Transformasi Genetik Kentang (Solanum tuberosum L.) Kultivar Baraka dengan Gen Pembungaan Hd3a
TRANSFORMASI GENETIK KENTANG (Solanum tuberosum
L.) KULTIVAR BARAKA DENGAN GEN PEMBUNGAAN
Hd3a
BUSTOMI
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Transformasi Genetik
Kentang (Solanum tuberosum L.) Kultivar Baraka dengan Gen Pembungaan Hd3a
adalah benar karya saya bersama komisi pembimbing dan belum diajukan dalam
bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang
berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari
penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di
bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, September 2014
Bustomi
NIM G34100055
ABSTRAK
BUSTOMI. Transformasi Genetik Kentang (Solanum tuberosum L.) Kultivar
Baraka dengan Gen Pembungaan Hd3a. Dibimbing oleh SUHARSONO dan
UTUT WIDYASTUTI.
Pembungaan mempunyai peranan yang sangat penting dalam pemuliaan
tanaman. Pembungaan merupakan transisi dari fase vegetatif ke fase generatif.
Salah satu gen yang berhubungan dengan pembungaan adalah Hd3a. Penelitian ini
bertujuan untuk melakukan transformasi genetik kentang (Solanum tuberosum L.)
kultivar Baraka dengan gen pembungaan Hd3a dibawah kendali promoter kuat
prolC. Tanaman kentang diperbanyak secara in vitro di media MS2. Transformasi
genetik dilakukan melalui bantuan Agrobacterium tumefaciens dengan metode kokultivasi menggunakan potongan daun dan buku sebagai eksplan. Seleksi tanaman
transgenik dilakukan di media MS yang mengandung 10-40 mg/L higromisin.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa rata-rata efisiensi transformasi genetik
relatif rendah yaitu 16.36% dengan efisiensi regenerasi yang sangat tinggi yaitu
100%. Rendahnya efisiensi transformasi kemungkinan disebabkan oleh rusaknya
eksplan selama proses transformasi. Efisiensi transformasi eksplan buku lebih
tinggi daripada eksplan daun. Rata-rata tunas transgenik putatif yang dihasilkan
tiap kalus adalah 2.5. Di media MS0, empat dari 24 tanaman transgenik putatif
menghasilkan umbi sedangkan tunas non-transgenik tidak menghasilkan umbi.
Hal ini menunjukkan bahwa Hd3a menginduksi pembentukan umbi pada tanaman
kentang kultivar Baraka transgenik putatif.
Kata kunci: Solanum tuberosum L. kultivar Baraka, transformasi genetik, gen
pembungaan Hd3a
ABSTRACT
BUSTOMI. Genetic Transformation of Potato (Solanum tuberosum L.) Cultivars
Baraka with Hd3a Flowering Gene. Supervised by SUHARSONO and UTUT
WIDYASTUTI.
Flowering has a very important role in plant breeding. Flowering is the
phase transition from the vegetative to the generative phase. One of the genes
associated with flowering is Hd3a. This research has an objective to transform
genetically potato (Solanum tuberosum L.) cultivar Baraka with Hd3a flowering
gene under control of a strong promoter prolC. Potato plants were propagated in
vitro on MS2 medium. Genetic transformation was carried out by co-cultivation
method by using Agrobacterium tumefaciens LBA4404. Leaf disc and internodes
were used as explants for transformation. Selection of transgenic plants was
performed in MS medium containing 10-40 mg/L hygromycin. The results
showed that the efficiency of transformation was relatively low. The efficiency of
shoot regeneration of transgenic calli was very high. The low efficiency of
transformation was caused by damage of explant during transformation process.
The efficiency of transformation of internode was higher than leaf explants.
Putative transgenic shoot regeneration per callus was 2.5. In MS0 media, four of
twenty-four putative transgenic plants produced tuber whereas all non-transgenic
plants did not. This result showed that Hd3a induced the formation of tuber of
transgenic potato cv. Baraka.
Keywords: Solanum tuberosum L. cultivar Baraka, genetic transformation, Hd3a
flowering gene
TRANSFORMASI GENETIK KENTANG (Solanum tuberosum
L.) KULTIVAR BARAKA DENGAN GEN PEMBUNGAAN
Hd3a
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
aJudul Skripsi: Transformasi Genetik Kentang (Solanum tuberosum L.) Kultivar
Baraka dengan Gen Pembungaan Hd3a
Nama
: Bustomi
: 034100055
NIM
Disetujui oleh
Prof Dr Ir Suharsono, DEA
Pembimbing I
Tanggal Lulus: t 1 "!.
AUG 2014
Dr Ir Utut Widyastuti. MSi
Pembimbing II
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang
dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Desember 2013 hingga
Mei 2014 ini ialah transformasi genetik kentang (Solanum tuberosum L.) kultivar
Baraka dengan gen pembungaan Hd3a .
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Prof Dr Ir Suharsono, DEA
dan Ibu Dr Ir Utut Widyastuti, MSi selaku pembimbing atas segala bimbingan,
dukungan, arahan, kesabaran waktu yang disediakan serta saran yang telah
diberikan selama penelitian dan penulisan karya ilmiah ini. Penulis juga
mengucapkan terima kasih kepada Proyek Penelitian Desentralisasi Baru IPB
yang berjudul “Rekayasa genetika tanaman dengan gen toleransi aluminium dan
pembungaan” dengan kontrak no: 48/IT3.11/LT/2014 atas nama: Prof Dr Ir
Suharsono, DEA yang telah membiayai penelitian ini. Terimakasih diucapkan
juga kepada Dr Berry Juliandi, MSi selaku penguji skripsi atas semua saran,
masukan, dan perbaikan yang telah diberikan. Terimakasih dan penghargaan
sebesar-besarnya penulis sampaikan kepada seluruh staf di laboratorium Biologi
Molekular dan Selular Tanaman (BMST) dan BIORIN, khususnya pada Mbak
Nia, Mbak Pepy, Mbak Ara, Pak Asep, Pak Mulya, Pak Iri, dan Pak Yanto.
Terimakasih juga ditujukan kepada Bapak Diky, SP (BA Farm) yang telah
membantu dalam proses aklimatisasi. Ucapan terimakasih juga penulis sampaikan
kepada rekan-rekan seperjuangan S1 Aje, Carin, Dwika, Eka, Ica, Ika, Ina, dan
Lisa, rekan-rekan S2 Bang Baso, Pak Ari, Cak Rudi, Mbak Wiwin, Mbak Isni,
Mbak Uuf, Mbak Efah, Mbak Nadea, Mbak Tiwi, Mbak Fajri, Mbak Destik, Mas
Wawan, Mbak Lia, Mbak Nurul, dan Mbak Nuril dan rekan-rekan S3 Pak Asri,
Pak Ilyas, Ibu Ifah, dan Ibu Ida serta teman-teman biologi 47 dan teman-teman
kost Perwira 6. Ungkapan terimakasih juga penulis sampaikan kepada seluruh
keluarga atas segala doa dan dukungan yang diberikan.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, September 2014
Bustomi
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
PENDAHULUAN
1
Latar Belakang
1
Tujuan Penelitian
2
BAHAN DAN METODE
2
Waktu dan Tempat
2
Bahan
2
Metode
3
Perbanyakan planlet
3
Perbanyakan Agrobacterium tumefaciens
3
Transformasi genetik kentang kultivar Baraka
3
Aklimatisasi
3
HASIL DAN PEMBAHASAN
4
Pembentukan kalus
4
Pembentukan tunas transgenik putatif
4
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran
9
9
10
UCAPAN TERIMA KASIH
10
DAFTAR PUSTAKA
10
LAMPIRAN
12
RIWAYAT HIDUP
14
DAFTAR TABEL
1 Rata-rata efisiensi transformasi kentang kultivar Baraka
2 Rata-rata efisiensi regenerasi kalus dan jumlah tunas setiap kalus
kentang kultivar Baraka
7
8
DAFTAR GAMBAR
1 Posisi Gen Hd3a pada daerah T-DNA di dalam plasmid p2K1-Hd3a
2 Bentuk kalus dari eksplan batang kentang kultivar Baraka hasil
transformasi dengan A. tumefaciens yang mengandung p2K1-Hd3a
3 Pembentukan tunas kentang kultivar Baraka di media regenerasi
Tunas kentang yang di tanam di media seleksi yang mengandung 40
mg/L higromisin
4 Uji viabilitas tunas kentang non-transgenik dan media seleksi
5 Tanaman kentang kultivar Baraka in vitro yang berumur 4 minggu
6 Tanaman kentang kultivar Baraka transgenik putatif yang ditanam di
polibag
2
4
5
6
6
9
9
DAFTAR LAMPIRAN
1 Komposisi Media MS (Murashige dan Skoog 1962)
2 Perhitungan persentase efisiensi transformasi dan efisiensi
regenerasi Baraka
12
13
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Kentang (Solanum tuberosum L.) merupakan salah satu komoditas yang
potensial untuk diversifikasi pangan. Kentang mengandung karbohidrat yang
tinggi sehingga dapat digunakan sebagai alternatif makanan pokok. Selain itu
kentang dapat dijadikan bahan baku industri makanan olahan.
Menurut Badan Pusat Statistik (BPS 2014), produktivitas tanaman kentang
Indonesia pada tahun 2012 adalah 16.6 ton/ha dan pada tahun 2013 adalah 16.7
ton/ha. Produktivitas ini lebih rendah daripada rata-rata produktivitas dunia yang
pada 2012 adalah sebesar 18.9 ton/ha dan Australia sebesar 38.3 ton/ha
(FAOSTAT 2014). Rendahnya produksi kentang di Indonesia dapat disebabkan
oleh beberapa faktor, diantaranya adalah rendahnya kualitas bibit, dan teknik
budidaya (Wattimena 1992) serta tingginya tingkat serangan hama dan penyakit
(Mahmud 1990). Penggunaan varietas yang unggul sangat penting dalam
meningkatkan produksi kentang. Varietas unggul dapat diperoleh melalui
persilangan konvensional, dan rekayasa genetika. Bunga sangat penting di dalam
persilangan konvensional sehingga pembungaan mempunyai peranan yang sangat
penting dalam pemuliaan tanaman.
Pembungaan merupakan transisi dari fase vegetatif ke fase
generatif/reproduksi. Keadaan cuaca sangat berpengaruh terhadap pembungaan
tanaman kentang. Kentang berbunga pada suhu 15-20°C, kelembaban udara yang
tinggi dan cukup sinar matahari, serta sedikit hujan (Sahat 1991). Untuk berbunga,
tanaman kentang memerlukan hari panjang yaitu sekitar 16-18 jam.
Gen Hd3a pertama kali diidentifikasi sebagai quantitative trait locus (QTL)
yang proteinnya dapat menginduksi pembungaan padi pada kondisi hari pendek
(Kojima et al. 2002). Gen Hd3a yang berasal dari padi telah diisolasi oleh Tamaki
et al. (2007) yang mempunyai homologi dengan gen flowering locus T (FT) dari
Arabidopsis thaliana. FT/Hd3a merupakan sinyal florigen pembungaan bertipe
cepat (Tamaki et al. 2007). Protein Hd3a berinteraksi dengan faktor transkripsi
bZIP untuk menginduksi transisi dari fase vegetatif ke fase reproduktif di dalam
meristem apikal (Tsuji et al. 2008). Komiya et al. (2008) menunjukkan bahwa
supresi Hd3a dengan RNA interference (RNAi) dapat menunda pembungaan.
Introduksi gen Hd3a dapat menginduksi pembungaan pada tanaman seperti
Saussurea involucrata (Li et al. 2011), Jatropha curcas L (Sulistyaningsih 2012)
dan Nicotiana benthamiana (Syafitri 2012; Senjaya 2013).
Transformasi genetik kentang dengan menggunakan Agrobacterium
tumefaciens telah banyak dilakukan, diantaranya yang dilakukan oleh Nurhasanah
et al. (2003) dan Manguntungi (2014).
Navarro et al. (2011) telah
mengekspresikan Hd3a secara berlebihan di kentang kultivar Andigena yang
merupakan kentang hari pendek. Kentang transgenik yang dihasilkan dapat
berbunga dan berumbi di daerah hari panjang, sedangkan tanaman kentang nontransgenik tidak berbunga dan tidak berumbi. Hal ini menunjukkan bahwa Hd3a
dapat menginduksi pembungaan dan pengumbian pada kentang hari pendek.
2
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk melakukan transformasi genetik kentang
(Solanum tuberosum L.) kultivar Baraka dengan gen pembungaan Hd3a di bawah
kendali promoter kuat prolC.
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Desember 2013 sampai dengan bulan
Mei 2014 di Laboratorium Biotechnology Research Indonesia-The Netherlands
(BIORIN), dan Laboratorium Biologi Molekuler dan Seluler Tanaman (BMST),
Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB), Lembaga
Penelitian dan Pengabdian kepada Masyarakat (LPPM), Institut Pertanian Bogor.
Bahan
Kentang (Solanum tuberosum L.) kultivar Baraka in vitro digunakan sebagai
bahan tanaman untuk transformasi genetik. Agrobacterium tumefaciens galur LB
A4404 yang mengandung plasmid p2K1 yang membawa gen Hd3a di bawah
kendali promoter prolC (Tamaki et al. 2007) yang dipautkan dengan gen penanda
GFP serta gen resistensi terhadap higromisin (hpt) digunakan untuk melakukan
transformasi genetik. Peta fisik daerah T-DNA dari plasmid p2K1-Hd3a disajikan
pada Gambar 1. Plasmid atau vektor ekspresi ini adalah pemberian Prof. Ko
Shimamoto (Nara Institute of Science & Technology, Jepang).
Hind
LB
Kpn I
prolC
Xba
Hd3a
Spe
GFP
NosT
hpt
RB
BB
Gambar 1 Posisi Gen Hd3a pada daerah T-DNA di dalam plasmid p2K1-Hd3a.
LB: left border, RB: right border, prol C: promoter dari
Agrobacterium rhizogenes, Hd3a: gen heading date dari padi, GFP:
gen penanda Green Fluorescent Protein, hpt: gen resistensi terhadap
higromisin. Daerah yang diarsir adalah sekuen 5’UTR (Tamaki et al.
2007)
Media tumbuh MS (Murashiage and Skoog 1962) digunakan sebagai media
dasar kultur in vitro dam media MS yang mengandung higromisin sebagai media
seleksi.
3
Metode
Perbanyakan tanaman in vitro
Tanaman kentang in vitro diperbanyak dengan stek ruas (node) tunggal yang
mengandung satu mata tunas di media MS2 makro. Media MS2 makro adalah
media MS yang mengandung 2x konsentrasi unsur hara makro ditambah 2 ml/L
pantothenic acid ditumbuhkan selama 4 minggu di ruang kultur dengan suhu 24o25oC dan pencahayaan 2000-3000 lux serta fotoperiode 16 jam.
Perbanyakan Agrobacterium tumefaciens
Agrobacteruim tumefaciens strain LBA4404 yang mengandung plasmid
p2K1-Hd3a yang mengandung gen Hd3a di bawah kendali promoter prolC
(Tamaki et al. 2007) dibiakkan selama 36 jam pada media LB (1% tripton, 0,5%
yeast extract, 1% NaCl) cair yang mengandung 50 mg/L kanamisin dan 25 mg/L
rifampisin, dengan penggoyangan pada kecepatan 150 rpm, suhu 28oC, di dalam
gelap. Sebanyak 100 µL dari biakan tersebut kemudian dibiakkan kembali di
dalam 10 mL media LB cair dengan kondisi yang sama dengan sebelumnya
hingga mencapai nilai OD600 sebesar 0,5-0,7.
Transformasi genetik kentang kultivar Baraka
Transformasi dilakukan dengan metode ko-kultivasi yang menggunakan
bantuan A. tumefaciens.
Sebelum ko-kultivasi, biakan A. tumefaciens
disentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm selama 15 menit dan endapan yang
diperoleh diresuspensi dengan 10 ml media ko-kultivasi cair (media MS cair yang
mengandung 0.5 mg/L BAP, 0.1 mg/L IAA, dan 20 mg/L Asetosiringon) hingga
OD600 0.5-0.7. Eksplan yang ditransformasi adalah potongan daun berukuran 1
cm2 dan buku (internode) berukuran 0.5-1 cm. Ko-kultivasi dilakukan dengan
merendam eksplan di dalam suspensi A. tumefaciens, selama 10 menit, digoyang
dengan kecepatan 100 rpm, pada suhu ruang. Eksplan dikeringkan dengan tisu
steril, kemudian ditanam di media ko-kultivasi padat selama 3 hari di ruang gelap.
Setelah itu eksplan dicuci dengan akuades steril sebanyak empat kali dan pada
bilasan terakhir ekplan direndam selama 10 menit dengan menambahkan 100 mg/l
larutan cefotaxime. Eksplan dikeringkan dengan tisu steril dan kemudian ditanam
di media induksi kalus yang juga merupakan media regenerasi tunas yaitu media
MS yang mengandung 3 mg/L BAP, 2 mg/L IAA, 1 mg/L GA3, 100 mg/L
cefotaxime, dan 3 g/L agar gelrite. Subkultur dilakukan setiap 12 hari. Tunas yang
terbentuk, dipindahkan ke media seleksi yaitu media MS yang mengandung 10
mg/L higromisin. Pada subkultur selanjutnya, konsentrasi higromisin ditingkatkan
hingga 40 mg/L. Eksplan yang menghasilkan tunas transgenik putatif dihitung
untuk mengetahui efisiensi transformasi dan efisiensi regenerasi (Lampiran 2).
Eksplan non transgenik (kontrol) yang tidak ditransformasi dengan A.
tumefaciens ditanam dalam media seleksi higromisin yang sama dengan eksplan
yang di transformasi dengan A. tumefaciens sebagai kontrol efisiensi media
seleksi.
Aklimatisasi
Tanaman kentang yang mempunyai batang dan akar lebih dari 2 cm,
dibersihkan dari semua agar, kemudian dipindahkan ke dalam ke tray yang
4
berukuran 3 cm x 3 cm x 5 cm yang berisi coco-peat. Setelah agak besar, sekitar 3
minggu, tanaman dipindah ke dalam polibag yang mengandung tanah, pasir dan
pupuk kandang dengan perbandingan 1:1:1 (volume).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Pembentukan kalus
Eksplan yang digunakan dalam proses transformasi adalah potongan daun
yang berukuran 1 cm2 dan buku batang tanpa mata tunas yang berukuran 0.5-1
cm. Penggunaan buku tanpa mata tunas bertujuan untuk menghindari tumbuhnya
tunas palsu dari bagian buku eksplan ketika ditanam di media regenerasi. Induksi
kalus dan regenerasi menggunakan media yang sama yaitu media MS yang
mengandung 3 mg/L BAP, 2 mg/L IAA, 1 mg/L GA3, 100 mg/L cefotaxime, dan
3 g/L agar gelrite, seperti yang digunakan oleh Puspita (2002) dan Manguntungi
(2014).
Hasil penelitian menunjukkan bahwa eksplan buku lebih cepat membentuk
kalus daripada eksplan daun yaitu pada minggu ke-2 setelah tanam. Kalus
terbentuk mulai dari kedua ujung buku batang yang dilukai kemudian merata ke
seluruh bagian eksplan (Gambar 2). Pada eksplan daun, kalus mulai terbentuk
pada minggu ke-3 setelah tanam, dari bagian tangkai lalu kemudian menyebar ke
seluruh permukaan daun. Penambahan IAA dan BAP pada penelitian ini dapat
memacu pembentukan kalus seperti yang dilakukan oleh Li et al. (2007). Menurut
Hidayat (2009) jaringan meristematik pada batang lebih banyak daripada di daun
sehingga proses pembelahan dan pemanjangan sel di batang lebih cepat dari pada
di daun.
1 cm
Gambar 2 Bentuk kalus dari eksplan batang kentang kultivar Baraka hasil
transformasi dengan A. tumefaciens yang mengandung p2K1-Hd3a
Pembentukan tunas transgenik putatif
Setiap 12 hari setelah penanaman di media induksi kalus, eksplan
disubkultur secara berulang pada media yang sama. Subkultur yang dilakukan
setiap 12 hari bertujuan untuk memacu pembentukan tunas. Pada bagian yang
terluka pada saat infeksi, kalus menghasilkan tonjolan-tonjolan yang kemudian
5
berkembang menjadi tunas. Pada eksplan buku, tunas mulai terbentuk dari kalus
yang berumur 4-7 minggu setelah tanam sedangkan pada eksplan daun, tunas
mulai terbentuk pada kalus yang berumur 5-6 minggu dari bagian tangkai daun
(Gambar 3). Menurut Gaba (2005), zat pengatur tumbuh endogen mempunyai
peranan yang penting dalam memicu terbentuknya tunas. Buku batang
kemungkinan mengandung zat pengatur tumbuh lebih banyak dari pada daun.
1 cm
1 cm
(a)
(b)
1 cm
(c)
Gambar 3 Pembentukan tunas kentang kultivar Baraka di media regenerasi.
Regenerasi tunas dari kalus yang terdapat pada: (a) ujung buku
batang, (b) tengah buku batang, dan (c) tangkai daun
Ko-kultivasi eksplan kentang dengan A. tumefaciens yang mengandung gen
Hd3a yang dipautkan dengan gen hpt telah menghasilkan tanaman yang resisten
terhadap higromisin. Hal ini menunjukkan bahwa proses transformasi kentang
dengan gen Hd3a yang dipautkan dengan gen hpt telah berhasil dan menghasilkan
tanaman kentang transgenik putatif. Transformasi genetik dengan menggunakan
perantara A. tumefaciens merupakan salah satu metode yang banyak digunakan
karena menghasilkan tanaman transgenik yang stabil (Li et al. 2007).
Tanaman kentang transgenik putatif dapat bertahan hidup di media seleksi
hingga 40 mg/L higromisin, sedangkan tanaman kentang non-transgenik yang
ditumbuhkan di media yang sama mengalami kematian (Gambar 4). Ketahanan
tanaman terhadap higromisin sangat tergantung dari spesies dan kultivarnya,
sehingga konsentrasi higromisin yang digunakan untuk menyeleksi tanaman
transgenik tergantung dari spesies dan kultivarnya. Konsentrasi higromisin yang
digunakan untuk menyeleksi tunas J. curcas adalah 40 mg/L (Sulistyaningsih
2012), sedangkan Saussurea involucrata transgenik diseleksi dengan konsentrasi
20 mg/L higromisin (Li et al. 2011), dan seleksi Nicotiana benthamiana
6
transgenik dilakukan pada media yang mengandung 30 mg/L higromisin ( Syafitri
2012).
1 cm
(a)
(b)
Gambar 4 Tunas kentang yang ditanam di media seleksi yang mengandung 40
mg/L higromisin. (a) tunas transgenik, (b) tunas non-transgenik
Untuk membuktikan bahwa tanaman kentang non-transgenik mempunyai
viabilitas yang baik dan media seleksi berfungsi dengan baik, tanaman nontransgenik ditanam di dua macam media MS yang berbeda yaitu: (1) media yang
tidak mengandung higromisin dan (2) media yang mengandung higromisin
sebagai media seleksi. Pada media yang tidak mengandung higromisin, tunas
kentang non-transgenik tumbuh dengan baik, sedangkan pada media yang
mengandung higromisin, tunas kentang mengalami kematian (Gambar 5). Hal ini
menunjukkan bahwa tanaman kentang non-transgenik mempunyai viabilitas yang
baik, dan media seleksi berfungsi dengan baik.
1 cm
1 cm
(a)
(b)
Gambar 5 Uji viabilitas tunas kentang non-transgenik dan media seleksi. (a)
tunas non-transgenik yang berumur 5 minggu yang ditanam di media
yang tidak mengandung higromisin, (b) tunas non-transgenik berusia
5 minggu yang ditanam di media seleksi yang mengandung
higromisin
7
Pada penelitian ini, efisiensi transformasi kentang kultivar Baraka berkisar
antara 4.2% dan 27% dengan rata-rata 16.36% (Tabel 1). Efisiensi transformasi
ini lebih tinggi dibandingkan dengan transformasi genetik kentang kultivar Russet
Burbank, Lehmi Russet, dan Atzimba dengan gen Bar (Dinarti 1999), kultivar
Atlantik dengan gen hordothionin (Nurhasanah 2003), dan relatif sama dengan
transformasi genetik kentang kultivar Atlantik dengan gen c-lysozyme
(Manguntungi 2014), tetapi lebih kecil dibandingkan dengan transformasi pada
Jatropha curcas yaitu 26.67% (Sulistyaningsih 2012) dan pada Nicotiana
benthamiana yaitu 86% (Syafitri 2012). Efisiensi transformasi dipengaruhi oleh
spesies dan kultivar yang digunakan. Rendahnya efisiensi transformasi pada
penelitian ini disebabkan oleh banyaknya eksplan yang mati karena terinfeksi A.
tumefaciens yang sulit dihilangkan dengan perlakuan cefotaxime. Rusaknya
jaringan dari eksplan selama proses transformasi dapat menyebabkan kematian
eksplan. Selain itu, perlakuan cefotaxime yang terus menerus untuk
menghilangkan A. tumefaciens juga dapat menghambat pertumbuhan dan bahkan
mematikan eksplan kentang.
Tabel 1 Rata-rata efisiensi transformasi kentang kultivar Baraka
Jumlah kalus
Jenis
Jumlah
Efisiensi
Percobaan
resisten
eksplan
eksplan
transformasi (%)
higromisin
Daun
24
1
4.2
1
Buku
40
12
30
2
Buku
32
2
6.25
3
Buku
20
5
25
Rata-rata efisiensi transformasi
16.36
Efisiensi transformasi dari eksplan daun lebih kecil daripada eksplan buku
(Tabel 1). Hal ini terjadi karena eksplan daun mempunyai jaringan yang sangat
tipis sehingga mudah rusak pada saat proses transformasi. Cadangan makanan di
daun lebih sedikit daripada di batang (Santoso dan Nursandi 2001) sehingga daun
lebih sulit untuk beregenerasi daripada batang.
Efisiensi regenerasi pada penelitian ini sangat tinggi yaitu sebesar 100%
(Tabel 2). Efisiensi regenerasi kentang kultivar Baraka transgenik putatif yang
mengandung gen Hd3a pada penelitian ini lebih tinggi dari pada kultivar Russet
Burbank, Lehmi Russet dan Atzimba transgenik putatif yang mengandung gen bar
yaitu berturut-turut 15, 8,6 dan 12.5 % (Dinarti 1999), kultivar Atlantik, Granola
dan Amudra transgenik putatif yang mengandung gen ketahanan penyakit hawar
daun RB yaitu berturut-turut 90%, 60% dan 56% (Listanto et al. 2009), dan
kultivar Desiree non-transgenik yaitu 94% (Puspita 2002). Keberhasilan
regenerasi menurut Listanto et al. (2009) dipengaruhi oleh beberapa faktor seperti
konsentrasi auksin, sitokinin, jenis eksplan, dan kultivar kentang yang digunakan.
Menurut Dinarti (1999) pemberian BAP dapat mempercepat pembentukan tunas.
Puspita (2002) melaporkan bahwa kombinasi pemberian IAA 0.2 mg/L dengan
BAP 3 mg/L dapat menghasilkan efisiensi regenerasi yang lebih tinggi yaitu 94%
daripada kombinasi pemberian IAA 0.2 mg/L dan BAP 2 mg/L yang hanya
menghasilkan 63%. Penambahan IAA atau IBA pada J. curcas L. dapat
8
meningkatkan frekuensi pembentukan tunas maupun jumlah tunas yang dihasilkan
(Sulistiyaningsih 2012).
Tabel 2 Rata-rata efisiensi regenerasi kalus dan jumlah tunas setiap kalus kentang
kultivar Baraka
Percobaan
Jenis
eksplan
Jumlah
Jumlah
kalus
kalus yang
resisten
beregenera
higromisin
si
Daun
1
Buku
12
2
Buku
2
3
Buku
5
Rata-rata efisiensi regenerasi
1
1
12
2
5
Efisiensi
regenera
si (%)
100
100
100
Jumlah
tunas
Jumlah
tunas
tiap
kalus
3
32
6
7
48
3
2.46
3
1.6
2.5
Jumlah tunas transgenik putatif yang dihasilkan tiap kalus kentang kultivar
Baraka pada penelitian ini adalah 2.5 (Tabel 2). Hasil ini relatif sama dengan
yang diperoleh Listanto et al. (2009).
Di media MS0, empat dari 25 tanaman transgenik putatif menghasilkan
umbi sedangkan tunas non-transgenik di media yang sama tidak menghasilkan
umbi. Umbi terbentuk pada kentang transgenik putatif yang berumur 4 minggu
(Gambar 6). Hasil ini menyerupai hasil penelitian Navarro et al. (2011) yang
menunjukkan bahwa Hd3a selain dapat menginduksi pembentukan bunga juga
dapat menginduksi terbentuknya umbi pada kentang kultivar Andigena, yang
merupakan kentang hari pendek dan berumur genjah, bila ditanam di hari panjang.
Kentang Andigena non-transgenik tidak berbunga dan tidak berumbi bila ditanam
di daerah yang mempunyai hari panjang. Kentang kultivar Andigena berbeda
dengan Baraka yang merupakan kultivar yang berumur dalam. Walaupun kultivar
Andigena dan Baraka berbeda tipe umurnya, tetapi Hd3a mempunyai pengaruh
yang relatif sama yaitu menginduksi pembentukan umbi yang lebih awal
dibandingkan dengan tanaman non-transgenik. Hal ini menunjukkan bahwa Hd3a
dapat menginduksi pembentukan umbi pada kentang walaupun harus dibuktikan
lagi pada kultivar kentang lainnya.
Untuk mengetahui pengaruh ekspresi gen Hd3a di dalam tanaman kentang
transgenik terhadap pembungaan, tanaman transgenik putatif ditanam pada media
tanah di dalam pot. Sebanyak 2 tanaman kentang kultivar Baraka transgenik
putatif telah berhasil ditanaman di polibag (Gambar 7).
9
1 cm
1 cm
(a)
(b)
Gambar 6 Tanaman kentang kultivar Baraka in vitro yang berumur 4 minggu. (a)
tanaman transgenik putatif, (b) tanaman non-transgenik.
= umbi
Gambar 7 Tanaman kentang kultivar Baraka transgenik putatif berumur 3 bulan
yang ditanam di polibag
Menurut Navarro et al. (2011), gen Hd3a dtranskripsikan dan translasikan
di dalam jaringan daun kentang, kemudian protein Hd3a tersebut disalurkan
melalui floem ke daerah pucuk apikal untuk menginduksi pembungaan dan
disalurkan ke daerah stolon untuk menginduksi pembentukan umbi. Protein Hd3a
memiliki kemampuan untuk mempercepat pengumbian melalui mekanisme
aktivasi gen-gen pengumbian yang homolog dengan gen pembungaan FT pada A.
thaliana.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Transformasi genetik kentang kultivar Baraka telah berhasil dilakukan dan
menghasilkan 48 tunas transgenik putatif. Efisiensi transformasi pada penelitian
ini relatif rendah yaitu 16.36%, dan efisiensi regenerasinya sangat tinggi yaitu
100%. Efisiensi transformasi pada eksplan buku lebih tinggi daripada eksplan
10
daun. Di media MS0, empat dari 24 tanaman transgenik putatif menghasilkan
umbi, yang menunjukkan bahwa Hd3a menginduksi pembentukan umbi.
Saran
Tanaman transgenik putatif perlu dianalisis untuk mengetahui integrasi
gennya.
UCAPAN TERIMA KASIH
Terima kasih disampaikan kepada Proyek Penelitian Desentralisasi Baru
IPB yang berjudul “Rekayasa genetika tanaman dengan gen toleransi aluminium
dan pembungaan” dengan kontrak no: 48/IT3.11/LT/2014 atas nama: Prof Dr Ir
Suharsono, DEA yang telah membiayai penelitian ini.
DAFTAR PUSTAKA
Dinarti D. 1999. Efisiensi transfer gen penanda nptII atau bar menggunakan isolat
Agrobacterium oncogenik dan disarmed pada tiga kultivar kentang. [tesis].
Bogor (ID): Program Pascasarjana, IPB
BPS [ Badan Pusat Statistik ]. 2014. Luas Panen, Produktivitas dan Produksi
Kentang. [Internet]. [diunduh 2014 Juni 4]. Tersedia pada:
http:www.bps.go.id.
FAOSTAT [Food and Agriculture Organization of the United States]. 2012. The
Agricultural Production of Potatoes. [Internet]. [diunduh 2014 Juli 4].
Tersedia
pada:
http:www.faostat3.foo.org/faostatgateway/gp/to/download/Q/QC/E.
Gaba V, Schlarman E, Elman C, Sagee O, Watad AA, Gray DJ. (1998) In vitro
studies on the anatomy and morphology of bud regeneration in melon
cotyledons. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Plant 35: 1-7
Hidayat O. 2009. Kajian penggunaan hormon IBA, BAP dan kinetin terhadap
multiplikasi Tunas Tanaman Penghasil Gaharu (Gyrinops versteegii (Gilg)
Domke) secara In Vitro. [skripsi]. Bogor (ID): Fakultas Kehutanan, IPB.
Kojima et al. 2002. Hd3a, a rice ortholog of the arabidopsis FT gene, promotes
transition to flowering downstream of Hd1 under short-day conditions.
Plant Cell Physiol 43:1096–1105.
Komiya R, Ikegami A, Tamaki S, Yokoi S, Shimamoto K. 2008. Hd3a and RFT1
are essential for flowering in rice. Development
135:767-774.
doi:10.1242/dev.008631
Li M, Li H, Jiang H, Pan X, Wu G. 2007. Establishment of an Agrobacterium
mediated cotyledon disc transformation method for Jatropha curcas. Plant
Cell Tiss Organ Cult. 92: 173-181.
11
Li M, Li H, Hu X. 2011. Genetic transformation and overexpression of a rice
Hd3a induces early flowering in Saussurea involucrata Kar.et Kir. ex
Maxim. Plant Cell Tiss Organ Cult. 106: 363-371.
Listanto E, Wattimena GA, Armini NM, Sinaga MS, Sofiari E, Herman M. 2009.
Regenerasi beberapa kultivar kentang dan transformasi kentang dengan
Gen RB melalui Agrobacterium tumefaciens. J. Hort. 19(2): 137-147.
Mahmud M. 1990. Penyakit Bakteri Tanaman Pangan dan Hortikultura di
Indonesia. Jakarta (ID): PT Agricon.
Manguntungi AB. 2014. Transformasi genetik kentang ‘Atlantik’ dengan gen
penyandi lisozim melalui perantara Agrobacterium tumefaciens. [makalah
seminar]. Bogor: Sekolah Pascasarjana, IPB.
Murashige T, Skoog F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays
with tobacco culture. Physiol Plant. 15: 473-497.
Navarro C, Abelanda JA, Cruz EO, Carlos A, Tamaki S, Silva J, Shimamoto K,
Prat S. 2011. Control of flowering and storage organ formation in potato
by flowering locus T. Nature 478: 119-123. doi: 10.1038/nature 10431.
Nurhasanah, Wattimena GA, Purwito A, Wiendi NMA, Suharsono. 2003.
Transformasi genetik tanaman kentang cv. Atlantik dengan
mengintroduksikan gen hordothionin untuk mendapatkan ketahanan
terhadap penyakit bakteri. Buletin Agronomi 31 (2): 63-67.
Puspita T. 2002. Studi regenerasi kentang (Solanum tuberosum) kultivar desiree
secara in vitro. [skripsi]. Bogor (ID): Fakultas Pertanian, IPB.
Sahat S. 1991. Pengaruh cara stimulasi perbungaan terhadap produksi bunga,
buah, dan biji beberapa kultivar kentang (Solanum tuberosum L.). Bull
Penel Hort. 20:105-111.
Senjaya SK. 2013. Pewarisan genetik transgen Hd3a pada tanaman Nicotiana
benthamiana transgenik. [skripsi]. Bogor (ID): Fakultas Matematika dan
Ilmu Pengetahuan Alam, IPB.
Smith O. 1968. Potatoes: Production, storing, processing. London (GB): Avi
Publishing Company.
Sulistyaningsih YC. 2012. Rekayasa ekspresi gen pembungaan Hd3a pada
tanaman jarak pagar (Jatropha curcas L.). [disertasi]. Bogor: Sekolah
Pascasarjana, IPB.
Syafitri LN. 2012. Transformasi genetik Nicotiana benthamiana dengan gen
pembungaan Hd3a dari padi. [skripsi]. Bogor (ID): Fakultas Matematika
dan Ilmu Pengetahuan Alam, IPB.
Tamaki S, Matsuo S, Wong H, Yokoi S, Shimamoto K. 2007. Hd3a protein is a
mobile flowering signal in rice. Science 36:1033-1036.
Tsuji H, Tamaki S, Komiya R, Shimamoto K. 2008. Florigen and the
photoperiodic control of flowering in rice. Rice 1:25-35.
Wattimena GA. 1992. Bioteknologi Tanaman I. Bogor (ID): Pusat Antar
Universitas Bioteknologi IPB.
12
Lampiran 1 Komposisi Media MS (Murashiege dan Skoog 1962)
Bahan
NH4NO3
KNO3
KH2PO4
H3BO3
Na2MoO4.2H2O
CoCl2.6H2O
KI
CaCl2.2H2O
MgSO4.7H2O
MnSO4.4H2O
ZnSO4.7H2O
CuSO4.5H2O
Na2EDTA
FeSO4.7H2O
Thiamine-HCl
Niacin (asam
nikotinat)
Pyridoxine-HCl
Glycine
Myo inositol
Gula pasir
Agar
Konsentrasi
Senyawa dalam
media (mg/L)
1650
1900
170
6.2
0.25
0.025
0.83
440
370
22.3
8.6
0.025
37.3
27.8
0.1
0.5
0.5
2.0
100
30 g/L
8 g/L
Volume yang
dipipet (ml/L)
20
20
5
5
5
5
5
10
13
Lampiran 2 Perhitungan persentase efisiensi transformasi dan efisiensi regenerasi
% efisiensi transformasi =
ℎ
% efisiensi regenerasi =
ℎ
�
ℎ
�
ℎ
ℎ
�
x 100%
%
14
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di jakarta pada tanggal 24 Februari 1993 dari ayah Tirsat
bin Langen (Alm) dan ibu Sumaliyah (Alm). Penulis merupakan anak tunggal.
Tahun 2010 penulis lulus dari SMA Negeri 52 jakarta dan pada tahun yang
sama lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB
(USMI). Penulis terpilih masuk Program Studi Biologi, Fakultas Matematika dan
Ilmu Pengetahuan Alam dan mendapatkan beasiswa dari Dikti yaitu beasiswa
bidik misi.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis aktif di Koperasi Mahasiswa
(KOPMA) sebagai staf Riset dan Pengembangan pada tahun 2011/2012 dan aktif
di Himpunan Mahasiswa Biologi (HIMABIO) sebagai staf divisi Pengembangan
sumber daya manusia (PSDM) pada tahun 2012/2013. Penulis pernah
melaksanakan studi lapang di Kebun Raya Cibodas, Taman Nasional Gunung
Gede-Pangrango pada tahun 2012, dengan judul makalah “Invasif Alien Species di
Kebun Raya Cibodas”. Penulis juga pernah melakukan magang dengan topik
isolasi DNA kedelai transgenik di BB Biogen Bogor pada bulan Januari-Februari
2013. Pada bulan Juni-Juli 2013 penulis melakukan praktik lapangan di Taman
Margasatwa Ragunan, Jakarta dengan topik “Perilaku harian anoa (Bubalus sp.) di
Taman Margasatwa Ragunan Jakarta”.
L.) KULTIVAR BARAKA DENGAN GEN PEMBUNGAAN
Hd3a
BUSTOMI
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Transformasi Genetik
Kentang (Solanum tuberosum L.) Kultivar Baraka dengan Gen Pembungaan Hd3a
adalah benar karya saya bersama komisi pembimbing dan belum diajukan dalam
bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang
berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari
penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di
bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, September 2014
Bustomi
NIM G34100055
ABSTRAK
BUSTOMI. Transformasi Genetik Kentang (Solanum tuberosum L.) Kultivar
Baraka dengan Gen Pembungaan Hd3a. Dibimbing oleh SUHARSONO dan
UTUT WIDYASTUTI.
Pembungaan mempunyai peranan yang sangat penting dalam pemuliaan
tanaman. Pembungaan merupakan transisi dari fase vegetatif ke fase generatif.
Salah satu gen yang berhubungan dengan pembungaan adalah Hd3a. Penelitian ini
bertujuan untuk melakukan transformasi genetik kentang (Solanum tuberosum L.)
kultivar Baraka dengan gen pembungaan Hd3a dibawah kendali promoter kuat
prolC. Tanaman kentang diperbanyak secara in vitro di media MS2. Transformasi
genetik dilakukan melalui bantuan Agrobacterium tumefaciens dengan metode kokultivasi menggunakan potongan daun dan buku sebagai eksplan. Seleksi tanaman
transgenik dilakukan di media MS yang mengandung 10-40 mg/L higromisin.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa rata-rata efisiensi transformasi genetik
relatif rendah yaitu 16.36% dengan efisiensi regenerasi yang sangat tinggi yaitu
100%. Rendahnya efisiensi transformasi kemungkinan disebabkan oleh rusaknya
eksplan selama proses transformasi. Efisiensi transformasi eksplan buku lebih
tinggi daripada eksplan daun. Rata-rata tunas transgenik putatif yang dihasilkan
tiap kalus adalah 2.5. Di media MS0, empat dari 24 tanaman transgenik putatif
menghasilkan umbi sedangkan tunas non-transgenik tidak menghasilkan umbi.
Hal ini menunjukkan bahwa Hd3a menginduksi pembentukan umbi pada tanaman
kentang kultivar Baraka transgenik putatif.
Kata kunci: Solanum tuberosum L. kultivar Baraka, transformasi genetik, gen
pembungaan Hd3a
ABSTRACT
BUSTOMI. Genetic Transformation of Potato (Solanum tuberosum L.) Cultivars
Baraka with Hd3a Flowering Gene. Supervised by SUHARSONO and UTUT
WIDYASTUTI.
Flowering has a very important role in plant breeding. Flowering is the
phase transition from the vegetative to the generative phase. One of the genes
associated with flowering is Hd3a. This research has an objective to transform
genetically potato (Solanum tuberosum L.) cultivar Baraka with Hd3a flowering
gene under control of a strong promoter prolC. Potato plants were propagated in
vitro on MS2 medium. Genetic transformation was carried out by co-cultivation
method by using Agrobacterium tumefaciens LBA4404. Leaf disc and internodes
were used as explants for transformation. Selection of transgenic plants was
performed in MS medium containing 10-40 mg/L hygromycin. The results
showed that the efficiency of transformation was relatively low. The efficiency of
shoot regeneration of transgenic calli was very high. The low efficiency of
transformation was caused by damage of explant during transformation process.
The efficiency of transformation of internode was higher than leaf explants.
Putative transgenic shoot regeneration per callus was 2.5. In MS0 media, four of
twenty-four putative transgenic plants produced tuber whereas all non-transgenic
plants did not. This result showed that Hd3a induced the formation of tuber of
transgenic potato cv. Baraka.
Keywords: Solanum tuberosum L. cultivar Baraka, genetic transformation, Hd3a
flowering gene
TRANSFORMASI GENETIK KENTANG (Solanum tuberosum
L.) KULTIVAR BARAKA DENGAN GEN PEMBUNGAAN
Hd3a
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
aJudul Skripsi: Transformasi Genetik Kentang (Solanum tuberosum L.) Kultivar
Baraka dengan Gen Pembungaan Hd3a
Nama
: Bustomi
: 034100055
NIM
Disetujui oleh
Prof Dr Ir Suharsono, DEA
Pembimbing I
Tanggal Lulus: t 1 "!.
AUG 2014
Dr Ir Utut Widyastuti. MSi
Pembimbing II
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang
dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Desember 2013 hingga
Mei 2014 ini ialah transformasi genetik kentang (Solanum tuberosum L.) kultivar
Baraka dengan gen pembungaan Hd3a .
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Prof Dr Ir Suharsono, DEA
dan Ibu Dr Ir Utut Widyastuti, MSi selaku pembimbing atas segala bimbingan,
dukungan, arahan, kesabaran waktu yang disediakan serta saran yang telah
diberikan selama penelitian dan penulisan karya ilmiah ini. Penulis juga
mengucapkan terima kasih kepada Proyek Penelitian Desentralisasi Baru IPB
yang berjudul “Rekayasa genetika tanaman dengan gen toleransi aluminium dan
pembungaan” dengan kontrak no: 48/IT3.11/LT/2014 atas nama: Prof Dr Ir
Suharsono, DEA yang telah membiayai penelitian ini. Terimakasih diucapkan
juga kepada Dr Berry Juliandi, MSi selaku penguji skripsi atas semua saran,
masukan, dan perbaikan yang telah diberikan. Terimakasih dan penghargaan
sebesar-besarnya penulis sampaikan kepada seluruh staf di laboratorium Biologi
Molekular dan Selular Tanaman (BMST) dan BIORIN, khususnya pada Mbak
Nia, Mbak Pepy, Mbak Ara, Pak Asep, Pak Mulya, Pak Iri, dan Pak Yanto.
Terimakasih juga ditujukan kepada Bapak Diky, SP (BA Farm) yang telah
membantu dalam proses aklimatisasi. Ucapan terimakasih juga penulis sampaikan
kepada rekan-rekan seperjuangan S1 Aje, Carin, Dwika, Eka, Ica, Ika, Ina, dan
Lisa, rekan-rekan S2 Bang Baso, Pak Ari, Cak Rudi, Mbak Wiwin, Mbak Isni,
Mbak Uuf, Mbak Efah, Mbak Nadea, Mbak Tiwi, Mbak Fajri, Mbak Destik, Mas
Wawan, Mbak Lia, Mbak Nurul, dan Mbak Nuril dan rekan-rekan S3 Pak Asri,
Pak Ilyas, Ibu Ifah, dan Ibu Ida serta teman-teman biologi 47 dan teman-teman
kost Perwira 6. Ungkapan terimakasih juga penulis sampaikan kepada seluruh
keluarga atas segala doa dan dukungan yang diberikan.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, September 2014
Bustomi
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
PENDAHULUAN
1
Latar Belakang
1
Tujuan Penelitian
2
BAHAN DAN METODE
2
Waktu dan Tempat
2
Bahan
2
Metode
3
Perbanyakan planlet
3
Perbanyakan Agrobacterium tumefaciens
3
Transformasi genetik kentang kultivar Baraka
3
Aklimatisasi
3
HASIL DAN PEMBAHASAN
4
Pembentukan kalus
4
Pembentukan tunas transgenik putatif
4
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran
9
9
10
UCAPAN TERIMA KASIH
10
DAFTAR PUSTAKA
10
LAMPIRAN
12
RIWAYAT HIDUP
14
DAFTAR TABEL
1 Rata-rata efisiensi transformasi kentang kultivar Baraka
2 Rata-rata efisiensi regenerasi kalus dan jumlah tunas setiap kalus
kentang kultivar Baraka
7
8
DAFTAR GAMBAR
1 Posisi Gen Hd3a pada daerah T-DNA di dalam plasmid p2K1-Hd3a
2 Bentuk kalus dari eksplan batang kentang kultivar Baraka hasil
transformasi dengan A. tumefaciens yang mengandung p2K1-Hd3a
3 Pembentukan tunas kentang kultivar Baraka di media regenerasi
Tunas kentang yang di tanam di media seleksi yang mengandung 40
mg/L higromisin
4 Uji viabilitas tunas kentang non-transgenik dan media seleksi
5 Tanaman kentang kultivar Baraka in vitro yang berumur 4 minggu
6 Tanaman kentang kultivar Baraka transgenik putatif yang ditanam di
polibag
2
4
5
6
6
9
9
DAFTAR LAMPIRAN
1 Komposisi Media MS (Murashige dan Skoog 1962)
2 Perhitungan persentase efisiensi transformasi dan efisiensi
regenerasi Baraka
12
13
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Kentang (Solanum tuberosum L.) merupakan salah satu komoditas yang
potensial untuk diversifikasi pangan. Kentang mengandung karbohidrat yang
tinggi sehingga dapat digunakan sebagai alternatif makanan pokok. Selain itu
kentang dapat dijadikan bahan baku industri makanan olahan.
Menurut Badan Pusat Statistik (BPS 2014), produktivitas tanaman kentang
Indonesia pada tahun 2012 adalah 16.6 ton/ha dan pada tahun 2013 adalah 16.7
ton/ha. Produktivitas ini lebih rendah daripada rata-rata produktivitas dunia yang
pada 2012 adalah sebesar 18.9 ton/ha dan Australia sebesar 38.3 ton/ha
(FAOSTAT 2014). Rendahnya produksi kentang di Indonesia dapat disebabkan
oleh beberapa faktor, diantaranya adalah rendahnya kualitas bibit, dan teknik
budidaya (Wattimena 1992) serta tingginya tingkat serangan hama dan penyakit
(Mahmud 1990). Penggunaan varietas yang unggul sangat penting dalam
meningkatkan produksi kentang. Varietas unggul dapat diperoleh melalui
persilangan konvensional, dan rekayasa genetika. Bunga sangat penting di dalam
persilangan konvensional sehingga pembungaan mempunyai peranan yang sangat
penting dalam pemuliaan tanaman.
Pembungaan merupakan transisi dari fase vegetatif ke fase
generatif/reproduksi. Keadaan cuaca sangat berpengaruh terhadap pembungaan
tanaman kentang. Kentang berbunga pada suhu 15-20°C, kelembaban udara yang
tinggi dan cukup sinar matahari, serta sedikit hujan (Sahat 1991). Untuk berbunga,
tanaman kentang memerlukan hari panjang yaitu sekitar 16-18 jam.
Gen Hd3a pertama kali diidentifikasi sebagai quantitative trait locus (QTL)
yang proteinnya dapat menginduksi pembungaan padi pada kondisi hari pendek
(Kojima et al. 2002). Gen Hd3a yang berasal dari padi telah diisolasi oleh Tamaki
et al. (2007) yang mempunyai homologi dengan gen flowering locus T (FT) dari
Arabidopsis thaliana. FT/Hd3a merupakan sinyal florigen pembungaan bertipe
cepat (Tamaki et al. 2007). Protein Hd3a berinteraksi dengan faktor transkripsi
bZIP untuk menginduksi transisi dari fase vegetatif ke fase reproduktif di dalam
meristem apikal (Tsuji et al. 2008). Komiya et al. (2008) menunjukkan bahwa
supresi Hd3a dengan RNA interference (RNAi) dapat menunda pembungaan.
Introduksi gen Hd3a dapat menginduksi pembungaan pada tanaman seperti
Saussurea involucrata (Li et al. 2011), Jatropha curcas L (Sulistyaningsih 2012)
dan Nicotiana benthamiana (Syafitri 2012; Senjaya 2013).
Transformasi genetik kentang dengan menggunakan Agrobacterium
tumefaciens telah banyak dilakukan, diantaranya yang dilakukan oleh Nurhasanah
et al. (2003) dan Manguntungi (2014).
Navarro et al. (2011) telah
mengekspresikan Hd3a secara berlebihan di kentang kultivar Andigena yang
merupakan kentang hari pendek. Kentang transgenik yang dihasilkan dapat
berbunga dan berumbi di daerah hari panjang, sedangkan tanaman kentang nontransgenik tidak berbunga dan tidak berumbi. Hal ini menunjukkan bahwa Hd3a
dapat menginduksi pembungaan dan pengumbian pada kentang hari pendek.
2
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk melakukan transformasi genetik kentang
(Solanum tuberosum L.) kultivar Baraka dengan gen pembungaan Hd3a di bawah
kendali promoter kuat prolC.
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Desember 2013 sampai dengan bulan
Mei 2014 di Laboratorium Biotechnology Research Indonesia-The Netherlands
(BIORIN), dan Laboratorium Biologi Molekuler dan Seluler Tanaman (BMST),
Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB), Lembaga
Penelitian dan Pengabdian kepada Masyarakat (LPPM), Institut Pertanian Bogor.
Bahan
Kentang (Solanum tuberosum L.) kultivar Baraka in vitro digunakan sebagai
bahan tanaman untuk transformasi genetik. Agrobacterium tumefaciens galur LB
A4404 yang mengandung plasmid p2K1 yang membawa gen Hd3a di bawah
kendali promoter prolC (Tamaki et al. 2007) yang dipautkan dengan gen penanda
GFP serta gen resistensi terhadap higromisin (hpt) digunakan untuk melakukan
transformasi genetik. Peta fisik daerah T-DNA dari plasmid p2K1-Hd3a disajikan
pada Gambar 1. Plasmid atau vektor ekspresi ini adalah pemberian Prof. Ko
Shimamoto (Nara Institute of Science & Technology, Jepang).
Hind
LB
Kpn I
prolC
Xba
Hd3a
Spe
GFP
NosT
hpt
RB
BB
Gambar 1 Posisi Gen Hd3a pada daerah T-DNA di dalam plasmid p2K1-Hd3a.
LB: left border, RB: right border, prol C: promoter dari
Agrobacterium rhizogenes, Hd3a: gen heading date dari padi, GFP:
gen penanda Green Fluorescent Protein, hpt: gen resistensi terhadap
higromisin. Daerah yang diarsir adalah sekuen 5’UTR (Tamaki et al.
2007)
Media tumbuh MS (Murashiage and Skoog 1962) digunakan sebagai media
dasar kultur in vitro dam media MS yang mengandung higromisin sebagai media
seleksi.
3
Metode
Perbanyakan tanaman in vitro
Tanaman kentang in vitro diperbanyak dengan stek ruas (node) tunggal yang
mengandung satu mata tunas di media MS2 makro. Media MS2 makro adalah
media MS yang mengandung 2x konsentrasi unsur hara makro ditambah 2 ml/L
pantothenic acid ditumbuhkan selama 4 minggu di ruang kultur dengan suhu 24o25oC dan pencahayaan 2000-3000 lux serta fotoperiode 16 jam.
Perbanyakan Agrobacterium tumefaciens
Agrobacteruim tumefaciens strain LBA4404 yang mengandung plasmid
p2K1-Hd3a yang mengandung gen Hd3a di bawah kendali promoter prolC
(Tamaki et al. 2007) dibiakkan selama 36 jam pada media LB (1% tripton, 0,5%
yeast extract, 1% NaCl) cair yang mengandung 50 mg/L kanamisin dan 25 mg/L
rifampisin, dengan penggoyangan pada kecepatan 150 rpm, suhu 28oC, di dalam
gelap. Sebanyak 100 µL dari biakan tersebut kemudian dibiakkan kembali di
dalam 10 mL media LB cair dengan kondisi yang sama dengan sebelumnya
hingga mencapai nilai OD600 sebesar 0,5-0,7.
Transformasi genetik kentang kultivar Baraka
Transformasi dilakukan dengan metode ko-kultivasi yang menggunakan
bantuan A. tumefaciens.
Sebelum ko-kultivasi, biakan A. tumefaciens
disentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm selama 15 menit dan endapan yang
diperoleh diresuspensi dengan 10 ml media ko-kultivasi cair (media MS cair yang
mengandung 0.5 mg/L BAP, 0.1 mg/L IAA, dan 20 mg/L Asetosiringon) hingga
OD600 0.5-0.7. Eksplan yang ditransformasi adalah potongan daun berukuran 1
cm2 dan buku (internode) berukuran 0.5-1 cm. Ko-kultivasi dilakukan dengan
merendam eksplan di dalam suspensi A. tumefaciens, selama 10 menit, digoyang
dengan kecepatan 100 rpm, pada suhu ruang. Eksplan dikeringkan dengan tisu
steril, kemudian ditanam di media ko-kultivasi padat selama 3 hari di ruang gelap.
Setelah itu eksplan dicuci dengan akuades steril sebanyak empat kali dan pada
bilasan terakhir ekplan direndam selama 10 menit dengan menambahkan 100 mg/l
larutan cefotaxime. Eksplan dikeringkan dengan tisu steril dan kemudian ditanam
di media induksi kalus yang juga merupakan media regenerasi tunas yaitu media
MS yang mengandung 3 mg/L BAP, 2 mg/L IAA, 1 mg/L GA3, 100 mg/L
cefotaxime, dan 3 g/L agar gelrite. Subkultur dilakukan setiap 12 hari. Tunas yang
terbentuk, dipindahkan ke media seleksi yaitu media MS yang mengandung 10
mg/L higromisin. Pada subkultur selanjutnya, konsentrasi higromisin ditingkatkan
hingga 40 mg/L. Eksplan yang menghasilkan tunas transgenik putatif dihitung
untuk mengetahui efisiensi transformasi dan efisiensi regenerasi (Lampiran 2).
Eksplan non transgenik (kontrol) yang tidak ditransformasi dengan A.
tumefaciens ditanam dalam media seleksi higromisin yang sama dengan eksplan
yang di transformasi dengan A. tumefaciens sebagai kontrol efisiensi media
seleksi.
Aklimatisasi
Tanaman kentang yang mempunyai batang dan akar lebih dari 2 cm,
dibersihkan dari semua agar, kemudian dipindahkan ke dalam ke tray yang
4
berukuran 3 cm x 3 cm x 5 cm yang berisi coco-peat. Setelah agak besar, sekitar 3
minggu, tanaman dipindah ke dalam polibag yang mengandung tanah, pasir dan
pupuk kandang dengan perbandingan 1:1:1 (volume).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Pembentukan kalus
Eksplan yang digunakan dalam proses transformasi adalah potongan daun
yang berukuran 1 cm2 dan buku batang tanpa mata tunas yang berukuran 0.5-1
cm. Penggunaan buku tanpa mata tunas bertujuan untuk menghindari tumbuhnya
tunas palsu dari bagian buku eksplan ketika ditanam di media regenerasi. Induksi
kalus dan regenerasi menggunakan media yang sama yaitu media MS yang
mengandung 3 mg/L BAP, 2 mg/L IAA, 1 mg/L GA3, 100 mg/L cefotaxime, dan
3 g/L agar gelrite, seperti yang digunakan oleh Puspita (2002) dan Manguntungi
(2014).
Hasil penelitian menunjukkan bahwa eksplan buku lebih cepat membentuk
kalus daripada eksplan daun yaitu pada minggu ke-2 setelah tanam. Kalus
terbentuk mulai dari kedua ujung buku batang yang dilukai kemudian merata ke
seluruh bagian eksplan (Gambar 2). Pada eksplan daun, kalus mulai terbentuk
pada minggu ke-3 setelah tanam, dari bagian tangkai lalu kemudian menyebar ke
seluruh permukaan daun. Penambahan IAA dan BAP pada penelitian ini dapat
memacu pembentukan kalus seperti yang dilakukan oleh Li et al. (2007). Menurut
Hidayat (2009) jaringan meristematik pada batang lebih banyak daripada di daun
sehingga proses pembelahan dan pemanjangan sel di batang lebih cepat dari pada
di daun.
1 cm
Gambar 2 Bentuk kalus dari eksplan batang kentang kultivar Baraka hasil
transformasi dengan A. tumefaciens yang mengandung p2K1-Hd3a
Pembentukan tunas transgenik putatif
Setiap 12 hari setelah penanaman di media induksi kalus, eksplan
disubkultur secara berulang pada media yang sama. Subkultur yang dilakukan
setiap 12 hari bertujuan untuk memacu pembentukan tunas. Pada bagian yang
terluka pada saat infeksi, kalus menghasilkan tonjolan-tonjolan yang kemudian
5
berkembang menjadi tunas. Pada eksplan buku, tunas mulai terbentuk dari kalus
yang berumur 4-7 minggu setelah tanam sedangkan pada eksplan daun, tunas
mulai terbentuk pada kalus yang berumur 5-6 minggu dari bagian tangkai daun
(Gambar 3). Menurut Gaba (2005), zat pengatur tumbuh endogen mempunyai
peranan yang penting dalam memicu terbentuknya tunas. Buku batang
kemungkinan mengandung zat pengatur tumbuh lebih banyak dari pada daun.
1 cm
1 cm
(a)
(b)
1 cm
(c)
Gambar 3 Pembentukan tunas kentang kultivar Baraka di media regenerasi.
Regenerasi tunas dari kalus yang terdapat pada: (a) ujung buku
batang, (b) tengah buku batang, dan (c) tangkai daun
Ko-kultivasi eksplan kentang dengan A. tumefaciens yang mengandung gen
Hd3a yang dipautkan dengan gen hpt telah menghasilkan tanaman yang resisten
terhadap higromisin. Hal ini menunjukkan bahwa proses transformasi kentang
dengan gen Hd3a yang dipautkan dengan gen hpt telah berhasil dan menghasilkan
tanaman kentang transgenik putatif. Transformasi genetik dengan menggunakan
perantara A. tumefaciens merupakan salah satu metode yang banyak digunakan
karena menghasilkan tanaman transgenik yang stabil (Li et al. 2007).
Tanaman kentang transgenik putatif dapat bertahan hidup di media seleksi
hingga 40 mg/L higromisin, sedangkan tanaman kentang non-transgenik yang
ditumbuhkan di media yang sama mengalami kematian (Gambar 4). Ketahanan
tanaman terhadap higromisin sangat tergantung dari spesies dan kultivarnya,
sehingga konsentrasi higromisin yang digunakan untuk menyeleksi tanaman
transgenik tergantung dari spesies dan kultivarnya. Konsentrasi higromisin yang
digunakan untuk menyeleksi tunas J. curcas adalah 40 mg/L (Sulistyaningsih
2012), sedangkan Saussurea involucrata transgenik diseleksi dengan konsentrasi
20 mg/L higromisin (Li et al. 2011), dan seleksi Nicotiana benthamiana
6
transgenik dilakukan pada media yang mengandung 30 mg/L higromisin ( Syafitri
2012).
1 cm
(a)
(b)
Gambar 4 Tunas kentang yang ditanam di media seleksi yang mengandung 40
mg/L higromisin. (a) tunas transgenik, (b) tunas non-transgenik
Untuk membuktikan bahwa tanaman kentang non-transgenik mempunyai
viabilitas yang baik dan media seleksi berfungsi dengan baik, tanaman nontransgenik ditanam di dua macam media MS yang berbeda yaitu: (1) media yang
tidak mengandung higromisin dan (2) media yang mengandung higromisin
sebagai media seleksi. Pada media yang tidak mengandung higromisin, tunas
kentang non-transgenik tumbuh dengan baik, sedangkan pada media yang
mengandung higromisin, tunas kentang mengalami kematian (Gambar 5). Hal ini
menunjukkan bahwa tanaman kentang non-transgenik mempunyai viabilitas yang
baik, dan media seleksi berfungsi dengan baik.
1 cm
1 cm
(a)
(b)
Gambar 5 Uji viabilitas tunas kentang non-transgenik dan media seleksi. (a)
tunas non-transgenik yang berumur 5 minggu yang ditanam di media
yang tidak mengandung higromisin, (b) tunas non-transgenik berusia
5 minggu yang ditanam di media seleksi yang mengandung
higromisin
7
Pada penelitian ini, efisiensi transformasi kentang kultivar Baraka berkisar
antara 4.2% dan 27% dengan rata-rata 16.36% (Tabel 1). Efisiensi transformasi
ini lebih tinggi dibandingkan dengan transformasi genetik kentang kultivar Russet
Burbank, Lehmi Russet, dan Atzimba dengan gen Bar (Dinarti 1999), kultivar
Atlantik dengan gen hordothionin (Nurhasanah 2003), dan relatif sama dengan
transformasi genetik kentang kultivar Atlantik dengan gen c-lysozyme
(Manguntungi 2014), tetapi lebih kecil dibandingkan dengan transformasi pada
Jatropha curcas yaitu 26.67% (Sulistyaningsih 2012) dan pada Nicotiana
benthamiana yaitu 86% (Syafitri 2012). Efisiensi transformasi dipengaruhi oleh
spesies dan kultivar yang digunakan. Rendahnya efisiensi transformasi pada
penelitian ini disebabkan oleh banyaknya eksplan yang mati karena terinfeksi A.
tumefaciens yang sulit dihilangkan dengan perlakuan cefotaxime. Rusaknya
jaringan dari eksplan selama proses transformasi dapat menyebabkan kematian
eksplan. Selain itu, perlakuan cefotaxime yang terus menerus untuk
menghilangkan A. tumefaciens juga dapat menghambat pertumbuhan dan bahkan
mematikan eksplan kentang.
Tabel 1 Rata-rata efisiensi transformasi kentang kultivar Baraka
Jumlah kalus
Jenis
Jumlah
Efisiensi
Percobaan
resisten
eksplan
eksplan
transformasi (%)
higromisin
Daun
24
1
4.2
1
Buku
40
12
30
2
Buku
32
2
6.25
3
Buku
20
5
25
Rata-rata efisiensi transformasi
16.36
Efisiensi transformasi dari eksplan daun lebih kecil daripada eksplan buku
(Tabel 1). Hal ini terjadi karena eksplan daun mempunyai jaringan yang sangat
tipis sehingga mudah rusak pada saat proses transformasi. Cadangan makanan di
daun lebih sedikit daripada di batang (Santoso dan Nursandi 2001) sehingga daun
lebih sulit untuk beregenerasi daripada batang.
Efisiensi regenerasi pada penelitian ini sangat tinggi yaitu sebesar 100%
(Tabel 2). Efisiensi regenerasi kentang kultivar Baraka transgenik putatif yang
mengandung gen Hd3a pada penelitian ini lebih tinggi dari pada kultivar Russet
Burbank, Lehmi Russet dan Atzimba transgenik putatif yang mengandung gen bar
yaitu berturut-turut 15, 8,6 dan 12.5 % (Dinarti 1999), kultivar Atlantik, Granola
dan Amudra transgenik putatif yang mengandung gen ketahanan penyakit hawar
daun RB yaitu berturut-turut 90%, 60% dan 56% (Listanto et al. 2009), dan
kultivar Desiree non-transgenik yaitu 94% (Puspita 2002). Keberhasilan
regenerasi menurut Listanto et al. (2009) dipengaruhi oleh beberapa faktor seperti
konsentrasi auksin, sitokinin, jenis eksplan, dan kultivar kentang yang digunakan.
Menurut Dinarti (1999) pemberian BAP dapat mempercepat pembentukan tunas.
Puspita (2002) melaporkan bahwa kombinasi pemberian IAA 0.2 mg/L dengan
BAP 3 mg/L dapat menghasilkan efisiensi regenerasi yang lebih tinggi yaitu 94%
daripada kombinasi pemberian IAA 0.2 mg/L dan BAP 2 mg/L yang hanya
menghasilkan 63%. Penambahan IAA atau IBA pada J. curcas L. dapat
8
meningkatkan frekuensi pembentukan tunas maupun jumlah tunas yang dihasilkan
(Sulistiyaningsih 2012).
Tabel 2 Rata-rata efisiensi regenerasi kalus dan jumlah tunas setiap kalus kentang
kultivar Baraka
Percobaan
Jenis
eksplan
Jumlah
Jumlah
kalus
kalus yang
resisten
beregenera
higromisin
si
Daun
1
Buku
12
2
Buku
2
3
Buku
5
Rata-rata efisiensi regenerasi
1
1
12
2
5
Efisiensi
regenera
si (%)
100
100
100
Jumlah
tunas
Jumlah
tunas
tiap
kalus
3
32
6
7
48
3
2.46
3
1.6
2.5
Jumlah tunas transgenik putatif yang dihasilkan tiap kalus kentang kultivar
Baraka pada penelitian ini adalah 2.5 (Tabel 2). Hasil ini relatif sama dengan
yang diperoleh Listanto et al. (2009).
Di media MS0, empat dari 25 tanaman transgenik putatif menghasilkan
umbi sedangkan tunas non-transgenik di media yang sama tidak menghasilkan
umbi. Umbi terbentuk pada kentang transgenik putatif yang berumur 4 minggu
(Gambar 6). Hasil ini menyerupai hasil penelitian Navarro et al. (2011) yang
menunjukkan bahwa Hd3a selain dapat menginduksi pembentukan bunga juga
dapat menginduksi terbentuknya umbi pada kentang kultivar Andigena, yang
merupakan kentang hari pendek dan berumur genjah, bila ditanam di hari panjang.
Kentang Andigena non-transgenik tidak berbunga dan tidak berumbi bila ditanam
di daerah yang mempunyai hari panjang. Kentang kultivar Andigena berbeda
dengan Baraka yang merupakan kultivar yang berumur dalam. Walaupun kultivar
Andigena dan Baraka berbeda tipe umurnya, tetapi Hd3a mempunyai pengaruh
yang relatif sama yaitu menginduksi pembentukan umbi yang lebih awal
dibandingkan dengan tanaman non-transgenik. Hal ini menunjukkan bahwa Hd3a
dapat menginduksi pembentukan umbi pada kentang walaupun harus dibuktikan
lagi pada kultivar kentang lainnya.
Untuk mengetahui pengaruh ekspresi gen Hd3a di dalam tanaman kentang
transgenik terhadap pembungaan, tanaman transgenik putatif ditanam pada media
tanah di dalam pot. Sebanyak 2 tanaman kentang kultivar Baraka transgenik
putatif telah berhasil ditanaman di polibag (Gambar 7).
9
1 cm
1 cm
(a)
(b)
Gambar 6 Tanaman kentang kultivar Baraka in vitro yang berumur 4 minggu. (a)
tanaman transgenik putatif, (b) tanaman non-transgenik.
= umbi
Gambar 7 Tanaman kentang kultivar Baraka transgenik putatif berumur 3 bulan
yang ditanam di polibag
Menurut Navarro et al. (2011), gen Hd3a dtranskripsikan dan translasikan
di dalam jaringan daun kentang, kemudian protein Hd3a tersebut disalurkan
melalui floem ke daerah pucuk apikal untuk menginduksi pembungaan dan
disalurkan ke daerah stolon untuk menginduksi pembentukan umbi. Protein Hd3a
memiliki kemampuan untuk mempercepat pengumbian melalui mekanisme
aktivasi gen-gen pengumbian yang homolog dengan gen pembungaan FT pada A.
thaliana.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Transformasi genetik kentang kultivar Baraka telah berhasil dilakukan dan
menghasilkan 48 tunas transgenik putatif. Efisiensi transformasi pada penelitian
ini relatif rendah yaitu 16.36%, dan efisiensi regenerasinya sangat tinggi yaitu
100%. Efisiensi transformasi pada eksplan buku lebih tinggi daripada eksplan
10
daun. Di media MS0, empat dari 24 tanaman transgenik putatif menghasilkan
umbi, yang menunjukkan bahwa Hd3a menginduksi pembentukan umbi.
Saran
Tanaman transgenik putatif perlu dianalisis untuk mengetahui integrasi
gennya.
UCAPAN TERIMA KASIH
Terima kasih disampaikan kepada Proyek Penelitian Desentralisasi Baru
IPB yang berjudul “Rekayasa genetika tanaman dengan gen toleransi aluminium
dan pembungaan” dengan kontrak no: 48/IT3.11/LT/2014 atas nama: Prof Dr Ir
Suharsono, DEA yang telah membiayai penelitian ini.
DAFTAR PUSTAKA
Dinarti D. 1999. Efisiensi transfer gen penanda nptII atau bar menggunakan isolat
Agrobacterium oncogenik dan disarmed pada tiga kultivar kentang. [tesis].
Bogor (ID): Program Pascasarjana, IPB
BPS [ Badan Pusat Statistik ]. 2014. Luas Panen, Produktivitas dan Produksi
Kentang. [Internet]. [diunduh 2014 Juni 4]. Tersedia pada:
http:www.bps.go.id.
FAOSTAT [Food and Agriculture Organization of the United States]. 2012. The
Agricultural Production of Potatoes. [Internet]. [diunduh 2014 Juli 4].
Tersedia
pada:
http:www.faostat3.foo.org/faostatgateway/gp/to/download/Q/QC/E.
Gaba V, Schlarman E, Elman C, Sagee O, Watad AA, Gray DJ. (1998) In vitro
studies on the anatomy and morphology of bud regeneration in melon
cotyledons. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Plant 35: 1-7
Hidayat O. 2009. Kajian penggunaan hormon IBA, BAP dan kinetin terhadap
multiplikasi Tunas Tanaman Penghasil Gaharu (Gyrinops versteegii (Gilg)
Domke) secara In Vitro. [skripsi]. Bogor (ID): Fakultas Kehutanan, IPB.
Kojima et al. 2002. Hd3a, a rice ortholog of the arabidopsis FT gene, promotes
transition to flowering downstream of Hd1 under short-day conditions.
Plant Cell Physiol 43:1096–1105.
Komiya R, Ikegami A, Tamaki S, Yokoi S, Shimamoto K. 2008. Hd3a and RFT1
are essential for flowering in rice. Development
135:767-774.
doi:10.1242/dev.008631
Li M, Li H, Jiang H, Pan X, Wu G. 2007. Establishment of an Agrobacterium
mediated cotyledon disc transformation method for Jatropha curcas. Plant
Cell Tiss Organ Cult. 92: 173-181.
11
Li M, Li H, Hu X. 2011. Genetic transformation and overexpression of a rice
Hd3a induces early flowering in Saussurea involucrata Kar.et Kir. ex
Maxim. Plant Cell Tiss Organ Cult. 106: 363-371.
Listanto E, Wattimena GA, Armini NM, Sinaga MS, Sofiari E, Herman M. 2009.
Regenerasi beberapa kultivar kentang dan transformasi kentang dengan
Gen RB melalui Agrobacterium tumefaciens. J. Hort. 19(2): 137-147.
Mahmud M. 1990. Penyakit Bakteri Tanaman Pangan dan Hortikultura di
Indonesia. Jakarta (ID): PT Agricon.
Manguntungi AB. 2014. Transformasi genetik kentang ‘Atlantik’ dengan gen
penyandi lisozim melalui perantara Agrobacterium tumefaciens. [makalah
seminar]. Bogor: Sekolah Pascasarjana, IPB.
Murashige T, Skoog F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays
with tobacco culture. Physiol Plant. 15: 473-497.
Navarro C, Abelanda JA, Cruz EO, Carlos A, Tamaki S, Silva J, Shimamoto K,
Prat S. 2011. Control of flowering and storage organ formation in potato
by flowering locus T. Nature 478: 119-123. doi: 10.1038/nature 10431.
Nurhasanah, Wattimena GA, Purwito A, Wiendi NMA, Suharsono. 2003.
Transformasi genetik tanaman kentang cv. Atlantik dengan
mengintroduksikan gen hordothionin untuk mendapatkan ketahanan
terhadap penyakit bakteri. Buletin Agronomi 31 (2): 63-67.
Puspita T. 2002. Studi regenerasi kentang (Solanum tuberosum) kultivar desiree
secara in vitro. [skripsi]. Bogor (ID): Fakultas Pertanian, IPB.
Sahat S. 1991. Pengaruh cara stimulasi perbungaan terhadap produksi bunga,
buah, dan biji beberapa kultivar kentang (Solanum tuberosum L.). Bull
Penel Hort. 20:105-111.
Senjaya SK. 2013. Pewarisan genetik transgen Hd3a pada tanaman Nicotiana
benthamiana transgenik. [skripsi]. Bogor (ID): Fakultas Matematika dan
Ilmu Pengetahuan Alam, IPB.
Smith O. 1968. Potatoes: Production, storing, processing. London (GB): Avi
Publishing Company.
Sulistyaningsih YC. 2012. Rekayasa ekspresi gen pembungaan Hd3a pada
tanaman jarak pagar (Jatropha curcas L.). [disertasi]. Bogor: Sekolah
Pascasarjana, IPB.
Syafitri LN. 2012. Transformasi genetik Nicotiana benthamiana dengan gen
pembungaan Hd3a dari padi. [skripsi]. Bogor (ID): Fakultas Matematika
dan Ilmu Pengetahuan Alam, IPB.
Tamaki S, Matsuo S, Wong H, Yokoi S, Shimamoto K. 2007. Hd3a protein is a
mobile flowering signal in rice. Science 36:1033-1036.
Tsuji H, Tamaki S, Komiya R, Shimamoto K. 2008. Florigen and the
photoperiodic control of flowering in rice. Rice 1:25-35.
Wattimena GA. 1992. Bioteknologi Tanaman I. Bogor (ID): Pusat Antar
Universitas Bioteknologi IPB.
12
Lampiran 1 Komposisi Media MS (Murashiege dan Skoog 1962)
Bahan
NH4NO3
KNO3
KH2PO4
H3BO3
Na2MoO4.2H2O
CoCl2.6H2O
KI
CaCl2.2H2O
MgSO4.7H2O
MnSO4.4H2O
ZnSO4.7H2O
CuSO4.5H2O
Na2EDTA
FeSO4.7H2O
Thiamine-HCl
Niacin (asam
nikotinat)
Pyridoxine-HCl
Glycine
Myo inositol
Gula pasir
Agar
Konsentrasi
Senyawa dalam
media (mg/L)
1650
1900
170
6.2
0.25
0.025
0.83
440
370
22.3
8.6
0.025
37.3
27.8
0.1
0.5
0.5
2.0
100
30 g/L
8 g/L
Volume yang
dipipet (ml/L)
20
20
5
5
5
5
5
10
13
Lampiran 2 Perhitungan persentase efisiensi transformasi dan efisiensi regenerasi
% efisiensi transformasi =
ℎ
% efisiensi regenerasi =
ℎ
�
ℎ
�
ℎ
ℎ
�
x 100%
%
14
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di jakarta pada tanggal 24 Februari 1993 dari ayah Tirsat
bin Langen (Alm) dan ibu Sumaliyah (Alm). Penulis merupakan anak tunggal.
Tahun 2010 penulis lulus dari SMA Negeri 52 jakarta dan pada tahun yang
sama lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB
(USMI). Penulis terpilih masuk Program Studi Biologi, Fakultas Matematika dan
Ilmu Pengetahuan Alam dan mendapatkan beasiswa dari Dikti yaitu beasiswa
bidik misi.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis aktif di Koperasi Mahasiswa
(KOPMA) sebagai staf Riset dan Pengembangan pada tahun 2011/2012 dan aktif
di Himpunan Mahasiswa Biologi (HIMABIO) sebagai staf divisi Pengembangan
sumber daya manusia (PSDM) pada tahun 2012/2013. Penulis pernah
melaksanakan studi lapang di Kebun Raya Cibodas, Taman Nasional Gunung
Gede-Pangrango pada tahun 2012, dengan judul makalah “Invasif Alien Species di
Kebun Raya Cibodas”. Penulis juga pernah melakukan magang dengan topik
isolasi DNA kedelai transgenik di BB Biogen Bogor pada bulan Januari-Februari
2013. Pada bulan Juni-Juli 2013 penulis melakukan praktik lapangan di Taman
Margasatwa Ragunan, Jakarta dengan topik “Perilaku harian anoa (Bubalus sp.) di
Taman Margasatwa Ragunan Jakarta”.