35
Panen dilakukan apabila sel HeLa telah dalam kondisi 80 konfluen sel sudah menempel dan berkembang memenuhi wadah kultur, semua pekerjaan
dilakukan pada LAF. MK RPMI dibuang dari flask dengan mikropipet atau pipet pasteur, sel dicuci 2 kali dengan 5 ml PBS Phosphate Buffer Saline,
ditambahkan 400 µl Tripsin-EDTA 0,25 secara merata, kemudian diinkubasi di dalam inkubator CO
2
5 selama ± 5 menit, dan ditambahkan 4 ml MK untuk menginaktifkan tripsin. Sel diresuspensi dengan mikropipet agar sel terlepas
satu-satu tidak menggerombol. Keadaan sel diamati di mikroskop inverted. Sel diresuspensi kembali jika masih ada sel yang menggerombol. Sel ditransfer ke
dalam tabung konikel Doyle, et al., 2000.
3.10.2 Panen Sel Vero
Panen dilakukan apabila sel Vero telah dalam kondisi 80 konfluen sel sudah menempel dan berkembang memenuhi wadah kultur, semua pekerjaan
dilakukan pada LAF. MK M199 dibuang dari flask dengan mikropipet atau pipet pasteur, sel dicuci 2 kali dengan 5 ml PBS Phosphate Buffer Saline,
ditambahkan 400 µl Tripsin-EDTA 0,25 secara merata, kemudian diinkubasi di dalam inkubator CO
2
5 selama ± 5 menit, dan ditambahkan 4 ml MK untuk menginaktifkan tripsin. Sel diresuspensi dengan mikropipet agar sel terlepas
satu-satu tidak menggerombol. Keadaan sel diamati di mikroskop inverted. Sel diresuspensi kembali jika masih ada sel yang menggerombol. Sel ditransfer ke
dalam tabung konikel Doyle, et al., 2000
3.11 Penghitungan Sel HeLa dan Vero
36
Diambil 10 µl panenan sel dan dipipetkan ke dalam hemositometer kamar hitung. Jumlah sel dihitung dibawah mikroskop inverted dengan perbesaran
10x10 menggunakan counter.
Gambar 3.1 Hemositometer kamar hitung A, B, C dan D
Hemositometer terdiri dari 4 kamar hitung A, B, C, dan D, setiap kamar hitung terdiri dari 16 kotak. Sel pada 4 kamar hemositometer dihitung, sel yang gelap
mati dan sel yang berada di batas luar di sebelah kiri dan atas tidak ikut dihitung. Sel di batas kanan dan bawah ikut dihitung. Jumlah sel per ml dihitung
dengan rumus : ∑selmL =
∑ sel A + ∑ sel B + ∑ sel C + ∑ sel D 4
× 10
4
Jumlah total sel yang diperlukan dihitung. Untuk menanam sel pada tiap sumuran 96-well plate maka jumlah total sel yang
diperlukan adalah 1x10
4
sumuran x 100 sumuran dibuat lebih = 1x 10
6
volume panenan sel yang diperlukan dalam mL dihitung dengan rumus : Volume panenan sel =
Jumlah total sel yang diperlukan Jumlah sel terhitungml
volume panenan sel dimbil, ditransfer ke tabung konikel baru kemudian ditambahkan MK sampai total volume yang diperlukan Doyle, et al., 2000.
37
3.12 Pembuatan Larutan Uji
Ekstrak etanol ditimbang sebanyak 50 mg dalam polytube, lalu dilakukan pengenceran hingga 5 mg, kemudian dilarutkan dalam dimetilsulfoksida
DMSO sebanyak 50 µl, divortex agar sampel terlarut sempurna kemudian di cukupkan dengan MK, kemudian dibuat pengenceran selanjutnya sampai
diperoleh larutan uji dengan konsentrasi 500 µgml, 250 µgml, 125 µgml, 62,5 µgml, dan 31,25 µ gml semua pengenceran dilakukan dengan menggunakan
MK.
3.13 Uji Sitotoksik EEDA Menggunakan Metode MTT 3.13.1 Uji Sitotoksik EEDA Terhadap Sel HeLa Menggunakan Metode
MTT
Sel HeLa ditanam pada microplate 96 sumuran sehingga diperoleh kepadatan 10.000 selsumuran dan diinkubasi selama 24 jam untuk mendapatkan
pertumbuhan yang baik. Setelah 24 jam medium diganti dengan yang baru kemudian ditambahkan larutan uji dengan berbagai konsentrasi menggunakan
cosolvent DMSO dan diinkubasi pada suhu 37ºC dalam inkubator CO
2
5 selama 24 jam. Pada akhir inkubasi, media dan larutan uji dibuang kemudian sel
dicuci dengan PBS. Pada masing-ma sing sumuran, ditambahkan 100 μL media
kultur dan 10 μL MTT 5 mgmL. Untuk mengamati viabilitasnya, sel diinkubasi kembali selama 4-6 jam dalam inkubator CO
2
5 pada suhu 37
o
C. Reaksi MTT dihentikan dengan reagen stopper SDS 10 dalam HCl 0,1 N, lalu plate
dibungkus dengan alumunium foil agar tidak tembus cahaya pada suhu kamar dan dibiarkan selama satu malam. Sel yang hidup bereaksi dengan MTT
38
membentuk warna ungu. Hasil pengujian dibaca dengan ELISA reader pada panjang gelombang 595 nm Doyle, et al., 2000
3.13.2 Uji Sitotoksik EEDA Terhadap Sel Vero Menggunakan Metode MTT
Sel Vero ditanam pada microplate 96 sumuran sehingga diperoleh kepadatan 10.000 selsumuran dan diinkubasi selama 24 jam untuk mendapatkan
pertumbuhan yang baik. Setelah 24 jam medium diganti dengan yang baru kemudian ditambahkan larutan uji dengan berbagai konsentrasi menggunakan
cosolvent DMSO dan diinkubasi pada suhu 37ºC dalam inkubator CO
2
5 selama 24 jam. Pada akhir inkubasi, media dan larutan uji dibuang kemudian sel
dicuci dengan PBS. Pada masing- masing sumuran, ditambahkan 100 μL media
kultur dan 10 μL MTT 5 mgmL. Untuk mengamati viabilitasnya, sel diinkubasi kembali selama 4-6 jam dalam inkubator CO
2
5 pada suhu 37
o
C. Reaksi MTT dihentikan dengan reagen stopper SDS 10 dalam HCl 0,1 N, lalu plate
dibungkus dengan alumunium foil agar tidak tembus cahaya pada suhu kamar dan dibiarkan selama satu malam. Sel yang hidup bereaksi dengan MTT
membentuk warna ungu. Hasil pengujian dibaca dengan ELISA reader pada panjang gelombang 595 nm Doyle, et al., 2010.
3.14 Analisis Hasil
Data absorbansi yang diperoleh dari uji sitotoksik sel dikonversi ke dalam persen sel hidup. Persen sel hidup dihitung menggunakan rumus:
Hidup =
Absorbansi sel dengan perlakuan - Absorbansi kontrol media Absorbansi kontrol media sel – Absorbansi kontrol media
× 100
39
Aktivitas sitotoksik dinyatakan dalam IC
50
konsentrasi yang menyebabkan kematian 50 populasi sel yang dianalisis dengan analisis probit
menggunakan SPSS 22 Doyle, et al, 2000.
3.15 Analisis Indeks Selektivitas
Untuk mengetahui nilai indeks selektivitas IS, perlu diketahui IC
50
sel Vero dan IC
50
sel HeLa dengan menggunakan metode MTT. Selektivitas obat antikanker dapat diukur dengan cara menghitung indeks selektivitas
menggunakan persamaan di bawah ini: Dewi, et al., 2015 Indeks Selektivitas =
IC
50
Sel Vero IC
50
Sel Hela
40
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Identifikasi Tumbuhan
Tumbuhan yang telah diidentifikasi di Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia Indonesian Institute of Science Pusat Penelitian Biologi Research
Center for Biology, Bogor adalah Vernonia amygdalina Del. suku Asteraceae. Hasil identifikasi tumbuhan dapat dilihat pada Lampiran 1 Ginting, 2012.
4.2 Hasil Karakterisasi Simplisia 4.2.1 Pemeriksaan makroskopik
Pemeriksaan makroskopik terdiri dari pemeriksaan bentuk, warna dan rasa. Hasil makroskopis daun Afrika segar memiliki bentuk daun oval-elips,
ujung dan pangkal daun meruncing, susunan tulang menyirip, tepi daun bergerigi dan kasar, permukaan berambut sangat halus, panjang 15-19 cm, lebar
8-9 cm, berwarna hijau muda, dan rasanya pahit.
4.2.2 Pemeriksaan mikroskopik
Hasil mikroskopik simplisia daun Afrika adalah rambut penutup multiseluler, kristal kalsium oksalat berbentuk prisma dan rosette, amilium dalam
media air, stomata anomositik, dan jaringan palidase.
4.2.3 Pemeriksaan karakteristik simplisia
Hasil penetapan kadar abu total simplisia daun Afrika cukup tinggi yakni sebesar 9,745. Hal tersebut dikarenakan banyaknya logam-logam yang terdapat
