Fusi Protoplas Interspesies Antara Jeruk Siam Simadu (Citrus nobilis Lour) dengan Mandarin Satsuma

SATSUMA (

C. unshiu

_Marc.)

ALI HUSNI

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2010

Dengan ini saya menyatakan bahwa Fusi Protoplas Interspesies Antara Jeruk Siam Simadu (Citrus nobilis _{Lour.) Dengan Mandarin Satsuma (}Citrus unshiu _Marc.)

adalah karya saya dengan arahan komisi pembimbing dan belum pernah diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka disertasi ini.

Bogor, April 2010

Ali Husni NIM A161060121

ALI HUSNI. Interspecies Protoplasts Fusion between Citrus Siam Simadu (Citrus nobilis Lour.) and Citrus Mandarin Satsuma (C. unshiu Marc.). Supervised by AGUS PURWITO, SUDARSONO, and IKA MARISKA.

Somatic hybridization is an important tool for supplying new varieties to be used directly as cultivar genetic improvement programs. In citrus, this technology has been extensively used and has many important implipications. The objectives to the research are produceed citrus somatic hybrids between citrus siam Simadu and Mandarin Satsuma with chemical fusion (PEG). Protoplasts of siam Simadu from calli with Mandarin Satsuma from mesophyll-derived protoplasts were regenerated by somatic embryogenesis. Concentration and duration of incubation in a solution of PEG strongly affected the fusion induction of siam Simadu with Mandarin Satsuma. High concentrations of PEG can increase the frequency of fusion, while the low concentration produces a low frequency of fusion. The result showed that protoplasts from embryogenic callus of Simadu tangerine and in vitro leaf of Mandarin Satsuma can be isolated in large numbers by using a combination of cellulase Onozuka R10, Yakult Yakult% 1% with R10 Maserozim in CPW solution. Protoplasts are purified with a mixture of 25% sucrose with 13% mannitol. Protoplast density produced from embryogenic callus is 15.7x105 protoplasts / g callus and 13x105 protoplasts/ g in vitro leaf. The concentration of PEG used to induce fusion between mesophyll protoplasts Mandarin Satsuma and siam Simadu callus affect the average number of protoplasts fusion. Average number of protoplasts were fused by using PEG 4% are 3.3 hetero fusion, 5.0 homo fusion and multi-fusion. Average number of protoplasts were fused by using PEG 30% are 4.7 hetero fusion, 6.7 homo fusion 6.7 and 7.7multi-fusion. The success of fusan regeneration on regeneration medium is influenced by PEG concentration used for induction of fusion. Protoplasts were fused with PEG only 4%, which can regenerate to form cell walls, making cell division, colony cells, micro-callus and somatic embryo. Protoplasts were fused with PEG 30% can only be regenerated to form the cell wall and cell division. Giving light to the culture after 2 weeks may accelerate cell division that can form colonies of cells. Dilutions of cell suspension with the same medium (without 2, 4-D) can accelerate the growth and development of the protoplasts formed colonies of cells, micro-callus and somatic embryos. MW medium is best used in the fusion because it can encourage of somatic embryos directly. Addition of ABA 0.5 mg / l in the media can produce somatic embryos and GA3 0.5 mg / l can germinate mature somatic embryos to plantlets with 76% germination efficiency. Somatic hybrids were germinated, then trasfered to a medium culture, and finally grafted in greenhouse. The hybrids were confirmed by growth of in vitro culture, morphology, cytology (chromosome number), molecular analysis (ISSR), and contain of chlorophyl

Keywords: Citrus, male sterility, chemical fusion, somatic embryogenesis, morphology, cytology, molecular analysis, somatic hybrids.

ALI HUSNI. Fusi Protoplas Intersepesies Antara Jeruk Siam Simadu (Citrus nobilis Lour.) dengan Mandarin Satsuma (C. unshiu Marc.). Dibimbing oleh: AGUS PURWITO, SUDARSONO, and IKA MARISKA.

Kebutuhan pasar dunia secara global akan buah jeruk yang dikonsumsi segar saat ini dan masa mendatang adalah perlu memenuhi kategori buah yang tidak berbiji (seedless), mudah dikupas (easy peeling) dan mempunyai tipe mandarin dengan warna yang menarik (pigmented). Jeruk siam Pontianak dan Simadu adalah dua dari jenis jeruk batang atas komersial (scion) yang banyak dikenal di Indonesia. Akan tetapi kedua jenis jeruk tersebut masih mempunyai biji yang relatif banyak (15-21 biji per buah) dan warna (pigmented) belum begitu menarik sehingga kalah bersaing dengan jeruk produk negara lain. Untuk menghindari tekanan buah jeruk impor tersebut maka diperlukan sentuhan inovasi teknologi terhadap jeruk lokal tersebut untuk meningkatkan kualitas buah sehingga dapat diterima dan bersaing di pasar global. Untuk mendapatkan tanaman jeruk yang mempunyai karakter buah seedless pada tanaman jeruk sudah dimulai dilakukan beberapa dekade yang lalu melalui pemuliaan konvensional. Mandarin Satsuma (C. unshiu Marc.) adalah merupakan jenis jeruk yang secara alami mempunyai sifat seedless dan telah terbukti bahwa sifat seedless yang terdapat pada jeruk Mandarin Satsuma disebabkan oleh polennya yang steril (male sterility) yang biasa disebut dengan istilah MS. Untuk memindahkan sifat MS tersebut dari jeruk Mandarin Satsuma kepada jeruk siam sangat sulit dilakukan melalui pemuliaan konvensional karena adanya faktor genetik (inkompaitble). Oleh karena itu perlu dicari cara lain untuk memindahkan sifat seedless dari jeruk Mandarin Satsuma ke jeruk siam. Konsentrasi dan lama inkubasi dalam larutan PEG sangat berpengaruh terhadap induksi fusi protoplas tanaman. Konsentrasi PEG yang tinggi dapat meningkatkan frekuensi fusi protoplas sedangkan konsentrasi yang rendah menghasilkan frekuensi fusi yang rendah. Dari hasil penelitian yang telah dilakukan diperoleh bahwa kombinasi enzim selulase Onozuka (R-10 Yakult) 1% dengan maserozim (R-10-Yakult) 1% dalam larutan CPW dapat mengisolasi protoplas sebanyak 13.9 x 105 protoplas/gram dari mesofil daun dan 15.1 x 105 protoplas/g dari kalus embriogenik. Semakin lama waktu inkubasi dalam larutan PEG maka semakin banyak jumlah protoplas yang mengalami fusi baik PEG konsentrasi tinggi (30%) maupun konsentrasi rendah (4%). Penggunaan induksi PEG 30% lebih efektif untuk menginduksi terjadinya fusi dari pada 4%. Tipe fusi yang dihasilkan adalah hetero fusi, homo fusi, dan multi fusi. Rata-rata jumlah hetero fusi yang dihasilkan dari fusi yang diinduksi dengan PEG 30% adalah 1.6 dari inkubasi 5 menit, 3.6 dari inkubasi 10 menit dan 4.8 dari inkubasi 15 menit. Rata-rata jumlah hetero fusi yang dihasilkan dari hasil fusi menggunakan PEG 4% adalah 1.2 dari inkubasi 5 menit, 1.8 dari inkubasi 10 menit dan 3.0 dari inkubasi 15 menit. Frekuwensi fusi meningkat setelah penambahan 200 µl larutan pencuci. Ratara-rata jumlah heterofusi dari induksi PEG 30% menjadi 7.2 dan 3.6 dari induksi fusi PEG 4%. Protoplas dari kalus embriogenik jeruk siam Simadu dan daun in vitro jeruk Mandarin Satsuma dapat diisolasi dalam jumlah yang banyak menggunakan kombinasi enzim selulase Onozuka R10-Yakult 1% dengan Maserozim R10-R10-Yakult 1% dalam larutan CPW yang dimurnikan dengan campuran sukrosa 25% dengan manitol 13%. Densitas protoplas yang dihasilkan dari kalus embriogenik adalah 15.7x105 protoplas/g kalus dan 13.0x105 protoplas/g daun. Konsentrasi PEG yang digunakan untuk menginduksi fusi protoplas dari kalus jeruk siam Simadu dengan protoplas mesofil daun in vitro berpengaruh terhadap jumlah rata-rata protoplas berfusi yang dihasilkan. Rata-rata jumlah total protoplas berfusi menggunakan PEG 4% adalah 3.3 hetero fusi, 5 homo fusi dan multi fusi sedangkan menggunakan PEG 30% adalah

beregenerasi membentuk dinding sel, melakukan pembelahan sel, koloni sel, mikro kalus dan embrio somatik, sedangkan protoplas yang difusikan dengan PEG 30% hanya dapat beregenerasi membentuk dinding sel dan pembelahan sel. Pemberian cahaya pada kultur setelah umur 2 minggu dapat mempercepat pembelahan sel sehingga dapat membentuk koloni-koloni sel. Pengenceran suspensi sel dengan media kultur yang sama (tanpa 2,4-D) dapat mempercepat pertumbuhan dan perkembangan protoplas membentuk koloni sel, mikro kalus dan embrio somatik. Media kultur MW merupakan media yang paling baik digunakan dalam kultur protoplas hasil fusi karena dapat menginduksi terjadinya embriogensis somatik secara langsung. Penambahan ABA 0.5 mg/l dalam media dapat mendewasakan embrio somatik dan GA3 0.5 mg/l dapat mengecambahkan embrio somatik dewasa sehingga diperoleh plantlet. Berdasarkan pertumbuhan hasil keragaan kultur in vitro pada media tumbuh yang selektif (MW+EM 500 mg/l) diperoleh 5 kandidat hibrida somatik dari 19 regeneran yang diuji. Evaluasi lebih lanjut dengan marka molekuler ISSR menggunakan primer ISSR8 diperoleh 4 hibrida somatik dari 5 kandidat yang diuji. Jumlah kromosom dari hibrida somatik yang diperoleh merupakan penjumlahan dari jumlah kromosom kedua tetuanya (36 pasang) kecuali R10 dengan jumlah kromosom 35 pasang. Warna, tulang, dan kandungan kloropil daun dari hibrida somatik merupakan intermediet dari kedua tetuanya.

Kata Kunci: Jeruk, mandul jantan, fusi secara kimia, embriogenesis somatik, morfologi, sitologi, analisis molekular, hibrida somatik

© Hak cipta milik IPB, tahun 2010 Hak Cipta dilindungi Undang-Undang

Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB.

Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagaian atau seluruh Karya Tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB.

SATSUMA (

Marc.)

ALI HUSNI

Disertasi

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor pada

Progran Studi Agronomi

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2010

Lour.) dengan Mandarin Satsuma (C. unshiu Marc.)

Nama : Ali Husni

NIM : A161060121

Disetujui Komisi Pembimbing

Ketua

Dr. Ir. Agus Purwito, M.Sc

Prof. Dr. Ir Sudarsono, M.Sc

Anggota Anggota

Dr. Ir. Ika Mariska, APU

Mengetahui

Ketua Program Studi Agronomi Dekan Sekolah Pascasarjana

Dr. Ir. Munif Ghulamahdi, MS Prof. Dr. Ir. Khairil A Notodiputro, MS Tanggal Ujian: 27 Mei 2010 Tanggal Lulus:...

dapat menyelesaikan penulisan disertasin ini yang merupakan salah satu syarat dalam rangka penyelesaian program Doktor (S3) di sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor (IPB) dengan judul “Fusi Protoplas Interspesies Antara Jeruk Siam Simadu (Citrus nobilis Lour.) dengan Mandarin Satsuma (C. unshiu _Marc.)”.

Sebagian dari disertasi ini telah diterbitkan di Jurnal AGRITEK, Institut Pertanian Malang Vol 17 No.18 tahun 2008 dengan judul ‘Studi Isolasi Protoplas Tanaman Jeruk Siam dan Mandarin Satsuma, Jurnal Agro Biogen (dalam proses) dengan judul “Regenerasi Tanaman Jeruk Siam Melalui Jalur Embriogenesis Somatik”. Pada kesempatan ini penulis menyampaikan terima kasih dan penghargaan kepada Dr. Ir. Agus Purwito, M.Sc, selaku ketua komisi pembimbing dan Prof. Dr. Ir. Sudarsono, M.Sc serta Dr. Ir. Ika Mariska, APU sebagai anggota komisi pembimbing atas bimbingan, saran, dan motivasi mulai dari penulisan usulan penelitian (proposal), pelaksanaan penelitian, dan penulisan disertasi. Ucapan terimakasih dan penghargaan yang mendalam kepada ayah dan ibu tercinta H. Abdul Manan Harahap dan Ibu Hj. Mardiah Aritonang yang senantiasa sabar dalam mendo’akan, mendidik, dan mengarahkan anak-anaknya. Penulis ucapkan terimakasih juga kepada bapak dan ibu mertua H. Kosasih dan Hj Tejaningsih yang telah banyak memberikan semangat dan do’a dalam menyelesaikan disertasi ini. Secara khusus, penulis ucapkan terimakasih kepada istri tercinta dan anak-anakku yang tersayang atas dorongan dan bantuan yang begitu banyak, doa’ yang tulus serta pengertian dan perhatiannya yang begitu dalam yang dapat memberikan dorongan dan semangat dalam menyelesaikan studi dan disertasi ini.

Ucapan terimakasih juga kepada kepala Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan sumberdaya Genetik Pertanian (BB-Biogen) di Bogor dan kepala Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian di Jakarta atas kesempatan yang diberikan kepada penulis untuk dapat melanjutkan pendidikan program Doktor. Terimakasih juga disampaikan kepada dekan sekolah Pascasarjana IPB, ketua program studi Agronomi, dan seluruh staf pengajar di departemen Agronomi IPB. Penulis tidak lupa mengucapkan terimakasih kepada Dr. Ir. Ika Mariska, APU sebagai ketua kelompok peneliti, rekan-rekan peneliti, dan teknisi kelompok peneliti Biologi sel dan Jaringan, BB- Biogen atas bantuan, dorongan dan kerjasamanya. Terimakasih juga disampaikan kepada saudari Chaerani Marta, S.Si, MP, Ir. Karsinah, MP dan saudara Yusuf yang telah banyak memberikan informasi, bantuan penyambungan (grafting) dan pemeliharaan tanaman hasil fusi protoplas di rumah kaca Balai Penelitian Jeruk dan Buah Subtropika di Batu, Malang. Terimakasih juga disampaikan kepada bapak Dr. Trijoko Santoso, M.Si atas bantuannya dalam mengidentifikasi hibrida somatik menggunakan marka molekular ISSR di laboratorium Biologi Molekuler BB-Biogen dan bapak Ujang Havid yang telah banyak membantu penulis dalam pembuatan preparat dan penghitungan jumlah kromosom di laboratorium sitologi Pusat Penelitian Biologi LIPI, Cibinong dan bapak Dr. Sutoro MS atas bantuan alat Chlorophyll Meter yang digunakan dalam penenentuan kandungan klorofil daun.

Penelitian ini didukung oleh dana dari penelitian Riset Insentif dari Kementerian Ristek dan dana penelitian beasiswa Badan Litbang Pertanian. Untuk itu, penulis menyampaikan terimakasih kepada bagian kerjasama Kementerian Riset dan Teknologi serta Kepala Badan Litbang Pertanian atas dana penelitian yang telah diberikan.

bernama H. Abdul Manan Harahap (Alm) dan ibu Hj. Mardiah Aritonang (Almh). Jenjang pendidikan penulis berturut-turut adalah lulusan sekolah dasar di SD Alwasliyah, Padangsidempuan pada tahun 1976, lulusan SMP Negeri V Padangsidempuan pada tahun 1980, lulusan SMA Negeri 32 Jakarta pada tahun 1983. Padatahun 1989 penulis mendapat gelar sarjana (S1) dari Fakultas Biologi Universitas Nasional, Jakarta. Gelar Magister Sains (M.Si) diperoleh pada tahun 2002 dari Program Studi Bioteknologi, Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor (IPB) dengan beasiswa dari PAATAP. Tahun 2006, penulis mendapat kesempatan untuk melanjutkan pendidikan Program doktor di Program Studi Agronomi di perguruan tinggi yang sama dengan beasiswa dari Badan Litbang Pertanian. Penulis menikah dengan Mia Kosmiatin, Ssi, Msi pada tahun 1995 dengan dikaruniai dua orang putri yang bernama Aphylla Planifolia Harp dan Aulia Floribunda Harp serta seorang putra yang bernama Muhammad Houzni Rafsanzani Harp.

Penulis menjadi staf peneliti bioteknologi mulai tahun 1992 di Pusat Penelitian dan Pengenbangan Tanaman Industri (Puslitbangtri) di Bogor. Kemudian dipindahkan ke kelompok peneliti Fisiologi di Balai Penelitian Tanaman Rempah dan Obat pada tahun 1995. Penulis dipindahkan kembali ke kelompok peneliti Reproduksi dan Pertumbuhan Balitbio pada tahun 1997 karena adanya reorganisasi di Badan Litbang Pertanian. Kemudian menjadi kelompok peneliti Biologi sel dan Jaringan pada tahun 1999 Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan sumberdaya Genetik Pertanian (BB-Biogen) sampai sekarang.

1. Bahan tanaman dan media perlakuan yang digunakan pada setiap

tahapan percobaan dalam penelitian ……….. 29

2. Keberhasilan mendapatkan nuselus yang aseptik dari biji muda jeruk

siam Simadu dan Pontianak dalam media perlakuan ... 31 3. Respon nuselus jeruk siamSimadu dan Pontianak pada media

perlakuan terhadap persentase pembentukan kalus ……….... 32 4. Tipe kalus dan banyaknya jumlah pem yang dihasilkan dari setiap

media perlakuan dari masing – masing jeruk siam setelah kultur

berumur 8 minggu ... 34 5. Persentase keberhasilan mendapatkan nuselus dan embrio yang

aseptik serta induksi kalus pada minggu ke- 4 dan ke- 8 ... 35 6. Tipe kalus dan banyaknya jumlah struktur pem dan globular yang

dihasilkan dari eksplan nuselus dan embrio, 8 minggu setelah kultur ... 36 7. Pengaruh penambahan ABA dalam proses pendewasaan struktur

globular embrio somatik, 4 minggu setelah kultur ... 39 8. Pengaruh penambahan GA dalam proses pengecambahan embrio

somatik menjadi plantlet benih somatik), 4 minggu setelah kultur ... 40 9. Kombinasi larutan enzim yang digunakan untuk isolasi protoplas

kalus embriogenik, daun in vitro dan suspensi sel ... 50 10. Keberhasilan biji berkecambah, tinggi tunas dan jumlah daun pada

jeruk siam madu, Pontianak dan Mandarin Satsuma 4 minggu dalam

media MW+0.5 mg/l GA3 ... 53 11. Persentase keberhasilan induksi kalus dari nuselus dan embrio jeruk

siam simadu dan Pontianak, 2 bulan setelah kultur ………... 54 12. Produksi protoplas daun mesofil yang dihasilkan dari dua

kombinasienzim yang berbeda setelah inkubasi 16 jam setelah

dimurnikan dengan campuran 25% sukrosa dalam larutan CPW.. ... 56 13. Produksi protoplas mesofil daun yang dihasilkan dari dua kombinasi

enzim yang berbeda setelah inkubasi 16 jam setelah dimurnikan

dengan campuran 25% sukrosa + 13% manitol dalam larutan CPW ... 57 14. Produksi protoplas dari kalus embriogenik nuselus dan embrio dari

dua kombinasi enzim yang berbeda setelah inkubasi 16 jam setelah dimurnikan dengan campuran 25% sukrosa + 13% manitol dalam

kombinasi enzim 1 setelah inkubasi 16 jam dan dimurnikan dengan

campuran 25% sukrosa + 13% manitol dalam larutan CPW …………. 61 16. Rata-rata jumlah protoplas yang dihasilkan dari mesofil daun dan

kalus embriogenik yang diisolasi dengen enzim selulase 1% +

maserozim 1% yang diinkubasi selama 16 jam ……… 75

17. Produksi protoplas dari kalus dan mesofil daun menggunakan kombinasi enzim Selualse 1%+ Maserozim 1% yang diinkubasi selama 16 jam dan murnikan dengan campuran 25% sukrosa+13%

manitol dalam larutan CPW ………... 98

18. Pengaruh konsentrasi PEG (4 dan 30%) terhadap keberhasilan fusi (hetero fusi, homo fusi dan multi fusi) protoplas jeruk siam simadu

dengan Mandarin Satsuma, inkubasi 15 menit ………... 104 19. Pengaruh media kultur terhadap persentase kemampuan protoplas

membentuk dinding dan pembelahan sel yang diinduksi fusi dengan

PEG 4 dan 30%, 2 minggu setelah kultur ... 107 20. Pengaruh media kultur terhadap persentase kemampuan protoplas

melakukan pembelahan dan jumlah koloni sel setelah pemberian

cahaya, 2 minggu setelah kultur ………. 109

21. Pengaruh media kultur terhadap kemampuan koloni sel membentuk

mikrokalus , 1, 2, dan 3 minggu setelah pengenceran ……….. 111 22. Pengaruh media kultur terhadap kemampuan koloni sel membentuk

mikro kalus dan embrio somatik, 4 minggu setelah pengenceran ….... 113 23. Pendewasaan embrio somatik fase globular menjadi fase torpedo dan

hati dalam media MW + 1.5 mg/l ABA + 500 mg/l EM umur 2 dan 4

minggu ……….... 129

24. Banyaknya jumlah kromosom dari f hibrida somatik yang dihasilkan

dan kedua tetuanya (Mandarin Satsuma dan siam Simadu) …………... 132 25. Morfologi batang hibrida somatik pada umur 5 bulan setelah

penyambungan .……….. 133

26. Morfologi daun hibrida somatik pada umur 5 bulan setelah

1. Diagram dan alur strategi penelitian serta keterkaitan antar percobaan

dari seluruh kegiatan penelitian ... 9 2. Kenampakan kalus embriogeneik yang dihasilkan (A= kalus dalam botol

kultur , B= kalus yang diamati secara mikroskopik, pem= pre embrio dan

glob=globular) ……... 33 3. Penampakan gambar kalus yang berasal dari nuselus (A) dan embrio (B),

penampakan mikroskopik kalus dari nuselus (C) dan kalus dari embrio

(D) ... 37 4. Tahapan proses pendewasaan embrio somatik dari jeruk siam

(A=struktur globular, B=struktur hati, C=struktur torpedo dan D=

struktur kotiledon) ... 38 5. Tahapan pertumbuhan dan perkembangan dari embrio somatic dewasa

menjadi plantlet pada jeruk siam (A=fase kotiledon, B=pembukan

kotiledon, C=Perkecambahan dan D=plantlet) ... 40 6. Penampakan kecambah biji jeruk siam dan mandarin dalam media

MW+1mg/l GA3(A = siam simadu, B = siam pontianak dan C =

mandarin satsuma) ... 53 7. Penampakan kalus embriogenik dari eksplan nuselus (A dan C) dan

eksplan embrio (B dan D) ………... 54

8. Isolasi protoplas jeruk siam simadu, pontianak dan Mandarin Satsuma dari mesofil daun dengan pemurnian larutan sukrosa 25% + manitol 13% dalam larutan enzim 1(SM=siam simadu, SP=siam Pontianak, A=Protoplas siam simadu, B=protoplas siam Pontianak dan C=protoplas

Mandarin Satsuma) perbesaran 10x ...

58 9. Penampakan struktur kalus yang berasal dari nusellus (A) dan embrio (B)

serta pada saat inkubasi dalam larutan enzim (C dan D)... 60 10. Penampakan protoplas sebelum dan sesudah pemurnian dengan larutan

sukrosa 25% + manitol 13% (A dan C=protoplas siam Simadu sebelum (10X) dan sesudah pemurnian (20X), B dan D=protoplas siam

Pontianak sebelum (10X) dan sesudah pemurnian (20X) ………... 62 11. Perbedaan warna protoplas yang diisolasi dari kalus dan mesofil daun (A

dan C=isolasi protoplas dari kalus, B dan D=isolasi protoplas dari

mesofil daun) ………... 62 12. Penampakan gambar sumber protoplas yang digunakan sebelum isolasi,

13. Tipe fusi (hetero, homo, dan multi fusi) dan rata-rata jumlah protoplas berfusi yang dihasilkan setelah perlakuan PEG 30% inkubasi 5, 10, dan

15 menit... 78 14. Penampakan miroskopik hasil fusi protoplas dengan perlakuan PEG 30%

perbesaran 20x.(A=hetero fusi, B=homo fusi dan C=multi fusi) ………. . 80 15. Perbandingan rata-rata jumlah protoplas berfusi sebelum dan sesudah

penambahan larutan 200 µ l ke dalam suspensi protoplas yang telah difusi

dengan PEG 30% ... 81 16. Tipe fusi (hetero, homo, dan multi fusi) dan rata-rata jumlah protoplas

berfusi yang dihasilkan setelah perlakuan PEG 4% inkubasi 5, 10, dan 15

menit... 82 17. Induksi fusi antara protoplas yang diisolasi dari mesofil daun dan kalus

untuk mendeteksi fusi hetero karion dengan PEG 4% (perbesaran 20x)

(A=heterofusi, B=homo fusi dan C=multi fusi) ... 83 18. Perbandingan rata-rata jumlah protoplas berfusi sebelum dan sesudah

penambahan larutan 200 µ l ke dalam suspensi protoplas yang telah difusi

dengan PEG 4% ... 83 19. Penampakan kalus embriogenik daun in vitro yang digunakan sebagai

sumber protoplas (A= kalus embriogenik dari jeruk siam Simadu dan, B=

daun in vitro dari jeruk Mandarin

Satsuma)...

92

20. Isolasi protoplas mesofil daun Mandarin Satsuma dan kalus jeruk siam Simadu dengan kombinasi enzim selulase 1%+maserozim 1% yang dimurnikan dengan larutan sukrosa 25% + manitol 13% (A dan C= mesofil daun dan protoplas yang dihasilkan, B dan D=kalus embriogenik dan protoplas yang dihasilkan) perbesaran 20x ...

99 21. Pengaruh konsentrasi PEG (4% dan 30%) terhadap keberhasilan fusi

(hetro, homo, dan multi fusi) protoplas jeruk siam Simadu dengan

Mandarin Satsuma, inkubasi 15 menit... 100 22. Peningkatan jumlah protoplas berfusi setelah penambahan larutan

pencuci ke dalam suspensi protoplas yang telah difusi selama 15 menit

dengan PEG 4% dan 30%... 101 23. Penampakan keadaan suspensi protoplas pada saat penambahan PEG (A)

dan jenis fusi yang dihasilkan dari protoplas yang diinduksi dengan PEG selama 15 menit (B =hetero fusi, C=homo fusi, D=multi fusi, dan E=

pembelahan) ………... 106 25. Pertumbuhan dan perkembangan protoplas membentuk koloni sel setelah

pemberian cahaya pada umur dua minggu setelah kultur

(A=penampakan kultur mata, B, C dan D = koloni sel) …………... 107 26. Penampakan kasat mata dan mikroskopik mikrokalus yang terbentuk

pada media kultur KM8P, VKM, MT dan MW 4 minggu setelah pengenceran (A dan E=mikro kalus pada media KM8P, B dan F=mikro kalus pada media VMW, C dan G=mikro kalus pada media MT serta D

dan H=mikro kalus pada media MW) ... 110 27. Proses embriogenesis somatik langsung dari tahap sel tunggal embryoid

hasil fusi antara jeruk siam Simadu dengan Mandarin Satsuma sampai menjadi plantlet pada media MW (. A dan B= Sel embryoid yang aktif membelah, C dan D= Pre-embrio (pem), E = Fase globuler, F = tahap

torpedo dan H= Fase hati) ………... 112

28. Proses pendewasaan dalam media MW+1.5 mg/l ABA dan

perkecambahan embrio somatik dalam media MW + 1.5 mg/l GA3menjadi plantlet (A= embrio somatik langsung dari hasil fusi, B dan C= pembentukan kalus embriogenik embrio somatik sekunder pada media pendewasaan, D dan E= perkecambahan embrio somatik pada media perkecambahan dan F= plantlet dalam

medsiaMW)……….. 114

29. Keragaan pertumbuhan in vitro regeneran hasil fusi protoplas dan kedua

tetuanya (Mandarin Satsuma dan siam Simadu) ... 130

30. Penggunaan primer ISSR8 (5’AGAGAGAGAGAGAGAGYC3’) dapat

membedakan hibrida somatik (R6, R7, R10 dan R19) dengan kedua tetuanya (Sm=siam Simadu dan St= Mandarin Satsuma) …...

131 31. Perbandingan jumlah kromosom antara putatif hibrida somatik yang

dihasilkan dengan kedua tetuanya (A= siam Simadu, B= Mandarin

Satsuma, C= R6, D= R17, E= R10 dan F= R19) ... 132 22. Keragaan hibrida somatik di rumahkaca (A dan B= penyambungan

dengan batang bawah JC, B= tanaman hasil penyambungan dan C=

1. Lampiran 1. Komposisi media dasar kultur, vitamin, dan komposisi

lainnya MS, MW, MT, KM, dan VKM... 152 2. Lampiran 2. Komposisi larutan CPW... 153 3. Lampiran 3. Komposisi larutan pencuci... 153

BAB I

PENDAHULUAN UMUM

Latar Belakang

Trend kebutuhan pasar dunia akan buah jeruk segar saat ini adalah mempunyai kategori buah yang tidak berbiji (seedless), mudah dikupas (easy peeling) dan mempunyai tipe Mandarin dengan warna yang menarik (pigmented), kandungan gula tinggi, dan ukurannya besar (Spiegel-Roy dan Goldschmidt 1996; Khan 2008; Nicotra 2007). Menurut Sudarwo (2003), kualitas produk yang dihasilkan mampu bersaing di pasaran global sangat tergantung kepada kemampuan menumbuhkan keunggulan biaya (harga) dan keunggulan diferensiasi yang sangat mempengaruhi seperti;1)kemampuan meningkatkan produksi, 2)kemampuan menghasilkan inovasi teknologi, dan 3)efisiensi rantai produksi.

Jeruk siam (Citrus nobilis) varietas Pontianak dan Simadu (Medan) adalah dua dari jenis jeruk lokal komersial (Scion) yang ada di Indonesia. Kedua jenis jeruk ini termasuk dalam true species dari genus Citrus dengan jumlah genom 2n=2x=18. Jeruk Siam sangat mendominasi pertanaman jeruk di Indonesia, yaitu mencapai 80% dari total pertanaman jeruk di Indonesia (Penebar Swadaya 2004 dan Kuntarsih 2007). Pada tahun 2006 areal pertanaman jeruk di Indonesia mencapai 72.390 ha dengan rata-rata produktivitas sebesar 35.44 ton/ha. Produksi nasional jeruk pada tahun yang sama adalah sebesar 2.565.543 ton (Deptan 2007).

Jeruk Siam atau dalam perdagangan internasional disebut jeruk Tanggerin

mempunyai ciri khas kulit tipis, rasanya manis, warna buah kuning – orange dan hampir mendekati kategori tipe jeruk yang sesuai dengan kebutuhan pasar dunia untuk dikonsumsi dalam keadaan segar. Namun demikian, kedua jenis jeruk tersebut masih mempunyai biji yang relatif banyak (15-21biji per buah) dan warna belum begitu menarik sehingga kalah bersaing dengan jeruk produk negara lain. Hal ini terbukti dengan maraknya buah impor jeruk di pasar lokal mulai dari kaki lima, toko dan supermarket yang menekan produk jeruk lokal sehingga menjadi terpuruk yang mengakibatkan kerugian bagi petani jeruk. Untuk menghindari tekanan buah jeruk impor, maka diperlukan inovasi teknologi terhadap jeruk lokal

untuk meningkatkan kualitas buah sehingga dapat diterima dan bersaing di pasar gelobal. Salah satu cara yang dapat dilakukan secara efisien dan efektif adalah merakit tanaman jeruk siam baru dengan sifat seedless dan pigmented sehingga dihasilkan jeruk yang tidak berbiji dan mempunyai warna yang menarik dan tetap disukai.

Untuk mendapatkan buah jeruk lokal yang dikonsumsi dalam keadaan segar dan sesuai dengan tuntutan pasar global (sifat seedless, pigmented, easy peeleng, dan rasanya manis) dapat dilakukan dengan cara meningkatkan keragaman genetik tanaman jeruk, khususnya jeruk siam. Untuk mendapatkan jenis jeruk yang diinginkan dapat diperoleh dengan cepat, maka diperlukan keragaman genetik jeruk siam yang tinggi. Keragaman genetik yang tinggi dapat dilakukan dengan cara persilangan, induksi mutasi, keragaman somaklonal, fusi protoplas, dan rekayasa genetika (Spiegel-Roy dan Goldschmidt 1996).

Keragaman genetik yang tinggi dapat terjadi secara alami ataupun buatan. Keragaman genetik yang muncul sudah terbukti mempunyai peranan penting di dalam peningkatan kualitas genetik tanaman. Perubahan genetik pada tingkat ploidi mempunyai potensi yang besar untuk mendapatkan perubahan fenotipe dan genotipe tanaman (Raza et al. 2003). Perubahan jumlah kromosom pada satu sel dapat disebabkan oleh beberapa perlakuan seperti perlakuan suhu rendah atau tinggi atau dapat disebabkan pemberian auksin (2,4-D, D-camba, dan IAA) konsentrasi tinggi dengan periode kultur yang lama (Harman dan Kester 1959), kultur endosperm (Gmitter et al. 1990), hibridisasi somatik (Oiyama et al. 1981), dan induksi mutasi dengan sinar gamma (Jaskhani 1998).

Untuk meningkatkan keragaman genetik yang tinggi pada jeruk siam dapat dilakukan dengan cara mengintrogresikan sifat seedless dan pigmented dari spesies jeruk lain seperti mandarin Satsuma. Jeruk mandarin Satsuma (C. unshiu

Marc.) merupakan jenis jeruk introduksi yang secara alami mempunyai sifat

seedless dengan jumlah genom 2n=2x=18 (Kunitake et al. 1991; Spiegel-Roy dan Goldschmidt 1996). Yamamoto et al. (1997) telah membuktikan melalui persilangan seksual dan silang balik bahwa pollen jeruk mandarin Satsuma adalah steril (MS) yang dikendalikan oleh gen yang ada di sitoplasmik yang disebut cytoplasmic male sterility (CMS). Untuk memindahkan sifat CMS dari

mandarin Satsuma ke kultivar jeruk lainnya seperti siam Simadu sangat sulit dilakukan melalui pemuliaan konvensional yang disebabkan oleh adanya faktor inkopatibilitas, nusellus ployembrioni, dan masa juvenil yang lama. Oleh karena itu perlu dicari cara lain untuk menggabungkan sifat seedless dari jeruk mandarin Satsuma dengan kultivar jeruk lainnya sehingga diperoleh jenis jeruk baru yang yang tidak berbiji.

Salah satu cara yang dapat digunakan secara efisien dan efektif adalah melalui hibridisasi somatik dengan teknik fusi protoplas. Melalui fusi protoplas dapat diperoleh kombinasi genetik dari dua tetua yang tidak kompatibel, bahkan dapat diperoleh rekombinasi genetik yang ada disitoplasma sehingga sifat CMS yang dikontrol oleh gen yang ada disitoplasma (mtDNA dan cpDNA) dapat diperoleh. Cai et al. (2007) melaporkan hasil fusi protoplas antara C. unshiu

dengan kultivar jeruk tradisional China yang mempunyai biji yang banyak C. sinensis (orange) kultivar Bingtang menghasilkan buah yang laku di pasaran, rasanya enak,dan mempunyai biji yang sedikit antara 6-10 biji/buah.

Tujuan Penelitian

1. Mendapatkan komposisi media kultur dan jenis eksplan yang dapat menghasilkan kalus embriogenik.

2. Mendapatkan metoda isolasi protoplas dari mesofil daun dan kalus embriogenik.

3. Mendapatkan metode fusi protoplas dan konsentrasi PEG yang dapat menginduksi terjadinya fusi.

4. Mendapatkan metoda regenerasi protoplas hasil fusi antara jeruk siam Simadu dengan mandarin Satsuma.

5. Mendapatka hibrida somatik antara jeruk siam Simadu dengan mandarin Satsuma.

Hipotesis

1. Komposisi media dan jenis eksplan berpengaruh terhadap kemampuan membentuk kalus embriogenik yang dapat diregenerasi melalui jalur embriogenesis somatik.

2. Jenis dan konsentrasi enzim sangat berpengaruh terhadap kemampuan mengisolasi protoplas.

3. Komposisi media, kondisi fisik dan cara kultur berpengaruh terhadap kemampuan protoplas beregenerasi membentuk dinding sel, pembelahan sel, pembentukan mikro kalus, embrio somatik, dan plantlet.

4. Hibrida somatik dapat diperoleh dari fusi protoplas antara jeruk siam Simadu dengan mandarin Satsuma .

Strategi dan Alur Penelitian

Agar tujuan penelitian tersebut di atas dapat tercapai maka strategi penelitian yang dilakukan harus mempunyai keterkaitan antara penelitian yang satu dengan penelitian lainnya. Pada tahap awal penelitian dilakukan studi regenerasi tanaman jeruk siam melalui jalur embriogenesis somatik untuk mendapatkan komposisi media dan jenis eksplan yang baik digunakan untuk regenerasi tanaman jeruk melalui jalur embrio genesis somatik (Penelitian 1). Pada penelitian ini dilakukan pencarian komposisi media dan jenis ekspklan yang baik untuk menghasilkan kalus embriogenik serta regenerasinya melalui jalur embriogenesis somatik. Diperolehnya metode regenerasi tanaman jeruk siam melalui jalur embriogenesis somatik sangat penting karena akan menjadi acuan pada penelitian regenerasi protoplas hasil fusi protoplas.

Sumber protoplas, komposisi enzim dan media pemurnian protoplas merupakan faktor yang sangat berpengaruh terhadap keberhasilan mendapatkan protoplas yang viabel dengan densitas yang tinggi. Berbagai hasil penelitian melaporkan bahwa densitas protoplas yang dihasilkan pada saat isolasi protoplas harus dapat mencapai kerapatan 105-106 protoplas/ml sehingga bisa dilanjutkan ke tahap fusi protoplas. Pada tahap ini dilakukan penelitian studi isolasi protoplas tanaman jeruk siam dan mandarin Satsuma untuk mendapatkan komposisi enzim yang tepat untuk isolasi protoplas dari kalus embriogenik dan mesofil daun serta larutan pemurnian protoplas sehingga diperoleh protoplas yang viabel dengan densitas yang tinggi (Penelitian 2). Pada penelitian ini dilakukan pencarian komposisi enzim yang dapat mengisolasi protoplas dari kalus embriogenik dan mesofil daun in vitro serta komposisi larutan pemurnian protoplas yang dapat

mengapungkan protoplas sehingga protoplas yang diperoleh terbebas dari debris (protoplas murni). Perbedaan jaringan yang digunakan sebagai sumber protoplas adalah untuk mempermudah pengamatan pada saat fusi protoplas. Protoplas yang berasal dari mesofil daun akan mempunyai warna yang berbeda dengan protoplas yang berasal dari kalus sehingga dapat diketahui jumlah hetero fusi. Diperolehnya metode isolasi protoplas dari kalus embriogenik dan mesofil daun merupakan syarat awal pada fusi protoplas karena densitas dan viabilitas protoplas sangat menentukan dalam keberhasilan fusi protoplas.

Konsentrasi polyetilenlikol (PEG) dan lama inkubasi dalam larutan PEG merupakan faktor yang sangat menentukan untuk mendapatkan protoplas yang berfusi. Pada tahap ini dilakukan optimasi induksi fusi menggunakan larutan PEG pada protoplas tanaman jeruk untuk mendapatkan konsentasi PEG dan lama inkubasi yang optimal untuk menginduksi terjadinya fusi protoplas sehingga diperoleh protoplas fusan (Penelitian 3). Pada penelitian ini dilakukan fusi protoplas menggunakan PEG konsentrasi rendah (4%) dan konsentrasi tinggi (30%) dengan waktu inkubasi 5-15. Perbedaan konsentrasi PEG dan lama inkubasi yang digunakan dalam induksi fusi dapat menentukan keberhasilan regenerasi protoplas setelah perlakuan fusi.

Untuk mendapatkan regeneran hasil fusi protoplas antara jeruk siam Simadu dengan mandarin Satsuma dilakukan isolasi protoplas dari kalus jeruk siam Simadu dan mesofil daun in vitro mandarin Satsuma, fusi protoplas dengan PEG 4% dan 30% selama 15 menit dan regenerasi protoplas hasil fusi (Penelitian 4). Regenerasi protoplas hasil fusi sampai terbentuk tanaman dilakukan dengan beberapa tahap. Pada tahap awal regenerasi, kultur disimpan dalam keadaan gelap selama dua minggu untuk regenerasi dinding sel. Setelah terbentuk dinding sel, kultur diberi cahaya dengan intensitas cahaya 1000 lux selama 16 jam untuk mendorong pembelahan sel sehingga terbentuk koloni sel dan embrio somatik dengan struktur globuler. Untuk mendorong pertumbuhan dan perkembangan koloni sel dan embrio somatik fase globuler dilakukan pengenceran dengan media baru sehingga terbentuk mikro kalus dan embrio somatik fase torpedo dan hati. Embrio somatik dipindahkan ke media padat (MW) untuk mendorong pertumbuhan dan perkembangannya menjadi lebih dewasa dengan menambahkan

asam absisik (ABA) dan menambahkan asam giberelin (GA3) untuk berkecambahan sehingga diperoleh tanaman lengkap (plantlet).

Untuk mendapatkan hibrida somatik dari jeruk siam Simadu dengan mandarin Satsuma secara dini dilakukan identifikasi secara in vitro pada media selektif (MW), secara molekuler dengan marka ISSR, sitologi dengan menghitung jumlah kromosom dan kandungan klorofil, morfologi dan warna daun serta tinggi tanaman (Penelitian 5). Untuk mempermudah pemahaman terhadap strategi penelitian yang dilakukan maka dibuat diagram alur penelitian yang lengkap dan terperinci (Gambar 1).

Daftar Pustaka

Cai X, Fu J, Deng XX, and Guo WW. 2007. Production and molecular characterization of potential seedless cybrid plants between pollen steril Satsuma mandarin and two seedy Citrus cultivars. Plant Cell Tiss Organ Cult. 90:275-283.

Departemen Pertanian. 2007. Statistik Produksi HortiKultura Tahun 2006. Dirjen Hortikultura. Jakarta

Gmitter FG Jr, Deng XX, Hearn CJ. 1990. Induction of triploid Citrus plants from endosperm calli in vitro. Theor. Appl. Genet.80:785-790.

Hartman HT and Kester DE. 1959. Plant Propagation: Principles and Practices. P. 167. Princeton Hall Inc. NJ. USA.

Jaskani MJ.1998. Interploid hiybridization and regeneration of kinnow mandarin. A Thesis submitted in partial fulfiment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy in Horticulture Faculty of Agriculture University of Agriculture Faisal Abad, Pakistan.p.169.

Khan SRA. 2008. Citrus quality too meet global demand (Agri Overview). Website:http:www.Pakissan.Com. Diakses tanggal 7 Agustus 2008.

Kuntarsih S. 2007. Pengelolaan rantai pasok dengan bisnis jeruk (kasus jeruk siam Pontianak Kabupaten Sambas). Makalah dalam seminar Nasional jeruk. Yogyakarta, 13-14 Juni 2007.

Kunitake H, Kagami H, Mii M. 1991. Somatic embrtogenesis and plant regeneration from protoplasts of Stsuma?mandarin (Citrus unshiu Marc.) Scientia Horticilturae, 47:27-33.

Nicotra A. 2007.Mandarin-like hybrids of recent interest for fresh consumption. Problems and ways of control. Instituto Sperimentale per la Frutticoltura Rme-Italy. 13p.

Oiyama I, Kobayashi S, Yoshinaga K, Ohgawara T, and Ishii S, 1981. Use of pollen from a somatic hybrid between Citrus and Poncirus in the production of triploids. Hort.Sci., 26:1082-1087.

Raza H, Khan MM, Khan A. 2003. Seedlessness in citrus. Int. J. Agri. Biol. Vol. 5 (3):388-391.

Spiegel-Roy P and Goldschmidt EE. 1996. Biology Of Citrus. Cambridge University Press. 221 p.

Sudarwo I. 2003. Peran teknologi dalam pengembangan buah tropika. Kerjasama Kementerian Ristek dengan PKBT-IPB. Bogor, 8-9 Mei.

Yamamoto M, Matsumoto R, Okudai N, and Yamada Y. 1997. Aborted anthers of Citrus result from gene-cytoplasmic male sterility. Sci Hortic 70:9-14.

Gambar 1. Diagram dan alur strategi penelitian serta keterkaitan antar percobaan dari seluruh kegiatan penelitian.

Output::Metode isolasi dari Kalus dan mesofil daun

PEN ELI T I AN 5 Identifikasi Hibrida Somatik dari Regeneran Hasil Fusi Protoplas Antara Jeruk Siam Simadu dengan

Mandarin Satsuma

Output:-Hibrida somatik hasil fusi antara jeruk siam Simadu dengan mandarin Satsuma

PEN ELI T I AN 2 Studi Isolasi Protoplas Tanaman Jeruk siam Simadu dan Mandarin Satsuma

Optimasi Induksi Fusi Menggunakan PEG pada Protoplas Tanaman Jeruk

PEN ELI T I AN 3

PEN ELI T I AN 4 Isolasi Protoplas, Fusi Protoplas dan Regenerasi Protoplas Hasil Fusi Antara Jeruk Siam Simadu

dengan Mandarin Satsuma a. Pengaruh jenis media kultur terhadap

pembentukankalus embriogenik

c. Pendewasaan embrio somatik

b. Pengaruh jenis eksplan terhadap pembentukankalus embriogenik

d. Perkecambahan embrio somatik

a. Produksi tunas in vitro c. Isolasi protoplas dari mesofil daun in

vitro

b. Produksi kalus embriogenik d.Isolasi protoplas dari kalus

embriogenik

a.Isolasi protoplas c.Regenerasi protoplas hasil fusi

a.Fusi protoplas

b.Fusi protoplas

a.Keragaan in vitro

regeneran hasil fusi pada c.Identifikasi hasil fusi _{dengan sitologi dan}

b. Identifikasi hasil fusi dengan marka ISSR

a. Isolasi protoplas

Output::Konsentrasi PEG dan lama inkubasi

Output::Metoda regenerasi dan Regeneran hasil fusi antara jeruk sim Simadu dengan mandarin Satsuma

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Tanaman Jeruk

Jeruk (Citrus sp) adalah tanaman buah tahunan yang berasal dari Asia. Spiegel-Roy and Goldschmidt (1996) mengatakan bahwa China di percaya sebagai tempat pertama kali jeruk tumbuh. Balai Pelitian Tanaman Jeruk dan Buah Subtropika (Balitjestro), Badan litbang Pertanian di Malang telah mengumpulkan lebih kurang 160 jenis jeruk yang dieksplorasi mulai dari Sabang sampai Merauke serta beberapa jenis jeruk import. Beberapa jenis jeruk diantaranya adalah jeruk keprok Tejakula, Sipirok, Kacang, Siam Banjar, Siompu, Simadu, Bali Merah, Crifta 01, Jemari Taji, Pamelo Ratu, Raja, Magetan, Sri Nyonya, Nambangan, jeruk manis Pacitan dan lain-lainnya dan dapat tumbuh dan berproduksi di Indonesia mulai dari dataran rendah sampai dataran tinggi, baik dilahan sawah maupun tegalan. Dari semua jenis jeruk tersebut, jeruk siam, jeruk baby, jeruk keprok, jeruk Bali, jeruk nipis dan jeruk purut merupakan jenis jeruk lokal paling banyak dibudidayakan di Indonesia. Sedangkan jeruk yang diintroduksi paling banyak adalah jenis Lemon dan Grapefruit. Sekitar 70-80% pertanaman jeruk di Indonesia adalah jeruk siam, sedangkan jenis jeruk lainnya adalah jeruk keprok, dan pamelo (Badan Litbang Pertanian 2005).

Jeruk, merupakan tanaman buah kedua terbesar produksinya di Indonesia, yaitu sekitar 2.479.852 ton dengan sumbangan sebesar 15.34% terhadap produksi buah nasional. Produksi dan luas panen jeruk Indonesia terus meningkat dari tahun ketahun. Luas pertanaman jeruk di Indonesia pada tahun 2005 lebih dari 120.000 ha dengan luas panen 67.883 ha dengan jumlah produksi mencapai 2.214.020 ton. Pada tahun 2006 luas panen jeruk meningkat menjadi 72.390 ha dengan jumlah produksi mencapai 2.565.543 ton (Deptan 2007). Saat ini Indonesia termasuk negara pengimpor jeruk terbesar kedua di ASEAN setelah Malaysia, dengan volume impor sebesar 94.696 ton, sedangkan ekspornya hanya sebesar 1.261 ton dengan tujuan

Malaysia, Brunei Darussalam, dan Timur Tengah. Ekspor jeruk nasional masih sangat kecil dibanding dengan negara produsen jeruk lainnya seperti Spanyol, Afrika Selatan, China, Yunani, Maroko, Pakistan, Belanda, Turki dan Mesir. Oleh karena itu, pemacuan produksi jeruk nasional akan memiliki urgensi penting karena disamping untuk meningkatkan pendapatan masyarakat, kesempatan kerja, konsumsi buah dan juga meningkatkan devisa ekspor nasional (Badan Litbang Pertanian 2005).

Pertanaman jeruk di Indonesia didominasi oleh jeruk siam dan keporok dengan produksi sebanyak 2.15 juta ton dan jeruk pamelo sebanyak 64 ribu ton. Luas panen jeruk pada tahun yang sama adalah seluas 68 ribu ha yang terdiri dari 63 ribu ha jeruk siam dan keprok serta 5.300 ha dari jeruk pamelo (Hutabarat dan Setyanto 2007). Jeruk ekspor Indonesia (termasuk mandarin) ditujukan pada pasar di wilayah Asia, seperti Timor Leste, Malaysia, India, Hongkong, Iran, Singapura dan Afganistan, sementara Indonesia mengimpor jeruk (termasuk Mandarin) dari 29 negara di dunia, terutama China, Pakistan dan Australia (Hutabarat dan Setyanto 2007).

Hambatan pengembangan jeruk di Indonesia antara lain: (1) Desakan kebijakan perdagangan multilateral dan diberbagai negara, (2) Desakan terhadap kebijakan perdagangan nasional, (3) Marjin keuntungan produsen rendah, (4) Ongkos produksi rendah, keberlanjutan usaha tidak pasti, dan (5) Biaya transaksi dan pemasaran tinggi.

Jeruk siam (Citrus nobilis _Lour.)

Jeruk siam merupakan anggota jeruk keprok dengan nama ilmiah Citrus nobilis . Dinamakan jeruk siam karena berasal dari Siam (Thailand). Di negara asalnya, jeruk ini dikenal dengan nama som kin wan. Sampai saat ini sebenarnya belum ada data resmi tentang kapan dan dimana tepatnya jeruk siam pertama kali didatangkan ke Indonesia. Meskipun demikian, ada daerah yang mempunyai catatan yang cukup tentang kisah awal masuknya jeruk siam di wilayahnya, seperti Kalimantan Barat (Deptan 1994).

Jeruk siam hanya merupakan bagian kecil dari sekian banyak spesies dan varietas jeruk yang sudah dikenal dan dibudidayakan. Para ahli Botani mengelompokkan semua anggota famili Rutaceae ke dalam 7 subfamili dan 130 genus. Sedangkan yang menjadi induk tanaman jeruk adalah subfamili Aurantioidae yang beranggotakan sekitar 33 genus. Subfamili ini masih dibagi lagi dalam beberapa kelompok tribe dan subtribe. Jeruk tergolong dalam rumpun Citriae dan subtribe Citrinae. Dari subtribe inilah berbagai jenis anggota tanaman jeruk berasal, termasuk didalamnya jeruk siam.

Klasifikasi botani tanaman jeruk adalah sebagai berikut:

Divisi : Spermatophyta

Sub Divisi : Angiospermae

Kelas : Dicotyledonae

Ordo : Rutales

Famili : Rutaceae

Subfamili : Aurantioidae

Genus : Citrus

Spesies : Citrus nobilis Lour

Pada umumnya batang pohon jeruk siam yang dibudidayakan secara komersial mempunyai tinggi antara 2.5-3.0 m. Pohon tersebut biasanya berasal dari perbanyakan vegetatif (cangkokan atau okulasi). Untuk pohon yang berasal dari okulasi, tingginya ditentukan oleh jenis batang bawah yang digunakan. Jeruk siam yang menggunakan batang bawah JC (Japanese citroen) biasanya memiliki tinggi sekitar 272.5 cm, lingkaran batang 16.8 cm, dan lebar tajuk sekitar 197.5 cm. Sedangkan tanaman jeruk siam yang menggunakan RL (Rough lemon) biasanya memiliki tinggi sekitar 267.5 cm, lingkar batang 31.9 cm, dan lebar tajuk 217.5 cm.

Kebanyakan varietas jeruk siam memiliki bentuk dan ukuran daun yang bisa di bedakan dari jenis jeruk lainnya. Bentuk daunnya oval dan berukuran sedikit lebih besar dari jeruk keprok Garut. Ukuran daunnya sekitar 7.5 cm x 3.9 cm dan memiliki sayap daun kecil yang berukuran 0.8 x 0.2 cm. Ujung daunnya agak terbelah, sedangkan bagian pangkalnya meruncing. Urat daunnya menyebar sekitar 0,1 cm dari

tepi daun. Antara batang dengan daun dihubungkan oleh tangkai daun dengan panjang sekitar 1.3 cm. Tanaman jeruk siam biasanya berbunga sekitar bulan September – Nopember. Bentuk dan warna bunganya cukup menarik. Ukuran bunga kecil dan mungil dengan warna putih segar seperti bunga melati. Bentuk buahnya bulat dengan ukuran idealnya sekitar 5.5 cm x 5.9 cm.

Jeruk siam memiliki ciri khas yang tidak dimiliki jeruk keprok lainnya karena mempunyai kulit yang tipis sekitar 2 mm, permukaannya halus dan licin, mengkilap serta kulit menempel lebih lekat dengan dagingnya. Dasar buahnya berleher pendek dengan puncak berlekuk. Tangkai buahnya pendek, dengan panjang sekitar 3 cm dan berdiameter 2.6 mm. Biji buahnya berbentuk ovoid, warnanya putih kekuningan dengan ukuran sekitar 20 biji. Daging buahnya lunak dengan rasa manis dan harum. Produksi buah cukup berat dengan bobot berat perbuah sekitar 75.6 g. Satu pohon rata-rata menghasilkan sekitar 7.3 kg buah. Panen biasanya dapat dilakukan pada bulan Mei – Agustus (Deptan 1994).

Pada dasarnya jeruk siam mepunyai satu nenek moyang yang berasal dari Siam (Muangthai). Orang Siam menyebut jenis jeruk ini dengan nama som kin wan. Mungkin karena lidah orang Indonesia sulit untuk menyebutkan nama tersebut sehingga terbiasa menyebutnya dengan nama Siam. Kelatahan ini terus berlanjut sampai sekarang. Jeruk siam di Indonesia mempunyai banyak jenis tergantung dari daerah asalnya seperti: jeruk siam Pontianak, siam Simadu, siam Garut, siam Palembang, siam Jati Barang dan lain-lain. Dari berbagai nama tersebut, jeruk siam Pontianak dan siam Simadu merupakan jenis jeruk siam yang paling dikenal.

Macam-macam jeruk siam tersebut tidak jauh berbeda satu dengan lainnya. Perbedaannya biasanya dalam hal warna kulit, keharuman dan rasa yang sedikit berbeda. Perbedaan ini biasanya timbul karena berbeda daerah penanamannya. Tempat penanaman yang berbeda tentunya mempunyai karakteristik faktor alam yang berbeda sehingga berpengaruh terhadap karakteristik buahnya.

Untuk pertumbuhan yang baik, jeruk siam memerlukan iklim dan kondisi lingkungan yang sesuai untuk pertumbuhannya. Jeruk siam dapat tumbuh dengan baik di dataran rendah pada ketinggian kurang dari 700 m dpl (di atas permukaan

laut) sesuai dengan daerah asalnya di Muangthai. Ketinggian tempat penanaman berpengaruh jelas terhadap rasa. Penanaman di atas 900 dpl menyebabkan rasa buah jeruk siam menjadi sedikit asam (Deptan 1994).

Jeruk siam merupakan jenis jeruk yang paling banyak dibudidayakan di indonesia. Dominasi pertanaman jeruk siam adalah sekitar 85% dari seluruh pertanaman jeruk yang ada di indonesia. Kemudian diikuti oleh jeruk keprok sebesar 8%, jeruk pamelo 55% dan jenis jeruk lainnya sebesar 3% (Kuntarsih 2007). Produksi jeruk siam Indonesia merupakan yang ke 3 terbesar di dunis setelah China dan Spanyol, sedang jeruk pamelo adalah urutan nomor 9 di dunia.

Buah Jeruk Tanpa Biji (Seedless₎

S_{eedless adalah merupakan sifat buah yang tidak memiliki biji. Sifat seedles}

tersebut dapat diperoleh secara alami pada beberapa jenis tanaman yang mempunyai kemampuan membentuk buah tanpa biji tanpa adanya penyerbukan dan pembuahan yang disebut dengan buah partenokarpi (Frost and Soost 1968; Spiegel-Roy and Goldschmidt 1996). Sifat tersebut merupakan sifat yang mempunyai nilai ekonomi tinggi pada tanaman jeruk karena merupakan karakter yang harus dimiliki buah jeruk konsumsi segar agar dapat bersaing di pasar global (Spiegel-Roy and Goldschmidt 1996 dan Cai 2007). Sifat tersebut juga merupakan salah satu objek penelitian yang banyak dilakukan pada program pemuliaan tanaman jeruk, baik secara konvensional maupun non konvensional (Nicotra 2007).

Untuk mendapatkan tanaman jeruk yang mempunyai karakter buah seedless

pada tanaman jeruk sudah dimulai dilakukan beberapa dekade yang lalu melalui pemuliaan konvensional. Satsuma mandarin (C. unshiu Marc.) adalah merupakan jenis jeruk berbuah seedless secara alami karena mempunyai sifat partenocarpy (Kunittake et al. 1991; Spiegel-Roy and Goldschmidt 1996). Yamamoto et al. (1997) telah berhasil membukt ikan bahwa sifat seedless yang terdapat pada jeruk Mandarin Satsuma disebabkan oleh pollennya yang steril (male sterility) dan bersifat apomiksis. Apomiksis adalah merupakan bentuk reproduksi aseksual dimana biji terbentuk dari sel telur tanpa didahului oleh penggabungan gamet jantan dan gamet betina. Sifat

apomiksis pada tanaman jeruk Mandarin Satsuma menyebabkan keragaman genetiknya rendah karena kondisi genetik embrio yang dihasilkan sama dengan tetua betinanya. Untuk memindahkan sifat tersebut dari jeruk Mandarin Satsuma kepada kultivar jeruk lainnya sangat sulit dilakukan melalui pemuliaan konvensional karena adanya faktor genetik (inkompatible). Oleh karena itu perlu dicari cara lain untuk memindahkan sifat seedless dari jeruk Satsuma mandarin ke kultivar jeruk lainnya. Salah satu teknologi yang dapat digunakan adalah teknik fusi protoplas (Grosser et al. 1996; Moriguchi et al. 1996; Grosser and Gmitter 2005). Teknologi fusi protoplas pada tanaman jeruk telah banyak menghasilkan hibrida somatik baru (Kobayashi et al. 1988; Grosser and Gemitter 1991; Oiyama et al. 1991). Guo et al. (2004) berhasil memasukkan sifat seedless dari Satsuma melalui teknik fusi protoplas. Calixto et al.

(2004) mendapatkan hibrida somatik dari C. sinensis dengan C. grandis yang toleran terhadap virus Citrus tristeza, Phytophthora dan berpotensi digunakan sebagai batang bawah. Cai et al. (2007) juga berhasil menggunakan teknologi fusi protoplas untuk mendapatkan tanaman jeruk yang seedless hasil fusi protoplas antara C. unshiu Marc dengan C. grandis dan C. sinensis.

Untuk mendapatkan tanaman jeruk yang seedless juga dapat dilakukan dengan teknik mutasi. Mutasi secara alami dapat terjadi dengan frekuensi yang sangat rendah. Untuk meningkatkan frekuensi terjadinya mutasi dapat diinduksi secara kimia maupun fisik. Pemberian sinar X dan panas Neutron pada biji dan tunas dapat menginduksi terjadinya mutasi (Broertjes and Van Harten 1988; Spingel-Roy et al. 1990). Induksi mutasi dengan radiasi dapat menghasilkan buah tanpa biji pada jeruk lemon yang mempunyai biji lebih kurang 25 butir per buah (Spingel-Roy et al. 1990). Buah jeruk tanpa biji juga sudah diperoleh dari mutan kultivar jeruk tangelo (Spingel-Roy and Vardi 1989). Pada tahun 1980 an sudah ditemukan mutan-mutan jeruk yang menghasilkan buah seedless di Florida (Hearn 1984, 1986) dan di China (Zhou 1986). Selain mutan seedless, mutan yang mempunyai buah dengan kandungan asam yang rendah dan pematangan buah yang lebih cepat juga sudah diperoleh pada tanaman jeruk (Hearn 1986; Gmitter et al. 1992). Gulsen et al. 2007 juga telah

mendapatkan jeruk lemon mutan yang seedless dan toleran terhadap penyakit mal secco yang disebabkan oleh jamur Phoma tracheiphila.

Isolasi Protoplas

Protoplas merupakan sebagai suatu hasil isolasi sel, yang sudah tidak mempunyai dinding sel lagi, mengandung selulosa dan pektin. Isolasi protoplas pertama kali dimulai oleh Klercker pada tahun 1892 secara mekanik menggunakan daun Stratiotes aloides yang terlebih dulu diplasmolisa, kemudian diiris tipis, dimasukkan dalam media cair, sehingga protoplas ada yang terlepas ke dalam medium (Bhojwani and Razdan 1983). Isolasi protoplas dengan cara mekanik ini menghasilkan protoplas yang rendah, banyak mengandung vakuola dan sel yang dihasilkan tidak bersifat meristematik (Veilleux et al. 2005).

Metode isolasi protoplas dari tanaman mulai banyak digunakan pada tahun 1960 menggunakan larutan enzim untuk isolasi dan pemurnian dari sel tanaman. Pada tahun 1960 Cocking berhasil mengisolasi protoplas yang hidup viable dari jaringan akar tomat melalui perlakuan dalam larutan enzim selulase yang diperoleh dari jamur

Myrothecium verrucaria. Pada tahun 1968, preparasi isolasi dan purifikasi protoplas dari jaringan tanaman mulai dilakukan secara komersial menggunakan larutan enzim selluase dan maserozim (Veilleux et al. 2005).

Jenis dan konsentrasi enzim yang dapat dipergunakan untuk mengisolasi protoplas sangat bervariasi. Ada 15 jenis enzim yang dapat dipergunakan seperti: pektin glikosidase, pektinase, selulase R-10, silanase, maserozim, meiselase, rohamen P, selulase onozuka RS, driselase, pektoliase Y-23, hemiselulase, selulisin, naserase, dan rozim. Karena enzim bersifat termolabil sehingga sterilisasi tidak bisa dilakukan dengan pemanasan. Sterilisai enzim hanya dilakukan dengan millipore filters yang mempunyai lobang ”mesh” sebesar 0,22 – 0,24 mikron atau 0,24 – 0,45 mikron agar tidak rusak. Setiap jenis tanaman, bahkan setiap jenis jaringan yang digunakan sebagai sumber protoplas mempunyai respon yang berbeda-beda terhadap enzim yang digunakan sehingga untuk mencapai protoplas yang viabel dalam jumlah optimum (104 – 105 protoplas/ml) sehingga perlu dicari jenis enzim, konsentrasi enzim dan

lama inkubasi yang digunakan untuk jaringan dan tanaman tertentu. Untuk dapat menentukan banyaknya jumlah protoplas yang dihasilkan dari isolasi dapat dihitung dengan cara tertentu. Menurut Power et al. (1970), densitas protoplas dapat dihitung dengan menggunakan alat haemocytometer dengan ruang dobel, protoplas yang dihitung adalah protoplas yang berada dalam area one triplelined square.

Protoplas pada mulanya diisolasi dari bagian tanaman yang tumbuh di tanah. Jaringan yang dapat diguanakan adalah akar, daun, nodul akar, coleoptil, jaringan buah, tajuk bunga dan serbuk sari. Kemudian berkembang seiring dengan pesatnya teknik biak in vitro. Saat ini, tanaman atau bagian tanaman yang baik digunakan sebagai sumber protoplas adalah tanaman yang berasal dari biakan in vitro karena sudah bebas dari patogen (steril) dan lebih mudah diisolasi karena dinding selnya lebih tipis.

Karena protoplas merupakan sel tanpa dinding, maka bagaimana caranya menghasilkan protoplas yang utuh, viabel dan dalam jumlah banyak sehingga berfungsi normal dan dapat beregenerasi membentuk dinding sel, tumbuh dan berkembang melakukan pembelahan.

Untuk menentukan protoplas yang dihasilkan bersifat viabel atau tidak dapat dilakukan dengan teknik pewarnaan menggunakan FDA (Fluorescein Diacetat). Molekul FDA dapat masuk bebas melalui membran plasma ke dalam protoplas yang masih hidup. Protoplas yang masih hidup melakukan metabolisme (viable) dapat dilihat dengan adanya eksitasi pada fluorescein yang ada dalam protoplas dengan penyinaran memakai lampu ultra violet.

Untuk mencegah pecahnya protoplas biasanya digunakan zat anti pecah (anti blastin) yang biasa disebut osmolyticum atau osmotic stabilizer. Zat anti pecah yang biasa digunakan adalah gula alkohol, gula, sorbitol, mannitol, atau sakharosa. Sihachakr (1998) dan Husni et al. (2004) menggunakan larutan sukrosa tunggal (21%) untuk mengapungkan protoplas tanaman terung yang diisolasi dari mesofil daun. Grosser and Gmitter (1990) menggunakan kombinasi larutan manitol 13% dan larutan sukrosa 26% dan Mendes da Gloria et al. (2000) menggunakan manitol 13%

dengan sukrosa 25% sebagai larutan untuk memurnikan protoplas (furification solution) dari kalus dan mesopil daun tanaman jeruk.

Karena protoplas merupakan sel hidup yang telanjang, hanya dilindungi oleh membran plasma, maka protoplas mulai dipergunakan untuk penelitian-pemelitian biologi eksperimental, fisiologis dan biokimia, virologi, patologi, fusi protoplas, manipulasi genetik dan rekayasa genetika.

Fusi Protoplas

Fusi protoplas adalah penggabungan dua genom dari dua tetua sel somatik untuk menghasilkan hibrida. Usaha untuk memfusikan sel somatik dimulai pada awal abad 20 oleh Winkler, Kuster dan Michel. Michel pada tahun 1937 mendemonstrasikan fusi protoplas dengan menggunakan NaNO3

Fusi protoplas dapat terjadi secara spontan atau dapat diinduksi dengan beberapa cara antara lain dengan NaNO

. Kemudian berkembang dengan berbagai percobaan untuk memperoleh senyawa kimia yang dapat digunakan untuk menginduksi fusi.

3

Senyawa yang banyak digunakan untuk induksi fusi saat ini adalah dengan penambahan polietilen glikol (PEG) dan arus listrik. Senyawa PEG dapat menginduksi terjadinya fusi dengan frekuensi yang tinggi dan dapat tumbuh dan berkembang menjadi tanaman hibrida baru. Terjadinya fusi telah dibuktikan disebabkan oleh karena PEG dalam air bermuatan sedikit negatif dan mampu membentuk ikatan hidrogen dengan membran plasma pada protoplas. Selain itu, PEG juga dapat mengikat Ca

, asam lemak, ion kalsium dan pH tinggi, dekstran sulfat, polifenil alkohol (PVP), polietilen glikol (PEG) dan arus listrik. Jika dinding sel tanaman dihilangkan secara enzimatik, protoplas yang dihasilkan dapat melakukan fusi secara spontan sehingga membentuk multinucleate fusion bodies. Kejadian ini biasa terjadi karena adanya plasmodesmata yang menghubungkan sel-sel tanaman (Veilleux et al. 2005).

2+

atau kation lain. Kation Ca2+ membentuk jembatan antara membran dan PEG sehingga meningkatkan agregasi (Grosser and Gemitter 1990; Veilleux et al. 2005).

Pada tahun 1974, induksi fusi menggunakan arus listrik juga mulai diperkenalkan oleh Senda et al. secara manual pada tahun 1979. Kemudian diperbaharui oleh Zimmermann dan co-Workers pada tahun 1980 dengan dua sistem menggunakan generator AC dan DC. Generator AC berfungsi untuk membuat protopla sejajar seperti rantai, kemudian arus DC diberikan untuk membuat celah yang dapat balik sehingga protoplas dapat berfusi (Zimmerman dan Scheurich 1981).

Semenjak hibrida somatik dapat diperoleh dari hasil fusi antara Nicotiana glauca dengan N. langsdorfii oleh Carlson et al. pada tahun 1972 maka teknik fusi protoplas mulai digunakan untuk menghasilkan hibrida baru baik inter maupun intra specifik pada beberapa tanaman.yang secara genetik tidak bisa dilakukan karena adanya faktor ketidak sesuaian gen (inkompatibilitas).

Fusi Protoplas pada Tanaman Jeruk

Pada tanaman jeruk, teknik fusi protoplas mulai berkembang setelah Ohgawara et al. (1985) melaporkan keberhasilannya mendapatkan hibrida somatik antara C. sinensis dengan Poncirus tripoliata yang secara genetik inkompatibel. Semenjak itu, teknik tersebut banyak digunakan dalam program pemuliaan tanaman jeruk di dunia seperti di Jepang oleh Kobayashi et al. (1988), Israel oleh Vardi et al.

(1987), Amerika Serikat oleh Grosser dan Gemitter (1990), di Prancis oleh Ollitrault

et al. (1996) dan di Brazil oleh Mendes da Gloria et al. (2000). Pada saat ini telah diperoleh lebih dari 250 kombinasi dari 40 tetua jenis jeruk melalui fusi protoplas (Grosser et al. 2000; Cabasson et al. 2001; Guo et al. 2004).

Beberapa hasil penelitian yang telah menggunakan jeruk Mandarin Satsuma (C. Unshui) sebagai salah satu tetua dalam teknologi fusi protoplas untuk perbaikan tanaman jeruk batang atas (C. sinensis) adalah Yamamoto and Kobayashi (1995), Yamamoto et al. (1997), Guo et al. (2004), Xu et al. (2006), dan Cai et al. (2007).

Teknologi fusi protoplas pada tanaman jeruk juga sudah banyak digunakan untuk perbaikan genetik batang bawah. Grosser (1988) memfusikan C. sinensis

denga Poncirus trifoliata, Mendes da Gloria (2000) memfusikan jeruk Caipira sweet orange dengan Rangpur lime, Moore et al. (2001) memfusikan C grandis dengan P.

tripoliata untuk ketahanan terhadap garam dan dingin, Calixo et al. (2004) memfusikan C. sinensis dengan C. grandis untuk ketahanan terhadap virus dan Phytophthora, Fu et al. ( 2003) memfusikan C. sinensis dengan Clausena lansium.

Dengan teknologi fusi protoplas dapat dilakukan introgresi gen sifat baik dari jeruk Mandarin Satsuma ke jeruk siam Simadu karena jeruk Mandarin Satsuma merupakan jeruk tipe mandarin yang mempunyai sifat parthenocarpy yang tinggi (seedless), mudah dikupas (easy peeling), pigmented dan telah adaptif di Indonesia. Untuk mendapatkan buah jeruk lokal yang mempunyai sifat sesuai dengan tuntutan pasar (seedless, pigmented, low acid dan ukuran besar) secara efisien dan efektif dapat digunakan dengan cara mengintrogresikan sifat seedless dan pigmented dari spesies jeruk lain seperti Mandarin Satsuma. Mandarin Satsuma (C. unshiu Marc.) adalah merupakan jeruk introduksi yang termasuk tipe Mandarin yang mempunyai sifat parthenocarpy yang tinggi (seedless), mudah dikupas (easy peeling) dan pigmented (Yamamoto et al. 1997; Spiegel-Roy dan Goldschmidt 1996). Hasil introgresi gen dari fusi protoplas tersebut dihasilkan hibrida dengan level ploidi 2n=4x=36 (Allotetraploid). Hibrida tersebut juga dapat digunakan sebagai tetua yang akan disilangkan dengan jeruk Siam (2n) untuk mendapatkan hibrida yang triploid (2n=3x) yang mempunyai sifat parthenocarpy yang tinggi. Strategi ini sudah banyak dilakukan para pakar pemulia jeruk di dunia, seperti di Jepang pada tahun 1985 oleh Ohgawara et al dan Kobayashi and Ohgawara tahun 1988, di Amerika pada tahun 1988 oleh Grosser di Pakistan oleh Jaskani (1998) dan di Brazil oleh Mendes-da-Gloria et al (1999 dan 2000). Dengan teknologi fusi protoplas tersebut telah banyak menghasilkan hibrida-hibrida baru yang mempunyai keunggulan, baik karakter buah, morfologi dan ketahanan terhadap cekaman biotik dan abiotik.

Bila dibandingkan dengan produk hasil bioteknologi lainnya, khususnya rekayasa genetika, fusi protoplas masih sangat diminati walaupun teknologi ini tergolong sulit dan rumit. Produk hibrida somatik yang dihasilkan dapat diterima oleh masyarakat tidak seperti tanaman transgenik hasil rekayasa genetika.

Daftar Pustaka

Badan Litbang Pertanian. 2005. Prospek dan arah Pengembangan Agribisnis Jeruk. Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian, Departemen Pertanian. 39 h. Bhojwani SS, Razdan MK. 1983. Plant Tissue culture. Theory and Practice. Elsevier

Sciences Publishing Company Inc: 237-238.

Broertjes C, Van Harten AM. 1988. Applied Mutation Bbreeding for Vegetatively Propagated Crops. Development in Crops Science. V. 12, Oxford:Elsevier, 345 pp.

Cabasson CM, Luro F, Ollitrault O, Grosser JW. 2001. Non-random inheritance of mithocondrial genomes in Citrus hybrids froduced by protoplast fusion.

Plant Cell rep 20:604-609.

Cai XD, Fu J, Deng XX, Guo WW. 2007. Production and molecular characterization of potential seedless cybrid plants between pollen steril Satsuma Mandarin and two seedy Citrus cultivars. Plant Cell Tiss Organ Cult. 90:275-283.

Calixto MC, Filho FFAM, Mendes BMJ, Vieira MLC. 2004. Somatic hybridozation between Citrus sinensis (L.) Osbeck and C. grandis (L.) Osbeck. Pesq. Agropec. Bras. 39(7):1-6.

Departemen Pertanian . 1994. Penuntun Budiddaya Buah-buahan (Jeruk). Direktorat Jenderal Pertanian Tanaman Pangan. 269 h.

Departemen Pertanian. 2007. Statistik Produksi HortiKultura Tahun 2006. Dirjen Hortikultura. Jakarta.

Fu CH, Guo WW, Liu JH, Deng XX. 2003. Regeneration of Citrus sinensis + Clausena lansium intergeneric triploid ang tetraploid somatic hybrids and their molecular identification. In Vitro Cell Dev. Sci.20:251-255.

Frost HB, Soost RK. 1968. Seed reproduction development of gametes and embryos . In: Reuther W, Webber HJ, Batchelor (eds) The Citrus Industry. Vol. I. University of California Press, Barkley, Calif. Pp. 290-324.

Gmitter FG Jr, Grosser JW, and Moore GA. 1992. Citrus. In Biotechnology of Prennial Fruits Crops, ed. F.A. Hammerschalag and R. E. Litz, pp. 335-369.. Wallingford , Oxon, UK:CAB International.

Grosser JW, 1988. Application of protoplast fusion of citrus scion and rootstock improvement. Proc. Workshop. Scope for citrus breeding in Australia and the use of new breeding techniques, CSIRO, Merbein, Juli 1987, 146-151.

Grosser JW and Gmitter FG Jr. 1990. Protoplast fusion and citrus improvement. Plant Breeding Reviews. Portland, V.8, p.339-374.

Grosser JW and Gmitter FG Jr. 1991.Protoplast technology in tropical fruit, improvement, with focus on Citrus. Workshop on Agricultural Biotechnology Bogor, May 21-24.

Grosser JW, Gmitter FG, Tusa N, Reforgiato G, and Cucinotta. 1996. Further evidence of a cybridization requirement for plant regeneration from citrus leaf protoplast following somatic fusion. Plant Cell Rep. 15:672-676.

Grosser JW, Ollitrault P, Olivares-Fuster O. (2000). Somatic hybridization in Citrus: an effective tool to facilitate variety improvement. In Vitro Cell Dev Biol Plant 36:434-449.

Grosser JW and Gmitter FG Jr. 2005. Application of somatic hybridization and cybridization in crop improvement, with citrus as a model. In vitro Cell Dev. Biol Plant 39:360-364.

Gulsen O, Uzun A, Pala H, Canihos E, and Kafa G. 2007. Development of seedless and Mal secco tolerant mutant lemons through budwood irradiation. Science Horticultura.112 (2):184-190.

Guo WW, Prassad D, Cheng YJ, Serrano P, Deng XX, and Grosser. 2004. Targeted cybridization in citrus: transfer of Satsuma cytoplasm to seedy cultivars for potential seedlessness. Plant Cell rep 22:752-758.

Hearn CJ. 1984. Development of seedless orange and grapefruit cultivars through seed irradiation. J. Am. Soc. Hort. Sci., 109:270-273.

Hearn CJ. 1986. Development of seedless grapefruit cultivars through budwood irradiation. J. Am. Soc. Hort. Sci.,111:304-306.

Husni A, Mariska I, dan Hobir. 2004. Fusi Protoplas dan regenerasi protoplas hasil fusi antara Solanum melongena dengan S. torvum. Jurnal Bioteknologi Pertanian 9(1):1-8.

Hutabarat, B dan Setyanto A. 2007. Komoditas jeruk Indonesia di persimpangan jalan pasar domestik dan internaional. Prosiding Seminar Nasional Jeruk, Yogyakarta, 13-14 Juni 2007. 472 h.

Jaskani MJ.1998. Interploid hiybridization and regeneration of kinnow mandarin. A Thesis submitted in partial fulfiment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy in Horticulture Faculty of Agriculture University of Agriculture Faisal Abad, Pakistan.p.169.

Kobayashi S, Ohgawara T, Ohgawara E, Oiyima I, and Ishii IS.1988. A somatic hybirid plant obtained by protoplast fusion between navel orange (Citrus sinensis) and Satsuma mandarin. Plant Cell Tissue and Organ Culture14:63-69.

Kobayashi S and Ohgawara T.1988. Production of somatic hybrid plants through protoplast fusion in Citrus. J. Agric. Rev. Quarterly. 22:181-188.

Kunitake H, Kagami H, and Mii M. 1991. Somatic embrtogenesis and plant regeneration from protoplasts of Stsuma?mandarin (Citrus unshiu Marc.) Scientia Horticilturae, 47:27-33.

Kuntarsih S. 2007. Pengelolaan rantai pasok dengan bisnis jeruk (kasus jeruk siam Pontianak Kabupaten Sambas). Makalah dalam seminar Nasional jeruk. Yogyakarta, 13-14 Juni 2007.

Mendes-da-Gloria FJ, Maurao Filho FA, Demetrio CGBM and Mendes BMJ. 1999. Embryogenic calli induction from nucellar tissu of Citrus cultivars. Sci. Agric. (56) 4: 1-11.

Mendes-da-Gloria FJ, Maurao Filho FA, Camargo LEA, and Mendes BMJ. 2000. Caipira sweet orange Rangpur lime: a swomatic hybrid with potential for use as rootstock in the Brazilian citrus industry. Genetic Molecular Biology, V.23, p. 661-665.

Moore GA. (2001). Oranges and lemons: clues to the taxonomy of Citrus from molecular markers. Trends Genet. 17(9):536-540.

Moriguchi T, Hidaka T, Omura M, Motomura T, and Akihama T. 1996. Genotypes and parental combination influence efficiency of cybrid induction in citrus by electrofusion. Hort Science 31:275-278.

Nicotra A. 2007.Mandarin-like hybrids of recent interest for fresh consumption. Problems and ways of control. Instituto Sperimentale per la Frutticoltura Rme-Italy. 13p.

Ohgawara T, Kobayashi S, Ohgawara E, Uchi miya H, Ishii S. 1985. Somatic hybrids plants obtained by protoplast fusion between (Citrus sinensis and Poncirus tripoliata). Theor Appl Genet. 71: 1-4.

Oiyama I, Kobayashi S, Yoshinaga K, Ohgawara T, and Ishii S, 1991. Use of pollen from a somatic hybrid between Citrus and Poncirus in the production of triploids. Hort.Sci., 26:1082-1087.

Ollitrault P, Dambier D, and Luro F. 1996. Somatic hybridization in Citrus; some new hybrids and alloplasmic plants. Proc. Int. Soc. Citricult.2:907-912. Power JB, Cummins SE, and Cocking EC. 1970. Fusion of isolated plant protoplasts.

Nature 255:1016-1018.

Sihachakr D. 1998. Culture Media and Protocols for Isolation and Fusion of Prtoplasts of Eggplant. Universite Paris sud, France (Tidak dipublikasi).

Spiege-Roy P and Vardi A. 1989. Induced mutations in citrus:In Proc.6th

International congres, pp 733-776, Tokyo: SABRAO.

Spiege-Roy P, Vardi A, and Elhanati A. 1990. Seedless induced mutan in highly seeded lemon (Citrus limon). Mutation Breed. Newsl. 36:11.

Spiegel-Roy P and Goldschmidt EE. 1996. Biology Of Citrus. Cambridge University Press. 221 p.

Vardi A, Breiman A, and Galun E. 1987. Citrus cybrids: production by donor-recipient protoplast fusion and verification by mitochondrial-DNA restriction profiles. Theor. Appl. Genet., 75:51-58.

Veilleux RE, Compton ME, and Saunders JA. 2005. Use of Protoplasts for Plant Improvement In R.N. Trigiano and D.J. Gray (Eds) Plant Development and Biotechnology.187-200pp. CRC Press LLC.

Xu XY, Liu JH, and Deng XX. 2006. Isolations of citoplats from Satsuma mandarin (Citrus unshiu Mrc.) and production of alloplasmic hybrid calluses via cytoplast-protoplsat fussion. Plant Cell rep. 25:533-539.

Yamamoto M, Matsumoto R, Okudai N, and Yamada Y. 1997. Aborted anthers of Citrus result from gene-cytoplasmic male sterility. Sci Hortic 70:9-14.

Zhou J. 1986. Induction of seedless mutation by irradiation citrus seeds with 60 gamma rays. China Citrus. 2:1-4.

Co

Zimmermann U and Scheurich P. High frequency fusion of plant protoplast by electric field. Planta. 151:26-32.

BAB IV

STUDI ISOLASI PROTOPLAS TANAMAN JERUK SIAM DAN MANDARIN SATSUMA)*

Ringkasan

Penelitian untuk mendapatkan metode isolasi protoplas dari tanaman jeruk siam (kultipar Simadu dan Pontianak) dan mandarin (kultivar Satsuma) telah dilakukan dari bulan Juli – Desember 2007. Dari hasil penelitian diperoleh bahwa jenis, konsentrasi, dan kombinasi enzim yang digunakan dalam isolasi protoplas sangat berpengaruh dalam keberhasilan isolasi protoplas. Kombinasi enzim selulase 1% (Onozuka RS-Yakult) dengan maserosim (Onozuka R-10 Yakult) (enzim 1) dapat mengisolasi protoplas dari jaringan daun maupun kalus embriogenik dengan densitas yang tinggi (105/ml) setelah dimurnikan dengan larutan sukrosa 25%+manitol 13%. Penambahan enzim pectoliyase Y-23 dalam komposisi enzim yang sama (enzim 2) juga dapat mengisolasi protoplas dari jaringan daun dan kalus embriogenik dengan densitas (105/ml). Rata-rata jumlah protoplas yang terisolasi dari jaringan daun adalah 1.3x105dari siam Simadu dan siam Pontianak, dan1.05x105dari Mandarin Satsuma pada enzim 1 serta 1.30x105, 1.20x105 dan 1.1x105 pada enzim 2. Rata-rata jumlah protoplas yang dihasilkan dari kalus yang berasal dari nuselus lebih banyak dari pada kalus embriogenik yang berasal dari embrio baik pada enzim 1 maupun enzim 2. Rata-rata jumlah protoplas yang dihasilkan adalah 1.5x105 siam Simadu maupun siam Pontianak.

*)Bagian disertasi ini telah dipublikasikan di Jurnal Agritek Vol. 17.2008.

Kata kunci: Jeruk siam Simadu dan Pontianak, Mandarin Satsuma, isolasi protoplas, mesopil daun, kalus embriogenik, dan larutan enzim.

PROTOPLAST ISOLATION STUDIES OF TANGERINE AND SATSUMA MANDARIN

Abstract

Research to find a method of protoplasts isolation from tangerine citrus (Simadu and Pontianak cultivars) and Satsuma Mandarin cultivar have been carried out from July to December 2007. Experiments have shown that the type, concentration, and the combination of enzymes used in protoplast isolation are very influential in the success of protoplast isolation. The combination of 1% cellulase (Onozuka RS, Yakult) with macerozim 1% (Onozuka R-10 Yakult) (enzyme 1) is able to isolate protoplasts from embryogenic callus or leaf tissue with high density (105/ml), after purified with a solution of sucrose 25% + 13% mannitol. Addition of Y-23 pectolyase enzyme in the composition of the same enzyme (enzyme 2) was also able to isolate protoplasts from embryogenic callus tissue and leafs with a density of 105/ml. Average number of protoplasts isolated from leaf tissue tangerine Simadu is 1.31x105, Tangerine Pontianak is 1.3x105, and Mandarin Satsuma 1.05x105, at enzyme 1 and 1.3x105, and 1.2x105 1.2x105 at enzyme 2. The average amount generated from callus protoplasts derived from embryogenic callus nuselus more than derived from embryos at both 1 and 2 enzymes. Average number of protoplasts produced was 1.5x105 from Simadu tangerine and 1.5 x105 from Pontianak tangerine. Average number of protoplasts produced was 1.5x105 from Simadu 1.5 x105 from Pontianak.

Keyword : Citrus siam Simadu and Pontianak, Mandarin Satsuma, protoplast isolation,embriogenic cali, and composition of enzym.

Pendahuluan

Protoplas adalah sel telanjang tanpa dinding yang hanya dilindungi oleh membran plasma. Isolasi protoplas pertama kali dilakukan oleh Klercher pada tahun 1892 dari potongan irisan umbi bawang yang terlebih dahulu diplasmolisa, kemudian dimasukkan ke dalam media cair sehingga banyak protoplas yang meluncur ke dalam medium (Bhojwani dan Razdan 1983).

Metode isolasi protoplas dimulai pada tahun 1960an dengan cara ekstraksi dan pemurnian menggunakan enzim yang dapat menghancurkan dinding sel. Cocking (1960) berhasil mengisolasi protoplas dari jaringan tanaman yang diinkubasi dalam larutan konsentrat kasar enzim selulase yang diisolasi dari cendawan Myrothecium verrucaria. Pada tahun 1968, preparasai dan pemurnian protoplas mulai dilakukan secara komersial sampai sekarang menggunakan larutan enzim seperti maserozim dan selulase (Veilleux et al. 2005). Untuk mengisolasi protoplas dari jaringan biasanya dilakukan secara enzimatik. Jenis dan konsentrasi enzim yang digunakan dalam isolasi protoplas sangat bervariasi. Paling tidak ada 15 jenis enzim yang dapat dipergunakan, yang biasa digunakan adalah pektinase, pektolyase, macerozim dan selulase. Pektinase, pektolyase, dan macerozim berfungsi untuk melarutkan dinding primitif antar sel yang tersusun oleh zat pektin sehingga menjadi sel-sel tunggal. Sedangkan selulase berfungsi melarutkan sisa dinding sel yang tersususn atas zat selulosa (Suryowinoto 1990).

Protoplas dapat diisolasi dari hampir semua bagian tanaman, seperti dari akar (Cocking 1960; Bawa dan Torrey 1971), dari daun (Wenzel 1980), dari nodul akar (Davey et al. 1973), coleptil (Hall dan Cocking 1974), jaringan buah (Cocking 1970), tajuk bunga (Potrykus 1973), serbuk sari (Bajaj 1977), kultur kalus (Schenk dan Hildebranadt 1969), kalus embriogenik (Grosser and Gemitter 1990, Vardi et al., 1990, Tusa et al. 2000) daun in vitro (Binding et al. 1982; Grosser et al. 1996; Serraf 1991, Fu et al. 2003; Husni et al. 2003; Husni et al. 2004 dan Cai et al. 2007.) dan suspensi sel (Grosser and Gemitter 2005; Mendes da Gloria et al. 2000; Fu et al. 2003 dan Cai et al. 2007).

Untuk mencegah pecahnya protoplas selama proses isolasi dan pemurnian protoplas biasanya digunakan zat anti pecah (anti blast) yang biasanya juga disebut osmolyticum atau osmotic stabilizer. Zat yang biasanya digunakan adalah gula alkohol (sorbitol, manitol) dan sukrosa (Suryowinoto 1990). Penggunaan sukrosa konsentrasi tinggi (21-25%) atau kombinasi sukrosa dengan manitol dapat digunakan untuk memisahkan protoplas dari sisa jaringan atau pecahan sel (debris) sehingga diperoleh protoplas yang murni.

Protoplas dari tanaman jeruk dengan viabilitas yang tinggi dapat diisolasi dari jaringan daun, nuselus, kalus, dan suspensi sel. Vardi et al. (1990); Kobayashi et al. (1983) dan Grosser dan Gmitter (1990) menggunakan kalus embriogenik sebagai sumber protoplas dan protoplas yang dihasilkan dapat diregenerasi menjadi tanaman. Ohgawara et al. (1991), Tusa et al. (2000), dan Calixo et al. (2004) menggunakan mesopil daun sebagai sumber protoplas dan Grosser et al. (2000), Mendes da Gloria (2000), dan Fu et al. (2003) menggunakan suspensi sel sebagai sumber protoplas.

Penelitian ini bertujuan untuk mendapat jenis sumber protoplas yang baik digunakan untuk isolasi protoplas, mendapatkan komposisi enzim yang tepat untuk isolasi protoplas dan mendapatkan komposisi larutan pemurnian untuk mengapungkan protoplas sehingga diperoleh protoplas yang murni.

Bahan dan Metode

Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Kultur Jaringan, Kelompok Peneliti Biologi Sel dan Jaringan, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian, Bogor. Penelitian dimulai pada bulan Juli – Desember 2007. Bahan tanaman yang digunakan sebagai sumber protoplas pada penelitian ini adalah kalus embriogenik, daun in vitro dan suspensi sel dari tanaman jeruk siam Simadu, siam Pontianak, dan Mandarin Satsuma. Media dasar yang digunakan untuk mendapatkan sumber protoplas (kalus, daun dan suspensi sel) adalah MP2 (Morel and Wetmore 1951 + 3 mg/l BA + 500 mg/l ekstrak malt) yang dipadatkan dengan 2 gr/l phytagel.

Ohgawara T, Kobayasi S, Ishii S, Yoshinaga K, and Oiyama I. 1991. Fertile fruit trees obtained by somatic hybridization: novel orange (Citrus sinensis) + Troyer citrange (C. sinensis x Poncirus trifoliate). Theor. Appl. Genet. 81:141-143.

Purwito A. 1999. Fusi protoplas intra dan interspesies pada tanaman kentang. Disertasi Program Pasca Sarjana. IPB. Bogor.

Raza H, Khan MM, Khan A. 2003. Seedlessness in citrus. Int. J. Agri. Biol. Vol. 5 (3):388-391.

Sihachakr D. 1998. Culture Media and Protocols for Isolation and Fusion of Prtoplasts of Eggplant. Morphogenese Vegetale Experimentale, Bat.360.Universite Paris sud, France (Tidak dipublikasi).

Spiegel-Roy P and Goldschmidt EE. 1996. Biology Of Citrus. Cambridge University Press. 221 p.

Tusa N, Patta del Bosco S, Nigro F, and Ippolito A. 2000. Response of cybrids and a somatic hybrid of lemon to Phoma tracheiphila infections. HortScience 35:125-127.

Vardi A, Breiman A, and Galun E. 1987. Citrus cybrids: production by donor-recipient protoplast fusion and verification by mitochondrial-DNA restriction profiles. Theor. Appl. Genet., 75:51-58.

Veilleux RE, Compton ME, and Saunders JA. 2005. Use of Protoplasts for Plant Improvement In R.N. Trigiano and D.J. Gray (Eds) Plant Development and Biotechnology.187-200pp. CRC Press LLC.

Von Arnold S, Sabala I, Bozhkov P, Kyachok J, and Filonova L. (2002). Developmental pathway of somatic embryogenesis. Plant Cell Tissue Organ Cult 69:233-249.

Wenzel, G. 1980. Protplast techniques incorporated into applied breeding program. In: L. Ferenczy L and G. L. Farkas, (eds.). Advences in rotoplast Research. Pergamon Press. Oxford, pp 327-340.

Xu XY, Liu JH, and Deng XX. 2006. Isolations of citoplats from Satsuma mandarin (Citrus unshiu Mrc.) and production of alloplasmic hybrid calluses via cytoplast-protoplsat fussion. Plant Cell rep. 25:533-539.

Yamamoto M and Kobayashi S. 1995. A cybrid plant produced by electrofusion between Citrus unshiu and C. Sinensis. Plant Tiss Cult Lett 12:131-137.

Yamamoto M, Matsumoto R, Okudai N, and Yamada Y. 1997. Aborted anthers of Citrus result from gene-cytoplasmic male sterility. Sci Hortic 70:9-14.

BAB X

DAFTAR PUSTAKA UMUM

Ammirato PV, Evan DAA, Sharp WR, Yamada Y. 1983. Handbook of Plant Cell Culture. Vol 1. MacMillan Publ. Co. New York, London.

Binding HS, Jair SM, Finges G, Mordhorst R, Nchls, Gresel J. 1982. Somatic hybridization of an atrazine resistance of Solanum nigrum with S. tuberosum. Part 1: Clonal variation in morphology and in atrazine sensitivity. Theor. Appl. Genet. 63:273-277.

Cocking EC. 1960. A method for isolation of plant protoplast and vacuali. Nature. 187:962-963.

Constabel, F., H. Koblitz, J.W. Kirkpatrick and S. Rambold. 1980. Fusion of cell sap vacuoles subsequent to protoplast fusion. Can. J. Bot. 58:1032-1034.

Cai X, Fu J, Deng XX, and Guo WW. 2007. Production and molecular characterization of potential seedless cybrid plants between pollen steril Satsuma mandarin and two seedy Citrus cultivars. Plant Cell Tiss Organ Cult. 90:275-283.

Ferreira DI and Zelcer A. 1989. Advances in protoplast research Solanum. Intl. Rev. Cytol. 115:1-65.

Fu CH, Guo WW, Liu JH, and Deng XX. 2003. Regeneration of Citrus sinensis + Clausena lansium intergeneric triploid ang tetraploid somatic hybrids and their molecular identification. In Vitro Cell Dev. Sci.20:251-255.

Gamborg, O.L., J.P. Shyluk and E.A. Shahin 1981. Isolation, Fusion and Culture of plant Protoplasts. In: Thorpe, T.A (Eds.). Plat Tissue Culture (Methods and applications in agriculture):Academic Press p.115-153.

Grosser JW and Gmitter FG Jr. 1990. Protoplast fusion and citrus improvement. Plant Breeding Reviews. Portland, V.8, p.339-374.

Grosser JW, Ollitrault P, Olivares-Fuster O. 2000. Somatic hybridization in Citrus: an effective tool to facilitate variety improvement. In Vitro Cell Dev Biol Plant 36:434-449.

Grosser JW, Gmitter FG. 2005. Application of somatic hybridization and cybridization in crop improvement, with citrus as a model. In vitro Cell Dev. Biol Plant 39:360-364.

Guo WW., Prassad D., Cheng YJ., Serrano P., Deng XX, and grosser.2004. Targeted cybridization in citrus: transfer of Satsuma cytoplasm to seedy cultivars for potential seedlessness. Plant Cell rep 22:752-758.

Husni A, Mariska I, dan Hobir. 2004. Fusi Protoplas dan regenerasi protoplas hasil fusi antara Solanum melongena dengan S. torvum. Jurnal Bioteknologi Pertanian 9(1):1-8.

Husni A. 2007. Penerapan teknologi fusi protoplas dalam perakitan jeruk lokal tipe baru. Laporan Akhir Penelitian, Kerja sama BB-Litbang Biogen dengan Menristek. 26 h.

Jaskani MJ.1998. Interploid hiybridization and regeneration of kinnow mandarin. A Thesis submitted in partial fulfiment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy in Horticulture Faculty of Agriculture University of Agriculture Faisal Abad, Pakistan.p.169.

Kao KN and Michayluh MR. 1975. Nutrition requirements for growth of Vicia hajastana cell and protoplast at a very low population density inliquid media. Planta. 125:105-110.

Khan SRA. 2008. Citrus quality too meet global demand (Agri Overview). Website:http:www.Pakissan.Com. Diakses tanggal 7 Agustus 2008.

Kobayashi S, Uchimaya H, and Ikeda I. 1983. Plant regeneration from ‘Trovita’ orange protoplasts. Japan J. Breed.33:119-122.

Kobayashi S and Ohgawara T.1988. Production of somatic hybrid plants through protoplast fusion in Citrus. J. Agric. Rev. Quarterly. 22:181-188.

Kunitake H, Kagami H, Mii M. 1991. Somatic embrtogenesis and plant regeneration from protoplasts of Stsuma?mandarin (Citrus unshiu Marc.) Scientia Horticilturae, 47:27-33.

Mendes-da-Gloria FJ, Maurao Filho FA, Camargo LEA, and Mendes BMJ. 2000. Caipira sweet orange Rangpur lime: a swomatic hybrid with potential for use as rootstock in the Brazilian citrus industry. Genetic Molecular Biology, v.23, p. 661-665.

Ohgawara T, Kobayashi S, Ohgawara E, Uchi miya H, Ishii S. 1985. Somatic hybrids plants obtained by protoplast fusion between (Citrus sinensis and Poncirus tripoliata). Theor Appl Genet. 71: 1-4.

Ohgawara T, Kobayasi S, Ohgawara E, Uchimiya H, and Ishii S. 1989. Somatic hybrid plants obtained by protoplast fusion between (Citrus sinensis and Poncirus trifoliata). Theor. Appl. Genet. 71:1-4.

Ohgawara T, Kobayasi S, Ishii S, Yoshinaga K, and Oiyama I. 1991. Fertile fruit trees obtained by somatic hybridization: novel orange (Citrus sinensis) + Troyer citrange (C. sinensis x Poncirus trifoliate). Theor. Appl. Genet. 81:141-143.

Purwito A. 1999. Fusi protoplas intra dan interspesies pada tanaman kentang. Disertasi Program Pasca Sarjana. IPB. Bogor.

Raza H, Khan MM, Khan A. 2003. Seedlessness in citrus. Int. J. Agri. Biol. Vol. 5 (3):388-391.

Sihachakr D. 1998. Culture Media and Protocols for Isolation and Fusion of Prtoplasts of Eggplant. Morphogenese Vegetale Experimentale, Bat.360.Universite Paris sud, France (Tidak dipublikasi).

Spiegel-Roy P and Goldschmidt EE. 1996. Biology Of Citrus. Cambridge University Press. 221 p.

Tusa N, Patta del Bosco S, Nigro F, and Ippolito A. 2000. Response of cybrids and a somatic hybrid of lemon to Phoma tracheiphila infections. HortScience 35:125-127.

Vardi A, Breiman A, and Galun E. 1987. Citrus cybrids: production by donor-recipient protoplast fusion and verification by mitochondrial-DNA restriction profiles. Theor. Appl. Genet., 75:51-58.

Veilleux RE, Compton ME, and Saunders JA. 2005. Use of Protoplasts for Plant Improvement In R.N. Trigiano and D.J. Gray (Eds) Plant Development and Biotechnology.187-200pp. CRC Press LLC.

Von Arnold S, Sabala I, Bozhkov P, Kyachok J, and Filonova L. (2002). Developmental pathway of somatic embryogenesis. Plant Cell Tissue Organ Cult 69:233-249.

Wenzel, G. 1980. Protplast techniques incorporated into applied breeding program. In: L. Ferenczy L and G. L. Farkas, (eds.). Advences in rotoplast Research. Pergamon Press. Oxford, pp 327-340.

Xu XY, Liu JH, and Deng XX. 2006. Isolations of citoplats from Satsuma mandarin (Citrus unshiu Mrc.) and production of alloplasmic hybrid calluses via cytoplast-protoplsat fussion. Plant Cell rep. 25:533-539.

Yamamoto M and Kobayashi S. 1995. A cybrid plant produced by electrofusion between Citrus unshiu and C. Sinensis. Plant Tiss Cult Lett 12:131-137. Yamamoto M, Matsumoto R, Okudai N, and Yamada Y. 1997. Aborted anthers of