Alat-alat Bahan-bahan Lokasi Penelitian Pembuatan Ekstrak

BAB III METODOLOGI PENELITIAN

Metode yang digunakan adalah metode eksperimental meliputi pengumpulan dan pengolahan sampel, pemeriksaan karakteristik, pembuatan ekstrak, dan uji aktivitas ekstrak umbi keladi tikus menggunakan larva Artemia salina Leach.

2.1 Alat-alat

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat-alat gelas laboratorium, pipet tetes, kertas saring, aluminium foil, kaca penutup, kaca objek, vial, bejana penetasan telur Artemia salina Leach, lampu 18 watt Hannochs, cawan berdasar rata, botol bersumbat, krusen tang, seperangkat alat penetapan kadar air, cawan porselen, eksikator, mikroskop Olympus, oven listrik Stork, elektromantel EM 2000, neraca analitik Vibra AJ, dan penangas air Yenaco.

2.2 Bahan-bahan

Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah umbi keladi tikus tuber Typhonii, telur Artemia salina Leach ISO, garam laut, ragi, aqua bidestilata, Aquadest. Bahan-bahan kimia yang digunakan kecuali dinyatakan lain berkualitas pro analysis yaitu n-heksan destilasi, etilasetat destilasi, etanol destilasi, asam asetat anhidrida, asam sulfat pekat, kloroform, toluen, timbal II asetat, amil alkohol, metanol, natrium hidroksida, asam klorida pekat, serbuk magnesium, serbuk seng, kloralhidrat, isopropanol, natrium sulfat anhidrida, α-naftol, amonia pekat, besi III klorida, iodium, raksa II klorida, kalium iodida, bismut III nitrat, dan asam nitrat pekat. Universitas Sumatera Utara

2.3 Pengumpulan dan Pengolahan Bahan Tumbuhan

2.3.1 Pengumpulan Bahan Tumbuhan

Pengumpulan sampel dilakukan secara purposif, yaitu tanpa membandingkan dengan daerah lain. Umur sampel yang diambil tidak diperhitungkan. Sampel yang digunakan adalah tanaman dari umbi keladi tikus segar diambil dari UPT Matria Medica, Kota Batu, Jawa timur.

2.3.2 Identifikasi Tumbuhan

Identifikasi tumbuhan dilakukan di Pusat Lembaga Ilmu Pengetahuan, Jakarta. Hasil identifikasi tumbuhan dapat dilihat pada lampiran 1 halaman 23.

2.3.3 Pengolahan Sampel

Sampel yang digunakan adalah umbi keladi tikus sebanyak 4 kg. Umbi keladi tikus dibersihkan dari kotoran dengan cara mencucinya dibawah air mengalir hingga bersih, ditiriskan kemudian ditimbang beratnya 1500 g. Setelah itu umbi keladi tikus di potong-potong, dirajang dan dikeringkan dilemari pengering pada suhu 40 C. Setelah kering, ditimbang beratnya 800 g kemudian di blender sampai menjadi serbuk.

2.4 Lokasi Penelitian

Penelitian dilakuk an di Laboratorium Farmakognosi Fakultas Farmasi Unversitas Sumatera Utara Medan.

2.5 Pembuatan Larutan Pereaksi

2.5.1. Larutan Pereaksi Asam Klorida 2 N

Sebanyak 17 ml asam klorida pekat diencerkan dengan air suling hingga 100 ml Ditjen POM, 1978.

2.5.2. Larutan Pereaksi Natrum Hidroksida 2 N

Universitas Sumatera Utara Sebanyak 8,002 g natrium hidroksida dilarutkan dalam air suling bebas karbondioksida hingga 100 ml Ditjen POM, 1978.

2.5.3. Larutan pereaksi Bouchardat

Sebanyak 4 g kalium iodida ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air suling, ditambahkan iodium sebanyak 2 g dan dicukupkan dengan air suling hingga 100 ml Ditjen POM, 1978.

2.5.4. Larutan pereaksi Mayer

Sebanyak 1,4 g raksa II klorida dilarutkan dalam air suling hingga 60 ml. Pada wadah lain dilarutkan 5 g kalium iodida dalam 10 ml air suling. Kemudian keduanya dicampurkan dan ditambahkan air suling hingga diperoleh larutan 100 ml Ditjen POM, 1978.

2.5.5. Larutan Pereaksi Dragendorff

Sebanyak 8 g bismut III nitrat ditimbang, kemudian dilarutkan dalam 20 ml asam nitrat pekat. Pada wadah lain dilarutkan 27,2 g kalium iodida dalam 50 ml air suling. Kemudian kedua larutan dicampurkan sama banyak dan didiamkan sampai memisah sempurna. Larutan yang jernih diambil dan diencerkan dengan air suling hingga 100 ml Ditjen POM, 1978.

2.5.6. Larutan Pereaksi Besi III Klorida 1

Sebanyak 1 g besi III klorida dilarutkan dalam air suling hingga 100 ml Ditjen POM, 1989.

2.5.7. Larutan Pereaksi Liebermann- Burchard

Sebanyak 20 bagian asam asetat anhidrida dicampurkan dengan 1 bagian asam sulfat pekat. Larutan penyemprotnya dibuat dengan 20 bagian asam asetat Universitas Sumatera Utara anhidrida dengan 1 bagian asam sulfat pekat dan 50 bagian kloroform. Larutan penyemprot ini harus dibuat baru Harborne, 1987.

2.5.8. Larutan Pereaksi Molisch

Sebanyak 3 g α-naftol dilarutkan dalam asam nitrat 0,5 N hingga diperoleh volume 100 ml Ditjen POM, 1978.

2.5.9. Larutan Air Kloroform

Sebanyak 2,5 ml kloroform dikocok dengan 900 ml air suling, encerkan dengan air suling hingga 1000 ml Ditjen POM, 1995.

2.5.10. Larutan Kloralhidrat

Sebanyak 50 gram kloralhidrat ditimbang dan dilarutkan dalam 20 ml air suling Ditjen POM, 1979.

2.5.11. Larutan Pereaksi Timbal II Asetat 0,4 N

Sebanyak 15,17 gram timbal II asetat dilarutkan dalam air suling bebas karbondioksida secukupnya hingga 100 ml Ditjen POM, 1989.

2.5.12. Pereaksi Asam Nitrat 0,5 N

Sebanyak 3,4 ml asam nitrat pekat diencerkan dengan air suling hingga volume 100 ml Ditjen POM, 1979.

2.6 Pemeriksaan Karakteristik Simplisia

Pemeriksaan karakteristik simplisia meliputi pemeriksaan makroskopik dan mikroskopik, penetapan kadar air, penetapan kadar sari yang larut dalam air, penetapan kadar sari yang larut dalam etanol, penetapan kadar abu total, dan penetapan kadar abu yang tidak larut dalam asam.

2.6.1. Pemeriksaan Makroskopik

Universitas Sumatera Utara Pemeriksaan makroskopik dilakukan dengan mengamati bentuk, warna, bau dan rasa umbi keladi tikus. Gambar simplisia umbi keladi tikus dapat dilihat pada lampiran 2 halaman 24.

2.6.2. Pemeriksaan Mikroskopik

Pemeriksaan mikroskopik dilakukan terhadap serbuk simplisia dengan cara menaburkan serbuk simplisia di atas kaca objek yang telah ditetesi dengan kloralhidrat dan aquadest kemudian ditutupi dengan cover glass kaca penutup setelah itu dilihat dibawah mikroskop. Gambar mikroskopik dapat dilihat pada lampiran 3 halaman 26.

2.6.3. Penetapan kadar air

Penetapan kadar air dilakukan dengan metode Azeotropi destilasi toluen WHO, 1992. Cara kerja : 1. Penjenuhan toluen Sebanyak 200 ml toluen dan 2 ml air suling dimasukkan ke dalam labu alas bulat, didestilasi selama 2 jam. Kemudian toluen didinginkan selama 30 menit dan volume air pada tabung penerima dibaca dengan 0,05 ml. 2. Penetapan kadar air simplisia Sebanyak 5 g serbuk simplisia yang telah ditimbang seksama dimasukkan ke dalam labu yang berisi toluen tersebut, lalu dipanaskan hati-hati selama 15 menit. Setelah toluen mendidih, kecepatan tetesan diatur lebih kurang 2 tetesan perdetik, sampai sebagian air terdestilasi, kemudian kecepatan destilasi dinaikkan hingga 4 tetes perdetik. Setelah semua air terdestilasi, bagian dalam pendingin dibilas dengan toluen. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung Universitas Sumatera Utara penerima dibiarkan dingin sampai suhu kamar. Setelah air dan toluen memisah sempurna, volume air dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. Selisih kedua volume air dibaca sesuai dengan kandungan air yang terdapat dalam bahan yang diperiksa. Kadar air dihitung dalam persen, dapat dilihat pada lampiran 4 halaman 27.

2.6.4. Penetapan kadar sari yang larut dalam air

Sebanyak 5 gram serbuk yang telah dikeringkan di udara dimaserasi selama 24 jam dengan 100 ml air-kloroform dalam labu bersumbat sambil berkali- kali dikocok selama 6 jam pertama kemudian dibiarkan selama 18 jam lalu disaring. Sejumlah 20 ml filtrat diuapkan hingga kering dalam cawan penguap berdasar rata yang telah ditara. Sisa dipanaskan pada suhu 105 C sampai bobot tetap. Kadar sari larut dalam air dihitung dengan persen terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara Ditjen POM, 1989. Hasil perhitungan kadar sari yang larut dalam air dapat dilihat pada lampiran 4 halaman 28.

2.6.5. Penetapan kadar sari yang larut dalam etanol

Sebanyak 5 gram serbuk yang telah dikeringkan di udara dimaserasi selama 24 jam dengan 100 ml etanol 96 dalam labu bersumbat sambil dikocok selama 18 jam. Kemudian disaring cepat untuk menghindari penguapan etanol 96, sejumlah 20 ml filtrat diuapkan sampai kering dalam cawan penguap berdasar rata yang telah ditara dan sisanya dipanaskan pada suhu 105 C sampai bobot tetap. Kadar sari larut dalam etanol dihitung dalam persen terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara Ditjen POM, 1989. Hasil perhitungan kadar sari yang larut dalam etanol dapat dilihat pada lampiran 4 halaman 29.

2.6.6. Penetapan kadar abu total

Universitas Sumatera Utara Sebanyak 2 g serbuk yang telah digerus dan ditimbang seksama dimasukkan ke dalam cawan porselin yang telah dipijar dan ditara, kemudian diratakan. Krus dipijar perlahan-lahan sampai arang habis, pemijaran dilakukan pada suhu 500 - 600 ° C selama 3 jam kemudian didinginkan dan ditimbang sampai diperoleh bobot tetap. Kadar abu dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara WHO, 1992. Hasil perhitungan kadar abu total dapat dilihat pada lampiran 4 halaman 30.

2.6.7. Penetapan kadar abu yang tidak larut dalam asam

Abu yang telah diperoleh dalam penetapan kadar abu total dididihkan dalam 25 ml asam klorida encer selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam asam dikumpulkan, disaring melalui kertas saring dipijarkan sampai bobot tetap, kemudian didinginkan dan ditimbang. Kadar abu yang tidak larut dalam asam dihitung terhadap bahan yang dikeringkan diudara WHO, 1992. Hasil perhitungan kadar abu yang tidak larut dalam asam dapat dilihat pada lampiran 4 halaman 31.

2.7 Skrining fitokimia

Skrining fitokimia serbuk simplisia meliputi pemeriksaan senyawa gologan alkaloid, flavonoida, glikosida, glikosida antrakinon, saponin,tanin, dan steroidtriterpenoida Ditjen POM, 1989; Farnsworth, 1966. Hasil skrining fitokimia serbuk simplisia dapat dilihat pada lampiran 5 halaman 32. Skrining fitokimia ekstrak n-heksan, etilasetat dan etanol dilakukan dengan cara yang sama dengan skrining fitokimia serbuk simplisia.

2.7.1. Pemeriksaan alkaloida

Universitas Sumatera Utara Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 0,5 g, kemudian ditambah 1 ml asam klorida 2 N dan 9 ml air suling, dipanaskan di atas penangas air selama 2 menit. Dinginkan dan disaring. Filtrat dipakai untuk percobaan berikut : a. Filtat sebanyak 3 tetes ditambah dengan 2 tetes larutan pereaksi Mayer, akan terbentuk endapan menggumpal berwarna putih atau kuning bila terdapat alkaloida. b. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambah dengan 2 tetes larutan pereaksi Bouchardat, akan terbentuk endapan berwarna coklat sampai hitam bila terdapat alkaloida. c. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambah dengan 2 tetes pereaksi Dragendorf akan terbentuk warna merah atau jingga bila terdapat alkaloida.

2.7.2. Pemeriksaan Flavonoida

Sebanyak 10 g serbuk simplisia ditambah 100 ml air panas, dididihkan selama 5 menit dan saring dalam keadaan panas. Kedalam 5 ml filtrat ditambahkan serbuk Magnesium, 1 ml asam klorida pekat dan 2 ml amil alkohol, dikocok kuat dan dibiarkan memisah.Bila terdapat flavonoida ditunjukkan dengan timbulnya warna merah, kuning atau jingga pada lapisan amil alkohol.

2.7.3. Pemeriksaan Saponin

Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia, dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan 10 ml air panas, dinginkan kemudian dikocok selama 10 detik. Jika terbentuk busa setinggi 1 sampai 10 cm yang stabil tidak kurang dari 10 menit dan tidak hilang dengan penambahan asam klorida 2 N bila adanya saponin.

2.7.4. Pemeriksaan Tanin

Universitas Sumatera Utara Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia, disari dengan 10 ml air suling lalu disaring, filtratnya diencerkan dengan air sampai tidak berwarna. Larutan diambil sebanyak 2 ml dan ditambahkan 1-2 tetes pereaksi besi III klorida 1. Jika terjadi warna biru atau hijau kehitaman bila adanya tanin.

2.7.5. Pemeriksaan Glikosida

Sebanyak 3 g serbuk simplisia disari dengan 30 ml campuran etanol 95 dengan air 7:3 dan 10 ml asam sulfat 2 N, direfluks selama 1 jam, didinginkan dan disaring. Pada 20 ml filtrat ditambahkan 25 ml air dan 25 ml timbal asetat 0,4 M, dikocok, diamkan 5 menit lalu disaring. Filtrat disari dengan 20 ml campuran isopropanol dan kloroform 2:3, dilakukan sebanyak 3 kali. Kumpulan sari air diuapkan pada temperatur tidak lebih dari 50 o C. Sisanya dilarutkan dalam 2 ml metanol. Larutan sisa dimasukkan dalam tabung reaksi selanjutnya, diuapkan di atas penangas air, pada sisa ditambahkan 2 ml air dan 5 tetes pereaksi Molisch. Tambahkan hati- hati 2 ml asam sulfat pekat melalui dinding tabung, terbentuknya cincin ungu pada batas kedua cairan bila adanya gula.

2.7.6. Pemeriksaan Antrakinon

Sebanyak 0,2 g serbuk simplisia dicampur dengan 5 ml asam sulfat 2 N, dipanaskan sebentar, lalu didinginkan, ditambahkan 10 ml benzena, dikocok, didiamkan. Lapisan benzena dipisahkan dan disaring. Kocok lapisan benzena dengan 2 ml NaOH 2 N, diamkan. Lapisan air berwarna merah dan lapisan benzena tidak berwarna bila adanya glikosida antrakinon.

2.7.8. Pemeriksaan Steroidatriterpenoida

Sebanyak 1 g serbuk simplisia dimaserasi dengan 20 ml n-heksan selama 2 jam, disaring, filtrat diuapkan dalam cawan penguap dan pada sisanya Universitas Sumatera Utara ditambahkan 2 tetes Liebermann-Burchard. Apabila terbentuk warna ungu atau merah berubah menjadi ungu atau biru hijau bila adanya steroidatriterpenoida.

2.8 Pembuatan Ekstrak

Cara kerja : Sebanyak 200 gram umbi keladi tikus yang telah diserbukkan dimasukkan ke dalam bejana tertutup, lalu direndam dengan cairan penyari selama 3 jam. Kemudian massa dimasukkan ke dalam perkolator, lalu pelarut n-heksan dituang secukupnya sampai terdapat selapis larutan penyari diatas serbuk simplisia, mulut perkolator ditutup dengan plastik dan aluminium foil dan dibiarkan selama 24 jam. Setelah 24 jam keran perkolator dibuka dan cairan perkolat dibiarkan menetes dengan kecepatan 1 tetes per detik dan ditampung dalam botol berwarna bening. Perkolasi dihentikan setelah tetesan terakhir perkolat tidak berwarna lagi atau apabila sebanyak 500 mg cairan perkolat diuapkan di atas penangas air tidak meninggalkan sisa. Perkolat dipekatkan dengan bantuan alat penguap rotary evaporator pada temperatur tidak lebih dari 40 C, lalu ampas dikeluarkan dari alat perkolator dan dikeringkan dengan cara diangin- anginkan selama 1 jam. Perkolasi dengan penyari etil asetat dan etanol dilakukan dengan cara yang sama. Bagan pembuatan ekstrak dapat dilihat pada lampiran 5 halaman 33.