mengenai regio pre- S1, pre-S2, dan S masih sangat diperlukan untuk memperoleh data strategi

  replikasi, patogenesis, diagnosis, terapi, dan vaksin VHB . Sampai bulan Juni

  2012, jumlah publikasi ilmiah mengenai regio pre-S1, pre-S2, dan S VHB

  yang dipublikasikan di PubMed (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/) sudah sebanyak 570 publikasi ilmiah. Sedangkan di Indonesia, sampai bulan Juni 2012 baru ada 15 publikasi ilm iah di PubMed yang membahas regio pre- S1, pre-S2, dan S VHB. Oleh karena itu peluang mengembangkan penelitian mengenai regio pre-S1, pre-S2, dan S untuk pengembangan ilmu pengetahuan mengenai hepatitis B terutama di Indonesia masih sangat diperlukan sehingga penulis sangat tertarik untuk melakukan penelitian mengenai analisis molekuler regio pre-S1, pre-S2, dan S VHB tersebut.

  Sejak tahun 2009, grup riset Blood Borne Virus Universitas Sebelas Maret telah melakukan studi epidemiologi molekuler mengenai virus yang menular melalui darah di antaranya yaitu VHB. Dari kesempatan yang ada ini, penulis tertarik bergabung dalam penelitian tersebut dengan melakukan analisis molekuler regio pre-S1, pre-S2, dan S isolat VHB 09IDSKAB-3 di Laboratorium Biomedik FK UNS.

  B. Perumusan Masalah

  Bagaimanakah analisis molekuler regio pre-S1, pre-S2, dan S iso lat Virus Hepatitis B 09IDSKAB-3? C.

   Tujuan Penelitian

  Penelitian ini bertujuan melakukan analisis molekuler regio pre-S1, pre- S2, dan S iso lat Virus Hepatitis B 09IDSKAB-3.

  D. Manfaat Penelitian 1. Aspek teoritis

  Penelitian ini dapat memberikan informasi ilmiah mengenai analisis molekuler regio pre-S1, pre-S2, dan S isolat Virus Hepatitis B

  09IDSKAB-3.

2. Aspek aplikatif

  Analisis molekuler yang didapatkan melalui penelitian ini dapat digunakan untuk penelitian lanjutan mengenai strategi pembuatan vaksin

  VHB yang lebih adekuat dari pada vaksin yang sudah ada sekarang. Selain itu penelitian ini juga dapat dijadikan bahan rujukan penelitian VHB selanjutnya khususnya terkait dengan regio pre-S 1, pre-S2, dan S.

BAB II LANDASAN TEORI A. Tinjauan Pustaka 1. Virus Hepatitis B (VHB) Virus Hepatitis B (VHB) termasuk dalam famili Hepadnaviridae,

  dan memiliki dua genera, yaitu genus Avihepadnavirus dan

  Orthohepadnavirus . Genus Avihepadnavirus ditemukan pada burung,

  sedangkan genus Orthohepadnavirus ditemukan pada hewan pengerat,

  woolly monkey , dan manusia (Schaefer, 2007). VHB kemudian

  digolongkan menjadi delapan genotipe (A-H) berdasarkan perbedaan intergenotipe paling minimal 8% pada urutan nukleotida lengkap atau lebih dari 4% pada gen S (Rodes et al., 2007).

  Virion VHB (partikel dane) terdiri dari mantel dan nukleokapsidnya. Mantel VHB dahulu dikenal dengan nama Australia antigen yang sekarang lebih dikenal dengan nama hepatitis B surface antigen (HBsAg) (Soemoharjo dan Gunawan, 2008). Sedangkan nukleokapsid VHB terdiri dari subunit protein hepatitis B core antigen (HBcAg) dan hepatitis B ‘e’ antigen (HBeAg) dengan diameter 27 nm (Gambar 2.1) (Kuntz dan Kuntz, 2006; Liang, 2009).

  5

Gambar 2.1 Virion VHB (Liang, 2009).

  VHB memiliki kandungan core berbentuk icosahedral dan memiliki genom (DNA) dengan panjang bervariasi, antara 3185-3284 bp tergantung dari genotipe VHB-nya (Rodes et al., 2007). DNA VHB terd iri dari untai positif dan untai negatif dengan panjang struktur yang tidak sama (partially double stranded DNA) (Soemoharjo dan Gunawan, 2008). Dua untai tersebut sebenarnya berbentuk lurus, tetapi karena terjad i overlaps 234 basa pada posisi 5’ terminal DNA VHB menjadikan DNA VHB berbentuk sirkuler (Gambar 2.2) (Rodes et al., 2007).

  DNA VHB akan menyandi empat Open Reading Frame (ORF) yang letaknya saling berhimpitan, yaitu ORF S untuk gen S (Surface); ORF C untuk gen C (Core); ORF X untuk gen X, dan ORF P untuk gen P (Polymerase). Masing-masing ORF mengkode protein VHB, yaitu HBsAg dari gen S, HBcAg dari gen C, HBxAg dari gen X, dan DNA polymerase dari gen P (Kuntz dan Kuntz, 2006; Liang, 2009). ORF pada genom VHB dikontrol oleh empat promotor (promotor pre-S1, pre-S2, core, dan x) dan dua enhancer (Enh1 dan Enh2), yang berfungsi dalam pengaturan transkripsi RNA dan sinyal poliadenilasi yang dibutuhkan untuk replikasi DNA. Ada dua regio penting lain yang juga berperan dalam replikasi VHB yaitu DR1 (Direct Repeat 1) dan DR2 (Direct Repeat 2). (Gambar 2.2) (Rodes et al., 2007).

Gambar 2.2 Genom VHB (Liang, 2009).

  DNA VHB merupakan virus yang melakukan replikasi dengan cara transkripsi balik. Dalam replikasi tersebut, partially double stranded DNA akan mengalami proses DNA repair menjadi berbentuk covalently closed

  circular (ccc) DNA. cccDNA akan mengalami transkripsi menjadi

  pregenom RNA (pgRNA) dan beberapa messenger RNA (mRNA: mRNA LHBsAg, mRNA MHBsAg, dan mRNA SHBsAg). Translasi pgRNA dan mRNA akan menghasilkan HBcAg, HBeAg, dan enzim polimerare, sedangkan translasi mRNA LHBsAg, MHBsAg, dan SHBsAg akan menghasilkan komponen protein HBsAg yaitu large (L) HBsAg, middle (M) HBsAg, dan small (S) HBsAg. Dalam proses selanjutnya pgRNA akan dimaturasi dengan proses transkripsi balik dengan dibantu enzim polimerase. Proses ini dimulai dengan proses priming sintesis untai DNA (-) yang terjadi bersamaan dengan degradasi pgRNA, dan selanjutnya berlangsung sintesis DNA (+) sehingga diperoleh DNA VHB secara utuh (Soemoharjo dan Gunawan, 2008).

2. Hepatitis B Surface Antigen (HBsAg)

  Hepatitis B surface Antigen (HBsAg) ada dalam tiga bentuk, yaitu selubung luar virion dan partikel HBsAg lepas yang berbentuk sferis (bulat) dan tubuler (filamen) (Soemoharjo dan Gunawan, 2008). Dalam perjalanan infeksi VHB, ada saat-saat dimana ketiga bentuk partikel tersebut dapat ditemukan dalam darah secara bersamaan (Liang, 2009).

  Semua partikel HBsAg selalu memiliki antigen ‘a’ yang sering dinamakan determinan ‘a’. Di samping itu ada dua pasang subdeterminan lain pada HBsAg, yaitu subdeterminan ‘d’ atau ‘y’, dan subdeterminan ‘w’ atau ‘r’. Atas dasar determinan ‘a’ dan subdeterminan tersebut didapatkan subtipe HBsAg yaitu adw, adr, ayw, dan ayr (Rodes et al., 2007). Subdeterminan ini ditentukan oleh jenis asam amino yang menduduki posisi tertentu yaitu nomor 122 dan 160. Bila mula-mula hanya ada 4 subtipe yaitu adw, adr, ayw, ayr ada tambahan subtipe baru, yaitu ayw1- ayw 4, adw2, adw4, adrq-, dan adrq+ (Soemoharjo dan Gunawan, 2008).

  Ada tiga jenis protein dari HBsAg yang diterjemahkan oleh ORF S yaitu large protein (LHBsAg), middle protein (MHBsAg), dan small

  

protein (SHBsAg). Protein ini dibedakan berdasarkan ukuran yang terjadi

karena penambahan asam amino pada akhiran dari domain SHBsAg.

  MHBsAg mengandung regio pre-S2 yang ditambahkan pada SHBsAg, sedangkan LHBsAg terdiri dari regio pre-S1 dan sekuens MHBsAg (Gambar 2.3) (Liang, 2009).

  3. Regio Pre-S1, Pre-S2, dan S

Gambar 2.3 Regio Pre-S1, Pre-S2, dan S (Chai et al., 2007).

  Regio pre-S dan S VHB merupakan regio yang memiliki jumlah asam amino sekitar 400 aa (Gambar 2.3) (Hung et al., 2011). Regio pre-S kemudian dapat dibagi menjadi pre-S1 dan pre-S2. Regio pre-S1 memiliki panjang kira-kira 2848-3215 nukleotida dan regio pre-S2 memiliki panjang kira-kira 1-154 nukleotida. Sedangkan untuk regio S memiliki panjang sekitar 155-835 nukleotida (Soemoharjo dan Gunawan, 2008). Regio pre-S merupakan regio yang sangat menentukan infektivitas VHB. Sifat dari regio pre-S sangat hidrofilik dan sangat sensitif terhadap protease. Sedangkan, regio S bersifat hidrofobik pada bagian yang menghadap ke dalam membran dan hidrofilik pada bagian yang menghadap luar, serta sangat resisten tehadap protease (Shen et al., 2009).

  Regio pre-S dan S merupakan regio yang sangat rentan terjadi mutasi. Mutasi yang terjadi pada regio pre-S dan S terjadi di beberapa tempat. Pada regio pre-S dapat terjadi akibat delesi pada 3’ terminal regio pre-S1, delesi pada start codon dari pre-S2, delesi pada 5’ terminal regio pre-S2, dan mutasi titik pada start codon regio pre-S2. Semua mutasi ini dikaitkan dengan risiko terjadinya karsinoma hepatoseluler (Liu et al., 2009). Mutasi yang paling sering terjadi pada regio pre-S adalah pada regio pre-S2, yaitu terjadinya delesi 2-55 nukleotida pada start codon regio pre-S2 (Fang et al., 2008; Hung et al., 2002).

  

Pada regio S, mutasi dapat terjadi akibat hilangnya determinan ‘a’

(escape mutant). Mutasi yang paling sering terjadi pada regio S terjadi

  akibat subtitusi Glisin menjadi Arginin pada kodon 145 (G145R) dan Aspartat menjadi Alanin pada kodon 144 (D144A) di determinan ‘a’.

  Mutasi ini ditemukan setelah pasien yang terinfeksi VHB diberikan vaksin VHB (Revill dan Locarnini, 2005; Schiff et al., 2007).

B. Kerangka Pemikiran

  Kandidat Diagnostik

  Isolat VHB 09IDSKAB-3 Sekuensing

  Kloning Gen Penyandi Regio Pre-S1, Pre-S2, dan S Analisis Regio Pre-S1, Pre-S2, dan S

  Vaksin Kandidat Diagnostik

  Ekspresi Mutasi pada Regio S

  Fokus Penelitian Ekspresi Mutasi pada

  Regio Pre-S1 dan Pre-S2 Vaksin

BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis Penelitian Penelitian ini bersifat eksploratif. B. Lokasi Penelitian Penelitian dilakukan di Laboratorium Biomedik Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret. C. Subjek Penelitian Sampel darah yang diperoleh dari komunitas Man Who Have Sex With Man . D. Objek Penelitian Objek penelitian adalah aliquot sampel HBsAg positif.

  12

  E. Rancangan Penelitian

  Sampel Darah dari Komunitas Man Who Have Sex With

  Man

  Uji Serologi HBsAg

• Isolasi DNA

  Skripsi PCR

  Sekuensing Analisis Regio Pre-S1, Pre-S2, dan S

  F. Instrumen Penelitian 1.

   Alat Penelitian:

  a. centrifuge (Eppendorf, Hamburg, Jerman); b. thermocycler (Eppendorf, Hamburg, Jerman); c. micropipet (P1000, P200, P10) (Gilson, Wisconsin, USA); d. vortex (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA); e. microwave (Panasonic, Osaka, Jepang); f. deepfreezer (New Brunswick Scientific, New Jersey, USA ); g. tube rack; l. apparatus

  elektroforesis (chamber, comb, dan power supply) (BioRad, California,

  USA); h. gel documentation (BioRad, California, USA); i. autoclave (Hirayama, Saitama, Jepang); j. refrigerator (Sharp, Osaka, Jepang); k.

  class II safety cabinet (ESCO, Oregon, USA); l. digital scale (Mettler

  Toledo, Greifensee, Switzerland); m. magnetic stirrer (Cimarex, Colorado, USA); n. Glove; o. Masker; p. Tissue.

2. Bahan Penelitian:

  a. 96-100% ethanol; b. Sampel untuk isolasi DNA; c. Phospate Buffered Saline (PBS); d. Tabung microsentifuge steril dan bebas DNAse; e.

  TM Water baths or heat blocks ; f. PureLink Viral RNA/DNA Mini Kit

  (Invitrogen, California, USA); h. Proteinase K (20 mg/m l); i. RNase A (20 mg/m l); j. 12,5 µl GoTaq® Green Master Mix, 2X (Promega, Wisconsin, USA); k. 2,5 µl upstream primer 10 µM; l. 2,5 µl

  downstream primer 10 µM; m. 5 µl DNA template; n. 25 µl Nuclease- Free Water .

G. Cara Kerja 1. Ekstraksi DNA VHB

  DNA VHB diekstraksi dengan menggunakan PureLink™ Viral

  

RNA/DNA Mini Kit , protokol dalam menggunakannya sebagai berikut:

a. Lysate disiapkan.

  b. Binding DNA:

  TM

  1) PureLink Spin Column dipindahkan ke dalam collection tube dari package.

  2) Lysate (~640 µl) dengan lysis/binding buffer dan etanol dimasukkan ke dalam PureLink

  

TM

Spin Column.

  3) Column dipusingkan dengan 10.000 x g selama satu menit. 4) Collection tube dibuang dan spin column ditempatkan dalam collection tube baru.

  c. Pembilasan DNA 1) Column dibilas dengan 500 µl wash buffer 1 yang disiapkan dengan etanol.

  2) Column dipusingkan dengan 1000 x g selama satu menit pada suhu ruangan. Kemudian collection tube dibuang dan ditempatkan pada

  collection tube baru.

  3) Column dicuci dengan menggunakan 500 µl wash buffer 2 yang disiapkan dengan etanol.

  4) Column dipusingkan pada kecepatan maksimum selama tiga menit pada suhu ruangan. Kemudian collection tube dibuang.

  d. Eluting DNA: 1) Spin column ditempatkan ke dalam 1,5 ml microsentrifuge tube steril.

  2) DNA dielusikan menggunakan 25-200 µl PureLink

  TM Genomic elution buffer .

  3) Column diinkubasi pada temperatur ruangan selama satu menit. 4) Column dipusingkan pada kecepatan maksimum selama satu menit.

2. Amplifikasi dan Sekuensi PCR

  Proses amplifikasi DNA VHB regio pre-S1, pre-S2, dan S menggunakan kit GoTaq® Green Master Mix dan primer KL-12 dan KL- 33 (Okamoto et al., 1990), dengan protokol sebagai berikut:

  a. GoTaq® Green Master Mix dicairkan dalam temperatur ruangan, kemudian dipusingkan sebentar dengan microsentrifuge.

  b. Komponen berikut ditambahkan ke dalam PCR tube on ice: Komponen Jumlah

  GoTaq® Green Master Mix 12,5 ml upstream primer 10 µM (KL 12) 1 ml downstream primer 10 µM (KL 33) 1 ml

  DNA template 5 µl

  Nuclease-Free Water 25 ml o

  c. Kemudian dilakukan proses preheated pada suhu 94 C selama 5 menit, selanjutnya dilakukan 40 kali siklus PCR yang terdiri dari:

  Denaturation 94°C 1 menit Annealing 55 °C 1 menit Extension 72 °C 2 menit o

  d. Setelah siklus selesai suhu diatur agar dalam kondisi 4

  C, kemudian

  o produk PCR dapat disimpan pada suhu –20 C hingga digunakan.

  e. Produk PCR kemudian dianalisis dengan menggunakan gel agarose 2% yang divisualisasikan dengan EtBr.

H. Sekuensing dan Analisis Data

  Sekuens nukleotida dari hasil amplifikasi ditentukan menggunakan

  

BigDye deoxy Terminator v1.1 cycle sequencing kit (Applied Biosystems) dan

ABI Prism 310 genetic analyzer (Perkin Elmer). Data sekuens yang diperoleh

  kemudian dibandingkan dengan Bank data VHB di GenBank/DDBJ/EMBL dan dianalisis dengan menggunakan aplikasi MEGA 4.0 (Tamura et al., 2007).

BAB IV HASIL PENELITIAN A. Isolasi DNA VHB Sampel darah yang diperoleh dari komunitas Man Who Have Sex With Man yang positif dengan uji HBsAg selanjutnya dilakukan ekstraksi DNA TM

  dengan menggunakan PureLink Viral RNA/DNA Mini Kit sehingga diperoleh hasil isolat DNA VHB 09IDSKAB-3.

  B. Amplifikasi PCR

  Produk isolasi DNA VHB yang telah diperoleh selanjutnya digunakan sebagai cetakan untuk amplifikasi regio pre-S1, pre-S2, dan S dengan menggunakan GoTaq® Green Master Mix. Dalam amplifikasi dengan PCR tersebut, pasangan primer yang digunakan adalah KL-12 dan KL-33 (Okamoto et al., 1990). Hasil amplifikasi menunjukkan isolat VHB 09IDSKAB-3 positif dengan primer KL-12 dan KL-33.

  C. Sekuensing Regio Pre-S1, Pre-S2, dan S VHB

  Isolat VHB 09IDSKAB-3 selanjutnya dilakukan penentuan sekuens nukleotida dengan menggunakan BigDye deoxy Terminator v1.1 cycle

  

sequencing kit (Applied Biosystems) dan ABI Prism 310 genetic analyzer

  (Perkin Elmer) (Lampiran 2). Sekuens nukleotida yang didapat kemudian

  18 digunakan untuk mencari isolat dengan kemiripan sekuens tertinggi pada suatu daerah menggunakan aplikasi Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Lampiran 3). Dari hasil BLAST tersebut didapatkan data isolat yang memiliki skor BLAST terbesar dengan isolat VHB 09IDSKAB-3 yaitu isolat VHB AB554070 (Lampiran 4).

D. Proses Analisis Data Molekuler Regio Pre-S1, Pre-S2, dan S Isolat VHB

  09IDSKAB-3

  Dalam usaha mencari informasi dan data pada tingkat molekuler dari isolat VHB 09IDSKAB-3 dengan isolat di dunia, data yang diperoleh dari hasil BLAST tersebut selanjutnya dijadikan pembanding kemiripan dan kedekatan isolat VHB 09IDSKAB-3 dengan isolat VHB yang ada di dunia.

  Pada proses selanjutnya penulis mencari reference sequences yang digunakan sebagai data pembanding untuk melihat phylogenetic tree dari isolat VHB 09IDSKAB-3. Data dari hasil tersebut diperoleh kedekatan genotipe maupun subgenotipe isolat VHB 09IDSKAB-3 dengan reference

  

sequences yang ada di dunia. Untuk membuat phylogenetic tree, sampel

  disejajarkan dengan reference sequences yang didapatkan dari

  

GenBank /DDBJ/EMBL. Reference sequences untuk VHB dari genotipee A-H

dapat dilihat pada tabel 4.1.

Tabel 4.1 Daftar Reference Sequences yang Digunakan dalam Analisis Regio Pre-S1, Pre-S2, dan S Isolat VHB 09IDSKAB-3.

  11 C4 AB048704

  22 G AF160501

  21 F X69798

  20 E X75657

  19 D6 AB493845

  18 D5 DQ315779

  17 D4 AB048702

  16 D3 X75668

  15 D2 X72702

  14 D1 AY161157

  13 C6 AB493841

  12 C5 AB241110

  10 C3 X75656

  NO

  9 C2 AF533983

  8 C1 AF068756

  7 B6 DQ463787

  6 B5 AB219427

  5 B4 AB073835

  4 B3 D00331 dan AB033555

  3 B2 AB073827

  2 B1 AB010291

  1 A S50225

  Reference Sequences

  Subgenotipe

  VHB Genotipe/

  23 H AY090454

  Seluruh sekuens tersebut sebelumnya disajikan menggunakan program CLC Sequence Viewer, yang selanjutnya dilakukan phylogenetic analysis menggunakan aplikasi MEGA 4.0 (Tamura et al., 2007) (Lampiran 5). Data dari hasil phylogenetic analysis tersebut kemudian disajikkan dalam bentuk phylogenetic tree (Gambar 4.1).

  Keterengan: : Isolat sampel : Isolat VHB hasil BLAST

  Phylogenetic Tree

Gambar 4.1 Berdasarkan Regio Pre-S1, Pre-S2, dan S Isolat VHB

  09IDSKAB-3 yang Dibandingkan dengan Reference Sequences dari Masing-Masing Genotipe VHB (A-H). Analisis penentuan subtipe dari isolat VHB 09IDSKAB-3 dilakukan dengan menggunakan aplikasi MEGA 4.0. Data yang diambil dalam analisis ini diperoleh dari multiple alignment asam amino dari sekuens HBsAg VHB isolat VHB 09IDSKAB-3 pada posisi asam amino 116-183. Seluruh

  reference sequences maupun data hasil BLAST dicocokkan, kemudian dilihat

  pada deteminan ‘a’ dan asam amino pada posisi 122, 127, 134, 159, 160, dan 177 untuk menentukan subtipe dari isolat VHB 09IDSKAB-3 (Gambar 4.2).

Gambar 4.2 Penyejajaran Asam Amino Posisi 116-183 Regio S (determinan ‘a’)

  dari Isolat VHB 09IDSKAB-3 dengan Reference Sequences Subtipe VHB.

  Selain menganalisis genotipe, subgenotipe, dan subtipe dari isolat VHB

  09IDSKAB-3. Analisis regio pre-S1, pre-S2, dan S VHB pada penelitian ini juga dilakukan pada tingkat asam amino dan nukleotida dari isolat VHB

  09IDSKAB-3 untuk mengetahui ada atau tidaknya mutasi pada regio pre-S1, pre-S2, dan S dari isolat tersebut. Hasil dari multiple alignment pada regio pre-S1, pre-S2 dan S dapat dilihat pada gambar 4.3-4.5.

Gambar 4.3 Regio Pre-S1 dari Isolat VHB 09IDSKAB-3 Dibandingkan

  dengan Reference Sequences yang Memiliki Genotipe B3 (aa 1-119).

Gambar 4.4 Regio Pre-S2 pada Isolat VHB 09IDSKAB-3 Dibandingkan

  dengan Reference Sequences yang Memiliki Genotipe B3 (aa 1-55).

Gambar 4.5 Regio S pada Isolat VHB 09IDSKAB-3 dengan Jumlah 168 aa

  Dibandingkan dengan Reference Sequences dengan Genotipe B3.

E. Hasil Analisis Data dari Isolat VHB 09IDSKAB-3 (Accession Number: JQ965941)

  Hasil phylogenetic analysis dari isolat

  VHB

  09IDSKAB-3 menunjukkan bahwa isolat tersebut termasuk ke dalam genotipe B3 (Gambar 4.1). Data dari hasil BLAST pada isolat ini menunjukkan bahwa isolat ini memiliki skor BLAST tertinggi dengan isolat VHB AB554070 (Lampiran 3).

  Isolat VHB AB554070 merupakan isolat yang berasal dari Papua (Indonesia) dengan genotipe yang sama dengan isolat VHB 09IDSKAB-3.

  Data pada gambar 4.2 yang merupakan determinan ‘a’ dari VHB memperlihatkan bahwa isolat VHB 09IDSKAB-3 dan AB554070 merupakan isolat VHB yang tergolong dalam subtipe adw2. Pada tingkat regio, data pada regio pre-S1 isolat VHB 09IDSKAB-3 maupun AB554070 tampak adanya perbedaan asam amino dengan reference sequences yang memiliki genotipe B3 yaitu variasi D27E (Aspartic Acid menjadi Glutamic Acid) (Gambar 4.3).

  Sedangkan pada regio pre-S2 maupun regio S tidak ditemukan adanya variasi genetik pada sekuens asam amino isolat VHB 09IDSKAB-3 (Gambar 4.4 dan Gambar 4.5).

BAB V PEMBAHASAN A. Analisis Genotipe dan Subtipe Isolat VHB 09IDSKAB-3 Sugauchi et al. (2002) mengklasifikasikan VHB/B ke dalam dua grup

  yaitu Bj (“j” singkatan dari Jepang) karena paling banyak ditemukan di Jepang dan Ba (“a” singkatan dari Asia), karena ditemukan di seluruh Asia.

  Subgrup dari Ba kemudian dibagi lagi menjadi empat subgenotipe yaitu

  VHB/B2-VHB/B5. Dari keempat jenis subgenotipe VHB tersebut, jenis VHB/B3 merupakan jenis VHB yang paling banyak ditemukan di Indonesia.

  Sedangkan untuk beberapa jenis genotipe dan subgenotipe lainnya yang ada di Indonesia, dapat ditemukan genotipe VHB/A di wilayah Balikpapan dan Kupang, VHB/D berada di wilayah Papua (VHB/D6) dan Maluku (VHB/D1 dan VHB/D3) (Mulyanto et al., 2009; Utama et al., 2009).

  Berdasarkan phylogenetic tree dari isolat VHB 09IDSKAB-3 menunjukkan bahwa isolat tersebut termasuk ke dalam genotipe B3 (Gambar 4.1). Hasil ini dapat dikatakan sesuai dengan teori karena dari studi sebelumnya menyatakan bahwa di Indonesia genotipe yang dominan adalah B3 (Utama et al., 2009). Studi ini juga menunjukkan bahwa isolat VHB

  09IDSKAB-3 termasuk dalam subtipe adw2 (Gambar 4.2). Hasil ini menunjukkan kesesuaian dengan studi yang ada sebelumnya bahwa subtipe

  

adw merupakan subtipe yang paling banyak ditemukan di Indonesia, terutama

  25 di wilayah Sumatra, Jawa, Kalimantan Selatan, Bali, Lombok, Ternate, dan Morotai (Lusida et al., 2003; Mulyanto et al., 1997).

B. Regio pre-S1 Isolat VHB 09IDSKAB-3

  Regio pre-S1 dari LHBsAg diketahui sebagai regio yang sangat penting bagi siklus hidup dan infektifitas VHB (Salisse dan Sureau, 2009). Di dalam regio pre-S1 terdapat beberapa sub-elemen penentu infektifitas VHB, yaitu pada asam amino 2-75. Pada area tersebut terdapat myristoyl yang berikatan

  2

  dengan Gly , receptor binding site (aa 2-48), dan daerah aa 49-75 (Duff et al., 2009). Salah satu sub-elemen tersebut, yaitu (hepatosite) receptor binding

  

site , memiliki sebuah struktur yang cukup berperan dalam siklus hidup VHB,

  struktur tersebut adalah N-terminal dari residu 75 asam amino pada regio pre- S1. N-terminal regio pre-S1 akan mengirimkan sebuah signal berupa

  

myristylation signal , signal ini merupakan signal yang akan membuat N-

  dari regio pre-S1 dapat menempel pada permukaan sel sehingga

  terminal

  protein VHB dapat disekresikan (Chai et al., 2007). Pada proses selanjutnya ketika ikatan dengan membran hepatosit sudah terjadi maka receptor binding

  

site (aa 2-48) akan melengkapi ikatan dan sisa asam amino yang lainnya (aa

49-75) akan menstabilkan ikatan yang terjadi (Duff et al., 2009).

  Mutasi genetik pada aa 2-75 dilaporkan dapat menyebabkan perubahan pada proses replikasi dan infektifitas VHB. Beberapa laporan mutasi genetik yang ada adalah substitusi G2A, delesi area receptor binding site (aa 2-48), dan delesi aa 48-75 (Duff et al., 2009). Dari ketiga letak mutasi, substitusi G2A menjadi mutasi yang menyebabkan perubahan secara signifikan pada proses pengiriman myristylation signal sehingga terjadi gangguan pada proses replikasi dan infektifitas VHB (Yeung et al., 2011). Di dalam sekuens dari isolat VHB 09IDSKAB-3, tidak menunjukkan adanya substitusi G2A maupun delesi pada receptor binding site dan aa 49-75. Data dari isolat VHB

  09IDSKAB-3 hanya ditemukan adanya variasi D27E (Gambar 4.3). Namun, studi yang menyatakan variasi yang terjadi pada isolat VHB 09IDSKAB-3 memang belum ada sehingga pengaruhnya terhadap infektifitas VHB juga belum diketahui secara pasti.

  Selain sub-elemen aa 2-75 pada regio pre-S1, di dalam regio pre-S1 juga terdapat beberapa area lain yang memiliki fungsi tertentu, di antaranya adalah promotor S (aa 67-111) dan kotak CCAAT (nt 3137-3141) (Yeung et al., 2011). Promotor S berperan cukup penting dalam menjaga keseimbangan dari sintesis tiga protein HBsAg (large, middle, dan small). Di dalam studi sebelumnya yang dilakukan oleh Yeung et al. (2011), delesi pada promotor S dilaporkan dapat merubah keseimbangn sintesis protein dari HBsAg dimana akan berakibat pada peningkatan stres pada Retikulum Endoplasma (RE).

  Stres tersebut kemudian dikaitkan dengan berkembangnya penyakit karsinoma hepatoseluler. Di dalam studi ini, isolat VHB 09IDSKAB-3 diketahui bahwa promotor S terkonservasi dengan baik sehingga tidak ditemukan indikasi adanya stres dari RE yang diakibatkan mutasi promotor S.

  Mutasi yang terjadi pada kotak CCAAT dilaporkan dapat meningkatkan stres dari RE sehingga dapat memperburuk penyakit hepatitis yang diderita. Namun, fungsi dari CCAAT dalam perjalanan penyakit VHB masih dipertanyakan (Yeung et al., 2011). Isolat VHB 09IDSKAB-3 tidak ditemukan adanya mutasi pada kotak CCAAT sehingga dapat dikatakan peningkatan stres pada RE yang diakibatkan o leh mutasi pada kotak CCAAT tidak ditemukan.

  Pada studi sebelumnya yang dilakukan dengan matched nested case-

  

control sudy menyebutkan terdapat keterkaitan antara delesi yang terjadi

  pada regio pre-S1 dengan meningkatnya risiko terjadinya karsinoma hepatoseluler (Fang et al., 2008). Yeung et al. (2011) juga menyebutkan bahwa adanya delesi pada regio pre-S1 dapat meningkatkan risiko berkembangnya karsinoma hepatoseluler pada penyakit hepatitis B kronis.

  Delesi yang terjadi pada regio pre-S1 tersebut adalah pada start codon dan daerah 3’ terminal dari regio pre-S1. Kejadian delesi yang paling berpengaruh terhadap berkembangnya karsinoma hepatoseluler adalah delesi pada daerah regio pre-S1. Di dalam sekuens asam amino isolat VHB

  3’ terminal

  09IDSKAB-3 tidak ditemukan adanya delesi start codon dan 3’ terminal regio pre-S1 sehingga indikasi adanya peningkakan risiko berkembangnya karsinoma hepatoseluler tidak ditemukan.

C. Regio pre-S2 Isolat VHB 09IDSKAB-3

  Regio pre-S2 merupakan regio hidrofilik yang memiliki beberapa sub-

  112

  elemen penting bagi infektifitas VHB yaitu asam amino asparagine (N112) dan area human serum albumin receptor (aa 17-28). Asam amino

  112 asparagine (N112) diketahui berkaitan penting dengan mekanisme N- glycosylation yang berperan dalam proses replikasi dan maturasi VHB

  (Rodes et al., 2007). N-glycosilation diketahui berperan penting pada berbagai protein, perannya antara lain sebagai protein folding, kontrol kualitas protein, sekresi protein, dan modulasi dari respon imun. Secara lebih khusus, N-glycosylation memiliki fungsi berdasarkan ukuran protein HBsAg- nya. Pada LHBsAg dan SHBsAg, N-glycosilation berperan dalam replikasi

  VHB, sedangkan pada MHBsAg diketahui bahwa N-glycosilation berperan dalam maturasi VHB (Lambert dan Prange, 2007). Mutasi genetik N112 dilaporkan dapat menyebabkan terhambatnya replikasi dan maturasi VHB. Pada isolat VHB 09IDSKAB-3, N112 diketahui terkonservasi dengan baik sehingga indikasi terhambatnya maturasi VHB tidak ditemukan.

  Area human serum albumin receptor belum diketahui secara jelas fungsinya, namun dipercaya berperan penting bagi infektifitas VHB. Mutasi genetik yang terjadi pada area ini juga belum diketahui secara jelas pengaruhnya terhadap perjalanan penyakit (Yeung et al., 2011).

  Mutasi pada regio pre-S2 dilaporkan dapat menyebabkan produksi protein di dalam RE secara berlebihan sehingga dapat meningkatkan stres dari RE. Stres RE ini dapat berakibat pada kerusakan DNA dan ketidakstabilan genom yang akhirnya memicu karsinoma hepar (Hsieh et al., 2004). Hsieh et al. (2007) melaporkan bahwa mutasi pada regio pre-S2 dapat menyebabkan kerusakan pada cyclin-dependent kinase inhibitor yang menyebabkan siklus sel tidak terkontrol sehingga menimbulkan mekanisme onkogenik.

  Hasil studi meta analysis dan a match nested case-control study menunjukkan delesi pada daerah 5’ terminal regio pre-S2 menjadi mutasi paling banyak ditemukan pada orang yang terkena karsinoma hepar (Fang et al., 2008; Liu et al., 2009). Di dalam studi lain juga dijelaskan selain delesi pada daerah 5’ terminal regio pre-S2, mutasi juga dapat ditemukan berupa delesi dan mutasi titik pada start codon regio pre-S2 (Yeung et al., 2011). Di dalam isolat VHB 09IDSKAB-3, tidak ditemukan adanya mutasi tersebut, maka dapat dikatakan peningkatan risiko untuk perkembangnya karsinoma hepatoseluler pada isolat VHB 09IDSKAB-3 tidak ditemukan jika dilihat dari faktor regio pre-S2.

D. Regio S Isolat VHB 09IDSKAB-3

  Di dalam regio S terdapat suatu regio hidrofilik yang dikenal dengan

  

Major Hidrophilic Region (MHR) (aa 101-172). MHR merupakan area yang

  memiliki penentu antigenitas VHB yang disebut determinan ‘a’. Di dalam MHR terdapat polipeptida yang akan mendefinisikan determinan ‘a’ pada reseptor. Polipeptida ini memiliki struktur berbentuk setengah lingkaran dan disebut dengan Antigen Loop (AGL). Peran AGL antara lain menginisiasi perlekatan ke sel dan pelekat spesifik pada reseptor. Letak AGL pada dasarnya berada di antara aa 101-172 (loop pertama: aa 120-138 dan loop kedua 139-149), yaitu di antara area transmembran II (aa 80-100) dan area C-

  terminal yang bersifat hidrofobik (aa 173-226) (Duff et al., 2009; Salisse dan Sureau, 2009).

  Secara setruktur dan fungsi, di dalam AGL terdapat asam amino yang sangat berpengaruh terhadap infektifitas VHB yaitu C121, C124, C137, C139, C147, C149, dan N146. Keenam asam amino cysteine (C) sangat terkonservasi dengan baik dan memiliki peranan penting karena memiliki ikatan disulfida yang sangat diperlukan dalam menjaga struktur dari

  

146

  determinan ‘a’, sedangkan asparagine (N146) memiliki peranan dalam perlekatan virus ke sel karena berperan penting dalam mekanisme N-

  glycosylation (Rodes et al., 2007; Yong-lin et al., 2012).

  Perubahan genetik pada AGL diketahui sangat mempengaruhi infektifitas VHB. Mutasi genetik terutama yang terjadi pada asam amino yang berperan penting bagi infektifitas VHB dapat merubah kemampuan