30
3.5 Pembuatan Ekstrak Etanol Daun Afrika EEDA
Pembuatan ekstrak etanol daun Afrika dilakukan oleh Yusrina 2014. Serbuk simplisia diekstraksi dengan cara maserasi dengan menggunakan pelarut
etanol. Menurut Farmakope Indonesia Edisi III, 1979 caranya adalah sebagai berikut:
Sebanyak 400 g 10 bagian serbuk simplisia dimasukkan ke dalam sebuah bejana, dituangi dengan 3 L 75 bagian etanol, ditutup, dibiarkan selama 5 hari
terlindung dari cahaya sambil sering diaduk, diserkai, diperas. Ampas diremaserasi dengan etanol secukupnya hingga diperoleh 4 L 100 bagian.
Pindahkan ke dalam bejana tertutup, dibiarkan di tempat terlindung dari cahaya selama 2 hari. Enap tuangkan atau saring. Maserat dikumpulkan dan diuapkan
dengan rotary evaporator pada suhu 40°C sampai diperoleh ekstrak kental.
3.6 Uji Sitotoksik Ekstrak Etanol Daun Afrika EEDA
Pengujian efek sitotoksik EEDA Vernonia amygdalina Del terhadap sel kanker serviks HeLa dan normal Vero dilakukan di Laboratorium
Parasitologi, Fakultas Kedokteran, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. Pengujian efek sitotoksik ini meliputi pembuatan media RPMI, pembuatan
media M199, pembuatan media kultur lengkap MK RPMI dan M199, penumbuhan sel HeLa dan Vero, pembuatan larutan uji EEDA, dan uji
sitotoksik EEDA terhadap sel HeLa dan Vero dengan menggunakan metode MTT.
3.7. Pembuatan Media 3.7.1 Pembuatan Media Roswell Park Memorial Institute RPMI
31
Komposisi: RPMI sachet, spesifikasi: GIBCO Lot No. 921956, dengan L-glutamine tanpa NaHCO
3
, netto 10,4 gram Hepes 2 gram
NaHCO
3
2 gram Aquabidest steril ad 1 liter
Sebanyak 1 sachet RPMI, 2 gram Hepes, dan 2 gram NaHCO
3
dimasukkan kedalam erlenmeyer, ditambahkan 800 ml aquabidest steril, dihomogenkan dengan menggunakan magnetic stirer. Ukur pH 7,2 – 7,4
dengan pH meter, untuk menyesuaikan pH dapat digunakan HCl 1N bila larutan basa atau NaOH 1N bila larutan asam, kemudian ditambahkan
aquabidest steril sampai 1 L, sterilisasi dilakukan dengan filter vaccum di dalam LAF Laminar air Flow, dipasang filter aparatus steril pada botol
duran 1 L steril, proses penyaringan dilakukan dengan filter, aliquot media ditampung dalam botol duran 500 ml, diberi identitas pada botol media
nama media, tanggal pembuatan, expire date, dan nama pembuat, dan disimpan pada suhu 2-8
o
C Sambrook, et al., 1989.
3.7.2 Pembuatan Media Kultur Lengkap MK RPMI
Komposisi: Fetal Bovine Serum FBS 10
Penisilin-Streptomisin 2 Fungizone Amphotericin B 0,5
RPMI ad 100 ml Semua bahan di atas dicampur, dan dilakukan di dalam LAF Laminar Air
Flow, diberi identitas pada botol MK nama media, tanggal pembuatan, expire
32
date, dan nama pembuat, kemudian disimpan pada suhu 2-8 C Sambrook, et
al., 1989.
3.7.3 Pembuatan Media M199
Komposisi: M199 sachet, spesifikasi: GIBCO Lot No. 819942, dengan Earle’s salt, dengan L-glutamine tanpa NaHCO
3
, netto 9,5 gram Hepes 2 gram
NaHCO
3
2 gram Aquabidest steril ad 1 liter
Sebanyak 1 sachet M199, 2 gram Hepes, dan 2 gram NaHCO
3
dimasukkan kedalam erlenmeyer, ditambahkan 800 ml aquabidest steril, dihomogenkan dengan menggunakan magnetic stirer. Ukur pH 7,2 – 7,4
dengan pH meter, untuk menyesuaikan pH dapat digunakan HCl 1N bila larutan basa atau NaOH 1N bila larutan asam, kemudian ditambahkan
aquabidest steril sampai 1 L, sterilisasi dilakukan dengan filter vaccum di dalam LAF Laminar air Flow, dipasang filter aparatus steril pada botol
duran 1 L steril, proses penyaringan dilakukan dengan filter, aliquot media ditampung dalam botol duran 500 ml, diberi identitas pada botol media
nama media, tanggal pembuatan, expire date, dan nama pembuat, dan disimpan pada suhu 2-8
o
C Handayani, et al., 2001.
3.7.4 Pembuatan Media Kultur Lengkap MK M199
Komposisi: Fetal Bovine Serum FBS 10 Penisilin-Streptomisin 2
Fungizone Amphotericin B 0,5 M199 ad 100 ml
33
Semua bahan di atas dicampur, dan di lakukan di dalam LAF Laminar Air Flow, diberi identitas pada botol MK nama media, tanggal pembuatan, expire
date, dan nama pembuat, kemudian disimpan pada suhu 2-8 C Handayani, et
al., 2001.
3.8 Penumbuhan Sel 3.8.1 Penumbuhan Sel HeLa
Alat dan bahan dipersiapkan dan dikondisikan pada suhu ruangan, aliquot 10 ml media RPMI dimasukkan ke dalam tabung konikel, diambil ampul yang
berisi sel biakan dari freezer -80 C atau tangki nitrogen cair dan dicairkan pada
suhu kamar, suspensi sel dalam ampul diambil, dan dimasukkan tetes demi tetes ke dalam media RPMI yang telah disiapkan, lalu disentrifuse pada 600 rpm
selama 5 menit. Supernatan dibuang dan ditambahkan 4 ml MK RPMI kemudian diresuspensi hingga homogen. Suspensi sel ditransfer masing-masing
2 ml ke dalam flask kultur baru. 5 ml MK ditambahkan ke dalam masing-masing flask kultur, dan dihomogenkan. Kondisi sel diamati dengan menggunakan
mikroskop inverted. Sel homogen dipastikan tersebar pada seluruh permukaan flask kultur tidak menggerombol pada bagian tertentu. Pada flask kultur diberi
identitas, dan kemudian disimpan dalam inkubator CO
2
5 Doyle, et al., 2000.
3.8.2 Penumbuhan Sel Vero
Alat dan bahan dipersiapkan dan dikondisikan pada suhu ruangan, aliquot 10 ml media M199 dimasukkan ke dalam tabung konikel, diambil ampul yang
berisi sel biakan dari freezer -80 C atau tangki nitrogen cair dan dicairkan pada
suhu kamar, suspensi sel dalam ampul diambil, dan dimasukkan tetes demi tetes
34
ke dalam media M199 yang telah disiapkan, lalu disentrifuse pada 600 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang dan ditambahkan 4 ml MK M199 kemudian
diresuspensi hingga homogen. Suspensi sel ditransfer masing-masing 2 ml ke dalam flask kultur baru. 5 ml MK ditambahkan ke dalam masing-masing flask
kultur, dan dihomogenkan. Kondisi sel diamati dengan menggunakan mikroskop inverted. Sel homogen dipastikan tersebar pada seluruh permukaan flask kultur
tidak menggerombol pada bagian tertentu. Pada flask kultur diberi identitas, dan kemudian disimpan dalam inkubator CO
2
5 Doyle, et al., 2000.
3.9 Subkultur Sel 3.9.1 Subkultur Sel HeLa
Alat dan bahan dipersiapkan dan dikondisikan pada suhu ruangan, pengerjaan dilakukan pada LAF. Proses panen sel HeLa dilakukan dengan cara
mengambil 500 µl panenan sel dan dimasukkan ke dalam flask kultur. ditambahkan 6 ml MK RPMI, dan dihomogenkan. Sel diinkubasi pada inkubator
CO
2
5, kondisi sel diamati pada keesokan harinya Doyle, et al., 2000. 3.9.2 Subkultur Sel Vero
Alat dan bahan dipersiapkan dan dikondisikan pada suhu ruangan, pengerjaan dilakukan pada LAF. Proses panen sel Vero dilakukan dengan cara
mengambil 500 µl panenan sel dan dimasukkan ke dalam flask kultur. ditambahkan 6 ml MK M199, dan dihomogenkan. Sel diinkubasi pada inkubator
CO
2
5, kondisi sel diamati pada keesokan harinya Doyle, et al., 2000.
3.10 Panen Sel 3.10.1 Panen Sel HeLa
Kategori