− Kolom dapat digunakan kembali
− Mudah melakukan rekoveri cuplikan
− Tekniknya tidak begitu tergantung pada keahlian operator dan
reprodusibilitasnya lebih baik −
Instrumennya memungkinan untuk bekerja secara automatis dan kuantitatif −
Waktu analisis umumnya singkat −
Kromatografi cair preparatif memungkinkan dalam skala besar −
Ideal untuk molekul besar dan ion. Keterbatasan metode KCKT adalah untuk identifikasi senyawa, kecuali
jika KCKT dihubungkan dengan spektrometer massa MS. Keterbatasan lainnya adalah jika sampelnya sangat kompleks, maka resolusi yang baik sulit diperoleh
Munson, 1991.
2.7.1 Cara Kerja KCKT
Kromatografi merupakan teknik yang mana solut atau zat-zat terlarut terpisah oleh perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut-solut ini melewati
suatu kolom kromatografi. Pemisahan solut-solut ini diatur oleh distribusi dalam fase gerak dan fase diam. Penggunaan kromatografi cair membutuhkan
penggabungan secara tepat dari berbagai macam kondisi operasional seperti jenis kolom, fase gerak, panjang dan diameter kolom, kecepatan alir fase gerak, suhu
kolom, dan ukuran sampel Rohman, 2007.
Universitas Sumatera Utara
2.7.2 Komponen KCKT
Gambar 3. Komponen KCKT
2.7.2.1 Wadah Fase Gerak
Wadah fase gerak harus bersih dan lembam inert. Wadah pelarut kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini
biasanya dapat meampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut.Fase gerak sebelum digunakan harus dilakukan degassingpenghilangan gas yang ada pada
fase gerak, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama dipompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis Rohman, 2007
2.7.2.2 Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk KCKT adalah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni pompa harus inert
terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu nilam. Pompa yang dgunakan sebaiknya mampu
memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 ml menit.
pompa
injektor kolom
oven detektor
Wadah solven
Data processor
Universitas Sumatera Utara
2.7.2.3 Injektor
Cuplikan harus dimasukkan kedalam pangkal kolom kepala kolom, diusahakan agas sesedikit mungkin terjadi gangguan pada kemasan kolom.
Ada tiga jenis dasar injektor, yaitu: a.
Hentikan aliranstop flow: aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, sistem tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa
digunakan karena difusi di dalam aliran kecil dan resolusi tidak dipengaruhi. b.
Septum: injektor-injektor langsung ke aliran fase gerak umumnya sama dengan yang digunakan pada kromatografi gas. Injektor ini dapat digunakan
pada kinerja sampai 60-70 atmosfir. Tetapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarut-pelarut kromatografi cair. Disamping itu, partikel kecil dari
septum yang terkoyak akibat jarum injektor dapat menyebabkan penyumbatan.
c. Katup putaran loop valve: ditunjukkan secara skematik dalam Gambar 5,
tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar daripada 10 µ l dan sekarang digunakan dengan cara otomatis dengan adaptor
khusus, volume-volume lebih kecil dapat diinjeksikan secara manual. Pada posisi LOAD, sampel loop cuplikan dalam putaran diisi pada tekanan
atmosfir. Bila katup difungsikan, maka cuplikan di dalam putaran akan bergerak ke dalam kolom.
Universitas Sumatera Utara
Gambar 4. Injektor
2.7.2.4 Kolom
Kolom adalah jantung kromatografi. Berhasil atau gagalnya suatu analisis tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi percobaan yang sesuai. Kolom
dapat dibagi menjadi dua kelompok: 1.
Kolom analitik: diameter khas adalah 2-6 mm. Panjang kolom tergantung pada jenis kemasan. Untuk kemasan pelikel biasanya panjang kolom 50-100
cm. Untuk kemasan mikropartikel berpori, umumnya 10-30 cm. Dewasa ini ada yang 5 cm.
2. Kolom preparatif: umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih besar dan
panjang kolom 25-100 cm. Kolom umumnya dibuat dari stainless steel dan biasanya dioperasikan
pada temperatur kamar, tetapi bisa juga digunakan temperatur lebih tinggi, terutama untuk kromatografi penukar ion dan kromatografi eksklusi. Kemasan
kolom tergantung pada mode KCKT yang digunakan.
Universitas Sumatera Utara
2.7.2.5 Detektor
Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen cuplikan dalam aliran yang keluar dari kolom. Detektor-detektor yang baik memiliki
sensitifitas yang tinggi, gangguan noise yang rendah, kisar respons linier yang luas, dan memberi tanggapanrespon untuk semua tipe senyawa. Suatu kepekaan
yang rendah terhadap aliran dan fluktuasi temperatur sangat diinginkan, tetapi tidak selalu dapat diperoleh.
Detektor yang paling banyak digunakan dalam kromatografi cair modern kecepatan tinggi adalah detektor spektrofotometer UV 254 nm. Bermacam-macam
detektor dengan variasi panjang gelombang UV-Vis sekarang menjadi populer karena mereka dapat digunakan untuk mendeteksi senyawa-senyawa dalam
rentang yang luas. Detektor indeks refraksi juga secara luas digunakan, terutama dalam kromatografi eksklusi, tetapi umumnya kurang sensitif dari pada detektor
spektrofotometer UV. Detektor lainnya, antara lain: detektor fluometer, detektor ionisasi nyala, detektor elektrokimia dan lain-lain juga telah digunakan.
2.7.2.6 Pengolahan Data
Komponen yang terelusi mengalir ke detektor dan dicatat sebagai puncak- puncak yang secara keseluruhan disebut sebagai kromatogram.
Universitas Sumatera Utara
Gambar 5. Kromatogram
Guna kromatogram:
1. Kualitatif
Waktu retensi selalu konstan dalam setiap kondisi kromatografi yang sama dapat digunakan untuk identifikasi.
2. Kuantitatif
Luas puncak proporsional dengan jumlah sampel yang diinjeksikan dan dapat digunakan untuk menghitung konsentrasi.
3. Kromatogram dapat digunakan untuk mengevaluasi efisiensi pemisahan dan kinerja kolom kapasitas ‘k’, selektifitas ‘
α’, jumlah pelat teoritis ‘N’, jarak setara dengan pelat teoritis ‘HETP’ dan resolusi ‘R’.
2.7.2.7 Fase Gerak
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya
W W
12
H
12
H Rt
Area
Universitas Sumatera Utara
elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel Johnson Stevenson, 1991.
Dalam kromatografi cair komposisi pelarut atau fase gerak adalah satu variabel yang mempengaruhi pemisahan. Terdapat keragaman yang luas dari fase
gerak yang digunakan dalam semua mode KCKT, tetapi ada beberapa sifat-sifat yang diinginkan yang mana umumnya harus dipenuhi oleh semua fase gerak.
Fase gerak harus:
•
Murni; tidak ada pencemarkontaminan
•
Tidak bereaksi dengan pengemas
•
Sesuai dengan detektor
•
Melarutkan cuplikan
•
Mempunyai viskositas rendah
•
Mudah rekoveri cuplikan, bila diinginkan
•
Tersedia diperdagangan dengan harga yang pantas
Umumnya, pelarut-pelarut dibuang setelah digunakan karena prosedur pemurnian kembali membosankan dan mahal. Dari semua persyaratan di atas, 4
persyaratan pertama adalah yang paling penting. Gelembung udara degassing yang ada harus dihilangkan dari pelarut,
karena udara yang terlarut keluar melewati detektor dapat menghasilkan banyak noise sehingga data tidak dapat digunakan Putra, 2007.
Elusi Gradien dan Isokratik
Elusi pada KCKT dapat dibagi menjadi dua sistem yaitu: sistem elusi isokratik. Pada sistem ini, elusi dilakukan dengan satu macam atau lebih fase
gerak dengan perbandingan tetap komposisi fase gerak tetap selama elusi.
Universitas Sumatera Utara
Sistem elusi gradien. Pada sistem ini, elusi dilakukan dengan campuran fase gerak yang perbandingannya berubah-ubah dalam waktu tertentu komposisi fase gerak
berubah-ubah selama elusi Putra, 2007.
2.7.3 Baku Dalam
Baku dalam terutama merupakan ragam yang berguna karena pemakaiannya secara tepat dapat memperkecil galat yang disebabkan oleh
penyiapan cuplikan, peralatan dan cara. Ada beberapa persyaratan yang harus dipenuhi oleh senyawa baku yakni:
a. harus terpisah sama sekali dari puncak cuplikan
b. harus terelusi dekat dengan puncak yang diukur
c. konsentrasi dan tanggapan detektornya harus sama dengan konsentrasi dan
tanggapan detektor puncak yang diukur d.
tidak boleh bereaksi dengan komponen cuplikan e.
tidak terdapat dalam cuplikan asal Secara singkat, cara ini mencakup penambahan bahan baku yang
jumlahnya diketahui. harus sangat murni dan mudah diperolehKemudian campuran itu dibuat untuk disuntikkan ke dalam kromatogram. Berdasarkan luas
puncak senyawa baku dan luas puncak komponen yang diminati, kita dapat menentukan susunan. Cara ini tidak mengandaikan semua komponen terelusi dan
dideteksi. Pada kenyataannya, cara ini sering menunjukkan bahwa memang ada komponen lain di dalam cuplikan asal, tetapi tidak ditentukan Johnson dan
Stevenson, 1991.
Universitas Sumatera Utara
BAB III METODOLOGI PENELITIAN
Penelitian ini merupakan penelitian deskriptif dan pengukuran dilakukan dengan menggunakan KCKT. Penelitian ini dilakukan di Laboratorium
Biofarmasi Fakultas Farmasi USU dan di Laboratorium Penelitian Farmasi USU.
3.1 Alat
Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah timbangan, beaker gelas, neraca analitis Baecho, pipet tetes, tabung sentrifugasi, rak tabung, gelas
ukur, alat vortex Health HVM-400, alat sentrifugasi Health HC 1120T, termos es, spuit 1 ml, spuit 3 ml, politube, mikropipet, batang pengaduk, vial 2 ml, satu
unit alat KCKT Agilent 1120 Compact LC, kolom ODS C18, wadah solven, injektor, syringe 50 µ l, sonifikator Branson 1510 pompa vakum Gast DOA-
PG04-BN, kertas membran filter whatman Cellulose Nitrate 0,45 µ m, penyaring PTFE 0,2 µm. Gambar alat dapat dilihat pada Lampiran 1 dan 2 halaman 37 dan
38.
3.2 Bahan
Bahan bahan yang digunakan dalam penelitian yaitu: metanol p.a. E. Merck, NaOH p.a. E. Merck, plasma darah pasien TB, plasma kosong gambar
dapat dilihat pada Lampiran 3 halaman 41, kalium dihidrogen fosfat p.a E. Merck, Baku Isoniazid BPFI BPOM Jakarta sertifikat analisis dapat dilihat
pada Lampiran 14 halaman 57 , Nikotinamid Western Drugs PVT. LTD.
Universitas Sumatera Utara
