Introduksi gen Hd3a ke dalam tanaman kentang (Solanum tuberosum L.) Kultivar Diamant
INTRODUKSI GEN Hd3a KE DALAM TANAMAN KENTANG
(Solanum tuberosum L.) KULTIVAR DIAMANT
IKA MASIIRATUL MARDIYYAH
BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi yang berjudul Introduksi Gen
Hd3a ke dalam Tanaman Kentang (Solanum tuberosum L.) Kultivar Diamant
adalah benar karya bersama saya dengan komisi pembimbing dan belum diajukan
dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang
berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari
penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di
bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Pebruari 2015
Ika Masiiratul Mardiyyah
NIM G34100056
ABSTRAK
IKA MASIIRATUL MARDIYYAH. Introduksi gen Hd3a ke dalam tanaman
kentang (Solanum tuberosum L.) kultivar Diamant. Dibimbing oleh
SUHARSONO dan UTUT WIDYASTUTI.
Gen Hd3a adalah penyandi protein yang menginduksi pembungaan dan
pembentukan umbi pada kentang kultivar Andigena. Penelitian ini bertujuan
untuk mengintroduksikan gen Hd3a ke dalam tanaman kentang (Solanum
tuberosum L.) kultivar Diamant di bawah kendali promoter rolC. Tanaman
kentang diperbanyak secara in vitro di media MS2 makro. Transformasi genetik
dilakukan dengan bantuan Agrobacterium tumefaciens LBA4404 dengan metode
ko-kultivasi menggunakan potongan ruas (internode) sebagai eksplan. Seleksi
tanaman transgenik dilakukan di media MS yang mengandung 10-40 mg/L
higromisin. Hasil penelitian menunjukkan bahwa rata-rata efisiensi transformasi
adalah sebesar 22.53% dan efisiensi regenerasi 100%. Tunas transgenik putatif
yang dihasilkan berjumlah 9 dari 18 eksplan yang ditransformasi, dengan rata-rata
tunas transgenik putatif adalah 2.33 tunas tiap kalus. Efisiensi transformasi
dipengaruhi oleh genotipe tanaman, konsentrasi asetosiringon, serta faktor teknis
pada proses transformasi seperti pembilasan eksplan dan pengambilan eksplan
dengan pinset selama proses transformasi.
Kata kunci: Agrobacterium tumefaciens, gen Hd3a, kultivar Diamant, Solanum
tuberosum L., transformasi genetik.
ABSTRACT
IKA MASIIRATUL MARDIYYAH. Introduction of Hd3a gene into potato
(Solanum tuberosum L.) cultivar Diamant. Supervised by SUHARSONO dan
UTUT WIDYASTUTI.
Hd3a gene encoded a protein inducing flowering and tuber formation in
potato cultivar Andigena. This research has an objective to introduce the Hd3a
gene into potato (Solanum tuberosum L.) cultivar Diamant under control of
promoter rolC. Potato plants were propagated in vitro on MS2 macro medium.
Genetic transformation was carried out by co-cultivation method by using
Agrobacterium tumefaciens LBA4404. Internodes were used as explants for
transformation. Selection of transgenic plants was performed in MS medium
containing 10-40 mg/L hygromycin. The results showed that the average of
transformation efficiency was 22.53% and regeneration efficiency of the calli was
100%. Transformation of 18 explants resulted 9 putative transgenic shoots and the
regeneration rate was 2.33 putative transgenic shoots per callus. Transformation
efficiency was affected by plant genotype, acetosyringone concentration, and
technical factors such as washing and pincetting during the transformation process.
Keywords: Agrobacterium tumefaciens, cultivar Diamant, genetic transformation,
Hd3a gene, Solanum tuberosum L..
INTRODUKSI GEN Hd3a KE DALAM TANAMAN KENTANG
(Solanum tuberosum L.) KULTIVAR DIAMANT
IKA MASIIRATUL MARDIYYAH
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biologi
BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang
dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Januari 2014 hingga Juli
2014 ini ialah introduksi gen Hd3a ke dalam tanaman kentang (Solanum
tuberosum L.) kultivar Diamant.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Prof Dr Ir Suharsono, DEA
dan Ibu Dr Ir Utut Widyastuti, MSi selaku pembimbing atas waktu yang
disediakan, segala bimbingan, dukungan, arahan, kesabaran, serta saran yang telah
diberikan selama penelitian dan penulisan karya ilmiah ini. Penulis juga
mengucapkan terima kasih kepada Dr Achmad Farajallah, MSi selaku penguji
skripsi atas semua saran, masukan, dan perbaikan yang telah diberikan.
Terimakasih diucapkan kepada Proyek Penelitian Desentralisasi Baru IPB yang
berjudul “Rekayasa genetika tanaman dengan gen toleransi aluminium dan
pembungaan” dengan kontrak no: 48/IT3.11/LT/2014 atas nama: Prof Dr Ir
Suharsono, DEA yang telah membiayai penelitian ini. Terimakasih juga penulis
sampaikan kepada seluruh staf di laboratorium Biologi Molekular dan Selular
Tanaman (BMST) dan BIORIN, khususnya pada Ibu Nia Dahniar, SP, Ibu Pepi
Elvavina, Ibu Sarah, Bapak Asep Saripudin, Bapak Abdul Mulya, Bapak Sairi,
dan Bapak Yulianto atas segala bantuan. Ucapan terimakasih juga penulis
sampaikan kepada rekan-rekan seperjuangan S1 Setiyadi, Liyana, Shuffur,
Bustomi, Maulani, Jeihandanu, Scarinta, Dwika, Nurrizky, Agistina, dan rekanrekan S2 Mas Baso, Mas Ari, Mas Rudi, Mbak Wiwin, Mbak Isni, Mbak Holifah,
Mbak Uuf, Mbak Nadea, Mbak Tiwi, Mbak Fajri, Mbak Destik, Mas Wawan,
Mbak Lia, Mbak Efa, dan Mas Luthfi, dan rekan-rekan S3 Mbak Nurul, Mbak
Nuril, Ibu Ifah, Ibu Ida, Pak Ilyas, Pak Asri, serta teman-teman biologi 47 atas
segala dukungan dan kebersamaan selama ini. Penghargaan terbesar penulis
sampaikan kepada kedua orang tua Ibu Ekaning Widji Astuty dan Bapak Eko
Budi Mardiyanto, dan adik Dwi Suputera Adi, Luqman Bagus Trianto, serta
seluruh keluarga atas segala do’a, kasih sayang, semangat, dan dukungan yang
diberikan.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Pebruari 2015
Ika Masiiratul Mardiyyah
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
PENDAHULUAN
1
Latar Belakang
1
Tujuan Penelitian
1
METODE
2
Waktu dan Tempat
2
Bahan
2
Metode
2
HASIL DAN PEMBAHASAN
3
SIMPULAN DAN SARAN
6
Simpulan
6
Saran
6
UCAPAN TERIMAKASIH
6
DAFTAR PUSTAKA
6
LAMPIRAN
9
RIWAYAT HIDUP
11
DAFTAR TABEL
1 Efisiensi transformasi kentang kultivar Diamant dengan menggunakan
eksplan ruas
2 Efisiensi regenerasi kalus transgenik putatif kentang kultivar Diamant
dengan menggunakan eksplan ruas
5
5
DAFTAR GAMBAR
1 Posisi gen Hd3a pada daerah T-DNA di dalam plasmid p2K1-Hd3a
2 Perkembangan eksplan kentang yang telah di-kokultivasikan dengan A.
tumefaciens
3 Pengujian tunas transgenik putatif dan non-transgenik berumur delapan
minggu pada media seleksi yang mengandung 40 mg/L higromisin
2
4
4
DAFTAR LAMPIRAN
1 Komposisi media MS (Murashige dan Skoog 1962)
2 Perhitungan persentase efisiensi transformasi dan efisiensi regenerasi
9
10
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Produktivitas tanaman kentang di Indonesia pada tahun 2012 adalah 16.58
ton/ha dan menurun pada tahun 2013 yakni 16.02 ton/ha (BPS 2014). Rendahnya
produksi kentang di Indonesia antara lain disebabkan oleh tingginya tingkat
serangan penyakit dan kondisi lingkungan. Salah satu cara untuk mengatasi hal
tersebut adalah dengan jalan pemuliaan misalnya dengan cara persilangan (Sahat
1991). Bunga sangat penting di dalam persilangan sehingga pembungaan
mempunyai peranan yang sangat penting dalam pemuliaan tanaman. Keadaan
cuaca sangat berpengaruh terhadap pembungaan tanaman kentang. Suhu udara
yang rendah (15-20 oC), kelembaban udara yang tinggi dan cukup sinar matahari,
serta sedikit hujan merupakan syarat yang baik untuk pertumbuhan, pembungaan,
dan pembentukan umbi. Tanaman kentang memerlukan hari panjang antara 16-18
jam untuk pertumbuhan bunganya (Sahat 1991).
Tanaman kentang kultivar Diamant berasal dari Belanda dan dihasilkan
dari persilangan mutan Cardinal pada tahun 1982 (ECPD 2013). Kultivar Diamant
memiliki batang tegak dan tebal, daun berwarna hijau hingga hijau gelap, bunga
berwarna merah-ungu, dan memiliki umbi yang berbentuk oval serta berkulit
kuning (NPCF 2011). Kultivar ini mempunyai potensi untuk dijadikan sebagai
tetua persilangan. Kultivar Diamant sukar berbunga (Sahat 1991) sehingga
kultivar ini membutuhkan penginduksi pembungaan untuk menjadikan kultivar
Diamant sebagai salah satu tetua persilangan.
Gen Hd3a adalah salah satu gen penyandi protein yang dapat menginduksi
pembungaan. Gen ini telah diidentifikasi melalui quantitative trait loci (QTL) dan
merupakan penyandi aktivator utama pembungaan pada padi dalam kondisi hari
pendek. Lokus Hd3a berada pada area ~20-kb yang mempunyai kesamaan dengan
gen flowering locus T (FT) yang memicu pembungaan pada tanaman hari panjang
seperti Arabidopsis (Kojima et al. 2002). Penelitian terbaru menunjukkan bahwa
FT/Hd3a merepresentasikan florigen yang merupakan tipe sinyal pembungaan.
Ekspresi Hd3a diregulasi oleh Hd1, Ehd1, juga sistem sensori fitokrom B
(Komiya et al. 2008). Penemuan gen Hd3a memungkinkan dilakukannya rekayasa
genetik untuk berbagai keperluan khususnya pemuliaan tanaman kentang.
Ekspresi berlebih (over expression) gen Hd3a dapat menginduksi pembungaan
tanaman padi (Komiya et al. 2008), Saussurea involucrata (Li et al. 2011),
Jatropha curcas L (Sulistyaningsih 2012) dan Nicotiana benthamiana (Syafitri
2012). Selain menginduksi pembungaan, ekspresi gen Hd3a mampu menginduksi
pengumbian tanaman kentang kultivar Andigena yang merupakan tanaman hari
pendek pada kondisi hari panjang (Navarro 2011), sehingga gen Hd3a dapat
digunakan untuk meningkatkan produksi kentang.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengintroduksikan gen Hd3a ke dalam
kentang (Solanum tuberosum L.) kultivar Diamant di bawah kendali promoter
rolC.
2
METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian ini telah dilaksanakan pada bulan Januari 2014 sampai dengan
bulan Juli 2014 di Laboratorium Biotechnology Research Indonesia-The
Netherlands (BIORIN), dan Laboratorium Biologi Molekuler dan Seluler
Tanaman (BMST), Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi
(PPSHB), LPPM, Institut Pertanian Bogor.
Bahan
Bahan penelitian ini berupa kentang (Solanum tuberosum L.) kultivar
Diamant. Agrobacterium tumefaciens galur LBA4404 yang membawa gen Hd3a
di bawah kendali promoter rolC (Tamaki et al. 2007) (Gambar 1) yang difusikan
dengan gen penanda seleksi hygromycin phosphotransferase (hpt) pada daerah TDNA plasmid p2K1-Hd3a yang digunakan untuk transformasi. Gen Hd3a berasal
dari pemberian Prof Ko Shimamoto (Nara Institute of Science and Technology,
Japan). Media tumbuh yang digunakan sebagai media dasar kultur in vitro adalah
media MS (Murashige dan Skoog 1962). Komposisi media MS disajikan pada
Lampiran 1.
LB
rolC
5’UTR
Kpn I
Hind III
Spe I
Xba I
Hd3a
GFP
NosT
hpt
RB
Gambar 1 Posisi gen Hd3a pada daerah T-DNA di dalam plasmid p2K1-Hd3a.
LB: left border, RB: right border, rolC: promoter dari A. rhizogenes,
Hd3a: gen heading date dari padi, GFP: gen penanda Green
Fluorescent Protein, hpt (hygromycin phosphotransferase): gen
resistensi terhadap higromisin yang digunakan sebagai penanda
seleksi (Tamaki et al. 2007).
Metode
Perbanyakan Tanaman
Tanaman kentang in vitro diperbanyak dengan stek buku (node) di media
MS2 makro yaitu media MS yang mengandung 2x konsentrasi unsur hara makro
selama 4 minggu. Eksplan ditumbuhkan di ruang kultur dengan suhu 20 oC,
dengan pencahayaan 2000-3000 lux dan fotoperiode 16 jam.
3
Perbanyakan Agrobacterium tumefaciens
Agrobacteruim tumefaciens strain LBA4404 yang mengandung plasmid
p2K1-Hd3a yang membawa gen Hd3a di bawah kendali promoter rolC (Tamaki
et al. 2007) yang berasal dari stok gliserol dibiakkan selama 36 jam pada media
LB (1% tripton, 0.5% yeast extract, 1% NaCl) cair mengandung 50 mg/L
kanamisin dan 25 mg/L rifampisin, dengan penggoyangan dengan kecepatan 150
rpm, pada suhu 28 oC, di dalam gelap. Sebanyak 100 µL dari biakan tersebut
kemudian dibiakkan kembali di dalam 10 mL media LB cair dengan kondisi yang
sama dengan sebelumnya hingga mencapai OD600 0.5-0.7.
Transformasi Genetik Kentang Kultivar Diamant
Transformasi dilakukan dengan metode ko-kultivasi menggunakan A.
tumefaciens. Sebelum ko-kultivasi, biakan A. tumefaciens disentrifuse pada
kecepatan 5000 rpm selama 15 menit dan endapannya diresuspensi dengan 10 mL
media ko-kultivasi cair (media MS yang mengandung 30 g/L sukrosa, 20 mg/L
asetosiringon, vitamin, 0.5 mg/L BAP, dan 0.1 mg/L IAA) hingga OD600 0.5-0.7.
Eksplan yang digunakan untuk transformasi berupa ruas (internode) berukuran
0.5-1 cm yang tidak mengandung mata tunas. Ko-kultivasi dilakukan dengan
merendam eksplan di dalam suspensi A. tumefaciens, selama 10 menit, digoyang
dengan kecepatan 100 rpm pada suhu ruang. Eksplan dikeringkan dengan tisu
steril, kemudian ditanam di media ko-kultivasi padat selama 3 hari di ruang gelap.
Setelah itu eksplan dicuci dengan akuades steril sebanyak empat kali dengan
penambahan cefotaxime 200 mg/L pada bilasan terakhir. Eksplan dikeringkan
dengan tisu steril dan kemudian ditanam di media induksi kalus yaitu media MS
yang mengandung 30 g/L sukrosa, 2.8 g/L gelrite, 100 mg/L cefotaxime, 3 mg/L
BA, 2 mg/L IAA, dan 1 mg/L GA3. Setelah satu minggu, eksplan ditanam di
media yang sama dan mengandung 10 mg/L higromisin sebagai agen seleksi.
Kalus yang resisten kemudian dipindah ke media regenerasi yaitu media yang
sama dengan media induksi kalus yang mengandung 10 mg/L higromisin. Tunas
yang terbentuk dipindahkan ke media perpanjangan tunas yaitu media MS2 makro
yang mengandung 10 mg/L higromisin. Pada subkultur selanjutnya, konsentrasi
higromisin ditingkatkan hingga 40 mg/L. Efisiensi transformasi dan efisiensi
regenerasi pada penelitian ini dihitung dengan rumus yang disajikan pada
Lampiran 2.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Eksplan Solanum tuberosum L. yang di-kokultivasikan dengan A.
tumefaciens yang mengandung gen Hd3a yang dipautkan dengan gen hpt mulai
membentuk kalus pada minggu ke-1 dan mulai beregenerasi pada minggu ke-4
(Gambar 2). Tunas hasil regenerasi ini mampu tumbuh pada media seleksi yang
mengandung 40 mg/L higromisin yang kemudian disebut dengan kentang
transgenik putatif, sedangkan tunas dari tanaman kentang non-transgenik yang
ditumbuhkan di media yang sama mengalami kematian (Gambar 3). Hal ini
menunjukkan bahwa gen hpt telah berhasil diintroduksikan dan terintegrasi ke
dalam genom kentang transgenik putatif, karena gen Hd3a terpaut dengan gen hpt,
4
maka tanaman trasngenik yang resisten terhadap higromisin juga mengandung gen
Hd3a. Konsentrasi 40 mg/L higromisin juga digunakan untuk melakukan seleksi
tanaman transgenik kentang kultivar Baraka (Bustomi 2014). Tanaman lain yang
menggunakan higromisin dengan konsentrasi berbeda antara lain kentang kultivar
Atlantik dengan konsentrasi 10 mg/L (Manguntungi 2014), padi kultivar
Nipponbare dengan konsentrasi 20 mg/L (Wardana 2014), dan Nicotiana
benthamiana dengan konsentrasi 30 mg/L (Senjaya 2013).
a
1 cm
b
1 cm
Gambar 2 Perkembangan eksplan kentang yang telah di-kokultivasikan dengan A.
tumefaciens. a: eksplan berumur satu minggu, b: eksplan berumur
empat minggu.
a
1 cm
b
1 cm
Gambar 3 Pengujian tunas transgenik putatif dan non-transgenik berumur delapan
minggu pada media seleksi yang mengandung 40 mg/L higromisin. a:
tunas transgenik, b: tunas non-transgenik.
Efisiensi transformasi kentang kultivar Diamant pada penelitian ini
berkisar antara 14.28% dan 33.33% dengan rata-rata 22.53% (Tabel 1). Efisiensi
transformasi kentang kultivar Diamant ini tidak jauh berbeda bila dibandingkan
dengan efisiensi transformasi genetik kentang kultivar Atlantik dengan nilai
efisiensi transformasi 16.7% (Manguntungi 2014) dan kentang kultivar Baraka
dengan nilai efisiensi transformasi 20.41% (Bustomi 2014). Umumnya
keberhasilan transformasi dipengaruhi oleh beberapa faktor antara lain genotipe
tanaman, konsentrasi asetosiringon, serta faktor teknis selama proses transformasi.
Beberapa genotipe kentang sangat sulit ditransformasi dengan Agrobacterium.
Genotipe yang relatif mudah dibiakkan melalui kultur jaringan secara in vitro
cenderung memberikan respon yang baik terhadap transformasi. Asetosiringon
merupakan senyawa fenolik yang berperan sebagai sinyal transkripsi gen-gen vir
di dalam Agrobacterium dan berperan dalam mekanisme transfer gen. Rashid et
5
al. (1996) melaporkan bahwa transformasi tanaman padi kultivar Basmati tidak
berhasil dilakukan apabila asetosiringon tidak ditambahkan ke dalam media kokultivasi. Konsentrasi asetosiringon juga mempengaruhi efisiensi transformasi.
Saharan et al. (2004) menambahkan asetosiringon ke dalam media ko-kultivasi
tanaman padi kultivar HKR-46 dan HKR-126 dengan empat konsentrasi berbeda
(100 µM, 200 µM, 400 µM, dan 500 µM) dan menunjukkan efisiensi transformasi
paling tinggi pada media ko-kultivasi dengan 400 µM asetosiringon. Faktor teknis
pada proses transformasi seperti pembilasan dan pengambilan eksplan dengan
pinset mengakibatkan kerusakan pada eksplan. Eksplan yang mengalami
kerusakan tidak akan berkembang dan mengalami kematian sehingga efisiensi
transformasi akan rendah apabila proses transformasi tidak dilakukan dengan
baik.
Tabel 1 Efisiensi transformasi kentang kultivar Diamant dengan menggunakan
eksplan ruas
Ulangan
Sumber
eksplan
Jumlah
eksplan
1
Ruas
2
Ruas
3
Ruas
Rata-rata efisiensi transformasi
6
7
5
Jumlah kalus
resisten
higromisin
2
1
1
Efisiensi
transformasi (%)
33.33
14.28
20
22.53
Pada penelitian ini, semua kalus yang resisten terhadap higromisin dapat
beregenerasi dan menghasilkan tunas transgenik putatif sehingga efisiensi
regenerasi kalus transgenik pada penelitian ini adalah 100%. Hasil dari tiga kali
proses transformasi dengan 18 eksplan adalah sembilan tunas transgenik putatif
sehingga rata-rata jumlah tunas transgenik putatif yang dihasilkan adalah 2.33
tunas tiap kalus (Tabel 2). Masing-masing tunas transgenik ini merupakan galur
yang terpisah dari galur lainnya (independent transgenic lines). Kontaminasi yang
menyebabkan kematian eksplan terjadi pada dua dari sembilan tunas transgenik
putatif.
Tabel 2 Efisiensi regenerasi kalus transgenik putatif kentang kultivar Diamant
dengan menggunakan eksplan ruas
Jumlah
Jumlah
Jumlah
Efisiensi
Jenis
kalus
Jumlah tunas
Ulangan
kalus
regenerasi
Eksplan
resisten
tunas
tiap
beregenerasi
(%)
higromisin
kalus
1
Ruas
2
2
100
4
2
2
Ruas
1
1
100
2
2
3
Ruas
1
1
100
3
3
Rata-rata
100
2.33
Pardal (2002) melaporkan bahwa regenerasi tanaman dipengaruhi oleh
jenis eksplan, genotipe tanaman, dan komposisi media yang digunakan. Tanaman
dari famili Solanaceae pada umumnya mudah diregenerasikan meskipun efisiensi
6
regenerasinya berbeda-beda. Hal ini dapat dilihat dari efisiensi regenerasi tanaman
kentang kultivar Baraka dengan efisiensi regenerasi 100% (Bustomi 2014),
tanaman terung kultivar Kopek dengan efisiensi regenerasi 86.67 (Husni et al.
2003), serta tanaman tomat kultivar Ratna dengan efisiensi regenerasi 26.3%
(Purnamaningsih 2010). Selain itu daya regenerasi sangat ditentukan oleh waktu
pemindahan kalus ke media regenerasi. Apabila kalus terlalu lama berada dalam
media induksi kalus, maka kalus akan kehilangan daya regenerasinya
(Purnamaningsih 2006). Pada penelitian ini, setelah terbentuk kalus langsung
diregenerasikan sehingga kalus tidak terlalu lama di media yang khusus untuk
induksi kalus.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Gen hpt telah berhasil diintroduksikan ke dalam kentang kultivar Diamant
sehingga penelitian ini menghasilkan sembilan tunas transgenik putatif yang
resisten terhadap 40 mg/L higromisin. Gen Hd3a terpaut dengan gen hpt, maka
tanaman yang mengandung gen hpt juga mengandung gen Hd3a di bawah kendali
promoter rolC. Efisiensi transformasi pada penelitian ini relatif rendah yaitu
22.53%, dan efisiensi regenerasinya sangat tinggi yaitu 100%.
Saran
Tanaman transgenik putatif perlu dianalisis untuk mengetahui integrasi gen
Hd3a dibawah kendali promoter rolC.
UCAPAN TERIMAKASIH
Terima kasih disampaikan kepada Proyek Penelitian Desentralisasi Baru
IPB yang berjudul “Rekayasa genetika tanaman dengan gen toleransi aluminium
dan pembungaan” dengan kontrak nomor: 48/ IT3.11/ LT/ 2014 atas nama: Prof
Dr Ir Suharsono yang telah membiayai penelitian ini.
DAFTAR PUSTAKA
Bustomi. 2014. Transformasi genetik kentang (Solanum tuberosum L.) kultivar
Baraka dengan gen pembungaan Hd3a [skripsi]. Bogor (ID): Institut
Pertanian Bogor.
[BPS] Badan Pusat Statistik. 2014. Luas panen, produksi dan produktivitas
kentang,/2009-2013/[Internet]./[diacu/2014/Juli/25]./Tersedia/dari:
7
http://www.bps.go.id/tab_sub/view.php?kat=3&tabel=1&daftar=1&id_subye
k=55¬ab=62.
[ECPD] European Cultivated Potato Database. 2013. Diamant (1982) [Internet].
[diacu 2013 Desember 31]. Tersedia dari: http:// www. europotato.
org/display_description.php?variety_name=Diamant%20%281982%29.
Husni A, Wattimena GA, Mariska I, Purwito A. 2003. Keragaman genetik
tanaman terung hasil regenerasi protoplas. J Biotek Pert. 8(2):52-59.
Kojima S, Takahashi Y, Kobayashi Y, Monna L, Sasaki T, Araki T, Yano M.
2002. Hd3a, a rice ortholog of the Arabidopsis FT gene, promotes transition
to flowering downstream of Hd1 under short-day conditions. Plant Cell
Physiol. 43(10):1096-1105.
Komiya R, Ikegami A, Tamaki S, Yokoi S, Shimamoto K. 2008. Hd3a and RFT1
are essential for flowering in rice. Development. 135:767774.doi:10.1242/dev.008631.
Li M, Li H, Hu X, Pan X, Wu G. 2011. Genetic transformation and
overexpression of a rice Hd3a induces early flowering in Saussurea
involucrata Kar.et Kir. ex Maxim. Plant Cell Tiss Org. 106:363371.doi:10.1007/s11240-011-9927-5.
Manguntungi AB. 2014. Transformasi genetik kentang (Solanum tuberosum)
kultivar Atlantik dengan gen penyandi lisozim melalui perantara
Agrobacterium tumefaciens [tesis]. Bogor (ID): Sekolah Pascasarjana, IPB.
Murashige T, Skoog F. 1962. A revised medium for rapid growth and bio assays
with
tobacco
tissue
cultures.
Physiol
Plantarum.
15:473497.doi:10.1111/j.1399-3054.1962.tb08052.x.
Navarro C, Abelanda JA, Oró EC, Cuéllar CA, Tamaki S, Silva J, Shimamoto K,
Prat S. 2011. Control of flowering and storage organ formation in potato by
flowering locus T. Nature. 478: 119-123.doi:10.1038/nature10431.
[NPCF] Netherlands Potato Consultative Foundation. 2011. Variety [Internet].
[diacu 2014 Januari 1]. Tersedia dari: http://www. nivaa. nl/ uk/
about_potatoes/ variety_catalogue/ras?frm_variety=128#.
Pardal SJ. 2002. Perkembangan Penelitian Regenerasi dan Transformasi pada
Tanaman Kedelai. J ArgoBiogen. 5(2):37-44.
Purnamaningsih R. 2006. Induksi kalus dan optimasi regenerasi empat varietas
padi melalui kultur in vitro. J AgroBiogen. 2(2):74-80.
Purnamaningsih R. 2010. Introduksi gen DefH9-iaaM dan DefH9-RI-iaaM ke
dalam genom tanaman tomat menggunakan vektor Agrobacterium
tumefaciens. J AgroBiogen. 6(1):18-25.
Rashid H, Yokoi S, Toriyama K, Hinata K. 1996. Transgenic plant production
mediated by Agrobacterium in lndica rice. Plant Cell Rep. 15:727730.doi:10.1007/bf00232216.
Saharan V, Yadav RC, Yadav NR, Ram K. 2004. Studies on improved
Agrobacterium-mediated transformation in two Indica rice (Oryza sativa L.).
Afr J Biotechnol. 3(11):572-575
Sahat S. 1991. Pengaruh cara stimulasi perbungaan terhadap produksi bunga,
buah, dan biji beberapa kultivar kentang (Solanum tuberosum L.). Bull Penel
Hort. 20(4):105-111.
8
Senjaya SK. 2013. Pewarisan genetik transgen Hd3a pada tanaman Nicotiana
benthamiana transgenik [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, IPB.
Sulistyaningsih YC. 2012. Rekayasa ekspresi gen pembungaan Hd3a pada
tanaman jarak pagar (Jatropha curcas L.) [disertasi]. Bogor (ID): Sekolah
Pascasarjana, IPB.
Syafitri LN. 2012. Transformasi genetik Nicotiana benthamiana dengan gen
pembungaan Hd3a dari padi [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Tamaki S, Matsuo S, Wong HL, Yokoi S, Shimamoto K. 2007. Hd3a protein is a
mobile
flowering
signal
in
rice.
Science.
36:10331036.doi:10.1126/science.1141753.
Wardana R. 2014. Transformasi genetik padi (Oryza sativa L.) dengan gen PaCS
penyandi sitrat sintase menggunakan perantara Agrobacterium tumefaciens
[tesis]. Bogor (ID): Sekolah Pascasarjana, IPB.
9
Lampiran 1 Komposisi media MS (Murashige dan Skoog 1962)
Bahan
NH4NO3a
KNO3a
KH2PO4
H3BO3
Na2MoO4.2H2O
CoCl2.6H2O
KI
CaCl2.2H2Oa
MgSO4.7H2O
MnSO4.4H2O
ZnSO4.7H2O
CuSO4.5H2O
Na2EDTA
FeSO4.7H2O
Thiamine-HCl
Niacin (asam
nikotinat)
Pyridoxine-HCl
Glycine
Myo inositol
Gula pasir
Agar
a
Konsentrasi
senyawa
dalam media
(mg/L)
1650
1900
170
6.2
0.25
0.025
0.83
440
370
22.3
8.6
0.025
37.3
27.8
0.1
0.5
0.5
2.0
100
30 g/L
8 g/L
Dibutuhkan 2x konsentrasi untuk pembuatan media MS2 makro
10
Lampiran 2 Perhitungan persentase efisiensi transformasi dan efisiensi regenerasi
% Efisiensi transformasi =
% Efisiensi regenerasi =
Keterangan:
KRH
KT
KRHT
KRH
× 100%
× 100%
KRH = jumlah kalus resisten higromisin
KT
= jumlah kalus total
KRHT = jumlah kalus resisten higromisin yang bertunas
11
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Probolinggo, 30 Agustus 1991 sebagai anak pertama
dengan dua adik dari pasangan Bapak Eko Budi Mardiyanto dan Ibu Ekaning
Widji Astuty. Pendidikan dasar diselesaikan pada tahun 2004 Di SD Negeri
Sukabumi 2 Probolinggo. Pendidikan lanjutan menengah pertama diselesaikan
pada tahun 2007 di SMP Negeri 1 Probolinggo, kemudian melanjutkan
pendidikan menengah atasnya di SMA Negeri 1 Probolinggo dan lulus pada tahun
2010. Melalui jalur USMI Institut Pertanian Bogor penulis melanjutkan
pendidikannya sebagai salah satu mahasiswa Biologi, Fakultas Matematika dan
Pengetahuan Alam, Insitut Pertanian Bogor pada tahun 2010.
Selama menjalani pendidikan sebagai mahasiswa, penulis aktif dalam
berbagai kegiatan termasuk menjadi asisten mata kuliah Pengantar Genetika
Molekuler pada semester genap tahun ajaran 2013/2014, menjadi Sekretaris Divisi
Infokom Himpunan Minat dan Profesi (Himpro) Himabio, Ketua Divisi Infokom
Himpro Himabio, Anggota Divisi Publikasi, Dekorasi, dan Dokumentasi Bionic
(Biology on Science and Aplication), Anggota Divisi Publikasi, Dekorasi, dan
Dokumentasi Masa Pengenalan Departemen Biologi, dan Anggota Unit Kegiatan
Mahasiswa Paduan Suara Mahasiswa (PSM) Agria Swara IPB.
(Solanum tuberosum L.) KULTIVAR DIAMANT
IKA MASIIRATUL MARDIYYAH
BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi yang berjudul Introduksi Gen
Hd3a ke dalam Tanaman Kentang (Solanum tuberosum L.) Kultivar Diamant
adalah benar karya bersama saya dengan komisi pembimbing dan belum diajukan
dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang
berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari
penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di
bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Pebruari 2015
Ika Masiiratul Mardiyyah
NIM G34100056
ABSTRAK
IKA MASIIRATUL MARDIYYAH. Introduksi gen Hd3a ke dalam tanaman
kentang (Solanum tuberosum L.) kultivar Diamant. Dibimbing oleh
SUHARSONO dan UTUT WIDYASTUTI.
Gen Hd3a adalah penyandi protein yang menginduksi pembungaan dan
pembentukan umbi pada kentang kultivar Andigena. Penelitian ini bertujuan
untuk mengintroduksikan gen Hd3a ke dalam tanaman kentang (Solanum
tuberosum L.) kultivar Diamant di bawah kendali promoter rolC. Tanaman
kentang diperbanyak secara in vitro di media MS2 makro. Transformasi genetik
dilakukan dengan bantuan Agrobacterium tumefaciens LBA4404 dengan metode
ko-kultivasi menggunakan potongan ruas (internode) sebagai eksplan. Seleksi
tanaman transgenik dilakukan di media MS yang mengandung 10-40 mg/L
higromisin. Hasil penelitian menunjukkan bahwa rata-rata efisiensi transformasi
adalah sebesar 22.53% dan efisiensi regenerasi 100%. Tunas transgenik putatif
yang dihasilkan berjumlah 9 dari 18 eksplan yang ditransformasi, dengan rata-rata
tunas transgenik putatif adalah 2.33 tunas tiap kalus. Efisiensi transformasi
dipengaruhi oleh genotipe tanaman, konsentrasi asetosiringon, serta faktor teknis
pada proses transformasi seperti pembilasan eksplan dan pengambilan eksplan
dengan pinset selama proses transformasi.
Kata kunci: Agrobacterium tumefaciens, gen Hd3a, kultivar Diamant, Solanum
tuberosum L., transformasi genetik.
ABSTRACT
IKA MASIIRATUL MARDIYYAH. Introduction of Hd3a gene into potato
(Solanum tuberosum L.) cultivar Diamant. Supervised by SUHARSONO dan
UTUT WIDYASTUTI.
Hd3a gene encoded a protein inducing flowering and tuber formation in
potato cultivar Andigena. This research has an objective to introduce the Hd3a
gene into potato (Solanum tuberosum L.) cultivar Diamant under control of
promoter rolC. Potato plants were propagated in vitro on MS2 macro medium.
Genetic transformation was carried out by co-cultivation method by using
Agrobacterium tumefaciens LBA4404. Internodes were used as explants for
transformation. Selection of transgenic plants was performed in MS medium
containing 10-40 mg/L hygromycin. The results showed that the average of
transformation efficiency was 22.53% and regeneration efficiency of the calli was
100%. Transformation of 18 explants resulted 9 putative transgenic shoots and the
regeneration rate was 2.33 putative transgenic shoots per callus. Transformation
efficiency was affected by plant genotype, acetosyringone concentration, and
technical factors such as washing and pincetting during the transformation process.
Keywords: Agrobacterium tumefaciens, cultivar Diamant, genetic transformation,
Hd3a gene, Solanum tuberosum L..
INTRODUKSI GEN Hd3a KE DALAM TANAMAN KENTANG
(Solanum tuberosum L.) KULTIVAR DIAMANT
IKA MASIIRATUL MARDIYYAH
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biologi
BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang
dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Januari 2014 hingga Juli
2014 ini ialah introduksi gen Hd3a ke dalam tanaman kentang (Solanum
tuberosum L.) kultivar Diamant.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Prof Dr Ir Suharsono, DEA
dan Ibu Dr Ir Utut Widyastuti, MSi selaku pembimbing atas waktu yang
disediakan, segala bimbingan, dukungan, arahan, kesabaran, serta saran yang telah
diberikan selama penelitian dan penulisan karya ilmiah ini. Penulis juga
mengucapkan terima kasih kepada Dr Achmad Farajallah, MSi selaku penguji
skripsi atas semua saran, masukan, dan perbaikan yang telah diberikan.
Terimakasih diucapkan kepada Proyek Penelitian Desentralisasi Baru IPB yang
berjudul “Rekayasa genetika tanaman dengan gen toleransi aluminium dan
pembungaan” dengan kontrak no: 48/IT3.11/LT/2014 atas nama: Prof Dr Ir
Suharsono, DEA yang telah membiayai penelitian ini. Terimakasih juga penulis
sampaikan kepada seluruh staf di laboratorium Biologi Molekular dan Selular
Tanaman (BMST) dan BIORIN, khususnya pada Ibu Nia Dahniar, SP, Ibu Pepi
Elvavina, Ibu Sarah, Bapak Asep Saripudin, Bapak Abdul Mulya, Bapak Sairi,
dan Bapak Yulianto atas segala bantuan. Ucapan terimakasih juga penulis
sampaikan kepada rekan-rekan seperjuangan S1 Setiyadi, Liyana, Shuffur,
Bustomi, Maulani, Jeihandanu, Scarinta, Dwika, Nurrizky, Agistina, dan rekanrekan S2 Mas Baso, Mas Ari, Mas Rudi, Mbak Wiwin, Mbak Isni, Mbak Holifah,
Mbak Uuf, Mbak Nadea, Mbak Tiwi, Mbak Fajri, Mbak Destik, Mas Wawan,
Mbak Lia, Mbak Efa, dan Mas Luthfi, dan rekan-rekan S3 Mbak Nurul, Mbak
Nuril, Ibu Ifah, Ibu Ida, Pak Ilyas, Pak Asri, serta teman-teman biologi 47 atas
segala dukungan dan kebersamaan selama ini. Penghargaan terbesar penulis
sampaikan kepada kedua orang tua Ibu Ekaning Widji Astuty dan Bapak Eko
Budi Mardiyanto, dan adik Dwi Suputera Adi, Luqman Bagus Trianto, serta
seluruh keluarga atas segala do’a, kasih sayang, semangat, dan dukungan yang
diberikan.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Pebruari 2015
Ika Masiiratul Mardiyyah
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
PENDAHULUAN
1
Latar Belakang
1
Tujuan Penelitian
1
METODE
2
Waktu dan Tempat
2
Bahan
2
Metode
2
HASIL DAN PEMBAHASAN
3
SIMPULAN DAN SARAN
6
Simpulan
6
Saran
6
UCAPAN TERIMAKASIH
6
DAFTAR PUSTAKA
6
LAMPIRAN
9
RIWAYAT HIDUP
11
DAFTAR TABEL
1 Efisiensi transformasi kentang kultivar Diamant dengan menggunakan
eksplan ruas
2 Efisiensi regenerasi kalus transgenik putatif kentang kultivar Diamant
dengan menggunakan eksplan ruas
5
5
DAFTAR GAMBAR
1 Posisi gen Hd3a pada daerah T-DNA di dalam plasmid p2K1-Hd3a
2 Perkembangan eksplan kentang yang telah di-kokultivasikan dengan A.
tumefaciens
3 Pengujian tunas transgenik putatif dan non-transgenik berumur delapan
minggu pada media seleksi yang mengandung 40 mg/L higromisin
2
4
4
DAFTAR LAMPIRAN
1 Komposisi media MS (Murashige dan Skoog 1962)
2 Perhitungan persentase efisiensi transformasi dan efisiensi regenerasi
9
10
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Produktivitas tanaman kentang di Indonesia pada tahun 2012 adalah 16.58
ton/ha dan menurun pada tahun 2013 yakni 16.02 ton/ha (BPS 2014). Rendahnya
produksi kentang di Indonesia antara lain disebabkan oleh tingginya tingkat
serangan penyakit dan kondisi lingkungan. Salah satu cara untuk mengatasi hal
tersebut adalah dengan jalan pemuliaan misalnya dengan cara persilangan (Sahat
1991). Bunga sangat penting di dalam persilangan sehingga pembungaan
mempunyai peranan yang sangat penting dalam pemuliaan tanaman. Keadaan
cuaca sangat berpengaruh terhadap pembungaan tanaman kentang. Suhu udara
yang rendah (15-20 oC), kelembaban udara yang tinggi dan cukup sinar matahari,
serta sedikit hujan merupakan syarat yang baik untuk pertumbuhan, pembungaan,
dan pembentukan umbi. Tanaman kentang memerlukan hari panjang antara 16-18
jam untuk pertumbuhan bunganya (Sahat 1991).
Tanaman kentang kultivar Diamant berasal dari Belanda dan dihasilkan
dari persilangan mutan Cardinal pada tahun 1982 (ECPD 2013). Kultivar Diamant
memiliki batang tegak dan tebal, daun berwarna hijau hingga hijau gelap, bunga
berwarna merah-ungu, dan memiliki umbi yang berbentuk oval serta berkulit
kuning (NPCF 2011). Kultivar ini mempunyai potensi untuk dijadikan sebagai
tetua persilangan. Kultivar Diamant sukar berbunga (Sahat 1991) sehingga
kultivar ini membutuhkan penginduksi pembungaan untuk menjadikan kultivar
Diamant sebagai salah satu tetua persilangan.
Gen Hd3a adalah salah satu gen penyandi protein yang dapat menginduksi
pembungaan. Gen ini telah diidentifikasi melalui quantitative trait loci (QTL) dan
merupakan penyandi aktivator utama pembungaan pada padi dalam kondisi hari
pendek. Lokus Hd3a berada pada area ~20-kb yang mempunyai kesamaan dengan
gen flowering locus T (FT) yang memicu pembungaan pada tanaman hari panjang
seperti Arabidopsis (Kojima et al. 2002). Penelitian terbaru menunjukkan bahwa
FT/Hd3a merepresentasikan florigen yang merupakan tipe sinyal pembungaan.
Ekspresi Hd3a diregulasi oleh Hd1, Ehd1, juga sistem sensori fitokrom B
(Komiya et al. 2008). Penemuan gen Hd3a memungkinkan dilakukannya rekayasa
genetik untuk berbagai keperluan khususnya pemuliaan tanaman kentang.
Ekspresi berlebih (over expression) gen Hd3a dapat menginduksi pembungaan
tanaman padi (Komiya et al. 2008), Saussurea involucrata (Li et al. 2011),
Jatropha curcas L (Sulistyaningsih 2012) dan Nicotiana benthamiana (Syafitri
2012). Selain menginduksi pembungaan, ekspresi gen Hd3a mampu menginduksi
pengumbian tanaman kentang kultivar Andigena yang merupakan tanaman hari
pendek pada kondisi hari panjang (Navarro 2011), sehingga gen Hd3a dapat
digunakan untuk meningkatkan produksi kentang.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengintroduksikan gen Hd3a ke dalam
kentang (Solanum tuberosum L.) kultivar Diamant di bawah kendali promoter
rolC.
2
METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian ini telah dilaksanakan pada bulan Januari 2014 sampai dengan
bulan Juli 2014 di Laboratorium Biotechnology Research Indonesia-The
Netherlands (BIORIN), dan Laboratorium Biologi Molekuler dan Seluler
Tanaman (BMST), Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi
(PPSHB), LPPM, Institut Pertanian Bogor.
Bahan
Bahan penelitian ini berupa kentang (Solanum tuberosum L.) kultivar
Diamant. Agrobacterium tumefaciens galur LBA4404 yang membawa gen Hd3a
di bawah kendali promoter rolC (Tamaki et al. 2007) (Gambar 1) yang difusikan
dengan gen penanda seleksi hygromycin phosphotransferase (hpt) pada daerah TDNA plasmid p2K1-Hd3a yang digunakan untuk transformasi. Gen Hd3a berasal
dari pemberian Prof Ko Shimamoto (Nara Institute of Science and Technology,
Japan). Media tumbuh yang digunakan sebagai media dasar kultur in vitro adalah
media MS (Murashige dan Skoog 1962). Komposisi media MS disajikan pada
Lampiran 1.
LB
rolC
5’UTR
Kpn I
Hind III
Spe I
Xba I
Hd3a
GFP
NosT
hpt
RB
Gambar 1 Posisi gen Hd3a pada daerah T-DNA di dalam plasmid p2K1-Hd3a.
LB: left border, RB: right border, rolC: promoter dari A. rhizogenes,
Hd3a: gen heading date dari padi, GFP: gen penanda Green
Fluorescent Protein, hpt (hygromycin phosphotransferase): gen
resistensi terhadap higromisin yang digunakan sebagai penanda
seleksi (Tamaki et al. 2007).
Metode
Perbanyakan Tanaman
Tanaman kentang in vitro diperbanyak dengan stek buku (node) di media
MS2 makro yaitu media MS yang mengandung 2x konsentrasi unsur hara makro
selama 4 minggu. Eksplan ditumbuhkan di ruang kultur dengan suhu 20 oC,
dengan pencahayaan 2000-3000 lux dan fotoperiode 16 jam.
3
Perbanyakan Agrobacterium tumefaciens
Agrobacteruim tumefaciens strain LBA4404 yang mengandung plasmid
p2K1-Hd3a yang membawa gen Hd3a di bawah kendali promoter rolC (Tamaki
et al. 2007) yang berasal dari stok gliserol dibiakkan selama 36 jam pada media
LB (1% tripton, 0.5% yeast extract, 1% NaCl) cair mengandung 50 mg/L
kanamisin dan 25 mg/L rifampisin, dengan penggoyangan dengan kecepatan 150
rpm, pada suhu 28 oC, di dalam gelap. Sebanyak 100 µL dari biakan tersebut
kemudian dibiakkan kembali di dalam 10 mL media LB cair dengan kondisi yang
sama dengan sebelumnya hingga mencapai OD600 0.5-0.7.
Transformasi Genetik Kentang Kultivar Diamant
Transformasi dilakukan dengan metode ko-kultivasi menggunakan A.
tumefaciens. Sebelum ko-kultivasi, biakan A. tumefaciens disentrifuse pada
kecepatan 5000 rpm selama 15 menit dan endapannya diresuspensi dengan 10 mL
media ko-kultivasi cair (media MS yang mengandung 30 g/L sukrosa, 20 mg/L
asetosiringon, vitamin, 0.5 mg/L BAP, dan 0.1 mg/L IAA) hingga OD600 0.5-0.7.
Eksplan yang digunakan untuk transformasi berupa ruas (internode) berukuran
0.5-1 cm yang tidak mengandung mata tunas. Ko-kultivasi dilakukan dengan
merendam eksplan di dalam suspensi A. tumefaciens, selama 10 menit, digoyang
dengan kecepatan 100 rpm pada suhu ruang. Eksplan dikeringkan dengan tisu
steril, kemudian ditanam di media ko-kultivasi padat selama 3 hari di ruang gelap.
Setelah itu eksplan dicuci dengan akuades steril sebanyak empat kali dengan
penambahan cefotaxime 200 mg/L pada bilasan terakhir. Eksplan dikeringkan
dengan tisu steril dan kemudian ditanam di media induksi kalus yaitu media MS
yang mengandung 30 g/L sukrosa, 2.8 g/L gelrite, 100 mg/L cefotaxime, 3 mg/L
BA, 2 mg/L IAA, dan 1 mg/L GA3. Setelah satu minggu, eksplan ditanam di
media yang sama dan mengandung 10 mg/L higromisin sebagai agen seleksi.
Kalus yang resisten kemudian dipindah ke media regenerasi yaitu media yang
sama dengan media induksi kalus yang mengandung 10 mg/L higromisin. Tunas
yang terbentuk dipindahkan ke media perpanjangan tunas yaitu media MS2 makro
yang mengandung 10 mg/L higromisin. Pada subkultur selanjutnya, konsentrasi
higromisin ditingkatkan hingga 40 mg/L. Efisiensi transformasi dan efisiensi
regenerasi pada penelitian ini dihitung dengan rumus yang disajikan pada
Lampiran 2.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Eksplan Solanum tuberosum L. yang di-kokultivasikan dengan A.
tumefaciens yang mengandung gen Hd3a yang dipautkan dengan gen hpt mulai
membentuk kalus pada minggu ke-1 dan mulai beregenerasi pada minggu ke-4
(Gambar 2). Tunas hasil regenerasi ini mampu tumbuh pada media seleksi yang
mengandung 40 mg/L higromisin yang kemudian disebut dengan kentang
transgenik putatif, sedangkan tunas dari tanaman kentang non-transgenik yang
ditumbuhkan di media yang sama mengalami kematian (Gambar 3). Hal ini
menunjukkan bahwa gen hpt telah berhasil diintroduksikan dan terintegrasi ke
dalam genom kentang transgenik putatif, karena gen Hd3a terpaut dengan gen hpt,
4
maka tanaman trasngenik yang resisten terhadap higromisin juga mengandung gen
Hd3a. Konsentrasi 40 mg/L higromisin juga digunakan untuk melakukan seleksi
tanaman transgenik kentang kultivar Baraka (Bustomi 2014). Tanaman lain yang
menggunakan higromisin dengan konsentrasi berbeda antara lain kentang kultivar
Atlantik dengan konsentrasi 10 mg/L (Manguntungi 2014), padi kultivar
Nipponbare dengan konsentrasi 20 mg/L (Wardana 2014), dan Nicotiana
benthamiana dengan konsentrasi 30 mg/L (Senjaya 2013).
a
1 cm
b
1 cm
Gambar 2 Perkembangan eksplan kentang yang telah di-kokultivasikan dengan A.
tumefaciens. a: eksplan berumur satu minggu, b: eksplan berumur
empat minggu.
a
1 cm
b
1 cm
Gambar 3 Pengujian tunas transgenik putatif dan non-transgenik berumur delapan
minggu pada media seleksi yang mengandung 40 mg/L higromisin. a:
tunas transgenik, b: tunas non-transgenik.
Efisiensi transformasi kentang kultivar Diamant pada penelitian ini
berkisar antara 14.28% dan 33.33% dengan rata-rata 22.53% (Tabel 1). Efisiensi
transformasi kentang kultivar Diamant ini tidak jauh berbeda bila dibandingkan
dengan efisiensi transformasi genetik kentang kultivar Atlantik dengan nilai
efisiensi transformasi 16.7% (Manguntungi 2014) dan kentang kultivar Baraka
dengan nilai efisiensi transformasi 20.41% (Bustomi 2014). Umumnya
keberhasilan transformasi dipengaruhi oleh beberapa faktor antara lain genotipe
tanaman, konsentrasi asetosiringon, serta faktor teknis selama proses transformasi.
Beberapa genotipe kentang sangat sulit ditransformasi dengan Agrobacterium.
Genotipe yang relatif mudah dibiakkan melalui kultur jaringan secara in vitro
cenderung memberikan respon yang baik terhadap transformasi. Asetosiringon
merupakan senyawa fenolik yang berperan sebagai sinyal transkripsi gen-gen vir
di dalam Agrobacterium dan berperan dalam mekanisme transfer gen. Rashid et
5
al. (1996) melaporkan bahwa transformasi tanaman padi kultivar Basmati tidak
berhasil dilakukan apabila asetosiringon tidak ditambahkan ke dalam media kokultivasi. Konsentrasi asetosiringon juga mempengaruhi efisiensi transformasi.
Saharan et al. (2004) menambahkan asetosiringon ke dalam media ko-kultivasi
tanaman padi kultivar HKR-46 dan HKR-126 dengan empat konsentrasi berbeda
(100 µM, 200 µM, 400 µM, dan 500 µM) dan menunjukkan efisiensi transformasi
paling tinggi pada media ko-kultivasi dengan 400 µM asetosiringon. Faktor teknis
pada proses transformasi seperti pembilasan dan pengambilan eksplan dengan
pinset mengakibatkan kerusakan pada eksplan. Eksplan yang mengalami
kerusakan tidak akan berkembang dan mengalami kematian sehingga efisiensi
transformasi akan rendah apabila proses transformasi tidak dilakukan dengan
baik.
Tabel 1 Efisiensi transformasi kentang kultivar Diamant dengan menggunakan
eksplan ruas
Ulangan
Sumber
eksplan
Jumlah
eksplan
1
Ruas
2
Ruas
3
Ruas
Rata-rata efisiensi transformasi
6
7
5
Jumlah kalus
resisten
higromisin
2
1
1
Efisiensi
transformasi (%)
33.33
14.28
20
22.53
Pada penelitian ini, semua kalus yang resisten terhadap higromisin dapat
beregenerasi dan menghasilkan tunas transgenik putatif sehingga efisiensi
regenerasi kalus transgenik pada penelitian ini adalah 100%. Hasil dari tiga kali
proses transformasi dengan 18 eksplan adalah sembilan tunas transgenik putatif
sehingga rata-rata jumlah tunas transgenik putatif yang dihasilkan adalah 2.33
tunas tiap kalus (Tabel 2). Masing-masing tunas transgenik ini merupakan galur
yang terpisah dari galur lainnya (independent transgenic lines). Kontaminasi yang
menyebabkan kematian eksplan terjadi pada dua dari sembilan tunas transgenik
putatif.
Tabel 2 Efisiensi regenerasi kalus transgenik putatif kentang kultivar Diamant
dengan menggunakan eksplan ruas
Jumlah
Jumlah
Jumlah
Efisiensi
Jenis
kalus
Jumlah tunas
Ulangan
kalus
regenerasi
Eksplan
resisten
tunas
tiap
beregenerasi
(%)
higromisin
kalus
1
Ruas
2
2
100
4
2
2
Ruas
1
1
100
2
2
3
Ruas
1
1
100
3
3
Rata-rata
100
2.33
Pardal (2002) melaporkan bahwa regenerasi tanaman dipengaruhi oleh
jenis eksplan, genotipe tanaman, dan komposisi media yang digunakan. Tanaman
dari famili Solanaceae pada umumnya mudah diregenerasikan meskipun efisiensi
6
regenerasinya berbeda-beda. Hal ini dapat dilihat dari efisiensi regenerasi tanaman
kentang kultivar Baraka dengan efisiensi regenerasi 100% (Bustomi 2014),
tanaman terung kultivar Kopek dengan efisiensi regenerasi 86.67 (Husni et al.
2003), serta tanaman tomat kultivar Ratna dengan efisiensi regenerasi 26.3%
(Purnamaningsih 2010). Selain itu daya regenerasi sangat ditentukan oleh waktu
pemindahan kalus ke media regenerasi. Apabila kalus terlalu lama berada dalam
media induksi kalus, maka kalus akan kehilangan daya regenerasinya
(Purnamaningsih 2006). Pada penelitian ini, setelah terbentuk kalus langsung
diregenerasikan sehingga kalus tidak terlalu lama di media yang khusus untuk
induksi kalus.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Gen hpt telah berhasil diintroduksikan ke dalam kentang kultivar Diamant
sehingga penelitian ini menghasilkan sembilan tunas transgenik putatif yang
resisten terhadap 40 mg/L higromisin. Gen Hd3a terpaut dengan gen hpt, maka
tanaman yang mengandung gen hpt juga mengandung gen Hd3a di bawah kendali
promoter rolC. Efisiensi transformasi pada penelitian ini relatif rendah yaitu
22.53%, dan efisiensi regenerasinya sangat tinggi yaitu 100%.
Saran
Tanaman transgenik putatif perlu dianalisis untuk mengetahui integrasi gen
Hd3a dibawah kendali promoter rolC.
UCAPAN TERIMAKASIH
Terima kasih disampaikan kepada Proyek Penelitian Desentralisasi Baru
IPB yang berjudul “Rekayasa genetika tanaman dengan gen toleransi aluminium
dan pembungaan” dengan kontrak nomor: 48/ IT3.11/ LT/ 2014 atas nama: Prof
Dr Ir Suharsono yang telah membiayai penelitian ini.
DAFTAR PUSTAKA
Bustomi. 2014. Transformasi genetik kentang (Solanum tuberosum L.) kultivar
Baraka dengan gen pembungaan Hd3a [skripsi]. Bogor (ID): Institut
Pertanian Bogor.
[BPS] Badan Pusat Statistik. 2014. Luas panen, produksi dan produktivitas
kentang,/2009-2013/[Internet]./[diacu/2014/Juli/25]./Tersedia/dari:
7
http://www.bps.go.id/tab_sub/view.php?kat=3&tabel=1&daftar=1&id_subye
k=55¬ab=62.
[ECPD] European Cultivated Potato Database. 2013. Diamant (1982) [Internet].
[diacu 2013 Desember 31]. Tersedia dari: http:// www. europotato.
org/display_description.php?variety_name=Diamant%20%281982%29.
Husni A, Wattimena GA, Mariska I, Purwito A. 2003. Keragaman genetik
tanaman terung hasil regenerasi protoplas. J Biotek Pert. 8(2):52-59.
Kojima S, Takahashi Y, Kobayashi Y, Monna L, Sasaki T, Araki T, Yano M.
2002. Hd3a, a rice ortholog of the Arabidopsis FT gene, promotes transition
to flowering downstream of Hd1 under short-day conditions. Plant Cell
Physiol. 43(10):1096-1105.
Komiya R, Ikegami A, Tamaki S, Yokoi S, Shimamoto K. 2008. Hd3a and RFT1
are essential for flowering in rice. Development. 135:767774.doi:10.1242/dev.008631.
Li M, Li H, Hu X, Pan X, Wu G. 2011. Genetic transformation and
overexpression of a rice Hd3a induces early flowering in Saussurea
involucrata Kar.et Kir. ex Maxim. Plant Cell Tiss Org. 106:363371.doi:10.1007/s11240-011-9927-5.
Manguntungi AB. 2014. Transformasi genetik kentang (Solanum tuberosum)
kultivar Atlantik dengan gen penyandi lisozim melalui perantara
Agrobacterium tumefaciens [tesis]. Bogor (ID): Sekolah Pascasarjana, IPB.
Murashige T, Skoog F. 1962. A revised medium for rapid growth and bio assays
with
tobacco
tissue
cultures.
Physiol
Plantarum.
15:473497.doi:10.1111/j.1399-3054.1962.tb08052.x.
Navarro C, Abelanda JA, Oró EC, Cuéllar CA, Tamaki S, Silva J, Shimamoto K,
Prat S. 2011. Control of flowering and storage organ formation in potato by
flowering locus T. Nature. 478: 119-123.doi:10.1038/nature10431.
[NPCF] Netherlands Potato Consultative Foundation. 2011. Variety [Internet].
[diacu 2014 Januari 1]. Tersedia dari: http://www. nivaa. nl/ uk/
about_potatoes/ variety_catalogue/ras?frm_variety=128#.
Pardal SJ. 2002. Perkembangan Penelitian Regenerasi dan Transformasi pada
Tanaman Kedelai. J ArgoBiogen. 5(2):37-44.
Purnamaningsih R. 2006. Induksi kalus dan optimasi regenerasi empat varietas
padi melalui kultur in vitro. J AgroBiogen. 2(2):74-80.
Purnamaningsih R. 2010. Introduksi gen DefH9-iaaM dan DefH9-RI-iaaM ke
dalam genom tanaman tomat menggunakan vektor Agrobacterium
tumefaciens. J AgroBiogen. 6(1):18-25.
Rashid H, Yokoi S, Toriyama K, Hinata K. 1996. Transgenic plant production
mediated by Agrobacterium in lndica rice. Plant Cell Rep. 15:727730.doi:10.1007/bf00232216.
Saharan V, Yadav RC, Yadav NR, Ram K. 2004. Studies on improved
Agrobacterium-mediated transformation in two Indica rice (Oryza sativa L.).
Afr J Biotechnol. 3(11):572-575
Sahat S. 1991. Pengaruh cara stimulasi perbungaan terhadap produksi bunga,
buah, dan biji beberapa kultivar kentang (Solanum tuberosum L.). Bull Penel
Hort. 20(4):105-111.
8
Senjaya SK. 2013. Pewarisan genetik transgen Hd3a pada tanaman Nicotiana
benthamiana transgenik [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, IPB.
Sulistyaningsih YC. 2012. Rekayasa ekspresi gen pembungaan Hd3a pada
tanaman jarak pagar (Jatropha curcas L.) [disertasi]. Bogor (ID): Sekolah
Pascasarjana, IPB.
Syafitri LN. 2012. Transformasi genetik Nicotiana benthamiana dengan gen
pembungaan Hd3a dari padi [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Tamaki S, Matsuo S, Wong HL, Yokoi S, Shimamoto K. 2007. Hd3a protein is a
mobile
flowering
signal
in
rice.
Science.
36:10331036.doi:10.1126/science.1141753.
Wardana R. 2014. Transformasi genetik padi (Oryza sativa L.) dengan gen PaCS
penyandi sitrat sintase menggunakan perantara Agrobacterium tumefaciens
[tesis]. Bogor (ID): Sekolah Pascasarjana, IPB.
9
Lampiran 1 Komposisi media MS (Murashige dan Skoog 1962)
Bahan
NH4NO3a
KNO3a
KH2PO4
H3BO3
Na2MoO4.2H2O
CoCl2.6H2O
KI
CaCl2.2H2Oa
MgSO4.7H2O
MnSO4.4H2O
ZnSO4.7H2O
CuSO4.5H2O
Na2EDTA
FeSO4.7H2O
Thiamine-HCl
Niacin (asam
nikotinat)
Pyridoxine-HCl
Glycine
Myo inositol
Gula pasir
Agar
a
Konsentrasi
senyawa
dalam media
(mg/L)
1650
1900
170
6.2
0.25
0.025
0.83
440
370
22.3
8.6
0.025
37.3
27.8
0.1
0.5
0.5
2.0
100
30 g/L
8 g/L
Dibutuhkan 2x konsentrasi untuk pembuatan media MS2 makro
10
Lampiran 2 Perhitungan persentase efisiensi transformasi dan efisiensi regenerasi
% Efisiensi transformasi =
% Efisiensi regenerasi =
Keterangan:
KRH
KT
KRHT
KRH
× 100%
× 100%
KRH = jumlah kalus resisten higromisin
KT
= jumlah kalus total
KRHT = jumlah kalus resisten higromisin yang bertunas
11
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Probolinggo, 30 Agustus 1991 sebagai anak pertama
dengan dua adik dari pasangan Bapak Eko Budi Mardiyanto dan Ibu Ekaning
Widji Astuty. Pendidikan dasar diselesaikan pada tahun 2004 Di SD Negeri
Sukabumi 2 Probolinggo. Pendidikan lanjutan menengah pertama diselesaikan
pada tahun 2007 di SMP Negeri 1 Probolinggo, kemudian melanjutkan
pendidikan menengah atasnya di SMA Negeri 1 Probolinggo dan lulus pada tahun
2010. Melalui jalur USMI Institut Pertanian Bogor penulis melanjutkan
pendidikannya sebagai salah satu mahasiswa Biologi, Fakultas Matematika dan
Pengetahuan Alam, Insitut Pertanian Bogor pada tahun 2010.
Selama menjalani pendidikan sebagai mahasiswa, penulis aktif dalam
berbagai kegiatan termasuk menjadi asisten mata kuliah Pengantar Genetika
Molekuler pada semester genap tahun ajaran 2013/2014, menjadi Sekretaris Divisi
Infokom Himpunan Minat dan Profesi (Himpro) Himabio, Ketua Divisi Infokom
Himpro Himabio, Anggota Divisi Publikasi, Dekorasi, dan Dokumentasi Bionic
(Biology on Science and Aplication), Anggota Divisi Publikasi, Dekorasi, dan
Dokumentasi Masa Pengenalan Departemen Biologi, dan Anggota Unit Kegiatan
Mahasiswa Paduan Suara Mahasiswa (PSM) Agria Swara IPB.