. Transformasi Genetik Tanaman Kentang (Solanum Tuberosum L.) Kultivar Jala Ipam Dengan Gen Hd3a.

TRANSFORMASI GENETIK TANAMAN KENTANG (Solanum
tuberosum L.) KULTIVAR JALA IPAM DENGAN GEN Hd3a

WIWIN WIDIARTI

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Transformasi Genetik
Tanaman Kentang (Solanum tuberosum L.) Kultivar Jala Ipam dengan Gen Hd3a
adalah benar karya saya bersama dengan komisi pembimbing dan belum diajukan
dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang
berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari
penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam daftar pustaka di
bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada
Institut Pertanian Bogor.

Bogor, Juni 2016

Wiwin Widiarti
NIM P051124011

RINGKASAN

WIWIN WIDIARTI. Transformasi Genetik Tanaman Kentang (Solanum
tuberosum L.) Kultivar Jala Ipam dengan Gen Hd3a. Dibimbing oleh
SUHARSONO dan GUSTAAF ADOLF WATTIMENA.
Kentang merupakan salah satu bahan pangan yang dapat dimanfaatkan
sebagai pangan tanpa diproses dan pangan olahan. Kentang French fries beku
merupakan kentang olahan yang sangat penting. Produksi kentang untuk French
fries beku masih sedikit, sehingga peningkatan produksi bibit dan perakitan
kultivar baru menjadi penting untuk dilakukan. Jala Ipam merupakan kultivar
kentang yang cocok untuk produksi French fries beku. Rekayasa genetik dengan
gen Hd3a dapat memperbaiki produktivitas kultivar ini. Hd3a merupakan mobile
florigen pada tanaman padi yang mempunyai homologi dengan FT (flowering
locus T) dari Arabidopsis. Ekspresi berlebih gen Hd3a menginduksi pembungaan

dan pengumbian pada kentang cv. Andigena transgenik. Penelitian ini bertujuan
untuk melakukan transformasi genetik kentang Jala Ipam dengan gen Hd3a.
Transformasi genetik dilakukan dengan perantara Agrobacterium
tumefaciens strain LBA4404 yang membawa plasmid p2K1-Hd3a yang
mengandung gen Hd3a di bawah kendali promoter rolC dan A. tumefaciens yang
membawa plasmid pCambia1300-Hd3a yang mengandung gen Hd3a di bawah
kendali promoter 35S CaMV. Ruas batang (internode) digunakan sebagai eksplan
yang ditransformasi. Eksplan mulai membentuk kalus 2 minggu setelah
kokultivasi. Efisiensi transformasi pada penelitian ini adalah sebesar 18% untuk
tanaman yang ditransformasi dengan p2K1-Hd3a dan 7% untuk tanaman yang
ditransformasi dengan pC1300-Hd3a.
Analisis molekuler dengan PCR dilakukan untuk mengetahui integrasi gen
Hd3a di dalam tanaman transgenik. PCR dilakukan dengan menggunakan
pasangan primer rolC-F dan Hd3a-FP-R untuk tanaman transgenik putatif yang
dihasilkan dari transformasi menggunakan plasmid p2K1-Hd3a dan pasangan
primer 35S-F dan Hd-R untuk tanaman transgenik putatif yang dihasilkan dari
transformasi menggunakan plasmid pC1300-Hd3a. Analisis PCR menunjukkan
bahwa dua dari tiga tanaman transgenik putatif adalah tanaman transgenik yang
mengandung gen Hd3a di bawah kendali promoter rolC dan keempat tanaman
transgenik putatif semuanya adalah tanaman transgenik yang mengandung gen

Hd3a di bawah kendali promoter 35S CaMV. Hasil ini menunjukkan bahwa
proses transformasi genetik kentang kultivar Jala Ipam dengan gen Hd3a telah
berhasil dengan baik.
Kata kunci: Kentang kultivar Jala Ipam, gen Hd3a, Agrobacterium tumefaciens,
promoter rolC, promoter 35S CaMV

SUMMARY

WIWIN WIDIARTI. Genetic transformation of potato (Solanum tuberosum L.) cv
Jala Ipam by using Hd3a gene. Supervised by SUHARSONO and GUSTAAF
ADOLF WATTIMENA.
Potato is one important food that can be used as unprocessed food and
processed food. Frozen French fries are very important processed potatoes.
Production of potatoes for frozen French fries are still low, so increasing seed
production and creating new cultivars are very important. Jala Ipam is a potato
cultivar suitable for the production of frozen French fries. Genetic engineering by
using Hd3a gene can improve the productivity of this cultivar. Hd3a is mobile
florigen in rice plants that have homology to the FT (flowering locus T) from
Arabidopsis. Overexpression of Hd3a gene induces flowering and tubering in
transgenic potato cv. Andigena. This research has an objectic to transform

genetically potato cv. Jala Ipam by using Hd3a gene.
Genetic transformation was done by using Agrobacterium tumefaciens
strain LBA4404 harbouring p2K1-Hd3a plasmid that contains Hd3a gene under
the control of rolC promoter and A. tumefaciens carrying pCambia1300-Hd3a that
contains Hd3a gene under the control of CaMV 35S promoter. Internodes of stem
were used as explants to be genetically transformed. Explant started to form calli
2 weeks after co-cultivation. The efficiency of transformation in this study is 18%
for plants transformed with p2K1-Hd3a and 7 % for the plants transformed with
pC1300-Hd3a.
Molecular analysis by PCR was carried out to determine Hd3a gene
integration in transgenic plants. PCR was performed using primer pairs of rolC-F
and Hd3a-FP-R for putative transgenic plants produced from the transformation
using plasmid p2K1-Hd3a and primer pair of 35S-F and Hd-R for putative
transgenic plants resulted from the transformation using a plasmid pC1300-Hd3a.
PCR analysis showed that two of three putative transgenic plants are transgenic
plants containing Hd3a gene under the control of rolC promoter and all four
putative transgenic plants are transgenic plants containing Hd3a gene under the
control of 35S CaMV promoter. These results indicate that the genetic
transformation of potato cultivars Jala Ipam with Hd3a gene has been successful.
Keywords: Potato cv Jala Ipam, Hd3a gene, Agrobacterium tumefaciens, rolC

promoter, 35S CaMV promoter

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2016
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB.
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis
ini dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB.

TANSFORMASI GENETIK TANAMAN KENTANG (Solanum
tuberosum L.) KULTIVAR JALA IPAM DENGAN GEN Hd3a

WIWIN WIDIARTI

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains

pada
Program Studi Bioteknologi

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr Ir Agus Purwito, MScAgr

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga penulis berhasil menyelesaikan penelitian dan tesis
yang berjudul Transformasi Genetik Tanaman Ketang (Solanum tuberosum L.)
Kultivar Jala Ipam dengan Gen Hd3a.
Ucapan terimakasih sebesar-besarnya dari hati yang paling dalam penulis
sampaikan kepada Prof Dr Ir Suharsono, DEA dan Prof Dr Ir Gustaaf Adolf
Wattimena, MSc sebagai komisi pembimbing atas ilmu, perhatian, nasehat,
masukan, kesabaran, dan waktu yang diberikan selama membimbing penulis.
Riset Andalan Perguruan Tinggi dan Industri atas nama Prof Dr Ir Suharsono,

DEA dengan judul “Peningkatan Produksi Bibit Kentang dan Perakitan Kultivar
Baru Kentang untuk Membangun Industri Kentang Olahan” dengan kontrak no.
079/SP2H/LT/DRPM/II/2016, yang telah membiayai penelitian ini. Penulis
mengucapkan terima kasih kepada penguji luar komisi Dr Ir Agus Purwito,
MScAgr atas saran dan masukan sehingga tulisan ini menjadi lebih baik. Ucapan
trimakasih juga disampaikan kepada staf dan rekan-rekan di Lab. Kultur Jaringan
(Mbak Nia, Teh Sarah, Pak Asep, Pak Sairi, Ari, Isni) dan Lab. BIORIN (Mbak
Pepi, Pak Mulya, Pak Asri, Pak Ilyas, Bu idha, Bu Ida, Bu Ifa, Mbak Nurul,
Nurul, Fajri, Seni, Yusdar, Fatah, Tiwi, Destik, Lutfi, Nadea, Farhana), serta
teman-teman S1 (Bustomi, Ika, Ica, Lisa, Ina, Eka) atas segala bantuan, semangat,
ilmu, kebersamaan, keceriaan dan persahabat selama proses penelitian dan
penulisan. Kepada suami terkasih Dody Darsono MSi, ananda tercinta dan
tersayang Abrisam Nur Alam Syah dan Umi Titin, penulis mengucapkan
terimakasih yang sebesar-besarnya atas segala bentuk pengorbanan, kesetiaan,
kesabaran, pengertian, dukungan moril, dan doa sehingga penulis dapat
menyelesaikan pendidikan S2. Karya ilmiah ini penulis persembahkan kepada
suami, anak, dan orang tua tersayang. Bapak Askawi (alm.) dan Ibu Hartini atas
doa, dukungan, kesabaran dan kasih serta Bapak Kadori dan Ibu Wastiri (alm.)
atas doa, dukungan, dan pengertiannya. Terimakasih juga disampaikan kepada
teman-teman seperjuangan BTK’12 dan BTK’13 atas segala semangat belajar,

doa, persahabatan, dan perhatian. Semoga persahabat ini dapat tetap terjalin.
Akhirnya penulis berharap semoga tulisan ini bermanfaat dan dapat
memberikan sumbangan bagi perkembangan bioteknologi tanaman terutama pada
tanaman kentang.

Bogor, Juni 2016

Wiwin Widiarti

DAFTAR ISI

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
DAFTAR GAMBAR
DAFTAR LAMPIRAN
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tujuan Penelitian
TINJAUAN PUSTAKA
Tanaman Kentang dan Manfaatnya

Pembungaan dan Pengumbian Kentang
Pembungaan
Pengumbian
Jalur Lintasan Fotoperiode
Jalur Lintasan Giberelin
Gen Hd3a
Transformasi Genetik dengan Perantara Agrobacterium tumefaciens
Perakitan Tanaman Kentang Transgenik
METODE PENELITIAN
Waktu dan Tempat
Bahan Penelitian
Metode
Perbanyakan Tanaman.
Transformasi Kentang dengan Gen Hd3a
Regenerasi Hasil Transformasi Tanaman Kentang
Identifikasi Tanaman Transgenik dengan Polymerase Chain Reaction
HASIL DAN PEMBAHASAN
Regenerasi Tanaman Kentang
Identifikasi Tanaman Transgenik
SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan
Saran
DAFTAR PUSTAKA
LAMPIRAN

ix
x
xi
xii
1
1
2
3
3
3
3
5
5
6
7

8
9
10
10
10
11
11
11
11
12
13
13
17
18
18
18
19
24

0

DAFTAR TABEL

1 Efisiensi transformasi dan efisiensi regenerasi gen Hd3a pada tanaman
kentang kultivar Jala Ipam

15

DAFTAR GAMBAR

1 Jalur pengaturan induksi pembungaan melalui dugaan fotoperiode pada
tanaman Arabidopsis thaliana
2 Jalur pengaturan pembungaan pada padi dibawah kondisi hari pendek
3 Posisi gen Hd3a di dalam daerah T-DNA dari vektor ekspresi
4 Kalus yang terbentuk pada media induksi kalus dan regenerasi
5 Tahapan transformasi genetik kentang Jala Ipam transgenik
6 Perkembangan kalus non-transgenik
7 Tanaman kentang kultivar Jala Ipam in vitro berumur 4 minggu
8 Hasil analisi PCR DNA tanaman kentang transgenik p2K1Hd3a
9 Hasil analisi PCR DNA tanaman kentang transgenik pC1300-Hd3a

4
8
10
13
14
14
15
17
18

DAFTAR LAMPIRAN

1 Karakteristik Kentang kultivar Jala Ipam
2 Komposisi Media Dasar MS (Murashige dan Skoog 1962)
3 Penentuan Efisiensi Regenerasi dan Efisiensi Transformasi

24
26
27

1

PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tanaman kentang merupakan tanaman pangan utama keempat dunia
setelah jagung, padi, dan gandum. Produksi kentang di Indonesia tahun 2013
adalah 1,124, 282 ton, naik menjadi 1,211,400 ton pada tahun 2014 (Kementan
2015). Kenaikan produksi kentang tersebut masih kurang memenuhi permintaan
pasar yang semakin bertambah. Pertambahan jumlah penduduk dan
berkembangnya gaya hidup modern berdampak pada peningkatan permintaan
kentang. Peningkatan permintaan kentang belum diimbangi dengan peningkatan
jumlah produksi. Kebutuhan kentang yang semakin meningkat mengharuskan
produksi bibit kentang yang semakin meningkat. Beberapa kendala produksi
kentang antara lain adalah serangan hama dan penyakit tanaman, keterbatasan
bibit kentang berkualitas (Wattimena 1992) serta keterbatasan lahan produktif
yang sesuai bagi penanaman kentang.
Tanaman kentang membutuhkan lingkungan bersuhu rendah. Tanaman
kentang di Indonesia tumbuh baik pada daerah dataran tinggi yaitu 1300 meter di
atas permukaan laut (Tantowijoyo dan Fliert 2006), serta menghendaki suhu
rendah antara 15.5 °C – 18.3 °C (BPTPY 2004). Masalah penanaman pada daerah
dataran tinggi adalah adanya aliran permukaan dan erosi tanah (Handoko et al.
2011) yang menyebabkan produksi rendah. Tanaman kentang mampu berbunga
dan menghasilkan umbi jika ditanam pada daerah dataran tinggi. Pembentukan
umbi pada beberapa varietas kentang seperti kentang Andigena sangat dipengaruhi
oleh hari pendek (Jackson 1999; Navarro et al. 2011; Abelenda et al. 2014).
Rekayasa genetik merupakan salah satu cara untuk memperbaiki sifat-sifat
tanaman. Perbaikan tanaman melalui rekayasa genetik didasarkan pada manipulasi
gen yang relevan dan tersedianya bahan genetik untuk transformasi ke dalam sel
tanaman (Nasir 2002). Rekayasa genetik pada tanaman kentang telah banyak
dilakukan seperti untuk mendapatkan ketahanan terhadap penyakit bakteri
(Nurhasanah et al. 2003), ketahanan terhadap jamur dan herbisida (Khan et al.
2008), serta ketahanan terhadap virus (Mikschofsky et al. 2011). Rekayasa
genetik yang belum banyak dilakukan adalah merakit tanaman kentang varietas
komersial yang mampu berbunga dan berproduksi tinggi.
Bunga mempunyai peranan yang sangat penting dalam perakitan kultivar
baru melalui persilangan. Kentang kultivar Jala Ipam relatif sulit berbunga,
sehingga induksi pembungaan pada kultivar ini sangat penting dalam rangka
persilangan dengan kultivar kentang lainnya. Kentang kultivar Jala Ipam sangat
cocok untuk diolah menjadi kentang goreng beku (frozen french fries). Kentang
ini mempunyai umbi yang berukuran besar dan berbentuk lonjong. Kandungan
pati umbi kentang kultivar Jala Ipam tinggi.
Pembungaan merupakan rangkaian proses yang diawali dengan perubahan
pucuk vegetatif menjadi pucuk generatif. Induksi pembungaan dipengaruhi oleh
faktor eksternal yang meliputi panjang hari (fotoperiode) dan suhu (Imaizumi dan
Kay 2006; Yuan-li dan Wei-jiang 2012), dan faktor internal seperti umur tanaman
dan jumlah hormon giberelic acid (GA) (Song et al. 2013). Respon tanaman
terhadap fotoperiode diatur oleh beberapa gen pengatur waktu pembungaan

2

seperti gen FT (Imaizumi dan Kay 2006; Navarro et al. 2011; Abelenda et al.
2014; Song et al. 2013) dan gen kelas E MADS-box (Wang et al. 2013).
Heading date 3a (Hd3a) merupakan protein penginduksi pembentukan
bunga pada padi. Gen Hd3a mempunyai homologi dengan gen FT (flowering
locus T) dari Arabidopsis dan merupakan sinyal pembungaan yang dapat
berpindah tempat (Tamaki et al. 2007). Ekspresi berlebih Hd3a yang dikendalikan
oleh promoter konstitutif 35S CaMV (Kojima et al. 2002) dan promoter spesifik
rolC (Tamaki et al. 2007) pada padi transgenik menyebabkan pembungaan lebih
cepat. Keberadaan gen Hd3a yang dikendalikan baik oleh promoter konstitutif
35S CaMV maupun oleh promoter rolC mengakibatkan munculnya bunga lebih
cepat pada tunas jarak pagar (Jatropha curcas) transgenik yang mengandung gen
Hd3a secara in vitro (Sulistyaningsih 2012). Promoter rolC merupakan promoter
spesifik floem yang mampu mengeskpresikan Hd3a dengan aktivitas tinggi,
terbukti dari percepatan waktu pembungaan pada padi transgenik rata-rata 19.5
hari (Tamaki et al. 2007).
Ekspresi berlebih gen Hd3a mampu menyebabkan pembungaan lebih
cepat pada beberapa tanaman seperti Oryza sativa L. (Kojima et al. 2002; Tamaki
et al. 2007; Wang et al. 2013), Saussurea involucrata (Li et al. 2011), Jatropha
curcas (Sulistyaningsih 2012), Nicotiana benthamiana (Syafitri 2012; Senjaya
2013), serta mampu mengaktifkan dua proses perkembangan sekaligus yaitu
pembungaan dan pembentukan umbi pada kentang Andigena (Navarro et al.
2011). Pengaruh ekspresi berlebih gen Hd3a di dalam kentang Andigena trangenik
terhadap pembungaan dan pengumbian menjadi fenomena yang menarik untuk
dilakukan pada kentang yang ada di Indonesia.
Introduksi gen ke dalam genom tanaman merupakan suatu upaya
perbaikan yang langsung mengenai karakter yang diinginkan. Introduksi gen
melalui transformasi genetik dengan bantuan A. tumefaciens merupakan metode
yang banyak digunakan. Respon beberapa kultivar kentang in vitro terhadap
infeksi A. tumefaciens pernah dilakukan oleh Churiyah et al. (1994). Keberhasilan
transformasi genetik pada kentang telah banyak dilakukan diantaranya pada
varietas Cardinal dan Heera (Khatun et al. 2012), kultivar Desiree, Agria, dan
Marfona (Khasani et al. 2012), kultivar Baraka (Bustomi 2014), kultivar Diamant
(Mardiyyah 2015; Nurrizky 2015), kultivar Agria (Salsabila 2015), dan kultivar
Kennebec (Maulani 2015).

Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk melakukan transformasi genetik tanaman
kentang kultivar Jala Ipam dengan gen Hd3a melalui perantara A. tumefaciens.

3

TINJAUAN PUSTAKA
Tanaman Kentang dan Manfaatnya
Tanaman kentang merupakan tanaman yang dipanen umbinya dan
digunakan sebagai makanan pokok bagi sebagian penduduk dunia. Kentang
merupakan tanaman pangan dunia setelah padi, gandum dan jagung (Wattimena
1992). Kentang diproduksi dalam jumlah besar di negara-negara maju. Di
Indonesia kentang menjadi salah satu komoditas sayuran yang mendapat prioritas
pengembangan, karena mempunyai potensi sebagai tanaman penunjang program
diversifikasi pangan untuk memenuhi kebutuhan gizi masyarakat (Prabaningrum
et al. 2014). Kentang dijadikan pengganti pangan yang ideal karena mengandung
protein, karbohidrat, lemak, mineral dan vitamin yang seimbang bagi tubuh
manusia (Wattimena 1992; McGregor 2007).
Kentang dikelompokkan dalam dua jenis yaitu kentang sayur dan kentang
bahan baku industri (processing). Kentang sayur tidak terlalu membutuhkan
karakter khusus seperti halnya pada kentang bahan baku industri. Sebagai bahan
baku industri, kentang banyak digunakan untuk membuat keripik, tepung kentang,
atau sebagai french fries. Kentang french fries memerlukan umbi kentang dengan
kandungan gula rendah, bahan kering rendah, dan bentuk umbi yang panjang.
Kentang olahan yang banyak dibudidayakan di Indonesia adalah kentang Atlantik,
sementara kentang yang digunakan sebagai kentang french fries masih belum
banyak. Saat ini Indonesia masih seratus persen mengimpor kentang french fries
dari luar negeri (Suharsono 2015).
Kentang Jala Ipam merupakan klon hasil seleksi positif dari variasi
somaklonal Russet Burbank. Karakteristik kentang kultivar Jala Ipam disajikan
pada Lampiran 1.

Pembungaan dan Pengumbian Kentang
Salah satu ciri makhluk hidup adalah tumbuh dan berkembang.
Petumbuhan dan perkembangan merupakan proses yang saling berhubungan.
Perkembangan merupakan suatu proses kombinasi dari sejumlah proses yang
kompleks, yaitu pertumbuhan dan diferensiasi yang mengarah pada akumulasi
berat kering tanaman. Ada banyak faktor yang mempengaruhi perkembangan
tanaman. Faktor-faktor tersebut dikelompokkan menjadi dua, yaitu faktor internal
dan faktor eksternal. Faktor internal meliputi faktor genetik dan fitohormon,
sedangkan faktor eksternal atau faktor lingkungan diantaranya adalah fotoperiode,
suhu, dan intensitas cahaya (Song et al. 2013).
Pembungaan
Pembungaan merupakan salah satu perkembangan tanaman dimana
terjadinya perubahan pucuk vegetatif menjadi pucuk reproduktif. Pembungaan
dikontrol oleh kondisi lingkungan dan pengaturan perkembangan yang kompleks.
Pengaturan tersebut dibuat oleh jaringan yang rumit dari beberapa jalur sinyal.
Jalur sinyal yang berperan diantaranya adalah fotoperiode. Fotoperiode atau

4

panjang hari mempengaruhi induksi pembungaan pada berbagai tumbuhan. Pada
tanaman A. thaliana, respon tumbuhan terhadap fotoperiode dipengaruhi oleh jam
sirkadian yang mengarah pada ekspresi Gigantea (GI), diikuti oleh pengaktifan
ekspresi gen Constans (CO) (Coelho et al. 2013). CO menginduksi traskripsi
FLOWERING LOCUS T (FT) dan TWIN SISTER OF FT (TSF). Proses
transkripsi terjadi di dalam floem dan selanjutnya disampaikan ke meristem tunas
apikal (SAM). Gen FT dan TSF bersama dengan FLOWERING LOCUS D
mengaktifkan ekspresi gen identitas meristem bunga (Matsoukas 2015). Interaksi
FT-FD secara langsung ataupun tidak langsung mengaktifkan gen tipe bunga
seperti gen SOC1 dan APETALA1 (AP1) (Abe et al. 2005) (Gambar 1). AP1
mengaktifkan ekspresi gen LEAFY (LFY) yang pada gilirannya bertanggung
jawab untuk mengikat promoter AP1 dan mengontrol ekspresi SEPALLATA3
(SEP3) baik langsung maupun tidak langsung yang terlibat dalam pembentukan
organ bunga (Kaufmann et al. 2010).

Gambar 1 Jalur pengaturan induksi pembungaan melalui dugaan fotoperiode pada
tanaman Arabidopsis thaliana. Penggalan gambar dari Bouche et al.
(2016).
Pembungaan juga dipengaruhi oleh jalur sinyal giberelin (GAs). Giberelin
diketahui memacu pembungaan pada berbagai tumbuhan. Jalur sinyal GA
merupakan jalur regulasi yang padat sebagai isyarat perkembangan. Pada tanaman
A. thaliana, sinyal GA memiliki pengaruh relatif lebih kecil terhadap pembungaan
pada kondisi hari panjang, sedangkan pada kondisi hari pendek, dengan tidak
adanya jalur sinyal fotoperiode, keberadaan jalur sinyal GA menjadi wajib
(Mutasa-Gottgens dan Hedden 2009). Mekanisme GA dalam pengaturan

5

pertumbuhan tergantung pada protein DELLA, yang teridentifikasi sebagai
inhibitor pertumbuhan melalui dua cara: pertama dengan mengganggu aktifitas
faktor transkripsi dalam memacu pertumbuhan dan kedua melalui pengaktifan
promoter dari beberapa gen yang mengatur peningkatan aktifitas jalur asam
absisat (ABA) yang aktifitasnya bertentangan dengan GA. Ketika ABA hadir,
molekul GA mengikat reseptor sel, GID1, yang memfasilitasi perubahan bentuk
yang memungkinkan pengikatan wilayah terminal-N dari DELLA (GoldbergMoller et al. 2013). Giberelin mendorong pembungaan melalui pengaktifan
beberapa gen yang menyandi beberapa protein seperti SUPRESSOR OF
OVEREXPRESSION OF CONSTANS 1 (SOC1), LEAFY (LFY), dan
FLOWERING LOCUS T (FT) pada daun dan meristem bunga (Mutasa-Gottegens
dan Hedden 2009).
Pengumbian
Umbi kentang terbentuk dari cabang yang tumbuh di dalam tanah yang
disebut stolon. Proses pembentukan umbi ditandai dengan terhentinya
pertumbuhan dari stolon yang diikuti pembesaran stolon di bagian ujung dan diisi
oleh sebagian berat kering hasil fotosintesis. Proses pengumbian pada kentang
terdiri dari beberapa tahap: pembentukan dan pemanjangan stolon, induksi umbi,
inisiasi umbi, dan pertumbuhan umbi (Aksenova et al. 2012).
Terdapat enam faktor kunci yang mendorong proses pembentukan umbi
kentang. Faktor tersebut adalah antara lain: fotoperiode, fitokrom, cahaya yang
optimal, sukrosa tinggi, suhu rendah dan nitrogen rendah. Faktor tersebut
mempengaruhi beberapa jalur sinyal gen (Jackson 1999). Sama halnya dengan
induksi pembungaan, paling sedikit ada dua jalur yang mengontrol pembentukan
umbi pada kentang, yaitu jalur lintasan fotoperiode dan jalur lintasan giberelin
(Martinez-Garcia et al. 2002).
Jalur Lintasan Fotoperiode
Panjang hari (fotoperiode) mempengaruhi induksi pengumbian pada
kentang. Perbedaan kultivar (varietas) kentang terkadang mempengaruhi
kebutuhan akan penyinaran. Kentang tipe liar dan beberapa kentang budidaya
membutuhkan fotoperiode hari pendek (SD) untuk menginduksi pengumbian
(Bou-Torrent et al. 2011). Adanya pengaruh night break (NB) dapat menghambat
proses pembentukan umbi. Fitokrom diketahui terlibat dalam respon fotoperiode
terhadap night break tersebut. Pengaruh cahaya merah (R) dapat menghambat
proses pengumbian, namun jika dilanjutkan dengan perlakuan pemberian cahaya
merah jauh (FR) proses pembentukan umbi akan tetap terjadi (Jackson 1999).
Sementara lamanya siang hari (LD) dapat mengakibatkan proses pengumbian
menjadi lambat dan terhambat (Haverkort 2007; Suarez-Lopez 2013).
Respon terhadap fotoperiode ditentukan oleh peran gen CO. Penelitian
Martinez-Garcia et al. (2012) menjelaskan bahwa sebuah gen CO-like pada
kentang (StCO) telah ditemukan dan diindentifikasi sangat mirip dengan gen
kentang yang telah dilaporkan sebelumnya. Ekspresi berlebih gen StCO
menyebabkan pengumbian lambat pada tanaman kentang tipe liar dibawah induksi
penyinaran yang lemah. StCO menghambat proses pembentukan umbi dengan
menekan dan melemahkan induksi dari fotoperiode. Ekspresi berlebih
Arabidopsis CO (pACo) menyebabkan penundaan pengumbian pada kentang di

6

bawah pengaruh hari pendek (SD) dan SD+NB (Martinez-Garcia et al 2002,
Gonzalez-Schain dan Suarez-Lopez 2008).
Pengaruh StCo pada induksi pengumbian juga dapat ditransmisikan
melalui cangkok. StCO mempengaruhi StFT/StSP6A yang merupakan protein
yang sangat mirip dengan protein FT. FT-like protein (StSP6A) berperan
menginduksi pembentukan umbi. Pengaruh StSP6A dalam pembentukan umbi
ditularkan melalui proses penyambungan (Navarro et al. 2011). StSP6A secara
negatif diatur oleh StCO, yang menahan pembentukan umbi dibawah non-induksi
LDs (Navarro et al. 2011; Gonzalez-Schain et al. 2012).
Jalur Lintasan Giberelin
Hormon tanaman giberelin (GAs) hadir di dalam jaringan floem dan
berperan sebagai molekul florigen pada beberapa spesies. Giberelin (GAs) terlibat
juga dalam pengaturan pengumbian (Prat 2010). Kadar GA di daun menurun
dibawah kondisi hari pendek dan meningkat pada kondisi hari panjang. Tingginya
kadar GA pada ujung stolon ditemukan pada perpanjangan maristem stolon,
sedangkan penurunan kadar GA berpengaruh pada inisisi pembentukan umbi
(Bou-Torrent et al. 2011).
Percobaan pada tanaman kentang Andigena, sintesis GA menghambat
pembentukan umbi pada kondisi hari panjang. Secara keseluruhan, kadar GA
lebih besar terjadi pada kondisi yang menghambat pembentukan umbi. GA 20oksidase dan GA 3-oksidase mengkatalisasi dua tahap terakhir dari pengaktifan
biosintesis GA, dan hasil konversi GA 2-oksidase ke katabolisme menjadi tidak
aktif. Ketiga jenis enzim disandikan oleh keluarga kecil gen GA20ox, GA3ox, dan
GA2ox. Tiga langkah enzimatik dianggap sebagai situs utama pengaturan
biosintesis GA. Ekspresi GA20ox dan GA3ox dikendalikan oleh umpan balik
GA1/GA3 (Carrera et al. 1999), sedangkan ekspresi GA2ox diatur oleh umpan
maju dari bioaktif GAs (Bou-Torrent et al. 2011). Pada tanaman kentang, tingkat
transkripsi dari StGA20ox lebih kecil dalam daun di bawah kondisi non-induksi
(SD+NB atau LD) dibandingkan kondisi tanaman dibawah kondisi SD (BouTorrent et al. 2011).
Pembungkaman potato GA20ox (StGA20ox1) dan manipulasi kadar
GA3ox (StGA3ox) tidak dapat menginduksi pembentukan umbi pada hari panjang
(Bou-Torrent 2011). Penambahan GA2ox, StGA2ox1, mengakibatkan
pembentukan umbi in vitro, namun tidak pada penanaman di lapang (Kloosterman
et al. 2007). StGA2ox1 lebih berperan sebagai gen identitas umbi dibandingkan
sebagai pengatur pada induksi umbi. Peningkatan pengaturan StGA2ox1 di stolon
dilakukan oleh StSP6A (Navarro et al. 2011).
Lebih dari itu, bentuk ekspresi dari beberapa biosintesis enzim GA dan
fenotipe tanaman dengan mengubah tingkat dari enzim tersebut tidak selalu sesuai
dengan hipotesis bahwa GAs menghambat pembentukan umbi. Sebagai contoh,
meskipun StGA3ox2 mengatur penurunan pada inisiasi perkembangan umbi,
StGA20ox1 dan StGA20ox3 mengatur peningkatannya (Kloosterman et al. 2007).
Kedua StGA20ox1-3 membungkam dan over-expresi StGA3ox2 pada tanaman
tersebut menyebabkan pengumbian lebih cepat dibandingkan pada tanaman tipe
liar pada kondisi hari pendek meskipun memperlihatkan perbedaan perubahan
pada tingkat GA1 (Bou-Torrent et al. 2011).

7

Aktivitas GA dipengaruhi juga oleh suhu. GA menanggapi suhu tinggi
dengan mencegah kondisi pembentukan umbi. Efek penghambatan terjadi pada
suhu tinggi (suhu siang 32 oC dan malam 28 oC) dan efek mendorong
pembentukan umbi terjadi pada suhu rendah (suhu siang 22 oC dan malam 18 oC).
Suhu bepengaruh mengubah keseimbangan antara GA dan inhibitor lain yang
bertindak secara langsung di ujung stolon (Menzel dalam Hannapel 2007).

Gen Hd3a
Hd3a merupakan salah satu florigen yang berperan dalam induksi
pembungaan. Hd3a adalah gen ortholog FT Arabidopsis yang terdapat di padi.
Protein ini berfungsi sebagai pendorong pembungaan. Ekspresi tinggi gen Hd3a
terjadi saat siang hari sebagai bentuk kontrol dari jalur fotoperiode hari pendek
(Kojima et al. 2002). Sebagai penyandi florigen Hd3a dapat bergerak dari daun
menuju maristem tunas apikal (SAM) dan menyebabkan pembungaan (Tamaki et
al. 2007). Bentuk ekspresi gen Hd3a sama dengan Rice FT- like 1 (RFT1) yang
memperlihatkan ekspresi tinggi saat siang hari, dan puncaknya terjadi saat fajar
(Kojima et al. 2002).
Pada lintasan pembungaan jalur fotoperiode, ekspresi gen Hd3a diaktifkan
oleh gen Hd1. Hd1 merupakan gen ortholog CO Arabidopsis. Berbeda dengan
CO, gen Hd1 diekspresikan pada hari pendek dan juga hari panjang. Akan tetapi
Hd1 mendorong pembungaan dibawah kondisi hari pendak, dan menghambat
pembungaan pada kondisi hari panjang. Ekspresi yang tinggi dari gen Hd1 terjadi
saat gelap (Yano et al. 2000). Transkripsi dari Hd3a ditekan kuat pada mutan hd1
NILs dibawah kondisi hari pendek, sedangkan Hd1 mampu meningkatkan
ekspresi Hd3a dibawah kondisi hari pendek (Kojima et al. 2002).
Jalur Hd1-Hd3a di padi sama dengan jalur CO-FT di Arabidopsis.
Ekspresi dari Hd1 didorong oleh keberadaan gen OsGI (sebuah gen ortholog
GIGANTEA di Arabidopsis). Gen OsGI menyandi protein GI sebagai akibat dari
induksi jam sirkadian dibawah kondisi hari pendek dan hari panjang. OsGI akan
mengaktifkan ekspresi Hd1 dan selanjutnya mendorong ekspresi dari gen Hd3a.
OsGI mampu mengirimkan sinyal akibat fotoperiod hari pendek ke OsMADS51,
kemudian akan mengaktifkan ekspresi Ehd1, Hd3a dan RTF1. Hd1 dan Ehd1
dapat diaktifkan oleh RID1, Ehd2, dan OsId1. Di sisi lain Ehd3 mampu
mengaktifkan ekspresi Ehd1. Sementara daerah hilir dari gen Hd3a/RTF1 adalah
gen-gen MADS-box seperti gen OsMADS14 dan OsMADS15 yang berfungsi
sebagai gen penentu indentitas bunga (Gambar 2). Gen OsMADS14 dan
OsMADS15 merupakan ortholog gen AP1 di Arabidopsis yang berperan penting
dalam mendukung bentuk bunga (Komiya et al. 2008). Pembentukan bunga yang
tidak normal dapat terjadi karena gen OsMADS14 dan OsMADS15 tidak
diekspresikan secara optimal (Yuan-Li dan Wei-Jiang 2012). Jalur pembungaan
padi dibawah kondisi hari pendek disajikan pada Gambar 2.
Peranan Hd3a sebagai florigen tidak hanya bekerja di padi, tetapi juga
pada tanaman Saussurea involucrate (Li et al. 2011), Jatropha curcas
(Sulistyaningsih 2012), dan Nicotiana benthamiana (Syafitri 2012), dimana
tanaman-tanaman tersebut mampu berbunga dengan cepat. Hd3a juga mampu
menginduksi pembentukan bunga dan umbi pada tanaman kentang Adigena

8

dibawah kondisi non-induksi hari panjang. Induksi pengumbian dapat terjadi pada
kondisi hari panjang di kentang ssp. Andigena disebabkan perlakuan
penyambungan tanaman tipe liar dengan galur kentang rolC::Hd3a-GFP. Galur
kentang transgenik yang dijadikan batang atas (scion) ataupun batang bawah
(stock), ternyata dapat menginduksi pengumbian pada kondisi hari panjang
(Navarro et al. 2011). Hal ini membuktikan bahwa Hd3a merupakan penginduksi
pembentukan umbi yang dapat bergerak.

Gambar 2 Jalur pembungaan pada padi dibawah kondisi hari pendek. Tanda 
menunjukkan mendorong. Tanda menunjukkan penghambatan (YuanLi dan Wei-Jiang 2012).
Penelitian terbaru menunjukkan bahwa selain sebagai aktivator pembungaan,
protein Hd3a mampu mendorong percabangan pada tanaman padi. Tsuji et al.
(2015) menjelaskan bahwa protein Hd3a mungkin terakumulasi dalam meristem
aksilar sehingga mampu mempromosikan percabangan dan diperlukan bagi
promosi pembentukan Florigen Activation Complex (FAC). FAC diperlukan
untuk proses selain pembentukan bunga. Sebagai sinyal percabangan yang
bergerak di padi, aktivitas Hd3a tergantung pada pembentukan FAC.

Transformasi Genetik dengan Perantara Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens merupakan bakteri gram negatif tanah yang
menyebabkan penyakit tumor pada tanaman dikotil. Tumor terbentuk karena
ekspresi gen yang terdapat di daerah T-DNA yang ditransfer dari plasmid Ti
(tumor inducing plasmid) ke dalam genom tanaman. Plasmid Ti yang terdapat di
dalam A. tumefaciens memiliki beberapa bagian yaitu, daerah T-DNA (transfer

9

DNA), daerah vir (virulensi), daerah inisiasi replikasi plasmid (ORI-Origin of
Replication), dan daerah katabolisme opin. Daerah tersebut memiliki fungsi yang
berbeda. Daerah T-DNA dan daerah vir merupakan daerah yang paling berperan
dalam proses transformasi genetik.
Proses transformasi genetik dari A.tumefaciens ke dalam sel tanaman
diawali dengan pengenalan luka. Luka pada jaringan tanaman berfungsi sebagai
jalur masuk bakteri menuju tempat yang dikenali pada permukaan sel tanaman,
sehingga sel tanaman menjadi kompeten untuk ditransformasi. Luka
menyebabkan tanaman menghasilkan senyawa fenolik (Asetosiringone) yang
menarik A. tumefaciens dan menginduksi gen-gen vir yang diperlukan dalam
proses transfer T-DNA (Galvin 2003).
Gen vir berperan secara langsung dalam transfer gen. Gen virA mendeteksi
senyawa fenolik yang terbentuk diikuti dengan autofosforilasi protein virA dan
mengaktifkan gen virG. Protein VirG akan menginduksi ekspresi gen VirD1 yang
akan memotong daerah T-DNA pada Agrobacterium sehingga diperoleh utas
tunggal T-DNA. Protein VirD2 yang terfosforilasi oleh protein VirD1 akan
mengarahkan daerah T-DNA ke dalam nukleus, sedangkan gen virC1 akan
melindungi daerah T-DNA dan meningkatkan aktivitas protein VirD. Gen virD
menempel pada ujung 5’ T-DNA kemudian membawa DNA ke sitosol sel inang,
dan T-DNA akan terinsersi ke dalam genom tumbuhan (Galvin 2003).

Perakitan Tanaman Kentang Transgenik
Kentang merupakan salah satu tanaman budidaya yang sukses
ditransformasi. Transformasi tanaman kentang dilakukan untuk tujuan tertentu
seperti ketahanan terhadap penyakit, ketahanan terhadap virus, dan juga untuk
meningkatkan nutrisi umbi. Kultivar kentang yang pernah ditransformasi salah
satunya adalah kentang kultivar Atlantik. Kentang kultivar Atlantik pernah
ditransformasi menggunakan gen hordothionin yaitu gen penyandi thionin yang
terdapat pada endosperma tanamanan barley sebagai anti bakteri yang dapat
meningkatkan resistensi tanaman terhadap serangan bakteri (Nurhasanah et al.
2003). Kentang kultivar Atlantik juga pernah ditransformasi dengan gen penyandi
lisozim. Hasil transformasi kentang dengan gen penyandi lisozim menghasilkan
tanaman yang tahan terhadap penyakit layu dan busuk lunak (Manguntungi 2014).
Penyakit layu merupakan penyakit yang banyak menyerang tanaman kentang
sehingga dapat menurunkan produksi hingga 80% (Wattimena 2000).
Perakitan tanaman kentang bukan hanya bertujuan untuk menghasilkan
tanaman yang tahan terhadap penyakit bakteri, namun juga untuk meningkatkan
komposisi nutrisi. Kashani et al. (2012) melakukan transformasi genetik kentang
dengan gen proinsulin manusia. Insulin merupakan senyawa metabolik yang
dibutuhkan bagi penderita diabetes.
Protein farmasi pada hewan yang dihasilkan melalui perakitan tanaman
kentang dengan mengintroduksikan gen vp60 pernah dilakukan oleh Mikschofsky
et al. (2011). Ekpresi dari antigen virus vp60 pada tanaman kentang transgenik
berakibat pada perubahan komposisi nutrisi umbi. Adanya protein VP60
ditunjukkan oleh adanya respon kekebalan yang melindungi kelinci dari penyakit
hemoragik virus.

10

METODE PENELITIAN
Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilakukan pada bulan September 2014 – Oktober 2015 di
Laboratorium Biologi Molekuler dan Seluler Tanaman, dan Laboratorium
Biotechnology Research Indonesia – The Netherland (BIORIN), Pusat Penelitian
Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB), Lembaga Penelitian dan
Pengabdian Kepada Masyarakat, Institut Pertanian Bogor.

Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah bagian ruas batang
(internode) tanaman kentang in vitro kultivar Jala Ipam. Bakteri A.tumefaciens
strain LBA4404 yang membawa plasmid p2K1-Hd3a (Tamaki et al. 2007) dan
plasmid pCAMBIA1300-Hd3a (Sulistyaningsih 2012) digunakan untuk proses
transformasi genetik tanaman kentang. Di daerah T-DNA pada plasmid p2K1Hd3a, gen Hd3a dikendalikan oleh promoter rolC, sedangkan pada plasmid
pCambia1300-Hd3a, gen Hd3a di bawah kendali promoter 35S CaMV. Peta fisik
gen Hd3a di daerah T-DNA disajikan pada Gambar 3.

Gambar 3

Posisi gen Hd3a di dalam daerah T-DNA dari vektor ekspresi. (A)
Daerah T-DNA dari p2K1-Hd3a (Tamaki et al. 2007), (B) Daerah TDNA dari pC1300-Hd3a (Sulistyningsih 2012). LB: left border, RB:
right border, rolC: promoter rolC dari A. rhizogenes, Hd3a: gen dari
padi, GFP: gen penanda Green Fluorecent Protein, hpt: gen
resistensi terhadap higromisin, 35S P: promoter 35S dari cauliflower
mosaic virus (CaMV), CA: sekuen polyA dari 35S CaMV.

Primer spesifik yang digunakan untuk analisis integrasi gen Hd3a di dalam
genom tanaman transgenik putatif yang ditransformasi dengan p2K1-Hd3a adalah
pasangan primer rolC-F (5’-AAGCTTAAAGTTGGCCCG-3’) dan Hd3a-FP-R
(5’-TCTAGAGGGGTAGACCCTCCTGCCGC-3’). Tanaman transgenik putatif
yang berhasil ditransformasi dengan pC1300-Hd3a dianalisis dengan pasangan

11

primer 35S-F (5’-CCAAGCTCTATCTGTCACTTCATC-3’) dan Hd-R (5’CTAGGGGTAGACCCTCCTGCC-3’). Gen aktin yang didasarkan pada aktin dari
kedelai digunakan untuk menguji kualitas DNA tanaman melalui PCR dengan
primer Act-F (5’-ATGGCAGATGCCGAGGATAT-3’) yang terdapat pada ekson 1
dan Act-R (5’-CAGTTGTGCGACCACTTGCA-3’) yang terdapat pada ekson 2.
Media MS (Murashige dan Skoog 1962) digunakan sebagai media dasar
untuk kultur tanaman kentang secara in vitro (Lampiran 2). Media MS2 makro
digunakan untuk perbanyakan tanaman secara in vitro. Media kokultivasi tersusun
dari media MS yang mengandung BA 0.5 g/L, IAA 0.1 g/L, dan acetocyringone
20 mg/L. Media regenerasi merupakan media MS yang mengandung IAA 2 mg/L,
BAP 3 mg/L, GA3 1 mg/L, cefotaxime 100 mg/L dan higromisin 40 mg/L. Media
LB (bacto tripton 5 g/L, yeast extract 10 g/L, dan NaCl 10 g/L) digunakan untuk
kultur bakteri.

Metode
Perbanyakan Tanaman
Tanaman kentang kultivar Jala Ipam in vitro diperbanyak pada media MS2
makro selama satu bulan. Ruas batang yang mengandung satu mata tunas dengan
panjang 0.5 cm – 1 cm digunakan sebagai eksplan untuk perbanyakan tanaman.
Transformasi Kentang dengan Gen Hd3a
Bakteri A. tumefaciens dari stok gliserol yang membawa gen Hd3a
ditumbuhkan pada media LB cair yang mengandung 50 mg/L antibiotik kanamisin
dan 25 mg/L rifampisin pada suhu ruang pada kondisi gelap selama 48 jam
dengan penggoyangan 100 rpm. Selanjutnya 100 μl bakteri dikulturkan kembali di
dalam 10 ml media LB cair dengan penggoyangan 100 rpm di ruang gelap
sehingga mencapai nilai absorbansi 0.5 pada panjang gelombang 600 nm (OD600).
Sel bakteri selanjutnya dipisahkan dari medium LB cair dengan disentrifugasi
dengan kecepatan 5000 rpm selama 15 menit. Sel bakteri yang mengendap
dilarutkan pada medium kokultivasi cair.
Eksplan yang berupa ruas batang (internode) yang tidak mengandung mata
tunas direndam dalam larutan bakteri A. tumefaciens selama 10 menit pada suhu
ruang dengan penggoyangan. Eksplan tersebut selanjutnya dikeringkan di atas
kertas tisu steril selama 10 menit dan ditanam pada media kokultivasi padat di
dalam cawan petri, kemudian kokultivasi dilakukan pada ruang gelap pada suhu
23°C selama tiga hari. Tahapan ini bertujuan agar bakteri dapat menginfeksi
eksplan. Setelah tiga hari, eksplan dicuci dengan air steril sebanyak 3 kali,
kemudian direndam pada larutan 100 mg/L cefotaxime selama 10 menit untuk
mematikan bakteri A. tumefaciens. Eksplan selanjutnya ditanam pada media
penginduksi kalus/regenerasi. Efisiensi transformasi ditentukan berdasarkan
rumus yang disajikan pada Lampiran 3.
Regenerasi Hasil Transformasi Tanaman Kentang
Tahap regenerasi bertujuan untuk menginduksi pembentukan tunas dari
kalus. Eksplan tanaman yang telah dikokultivasi selanjutnya ditanam pada media
pembentukan kalus dan regenerasi yang berupa media regenerasi dengan

12

penambahan 100 mg/L cefotaxime dan 40 mg/L higromisin. Subkultur dilakukan
setiap 2 minggu hingga kalus membentuk tunas. Tunas yang tumbuh dari kalus
pada media regenerasi selanjutnya dipindahkan ke medium MS2 makro selama
empat minggu. Setelah empat minggu tanaman disubkultur pada media seleksi
yang berupa media MS2 makro yang mengandung higromisin 40 mg/L.
Pertumbuhan tanaman diamati selama empat minggu. Tanaman yang tumbuh
dianggap sebagai tanaman transgenik putatif yang kemudian dianalisis
menggunakan metode Polymerase Chain Reaction (PCR). Efisiensi regenerasi
dihitung berdasarkan rumus yang disajikan pada Lampiran 3.
Identifikasi Tanaman Transgenik dengan Polymerase Chain Reaction (PCR)
DNA genom tanaman kentang Jala Ipam diisolasi dari daun dengan
metode CTAB (cetyl-trymethyl ammonium bromide) (Doyle dan Doyle 1987).
Daun tanaman kentang sebanyak 100 gram digerus dengan nitrogen cair
kemudian dimasukkan pada tabung eppendorf ukuran 1.5 ml dan ditambah larutan
pengekstraksi yaitu 600 μl buffer CTAB 2% (20 g/L CTAB, 150 ml/L 1 M Tris-Cl
Ph 8.0, 60 ml/L 0.5 M EDTA Ph 8.0) dan β-merkaptoetanol (0.2%). Tabung
dibolak-balik beberapa kali lalu diinkubasi pada suhu 65 °C selama 30 menit.
Setelah itu tabung disimpan di dalam es, kemudian ditambah kloroform-isoamil
alcohol 24:1 (v/v) sebanyak 1 kali volume larutan, dan disentrifugasi dengan
kecepatan 10000 rpm (Jouan BR 4i) selama 10 menit. Supernatan yang diperoleh,
diambil dan dipindahkan pada tabung eppendorf baru, kemudian ditambah PCI
(phenol-cloroform-isoamil alcohol) 25:24:1 (v/v/v) sebanyak 1 kali volume
larutan, dibolak-balik dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan 10000 rpm
selama 15 menit. Supernatan yang terbentuk dipindahkan ke dalam tabung
eppendorf baru, dan ditambah sodium asetat 0.2 M sebanyak 0.1 kali volume
supernatan yang diperoleh, dan ditambah etanol absolute sebanyak 2 kali volume
larutan. Tabung dibolak-balik beberapa kali, kemudian disimpan dalam freezer (20 °C) selama semalam. Kemudian, tabung disentrifugasi lagi dengan kecepatan
10000 rpm selama 20 menit. Supernatant dibuang, dan endapan yang terbentuk
ditambah dengan larutan etanol 70% (v/v) dan disentrifugasi dengan kecepatan
10000 rpm selama 10 menit, kemudian endapan dikeringkan menggunakan mesin
vakum dan diberi 20 μl ddH2O dan 4 μl RNAse (1 mg/ml).
DNA yang telah diisolasi kemudian dianalisis dengan PCR menggunakan
pasangan primer rolC-F dan Hd3a-FP-R untuk tanaman transgenik yang
diperkirakan mengandung gen Hd3a di bawah kendali promoter rolC dan primer
35S-F dan Hd-R untuk tanaman transgenik yang diperkirakan mengandung gen
Hd3a di bawah kendali promoter 35S CaMV. Kondisi PCR terdiri dari pra PCR
suhu 95 °C selama 5 menit, denaturasi pada suhu 95 °C selama 1 menit,
annealing pada suhu 58 °C selama 1 menit, extension pada suhu 72 °C selama 1
menit, post extension pada suhu 72 °C selama 5 menit, pendinginan pada suhu
25°C selama 10 menit. PCR dilakukan sebanyak 35 siklus. Hasil PCR selanjutnya
dielektroforesis dengan menggunakan gel agarosa 1% (b/v) pada voltase 100 volt
selama 30 menit. Setelah itu gel agarosa direndam dalam larutan Ethidium
Bromide (0.5 mg/L) selama 10 menit dan dibilas dengan air. Hasil elektroforesis
diamati dan diambil gambarnya dengan gel-doc transiluminator UV.

13

HASIL DAN PEMBAHASAN
Regenerasi Tanaman Kentang
Transformasi genetik tanaman kentang kultivar Jala Ipam dilakukan
dengan menggunakan eksplan ruas batang (internode) tanpa mata tunas yang
berumur 4 minggu. Penggunaan ruas batang tanpa mata tunas bertujuan untuk
menghindari kemungkinan tumbuhnya tunas transgenik palsu dari mata tunas
yang muncul pada bagian buku. Disamping itu pemilihan penggunaan ruas batang
sebagai eksplan disebabkan karena ruas batang lebih cepat membentuk kalus dan
lebih tinggi frekuensi regenerasi tunas dan jumlah tunas per eksplan dibandingkan
eksplan lain seperti daun dan tangkai daun. Kecepatan induksi kalus dari eksplan
ruas batang telah dibuktikan pada penelitian Dhital et al. (2010) dan Bustomi
(2014). Hasil yang berbeda diperoleh Manguntungi (2014) yang menunjukkan
bahwa potongan daun lebih cepat membentuk kalus dan kalusnya lebih banyak
beregenerasi menjadi tunas daripada eksplan yang berupa ruas batang.

Gambar 4 Kalus yang terbentuk pada media induksi kalus dan regenerasi pada 2
minggu setelah tanam. (A) kalus dari eksplan yang ditransformasi
dengan p2K1-Hd3a, (B) kalus dari eksplan yang ditransformasi
dengan pCambia1300-Hd3a, (C) kalus dari eksplan kontrol.
Eksplan internode yang telah ditransformasi dengan gen Hd3a ditanam
pada media induksi kalus dan regenerasi. Media induksi kalus dan media
regenerasi menggunakan media yang sama yaitu media MS yang mengandung 2
mg/L IAA, 3 mg/L BAP, 1 mg/L GA3, 100 mg/L cefotaxime, seperti yang
digunakan oleh Bustomi (2014) dan Manguntungi (2014). Eksplan tanaman
kentang kultivar Jala Ipam yang telah ditransformasi dan juga eksplan kontrol
mulai membentuk kalus dua minggu setelah ko-kultivasi (Gambar 4).
Pembentukan kalus mulai terlihat dari ujung potongan buku kemudian merata
pada semua bagian eksplan.
Eksplan disubkultur setiap dua minggu pada media yang sama dengan
tujuan menyediakan ketersediaan hara mineral dan hormon tanaman yang cukup
untuk memacu pembentukan tunas lebih cepat. Pembentukan tunas dimulai sekitar
empat sampai enam minggu setelah pembentukan kalus yang ditanam di media
regenerasi (Gambar 5). Tunas yang tumbuh selanjutnya dipindahkan pada media
MS2 makro agar dapat beregenerasi menjadi tanaman lengkap. Tanaman yang
telah tumbuh menjadi tanaman lengkap diperbanyak pada media seleksi MS2
makro yang mengandung 40 mg/L antibiotik higromisin. Tanaman transgenik
putatif ditumbuhkan menjadi besar untuk diaklimatisasi di rumah kaca.

14

Gambar 5 Tahapan regenerasi tanaman kentang Jala Ipam transgenik. (A) Kalus
bertunas, (B) tunas tumbuh menjadi tanaman utuh pada media MS2
makro yang mengandung antibiotik higromisin, (C) tanaman
transgenik untuk diaklimatisasi.
Sebagian besar eksplan yang ditransformasi secara perlahan mengalami
perubahan warna menjadi coklat (browning) dan kemudian mati (Gambar 8).
Kematian kultur ini dapat diakibatkan karena gen Hd3a yang dipautkan dengan
gen hpt tidak masuk, tidak terintegrasi kedalam genom dan tidak terekspresikan di
dalam eksplan, sehingga tidak mampu bertahan dalam media yang mengandung
antibiotik higromisin. Semua kalus dari eksplan yang tidak ditransformasi
(kontrol) berubah warna menjadi hitam dan mati (Gambar 6). Kondisi ini terjadi
karena pengaruh penambahan antibiotik pada media regenerasi. Konsentrasi 40
mg/L higromisin pada pembentukan kalus termasuk tinggi. Pada penelitian
Salsabila (2015) penggunaan dosis 10 mg/L higromisin sudah dapat menyeleksi
kalus yang resisten terhadap higromisin, dan dosis dinaikkan menjadi 20 mg/L
untuk menyeleksi tunas kentang Agria transgenik. Penggunaan dosis yang lebih
rendah pada seleksi kalus transgenik putatif dikarenakan kalus yang berupa
kumpulan sel dan belum terdiferensiasi memiliki sifat yang lebih sensitif daripada
tunas.

Gambar 6 Perkembangan kalus non-transgenik. (A) kalus yang ditransformasi
mengalami browning, (B) kalus kontrol yang tidak ditransformasi
mengalami browning.
Tunas transgenik putatif yang mengandung gen Hd3a dengan promoter
rolC serupa dengan tunas transgenik putatif Hd3a dengan promoter 35S. Tunas
tersebut tumbuh dengan normal dan beberapa terlihat mampu membentuk umbi
lebih cepat (Gambar 7). Pada umur 4 minggu, satu tanaman transgenik yang
mengandung gen Hd3a dibawah kendali promoter rolC menghasilkan umbi.
Tanaman non transgenik pada umur yang sama tidak menghasilkan umbi. Hal ini

15

menunjukkan bahwa gen Hd3a mampu menginduksi pembentukan umbi pada
tanaman kentang kultivar Jala Ipam transgenik secara in vitro.

Gambar 7 Tanaman kentang kultivar Jala Ipam in vitro berumur 4 minggu.
(A) Tanaman transgenik, (B) tanaman non-transgenik
Baik tanaman transgenik maupun tanaman non transgenik secara in vitro
tidak menghasilkan bunga. Umur 4 minggu tidak cukup untuk berbunga baik pada
tanaman transgenik maupun non-transgenik. Dalam kondisi di lapang di Indonesia
kultivar Jala Ipam sulit berbunga. Untuk mengetahui pengaruh gen Hd3a terhadap
pembungaan, tanaman kentang transgenik harus ditanam di lapang. Umbi G0
sangat baik digunakan sebagai bibit untuk mengetahui ekspresi gen Hd3a di
lapang karena efek zat pengatur tumbuh di media kultur in vitro sudah tidak ada
lagi.
Pada penelitian ini transformasi genetik pada kentang kultivar Jala Ipam
memiliki efisiensi transformasi sebesar 18% pada tanaman yang ditransformasi
menggunakan p2K1-Hd3a dan 7% pada tanaman tanaman yang ditransformasi
dengan pC1300-Hd3a (Tabel 1). Efisiensi transformasi kentang kultivar Jala Ipam
lebih rendah dibandingkan dengan efisiensi transformasi yang dilakukan pada
penelitian sebelumnya yang juga menggunakan gen Hd3a, seperti pada Jatropa
curcas sebesar 26.67% (Sulistyaninngsih 2012), pada Nicotiana benthamiana
sebesar 86% (Syafitri 2012), dan kentang kultivar Diamant sebesar 21.21%
(Mardiyyah 2014). Namun jika dibandingkan dengan kentang kultivar Agria, nilai
efisiensi transformasi Jala Ipam lebih besar. Kentang kultivar Agria yang
ditransformasi dengan gen Hd3a dibawah kendali promoter rolC yang terdapat
pada plasmid p2K1-Hd3a memiliki efisiensi transformasi sebesar 5.01%.
Tabel 1 Efisiensi transformasi dan efisiensi regenerasi gen Hd3a pada tanaman
kentang kultivar Jala Ipam

16

Perbedaan nilai efisiensi transformasi dapat dipengaruhi oleh spesies dan
kultivar yang digunakan. Rendahnya efisiensi transformasi pada penelitian ini
antara lain disebabkan karena genotipe tanaman Jala Ipam merupakan kentang
hasil seleksi positif dari variasi somaklonal Russet Burbank sehingga memiliki
kesamaan ciri dan sifat dengan kentang varietas Russet Burbank. Penelitan Newell
et al. (1991) melaporkan dari 225 eksplan kentang varietas Russet Burbank yang
ditransformasi, efisiensi transformasi pada penelitian tersebut rata-rata sebesar
2%. Penelitian Chang et al. (2002) menginformasikan bahwa pembentukan tunas
pada tanaman kentang varietas Russet Burbank dimulai dua bulan setelah
kokultivasi dan pembentukan akar dua minggu setelahnya, dengan efesiensi
transformasi sekitar 6.5% dari total semua perlakuannya. Jika dibandingkan
dengan kedua penelitian tersebut, efisiensi transformasi kentang kultivar Jala
Ipam pada penelitian ini relatif sama bahkan lebih besar.
Varietas Russet Burbank merupakan salah satu varietas kentang yang
memiliki sifa