B1J010189 9 1.
Lampiran 1. Diagram Alir Penelitian
Kultur Isolat S. pneumoniae
hasil seleksi pada Media BA
5% + Gentamisin
Uji Mikrobiologis
Ekstraksi DNA
(Uji sensitivitas antibiotik)
Duplex PCR
Gen erm(B)
Gen mef(A) & erm(B)
Analisis Data
Gen mef(A)
Lampiran 2. Spesifikasi Alat dan Bahan
No.
1.
Nama Alat
Erlenmeyer
Merek/Tipe
Duran, 100 dan
500 mL
LabServ
Kegunaan
Tempat pembuatan
media
Tempat media agar
2.
Cawan petri plastik
3.
pH meter
Thermo Orion 2
Star pH Benchtop
Barnstead
Thermolyne
Cimarec
Precisa
Mengukur pH
4.
Heater dan
pengaduk elektrik
5.
Timbangan digital
6.
Esco
7.
Laminar Air Flow
Cabinet
Mikropipet
8.
Tips
Thermo ; 0,5 µl1000 µl
9.
Autoklaf
Hirayama
10.
Refrigerator
Sanyo
11.
Biomedical Freezer
o
-86 C
Thermo Freezer
12.
Biomedical Freezer
o
-30 C
Sanyo
13.
Disposable cotton
bud
Puritan
14.
Vortex mixer
VM-300 K
15.
Alat sentrifugasi
16.
Inkubator
Thermo Heraeus
Centrifuge
Forma Scientific
17.
Sarung tangan nitril
18.
Mengaduk suspensi
media
Tempat
Lab. Mikrobiologi
Lembaga Eijkman
Lab. Mikrobiologi
Lembaga Eijkman
Lab. Mikrobiologi
Lembaga Eijkman
Lab. Mikrobiologi
Lembaga Eijkman
Mengukur berat
bahan pembuat
media
Tempat bekerja
secara aseptis
Meneteskan suatu
larutan dengan
akurasi tinggi
Tempat meneteskan
larutan pada
mikropipet
Tempat sterilisasi
mekanik
Tempat
penyimpanan media
Tempat
penyimpanan isolat
cair
Tempat
penyimpanan sampel
DNA
Mengulas suspensi
antibiotik dan bakteri
pada media
Menghomogenkan
suatu suspensi
Mengsentrifugasi
suatu suspensi
Menginkubasi biakan
murni mikoba
Lab. Mikrobiologi
Lembaga Eijkman
Hand Seal
Melindungi tangan
dari kontaminan
Lab. Mikrobiologi
Lembaga Eijkman
Tabung vial
Eppendorf; 1,5 ml
Menyimpan sampel
DNA
Lab. Mikrobiologi
Lembaga Eijkman
19.
Tabung cryotube
NUNC; 1,8 mL
Lab. Mikrobiologi
Lembaga Eijkman
20.
Multiblok heater
Thermo Scientific
Menyimpan media
STGG/mikroba murni
dalam bentuk cair
Memanaskan sampel
Eppendorf; 0,5 µl1000 µl
25
Lab. Mikrobiologi
Lembaga Eijkman
Lab. Mikrobiologi
Lembaga Eijkman
Lab. Mikrobiologi
Lembaga Eijkman
Washing Facility
Lembaga Eijkman
Lab. Mikrobiologi
Lembaga Eijkman
Lembaga Eijkman
Lembaga Eijkman
Lab. Mikrobiologi
Lembaga Eijkman
Lab. Mikrobiologi
Lembaga Eijkman
Lab. Mikrobiologi
Lembaga Eijkman
Lab. Mikrobiologi
Lembaga Eijkman
Lab. Mikrobiologi
Lembaga Eijkman
21.
Disposable ose
NUNC
Menginokulasi
bakteri
Lab. Mikrobiologi
Lembaga Eijkman
22.
Mesin thermal
cycler/ PCR
Applied
BioSystems 9700
Ruang PCR
Lembaga Eijkman
23.
Spektrofotometer
Nano Drop ND1000
Mengamplifikasi
sekuens DNA
tertentu
Mengukur
kuantifikasi DNA
24.
Apparatus
elektroforesis
Bio-Rad
25.
Power Pac Basic
Bio-Rad
26.
Gel-Doc 1000
Bio-Rad
27.
Jarum ose
Menginokulasi isolat
mikroba
Lab. Mikrobiologi
Lembaga Eijkman
28.
Pembakar bunsen
Menciptakan suasana
aseptis
Lab. Mikrobiologi
Lembaga Eijkman
29.
Tabung reaksi
Duran
Menyimpan suspensi
cair
Lab. Mikrobiologi
Lembaga Eijkman
30.
Water bath
Barnstead
Menjaga suhu media
tetap hangat
Lab. Mikrobiologi
Lembaga Eijkman
31.
Alumunium foil
Klin-Pak
Menutup erlenmeyer
Lab. Mikrobiologi
Lembaga Eijkman
32.
Tissue
Multi
Membersihkan meja
kerja
Lab. Mikrobiologi
Lembaga Eijkman
33.
PCR Cabinet
Scie-Plas
Lab. Mikrobiologi
Lembaga Eijkman
34.
Lilin
Memasukkan sampel
DNA yang akan
diamplifikasi
Sumber panas
35.
Jar (toples kaca)
Lab. Mikrobiologi
Lembaga Eijkman
36.
Rak tabung reaksi
Menyimpan media
berisi biakan kultur
bakteri anaerob
Menyimpan tabung
reaksi
37.
Biological Safety
Cabinet
Tempat bekerja
secara aseptis
Lab. Mikrobiologi
Lembaga Eijkman
Memisahkan molekul
DNA berdasarkan
ukurannya
Sumber arus listrik
untuk running
elektroforesis
Visualisasi hasil
elektroforesis gel
Nuaire
26
Lab. Konversi
Energi (Lab 1)
Lembaga Eijkman
Lab. Mikrobiologi
Lembaga Eijkman
Lab. Mikrobiologi
Lembaga Eijkman
Ruang PCR
Lembaga Eijkman
Lab. Mikrobiologi
Lembaga Eijkman
Lab. Mikrobiologi
Lembaga Eijkman
Lampiran 2. (lanjutan)
No.
Nama Bahan
Spesifikasi
Kegunaan
1,5 mL
Isolat bakteri yang tidak
peka terhadap Eritromisin
2.
Isolat murni Streptococcus
pneumoniae tidak peka
terhadap Eritromisin
Darah domba
5%
3.
Gentamisin
50 mg/mL
4.
ddH2O
500 mL
Sebagai media tumbuh S.
pneumoniae
Untuk menghindari
kontaminasi bakteri lain
terutama Staphylococcus
Sebagai pelarut
5.
Etanol
70%
Desinfektan
6.
Mueller-Hinton Broth
1 mL
7.
Mueller-Hinton Agar
500 g
8.
Gel agarosa
1%
9.
Go-Taq Green Master Mix
2x
Larutan nutrisi bakteri untuk
uji sensitivitas antibiotik
Media uji sensitivitas
antibiotik
Media untuk elektroforesis
gel
Buffer untuk reaksi PCR
10.
McFarland Standard
No. 0,5
Blangko untuk mengukur
turbiditas suspensi pada uji
sensitivitas antibiotik
11.
180.16 g/mol
Sumber karbohidrat pada
media
12.
Glukosa (Glucose
anhydrous Molecular
Biology Grade)
Gliserol
87%
Sumber lemak pada media
13.
Tryptone Soya Broth
500 g
14.
Tryptone Soya Agar
500 g
15.
Bubuk Skim-Milk
16.
Forward and reverse
primer mef(A)
Forward and reverse
primer erm(B)
DNA ladder
50 µM
Bahan untuk pembuatan
media STGG
Bahan untuk pembuatan
media agar darah
Bahan untuk pembuatan
media agar darah dan STGG
Primer untuk gen mef(A)
50 µM
Primer untuk gen erm(B)
100 bp
DNA Marker pada PCR
20 ng/µL
20.
DNA template S.
pneumoniae
TE Buffer
1x
DNA template yang
digunakan untuk amplifikasi
Buffer ekstraksi DNA
21.
Eritromisin disk
15 µg
Antibiotik jenis makrolida
22.
TBE Buffer
1x
Buffer elektroforesis gel
23.
SYBR Safe
400 µl
Pemberi warna yang
menyisip pada fragmen basa
pada proses elektroforesis
gel
1.
17.
18.
19.
27
Lampiran 3. Komposisi Media Agar Darah Domba 5% + Gentamisin.
Bahan
Darah domba
Tryptone Soya-Agar
Gentamisin
ddH2O
Komposisi
50 ml
40 g
50 µl
1000 ml
28
Lampiran 4. Komposisi Media STGG
Bahan
Skim milk
Tryptone Soya-Broth
Glukosa
Gliserol
ddH2O
Komposisi
2g
3g
0,5 g
10 ml
100 ml
29
Lampiran 5. Komposisi Media Agar Mueller-Hinton + Darah Domba 5%
Bahan
Mueller Hinton Agar
Darah domba
ddH2O
Komposisi
38 g
50 ml
1000 ml
30
Lampiran 6. Komposisi Go Taq Green 2x
Bahan
dATP
dTTP
dGTP
dCTP
MgCl2
Pewarna kuning
Pewarna biru
Taq Polymerase
Buffer
Konsentrasi / Kegunaan
400 M
400 M
400 M
400 M
3mM
Pewarna dengan kecepatan migrasi lebih cepat
dari fragmen DNA berukuran < 50 bp
Pewarna dengan kecepatan migrasi yang sama
dengan DNA berukuran 3-5 kb DNA
Enzim yang mengkatalisis reaksi polimerisasi
Meningkatkan densitas sampel
(Promega, 2012)
31
Lampiran 7. PCR Mix dan Kondisi untuk Duplex PCR
PCR Mix
Volume (µL)
Konsentrasi Akhir
Go Taq Green Mastermix (2x)
erm(B) f-primer (50 µM)
erm(B) r-primer (50 µM)
mef(A) f-primer (50 µM)
mef(A) r-primer (50 µM)
DNA template
ddH O
12,5
0,5
0,5
0,5
0,5
@2
8,5
1x
1 µM
1 µM
1 µM
1 µM
20 ng/µl*
Total
25 µl
2
o
94 C
0.30
o
o
72 C
72 C
1.30
5.00
o
50 C
0.30
o
25 C
Ko dan Song
(2004)
35 Siklus
32
Lampiran 8. PCR Mix dan Kondisi Singleplex PCR mef(A)
PCR Mix
Volume (µL)
Konsentrasi Akhir
Go Taq Green Mastermix (2x)
mef(A) f-primer (50 µM)
mef(A) r-primer (50 µM)
DNA template
ddH O
10
0,5
0,5
@2
12
1x
1 µM
1 µM
20 ng/µl*
Total
25 µl
2
o
93 C
3.00
o
93 C
1.00
o
72 C
5.00
o
72 C
1.00
o
52 C
1.00
o
25 C
Sutcliffe et.al (1996),
dengan sedikit modifikasi.
35 Siklus
33
Lampiran 9. PCR Mix dan Kondisi untuk Singleplex PCR erm(B)
PCR Mix
Volume (µL)
Konsentrasi Akhir
Go Taq Green Mastermix (2x)
erm(B) f-primer (50 µM)
erm(B) r-primer (50 µM)
DNA template
ddH O
10
0,5
0,5
@2
12
1x
1 µM
1 µM
20 ng/µl*
Total
25 µl
2
o
94 C
0.30
o
o
72 C
72 C
1.30
5.00
o
50 C
0.30
o
25 C
Ko dan Song
(2004)
35 Siklus
34
Kultur Isolat S. pneumoniae
hasil seleksi pada Media BA
5% + Gentamisin
Uji Mikrobiologis
Ekstraksi DNA
(Uji sensitivitas antibiotik)
Duplex PCR
Gen erm(B)
Gen mef(A) & erm(B)
Analisis Data
Gen mef(A)
Lampiran 2. Spesifikasi Alat dan Bahan
No.
1.
Nama Alat
Erlenmeyer
Merek/Tipe
Duran, 100 dan
500 mL
LabServ
Kegunaan
Tempat pembuatan
media
Tempat media agar
2.
Cawan petri plastik
3.
pH meter
Thermo Orion 2
Star pH Benchtop
Barnstead
Thermolyne
Cimarec
Precisa
Mengukur pH
4.
Heater dan
pengaduk elektrik
5.
Timbangan digital
6.
Esco
7.
Laminar Air Flow
Cabinet
Mikropipet
8.
Tips
Thermo ; 0,5 µl1000 µl
9.
Autoklaf
Hirayama
10.
Refrigerator
Sanyo
11.
Biomedical Freezer
o
-86 C
Thermo Freezer
12.
Biomedical Freezer
o
-30 C
Sanyo
13.
Disposable cotton
bud
Puritan
14.
Vortex mixer
VM-300 K
15.
Alat sentrifugasi
16.
Inkubator
Thermo Heraeus
Centrifuge
Forma Scientific
17.
Sarung tangan nitril
18.
Mengaduk suspensi
media
Tempat
Lab. Mikrobiologi
Lembaga Eijkman
Lab. Mikrobiologi
Lembaga Eijkman
Lab. Mikrobiologi
Lembaga Eijkman
Lab. Mikrobiologi
Lembaga Eijkman
Mengukur berat
bahan pembuat
media
Tempat bekerja
secara aseptis
Meneteskan suatu
larutan dengan
akurasi tinggi
Tempat meneteskan
larutan pada
mikropipet
Tempat sterilisasi
mekanik
Tempat
penyimpanan media
Tempat
penyimpanan isolat
cair
Tempat
penyimpanan sampel
DNA
Mengulas suspensi
antibiotik dan bakteri
pada media
Menghomogenkan
suatu suspensi
Mengsentrifugasi
suatu suspensi
Menginkubasi biakan
murni mikoba
Lab. Mikrobiologi
Lembaga Eijkman
Hand Seal
Melindungi tangan
dari kontaminan
Lab. Mikrobiologi
Lembaga Eijkman
Tabung vial
Eppendorf; 1,5 ml
Menyimpan sampel
DNA
Lab. Mikrobiologi
Lembaga Eijkman
19.
Tabung cryotube
NUNC; 1,8 mL
Lab. Mikrobiologi
Lembaga Eijkman
20.
Multiblok heater
Thermo Scientific
Menyimpan media
STGG/mikroba murni
dalam bentuk cair
Memanaskan sampel
Eppendorf; 0,5 µl1000 µl
25
Lab. Mikrobiologi
Lembaga Eijkman
Lab. Mikrobiologi
Lembaga Eijkman
Lab. Mikrobiologi
Lembaga Eijkman
Washing Facility
Lembaga Eijkman
Lab. Mikrobiologi
Lembaga Eijkman
Lembaga Eijkman
Lembaga Eijkman
Lab. Mikrobiologi
Lembaga Eijkman
Lab. Mikrobiologi
Lembaga Eijkman
Lab. Mikrobiologi
Lembaga Eijkman
Lab. Mikrobiologi
Lembaga Eijkman
Lab. Mikrobiologi
Lembaga Eijkman
21.
Disposable ose
NUNC
Menginokulasi
bakteri
Lab. Mikrobiologi
Lembaga Eijkman
22.
Mesin thermal
cycler/ PCR
Applied
BioSystems 9700
Ruang PCR
Lembaga Eijkman
23.
Spektrofotometer
Nano Drop ND1000
Mengamplifikasi
sekuens DNA
tertentu
Mengukur
kuantifikasi DNA
24.
Apparatus
elektroforesis
Bio-Rad
25.
Power Pac Basic
Bio-Rad
26.
Gel-Doc 1000
Bio-Rad
27.
Jarum ose
Menginokulasi isolat
mikroba
Lab. Mikrobiologi
Lembaga Eijkman
28.
Pembakar bunsen
Menciptakan suasana
aseptis
Lab. Mikrobiologi
Lembaga Eijkman
29.
Tabung reaksi
Duran
Menyimpan suspensi
cair
Lab. Mikrobiologi
Lembaga Eijkman
30.
Water bath
Barnstead
Menjaga suhu media
tetap hangat
Lab. Mikrobiologi
Lembaga Eijkman
31.
Alumunium foil
Klin-Pak
Menutup erlenmeyer
Lab. Mikrobiologi
Lembaga Eijkman
32.
Tissue
Multi
Membersihkan meja
kerja
Lab. Mikrobiologi
Lembaga Eijkman
33.
PCR Cabinet
Scie-Plas
Lab. Mikrobiologi
Lembaga Eijkman
34.
Lilin
Memasukkan sampel
DNA yang akan
diamplifikasi
Sumber panas
35.
Jar (toples kaca)
Lab. Mikrobiologi
Lembaga Eijkman
36.
Rak tabung reaksi
Menyimpan media
berisi biakan kultur
bakteri anaerob
Menyimpan tabung
reaksi
37.
Biological Safety
Cabinet
Tempat bekerja
secara aseptis
Lab. Mikrobiologi
Lembaga Eijkman
Memisahkan molekul
DNA berdasarkan
ukurannya
Sumber arus listrik
untuk running
elektroforesis
Visualisasi hasil
elektroforesis gel
Nuaire
26
Lab. Konversi
Energi (Lab 1)
Lembaga Eijkman
Lab. Mikrobiologi
Lembaga Eijkman
Lab. Mikrobiologi
Lembaga Eijkman
Ruang PCR
Lembaga Eijkman
Lab. Mikrobiologi
Lembaga Eijkman
Lab. Mikrobiologi
Lembaga Eijkman
Lampiran 2. (lanjutan)
No.
Nama Bahan
Spesifikasi
Kegunaan
1,5 mL
Isolat bakteri yang tidak
peka terhadap Eritromisin
2.
Isolat murni Streptococcus
pneumoniae tidak peka
terhadap Eritromisin
Darah domba
5%
3.
Gentamisin
50 mg/mL
4.
ddH2O
500 mL
Sebagai media tumbuh S.
pneumoniae
Untuk menghindari
kontaminasi bakteri lain
terutama Staphylococcus
Sebagai pelarut
5.
Etanol
70%
Desinfektan
6.
Mueller-Hinton Broth
1 mL
7.
Mueller-Hinton Agar
500 g
8.
Gel agarosa
1%
9.
Go-Taq Green Master Mix
2x
Larutan nutrisi bakteri untuk
uji sensitivitas antibiotik
Media uji sensitivitas
antibiotik
Media untuk elektroforesis
gel
Buffer untuk reaksi PCR
10.
McFarland Standard
No. 0,5
Blangko untuk mengukur
turbiditas suspensi pada uji
sensitivitas antibiotik
11.
180.16 g/mol
Sumber karbohidrat pada
media
12.
Glukosa (Glucose
anhydrous Molecular
Biology Grade)
Gliserol
87%
Sumber lemak pada media
13.
Tryptone Soya Broth
500 g
14.
Tryptone Soya Agar
500 g
15.
Bubuk Skim-Milk
16.
Forward and reverse
primer mef(A)
Forward and reverse
primer erm(B)
DNA ladder
50 µM
Bahan untuk pembuatan
media STGG
Bahan untuk pembuatan
media agar darah
Bahan untuk pembuatan
media agar darah dan STGG
Primer untuk gen mef(A)
50 µM
Primer untuk gen erm(B)
100 bp
DNA Marker pada PCR
20 ng/µL
20.
DNA template S.
pneumoniae
TE Buffer
1x
DNA template yang
digunakan untuk amplifikasi
Buffer ekstraksi DNA
21.
Eritromisin disk
15 µg
Antibiotik jenis makrolida
22.
TBE Buffer
1x
Buffer elektroforesis gel
23.
SYBR Safe
400 µl
Pemberi warna yang
menyisip pada fragmen basa
pada proses elektroforesis
gel
1.
17.
18.
19.
27
Lampiran 3. Komposisi Media Agar Darah Domba 5% + Gentamisin.
Bahan
Darah domba
Tryptone Soya-Agar
Gentamisin
ddH2O
Komposisi
50 ml
40 g
50 µl
1000 ml
28
Lampiran 4. Komposisi Media STGG
Bahan
Skim milk
Tryptone Soya-Broth
Glukosa
Gliserol
ddH2O
Komposisi
2g
3g
0,5 g
10 ml
100 ml
29
Lampiran 5. Komposisi Media Agar Mueller-Hinton + Darah Domba 5%
Bahan
Mueller Hinton Agar
Darah domba
ddH2O
Komposisi
38 g
50 ml
1000 ml
30
Lampiran 6. Komposisi Go Taq Green 2x
Bahan
dATP
dTTP
dGTP
dCTP
MgCl2
Pewarna kuning
Pewarna biru
Taq Polymerase
Buffer
Konsentrasi / Kegunaan
400 M
400 M
400 M
400 M
3mM
Pewarna dengan kecepatan migrasi lebih cepat
dari fragmen DNA berukuran < 50 bp
Pewarna dengan kecepatan migrasi yang sama
dengan DNA berukuran 3-5 kb DNA
Enzim yang mengkatalisis reaksi polimerisasi
Meningkatkan densitas sampel
(Promega, 2012)
31
Lampiran 7. PCR Mix dan Kondisi untuk Duplex PCR
PCR Mix
Volume (µL)
Konsentrasi Akhir
Go Taq Green Mastermix (2x)
erm(B) f-primer (50 µM)
erm(B) r-primer (50 µM)
mef(A) f-primer (50 µM)
mef(A) r-primer (50 µM)
DNA template
ddH O
12,5
0,5
0,5
0,5
0,5
@2
8,5
1x
1 µM
1 µM
1 µM
1 µM
20 ng/µl*
Total
25 µl
2
o
94 C
0.30
o
o
72 C
72 C
1.30
5.00
o
50 C
0.30
o
25 C
Ko dan Song
(2004)
35 Siklus
32
Lampiran 8. PCR Mix dan Kondisi Singleplex PCR mef(A)
PCR Mix
Volume (µL)
Konsentrasi Akhir
Go Taq Green Mastermix (2x)
mef(A) f-primer (50 µM)
mef(A) r-primer (50 µM)
DNA template
ddH O
10
0,5
0,5
@2
12
1x
1 µM
1 µM
20 ng/µl*
Total
25 µl
2
o
93 C
3.00
o
93 C
1.00
o
72 C
5.00
o
72 C
1.00
o
52 C
1.00
o
25 C
Sutcliffe et.al (1996),
dengan sedikit modifikasi.
35 Siklus
33
Lampiran 9. PCR Mix dan Kondisi untuk Singleplex PCR erm(B)
PCR Mix
Volume (µL)
Konsentrasi Akhir
Go Taq Green Mastermix (2x)
erm(B) f-primer (50 µM)
erm(B) r-primer (50 µM)
DNA template
ddH O
10
0,5
0,5
@2
12
1x
1 µM
1 µM
20 ng/µl*
Total
25 µl
2
o
94 C
0.30
o
o
72 C
72 C
1.30
5.00
o
50 C
0.30
o
25 C
Ko dan Song
(2004)
35 Siklus
34