Transformasi Genetik Kentang (Solanum Tuberosum L.) Kultivar Kennebec Dengan Gen Hd3a
TRANSFORMASI GENETIK KENTANG
(Solanum tuberosum L.) KULTIVAR KENNEBEC DENGAN
GEN Hd3a
EKA MAULANI
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Transformasi Genetik
Kentang (Solanum tuberosum L.) Kultivar Kennebec dengan Gen Hd3a adalah
benar karya bersama saya dan komisi pembimbing dan belum diajukan dalam
bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang
berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari
penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di
bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Pebruari 2015
Eka Maulani
NIM G34100043
ABSTRAK
Eka Maulani. Transformasi Genetik Kentang (Solanum tuberosum L.) Kultivar
Kennebec dengan Gen Hd3a. Dibimbing oleh SUHARSONO dan UTUT
WIDYASTUTI.
Kentang merupakan salah satu tanaman hortikultura yang ditanam secara
luas di dunia. Kentang mengandung karbohidrat yang tinggi dan asam amino
esensial yang baik untuk nutrisi manusia sehingga dapat digunakan sebagai salah
satu bahan diversifikasi pangan. Pembungaan sangat penting untuk perakitan
varietas baru melalui persilangan seksual. Hd3a dapat menginduksi pembungaan
pada beberapa spesies dan menginduksi pembentukan umbi pada kentang kultivar
Andigena. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk melakukan transformasi genetik
kentang (Solanum tuberosum L.) kultivar Kennebec dengan gen Hd3a dibawah
kendali promoter rolC. Transformasi genetik dilakukan melalui bantuan
Agrobacterium tumefaciens LBA4404 yang mengandung plasmid p2KI-Hd3a
dengan metode ko-kultivasi. Ruas tanaman digunakan sebagai eksplan. Seleksi
terhadap kalus dan tunas transgenik putatif dilakukan dengan media MS 20 mg/L
higromisin. Hasil penelitian menunjukkan bahwa transformasi terhadap kentang
kultivar Kennebec menghasilkan efisiensi transformasi sebesar 20%, sedangkan
efisiensi regenerasi sebesar 100%. Penelitian ini menghasilkan dua tunas
transgenik putatif.
Kata kunci: Hd3a, kultivar Kennebec, Solanum tuberosum L., transformasi
genetik
ABSTRACT
Eka Maulani. Genetical Transformation of Potato (Solanum tuberosum L.)
Kennebec Cultivar with Hd3a Gene. Supervised by SUHARSONO and UTUT
WIDYASTUTI.
Potato is one of the most important horticultural crops. This commodity is
cultivated in many area in the world. It contains high carbohydrate and essential
amino acid which are important nutrition for human, so it can be used for food
diversification. Flowering has an important role in the creation of new varieties
through sexual crossing. Hd3a induces flowering in several species and tuber
formation of potato cultivar Andigena. The objective of this research was to
transform genetically the potato (Solanum tuberosum L.) cultivar Kennebec with
Hd3a gene under the control of rolC promoter. Transformation of potato was
done by using Agrobacterium tumefaciens LBA4404 containing p2KI-Hd3a
plasmid by co-cultivation method using internodes as explants. Putative
transgenic calli and shoots were selected in the MS medium containing 20 mg/L
of hygromycin. The efficiency of transformation was 20 % and the efficiency of
regeneration of putative transgenic shoot was 100%. This research resulted two
putative transgenic shoots.
Keywords: Cultivar Kennebec, genetic transformation, Hd3a, Solanum tuberosum
L.
TRANSFORMASI GENETIK KENTANG
(Solanum tuberosum L.) KULTIVAR KENNEBEC DENGAN
GEN Hd3a
EKA MAULANI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Penelitian ini
berjudul Transformasi Genetik Kentang (Solanum tuberosum L.) Kultivar
Kennebec dengan Gen Hd3a. Penelitian dilaksanakan sejak bulan Januari sampai
dengan September 2014.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Prof Dr Ir Suharsono, DEA dan Dr Ir
Utut Widyastuti, MSi selaku pembimbing atas bimbingan, saran, dan ilmu yang
bermanfaat selama melaksanakan penelitian ini. Terima kasih kepada Dr Berry
Juliandi, MSi selaku penguji atas saran dan masukan pada tulisan ini. Terima
kasih kepada Kepala Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi
LPPM IPB beserta seluruh staf dan jajarannya atas sarana, prasarana, dan
bantuannya selama penulis melakukan penelitian di laboratorium BIORIN dan
Biologi Molekuler Seluler Tanaman. Penulis juga menyampaikan terima kasih
kepada Nia Dahniar SP, Pepi Elvavina, Abdul Mulya, Sairi, Yulianto, Sarah, Asep
Saripudin atas bantuan dan masukannya. Terima kasih kepada rekan-rekan
seperjuangan yaitu Bustomi, Ika, Ica, Lisa, Ina, Dwika, Aditya, Carin, Kak Isni,
Mas Ari, Mas Baso, Mas Rudi, Kak Destik, Kak Effa, Kak Wiwin, Kak Fajri, dan
Kak Tiwi atas ilmu, bimbingan, dan kerjasama yang diberikan. Terima kasih pula
untuk seluruh teman-teman Biologi 47, OWA 13, rekan-rekan seperjuangan di
Pondok Pink Muss (Rahma, Wulan dan Indah) atas segala masukan dan
semangatnya. Ungkapan terima kasih yang tak terhingga penulis sampaikan
kepada keluarga tercinta khususnya kepada ibunda dan ayahanda, Hoesni dan
Nunung Kartini, adik-adikku yang tersayang Akhyat Maulana dan Akmal Firdausi
atas segala do’a, dukungan dan kasih sayang yang telah diberikan.
Akhir kata, penulis berharap agar karya ilmiah ini dapat bermanfaat dan
dapat memberikan sumbangan bagi perkembangan ilmu pengetahuan.
Bogor, Pebruari 2015
Eka Maulani
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
PENDAHULUAN
1
Latar Belakang
1
Tujuan Penelitian
2
BAHAN DAN METODE
2
Waktu dan Tempat
2
Bahan
2
Metode
3
Perbanyakan tanaman in vitro
3
Perbanyakan Agrobacterium tumefaciens
3
Transformasi genetik kentang kultivar Kennebec
3
HASIL DAN PEMBAHASAN
4
Pembentukan kalus
4
Pembentukan tunas transgenik putatif
5
SIMPULAN DAN SARAN
8
Simpulan
8
Saran
8
UCAPAN TERIMA KASIH
8
DAFTAR PUSTAKA
8
LAMPIRAN
10
RIWAYAT HIDUP
12
DAFTAR GAMBAR
1 Peta daerah T-DNA yang mengandung gen Hd3a dan gen hpt didalam
plasmid p2KI-Hd3a
2 Kalus kentang kultivar Kennebec yang terbentuk di media induksi
kalus yang berumur 2 minggu setelah ko-kultivasi dengan A.
tumefaciens
3 Regenerasi tunas kentang kultivar Kennebec dari kalus transgenik
putatif yang berumur 3 minggu
4 Tunas kentang kultivar Kennebec yang diseleksi dengan media yang
mengandung 20 mg/L higromisin
5 Uji viabilitas tanaman kentang non-transgenik di media non selektif
dan media selektif
3
5
5
6
7
DAFTAR LAMPIRAN
1 Komposisi Media MS (Murashige dan Skoog 1962)
2 Perhitungan persentase efisiensi transformasi dan efisiensi regenerasi
10
11
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Hortikultura merupakan bagian dari sektor pertanian yang terdiri atas
sayuran, buah-buahan, dan tanaman hias. Hortikultura menjadi sektor yang sangat
penting bagi pertanian, karena mempunyai nilai ekonomi yang tinggi. Komoditas
hortikultura, khususnya sayuran dan buah-buahan berperan penting dalam
pemenuhan kebutuhan pangan manusia. Kentang merupakan salah satu komoditas
hortikultura yang penting untuk pangan. Di Indonesia kentang termasuk kedalam
35 komoditas unggulan nasional yang mendapat prioritas pengembangan oleh
pemerintah. Kentang merupakan tanaman sayuran musiman yang berbentuk
semak dan perdu, serta berumur pendek (Andarwati 2011). Tanaman ini berasal
dari Amerika Selatan (Peru, Chili, Bolivia, dan Argentina) dan beberapa daerah di
Amerika Tengah (Hawkes 1990).
Kentang mengandung karbohidrat yang tinggi dan asam amino esensial
yang baik untuk nutrisi manusia. Cuaca sangat berpengaruh terhadap tanaman
kentang. Suhu rendah (15-20oC), kelembaban udara tinggi dan sinar matahari
yang cukup, serta sedikit hujan merupakan syarat yang baik untuk pertumbuhan,
pembungaan dan pembentukan umbi (Sahat 1991).
Bunga mempunyai peranan yang sangat penting dalam perakitan varietas
baru melalui persilangan. Kentang kultivar Kennebec mempunyai karakteristik
yang sangat cocok sebagai kentang olahan khususnya french fries, sehingga
kultivar ini sangat potensial dijadikan sebagai sumber gen dan disilangkan dengan
kultivar lainnya. Tanaman kentang kultivar Kennebec dikembangkan oleh
Departemen Pertanian Amerika Serikat dan dilepas pada tahun 1948 dari
persilangan USDA 127x96-56. Kentang kultivar Kennebec memiliki batang yang
panjang dan lebar, serta daun yang berwarna hijau gelap dan umbi yang berbentuk
lonjong (Smith 1968).
Pembungaan merupakan hasil transisi pucuk meristem tanaman dari fase
vegetatif ke fase reproduktif. Pertumbuhan bunga suatu jenis tanaman sangat
dipengaruhi oleh lama penyinaran yang diperoleh ditempat tumbuhnya. Untuk
menghasilkan bunga, tanaman kentang memerlukan panjang hari sekitar 16-18
jam (Sahat 1991).
Gen Hd3a menyandi suatu protein yang menginduksi gen-gen pembungaan.
Gen Hd3a pertama kali diidentifikasi sebagai quantitative trait locus (QTL) yang
proteinnya menginduksi pembungaan padi dibawah kondisi hari pendek (Monna
et al. 2002). Ekspresi berlebihan (over expression) gen Hd3a dengan promoter
konstitutif (Kojima et al. 2002) atau promoter spesifik (Tamaki et al. 2007)
menghasilkan pembungaan dini. Supresi Hd3a dengan RNA interference (RNAi)
menunda pembungaan (Komiya et al. 2008). Hal ini menunjukkan bahwa Hd3a
berperan penting dalam menginduksi pembungaan.
Penemuan gen pembungaan ini memungkinkan dilakukannya rekayasa
genetik untuk berbagai keperluan. Tanaman transgenik yang mengandung gen
Hd3a sampai saat ini telah mampu untuk menginduksi pembungaan pada
beberapa spesies seperti Saussurea involucrate (Li et al. 2011), Jatropha curcas
L. (Sulistyaningsih 2012) dan Nicotiana benthamiana (Syafitri 2012; Senjaya
2
2013). Selain menginduksi pembentukan bunga, Hd3a juga menginduksi
pembentukan umbi pada kentang kultivar Andigena (Navarro et al. 2011).
Introduksi gen Hd3a kedalam kentang kultivar Baraka telah menghasilkan
tanaman transgenik putatif yang berumbi lebih awal dari pada tanaman nontransgenik (Bustomi 2014). Pada penelitian ini, gen Hd3a dibawah kendali
promoter rolC diintroduksikan kedalam genom kentang kultivar Kennebec.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk melakukan transformasi genetik kentang
(Solanum tuberosum L.) kultivar Kennebec dengan gen Hd3a di bawah kendali
promoter rolC.
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Januari sampai dengan September
2014 di Laboratorium Biotechnology Research Indonesia-The Netherlands
(BIORIN), dan Laboratorium Biologi Molekuler dan Seluler Tanaman (BMST) di
Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB), Lembaga
Penelitian dan Pengabdian kepada Masyarakat (LPPM), Institut Pertanian Bogor.
Bahan
Bahan yang digunakan berupa tanaman kentang kultivar Kennebec in vitro
yang digunakan sebagai bahan tanaman untuk transformasi genetik. Media
tumbuh MS (Murashige and Skoog 1962) (Lampiran 1) digunakan sebagai media
dasar kultur in vitro dan media MS yang mengandung higromisin sebagai media
seleksi. Agrobacterium tumefaciens galur LBA4404 yang mengandung plasmid
p2KI-Hd3a dan membawa gen Hd3a di bawah kendali promoter rolC (Tamaki et
al. 2007), digunakan untuk melakukan transformasi genetik. Gen Hd3a berasal
dari pemberian Prof. Ko Shimamoto (Nara Institute of Science & Technology,
Jepang). Peta fisik daerah T-DNA dari plasmid p2K1-Hd3a disajikan pada
Gambar 1.
3
LB
rolC
Kpn I
5’ UTR
Hind III
Xba I
Hd3a
Spe I
GFP NosT hpt
RB
Gambar 1 Peta daerah T-DNA yang mengandung gen Hd3a dan gen hpt di
dalam plasmid p2K1-Hd3a. LB: left border, RB: right border, rolC:
promoter dari Agrobacterium rhizogenes, Hd3a: gen heading date dari
padi, GFP: gen penanda Green Fluorescent Protein, hpt: gen
resistensi terhadap higromisin (Tamaki et al. 2007).
Metode
Perbanyakan tanaman in vitro. Tanaman kentang diperbanyak secara in
vitro dengan menggunakan stek buku (node) tunggal yang terdiri dari satu mata
tunas yang ditanam pada media MS (Murashige dan Skoog 1962) tanpa zat
pengatur tumbuh (MS0) dan MS2 makro yaitu MS yang mengandung dua kali
konsentrasi unsur hara makro ditambah 2 mg/L pantothenic acid selama 4
minggu. Eksplan ditumbuhkan di ruang kultur pada suhu 20 oC, dengan
pencahayaan 2000-3000 lux dan fotoperiode 16 jam.
Perbanyakan Agrobacterium tumefaciens. Agrobacterium tumefaciens
strain LBA4404 yang mengandung plasmid p2KI-Hd3a (Tamaki et al. 2007) yang
berasal dari stok gliserol dibiakkan di dalam media LB cair (1% tripton, 0,5%
yeast extract, 1% NaCl) yang mengandung 50 mg/L kanamisin dan 20 mg/L
rifampisin, digoyang dengan kecepatan 150 rpm di dalam ruang gelap pada suhu
28 oC. Sebanyak 100 µL dari biakan tersebut kemudian dibiakkan kembali di
dalam 10 mL media LB cair dengan kondisi yang sama dengan sebelumnya
hingga mencapai OD600=0.5-0.7.
Transformasi genetik kentang kultivar Kennebec. Transformasi
dilakukan melalui metode ko-kultivasi dengan menggunakan bantuan A.
tumefaciens. Sebelum ko-kultivasi, biakan A. tumefaciens disentrifugasi pada
kecepatan 5000 rpm selama 15 menit dan endapannya diresuspensi dengan media
ko-kultivasi cair (media MS yang mengandung 0,5 mg/L BAP dan 0,1 mg/L IAA)
hingga OD600 0.5-0.7. Eksplan ruas (internode) dengan ukuran 0.5 cm - 1 cm
direndam dalam A. tumefaciens OD600 0.5-0.7, digoyang dengan kecepatan 100
rpm pada suhu ruang selama 10 menit. Eksplan dikering anginkan dengan tisu
steril, kemudian eksplan ditanam di media ko-kultivasi selama 3 hari di ruang
gelap pada suhu 25 oC. Setelah itu eksplan dicuci dengan air steril dan cefotaxime
100 mg/L, kemudian ditanam di media induksi kalus yaitu MS yang mengandung
1 mg/L BAP selama 2 minggu. Kalus yang terbentuk kemudian ditanam di media
yang sama lalu ditambah dengan 20 mg/L higromisin sebagai agen seleksi selama
2 minggu. Kalus yang hidup ditanam di media regenerasi yaitu MS yang
mengandung 0.1 mg/L BAP dan 20 mg/L higromisin. Eksplan yang menghasilkan
kalus resisten higromisin dan kalus yang menghasilkan tunas transgenik putatif
4
dihitung untuk mengetahui efisiensi transformasi dan efisiensi regenerasinya.
Efisiensi transformasi dan regenerasi dihitung berdasarkan rumus yang disajikan
pada Lampiran 2.
Eksplan non-transgenik (kontrol) yang tidak ditransformasi dengan A.
tumefaciens ditanam dalam media yang tidak mengandung agen seleksi dan media
seleksi yang mengandung higromisin sebagai kontrol positif dan kontrol negatif.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Pembentukan kalus
Eksplan ruas yang diko-kultivasi dengan A. tumefaciens LBA4404 yang
mengandung plasmid p2K1-Hd3a mulai membentuk kalus pada minggu ke-2
(Gambar 2). Kalus terbentuk pada kedua ujung eksplan. Kalus yang ditanam di
media seleksi sebanyak 10 eksplan dan diperoleh hanya 2 kalus yang dapat
tumbuh karena resisten terhadap higromisin sehingga efisiensi transformasi pada
penelitian ini adalah 20%. Kedua kalus tersebut disebut sebagai kalus transgenik
putatif. Sedikitnya jumlah kalus yang ditanam di media seleksi ini karena
sebagian eksplan ruas mengalami kontaminasi pada saat ditanam di media induksi
kalus. Selain itu, kentang kultivar Kennebec sangat sulit untuk membentuk kalus,
sehingga tidak semua eksplan ruas dapat membentuk kalus untuk diseleksi.
Efisiensi transformasi pada penelitian ini lebih besar dibandingkan dengan
transformasi kentang kultivar Baraka dengan gen yang sama (Hd3a), yaitu
16.36% (Bustomi 2014) dan transformasi kentang kultivar Atlantik dengan gen
penyandi lisozim yaitu 16.67% (Manguntungi 2014), tetapi lebih kecil
dibandingkan dengan transformasi Jatropha curcas dengan gen Hd3a yaitu
26.67% (Sulistyaningsih 2012) dan Nicotiana benthamiana dengan gen Hd3a
yaitu 86% (Syafitri 2012). Perbedaan efisiensi transformasi ini disebabkan oleh
beberapa faktor antara lain genotipe tanaman, keefektifan asetosiringon, dan
kondisi pH media ko-kultivasi. Selain itu, persentase efisiensi transformasi juga
tergantung dari jumlah eksplan yang ditransformasi. Asetosiringon merupakan
senyawa kimia yang berfungsi sebagai inducer spesifik dari ekspresi gen vir.
Secara alami, pelukaan dapat menyebabkan sel tanaman menjadi rentan terhadap
Agrobacterium. Selain asetosiringon, ekspresi gen-gen vir juga sangat dipengaruhi
oleh pH. pH optimum untuk ekspresi gen-gen vir berkisar 5-5.8 (Wattimena
1992). Perlakuan fisik pada saat proses transformasi mulai dari pemotongan
eksplan, inokulasi eksplan dengan A. tumefaciens, pembilasan untuk membuang
A. tumefaciens yang menempel pada eksplan, dan perlakuan antibiotik cefotaxime
untuk membunuh A. tumefaciens juga dapat menyebabkan kematian sel dan
jaringan.
5
1 cm
Gambar 2 Kalus kentang kultivar Kennebec yang terbentuk di media induksi
kalus yang berumur 2 minggu setelah ko-kultivasi dengan A.
tumefaciens (tanda panah)
Pembentukan tunas transgenik putatif
Kalus yang resisten terhadap 20 mg/L higromisin beregenerasi untuk
membentuk tunas mulai umur 3 minggu setelah ditanam di media regenerasi yang
konsentrasi BAPnya diturunkan menjadi 0.1 mg/L. Penurunan konsentrasi BAP
ini penting agar kalus tidak tumbuh terus, tetapi mengalami diferensiasi
membentuk organ. Kedua kalus transgenik putatif ini menghasilkan dua tunas
transgenik putatif (Gambar 3) sehingga efisiensi regenerasi pada penelitian ini
100%. Setiap kalus hanya menghasilkan satu tunas transgenik putatif, sehingga
penelitian ini menghasilkan 2 tunas transgenik putatif yang merupakan galur
transgenik yang berbeda (independent transgenic line). Kedua tunas tersebut
kemudian dinamakan StK Hd3a-1 dan StK Hd3a-2.
1 cm
Gambar 3 Regenerasi tunas kentang kultivar Kennebec dari kalus transgenik
putatif yang berumur 3 minggu (tanda panah)
Regenerasi tanaman merupakan tahapan yang penting dalam transformasi.
Keberhasilan regenerasi tanaman secara in vitro dapat dipengaruhi oleh beberapa
faktor antara lain genotipe, media, lingkungan tumbuh dan fisiologi jaringan
tanaman sebagai eksplan (Wattimena 1992). Pada umumnya famili Solanaceae
mudah diregenerasikan walaupun memiliki daya regenerasi yang berbeda.
6
Efisiensi regenerasi kentang kultivar Kennebec ini sama dengan regenerasi
kentang kultivar Baraka yaitu sebesar 100% dari 19 kalus yang resisten
higromisin (Bustomi 2014), tetapi berbeda dengan kentang kultivar Atlantik dari
20 kalus yang tahan higromisin hanya 4 eksplan yang beregenerasi sehingga
didapatkan efisiensi regenerasi sebesar 20% (Manguntungi 2014).
Tunas transgenik putatif kentang kultivar Kennebec kemudian dipisahkan
dari kalusnya dan ditumbuhkan di media MS2 makro untuk membentuk akar yang
mengandung 20 mg/L higromisin sebagai agen seleksi. Kedua tunas transgenik
putatif dapat tumbuh baik di media tersebut dengan membentuk akar. Tunas nontransgenik kentang kultivar Kennebec juga ditumbuhkan di media yang sama
sebagai pembanding. Hasilnya, tunas non-transgenik tidak dapat tumbuh ditandai
dengan daunnya yang mengering karena mengalami klorosis dan sulit membentuk
akar (Gambar 4).
A
1 cm
B
1 cm
Gambar 4 Tunas kentang kultivar Kennebec yang diseleksi dengan media yang
mengandung 20 mg/L higromisin. (A) tunas transgenik, (B) tunas
non-transgenik yang daunnya mengalami klorosis (tanda panah)
Uji viabilitas eksplan digunakan untuk mengetahui eksplan viable pada
media seleksi yang mengandung 20 mg/L higromisin. Tunas kentang nontransgenik ditanam di media non-selektif yang tidak mengandung higromisin dan
media selektif yang mengandung higromisin. Tunas kentang non-transgenik yang
ditanam di media yang tidak mengandung higromisin tumbuh dengan baik dengan
membentuk daun dan akar sedangkan yang ditanam di media seleksi tidak dapat
membentuk daun dan akar setelah lima minggu (Gambar 5). Hal ini menunjukkan
bahwa tunas kentang non-transgenik mempunyai viabilitas yang baik dan 20 mg/L
higromisin dapat digunakan sebagai agen seleksi kentang transgenik kultivar
Kennebec yang mengandung gen penanda seleksi hpt. Konsentrasi 20 mg/L
higromisin juga digunakan untuk menyeleksi padi transgenik (Wardana 2014).
Pada kentang kultivar Atlantik, 10 mg/L higromisin dapat digunakan untuk
menyeleksi kentang transgenik (Manguntungi 2014), tetapi seleksi kentang
kultivar Baraka transgenik dilakukan dengan menggunakan 40 mg/L higromisin
(Bustomi 2014), dan seleksi Nicotiana benthamina transgenik dilakukan dengan
menggunakan 30 mg/L higromisin (Syafitri 2012; Senjaya 2013).
7
A
1 cm
B
1 cm
Gambar 5 Uji viabilitas tanaman kentang non-transgenik di media non selektif
dan media selektif. A= tunas di media non-selektif yang tidak
mengandung 20 mg/L higromisin, B= tunas di media selektif yang
mengandung 20 mg/L higromisin yang mengalami kematian yang
ditandai dengan daunnya yang mengering (tanda panah)
Resistensi terhadap higromisin dapat digunakan untuk menyeleksi tanaman
yang mengandung gen hpt. Penggunaan gen hpt sebagai gen penanda seleksi pada
transformasi genetik sangat penting untuk menyeleksi atau mendeteksi sel
transgenik, yang menandakan bahwa gen sudah berada di dalam sel tanaman.
Tanaman kentang yang mampu tumbuh dengan baik pada media seleksi
higromisin adalah tanaman transgenik yang mengandung gen hpt. Hal ini
menunjukkan bahwa tanaman kentang kultivar Kennebec telah berhasil
ditransformasi dengan gen hpt. Karena gen hpt pada plasmid p2KI-Hd3a terpaut
dengan gen Hd3a, maka tanaman transgenik yang resisten terhadap higromisin
juga mengandung gen Hd3a, sehingga transformasi tanaman kentang kultivar
Kennebec dengan gen Hd3a telah berhasil dilakukan.
Walaupun pada kentang kultivar Baraka, gen Hd3a dan promoter rolC yang
sama dapat menginduksi pembentukan umbi tanaman in vitro (Bustomi 2014)
tetapi pada penelitian ini tanaman kentang kultivar Kennebec transgenik putatif in
vitro belum sampai pada tahap pembungaan maupun pengumbian. Hal ini
kemungkinan disebabkan oleh belum cukup umur untuk berbunga dan berumbi
serta genotipe yang berbeda. Genotipe tanaman juga sangat berpengaruh terhadap
ekspresi suatu gen. Penelitian Navarro et al. (2011) menunjukkan bahwa gen
Hd3a dibawah kendali promoter rolC juga dapat menginduksi pembungaan dan
pembentukan umbi pada kentang kultivar Andigena. Kentang kultivar Andigena
dapat berbunga dan berumbi pada hari pendek tetapi tidak berbunga dan tidak
berumbi di hari panjang. Ekspresi berlebih gen Hd3a, menyebabkan kentang
Andigena dapat berbunga dan berumbi di hari panjang. Hal ini menunjukkan
bahwa Hd3a menginduksi pembungaan dan pembentukan umbi.
8
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Transformasi genetik kentang kultivar Kennebec dengan gen Hd3a telah
berhasil dilakukan dengan efisiensi transformasi 20% dan efisiensi regenerasi
sebesar 100%. Transformasi kentang kultivar Kennebec menghasilkan dua tunas
transgenik putatif yang tahan terhadap 20 mg/L higromisin. Karena gen hpt
dipautkan dengan gen Hd3a maka tanaman transgenik ini juga mengandung gen
Hd3a dibawah kendali promoter rolC.
Saran
Tanaman transgenik putatif perlu dianalisis secara molekuler untuk
mengetahui integrasi gen Hd3a. Tanaman transgenik perlu diaklimatisasi dan
ditanam di pot atau polybag untuk mengetahui pengaruh gen Hd3a terhadap
pembungaan dan pembentukan umbi.
UCAPAN TERIMA KASIH
Terima kasih disampaikan kepada Proyek Penelitian Desentralisasi Baru
IPB yang berjudul “Rekayasa genetika tanaman dengan gen toleransi aluminium
dan pembungaan” dengan kontrak no: 48/IT3.11/LT/2014 atas nama: Prof Dr Ir
Suharsono, DEA yang telah membiayai penelitian ini.
DAFTAR PUSTAKA
Andarwati AU. 2011. Efisiensi teknis usaha tani kentang dan faktor yang
mempengaruhi di Kecamatan Batur Kabupaten Banjarnegara [skripsi]. Bogor
(ID): Institut Pertanian Bogor.
Bustomi. 2014. Transformasi genetik kentang (Solanum tuberosum L.) kultivar
Baraka dengan gen pembungaan Hd3a [skripsi]. Bogor (ID): Institut
Pertanian Bogor.
Hawkes JG. 1990. The potato, evolution, biodiversity, and genetic resources.
London (GB): Balhaven Press.
Kojima et al. 2002. Hd3a, a rice ortholog of the arabidopsis FT gene, promotes
transition to flowering downstream of Hd1 under short-day conditions. Plant
Cell Physiol. 43:1096–1105.
Komiya R, Ikegami A, Tamaki S, Yokoi S, Shimamoto K. 2008. Hd3a and RFT1
are essential for flowering in rice. Development. 135:767-774.
Li M, Li H, Hu X. 2011. Genetic transformation and overexpression of a rice
Hd3a induces early flowering in Saussurea involucrata Kar.et Kir. ex Maxim.
Plant Cell Tiss Org. 106:363-371.
9
Manguntungi B. 2014. Transformasi genetik kentang (Solanum tuberosum)
kultivar Atlantik dengan gen penyandi lisozim melalui perantara
Agrobacterium tumefaciens [tesis]. Bogor (ID): Sekolah pascasarjana, IPB.
Monna L, Lin H.X, Kojima S, Sasaki T, Yano M. 2002. Genetic dissection of a
genomic region for A quantitative trait locus, Hd3, into two loci, Hd3a and
Hd3b, controlling heading date in rice. Theor Appl Ganet. 104:772-778.
Murashige T, Skoog F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays
with tobacco culture. Physiol Plantarum. 15:473-497.
Navarro C, Abelanda JA, Cruz EO, Carlos A, Tamaki S, Silva J, Shimamoto K,
Prat S. 2011. Control of flowering and storage organ formation in potato by
flowering locus T. Nature. 478: 119-123. doi: 10.1038/nature10431.
Sahat S. 1991. Pengaruh cara stimulasi perbungaan terhadap produksi bunga,
buah, dan biji beberapa kultivar kentang (Solanum tuberosum L.). Bull Penel
Hort. 20(4):105-111.
Senjaya SK. 2013. Pewarisan genetik transgen Hd3a pada tanaman Nicotiana
benthamiana transgenik [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Smith O. 1968. Potatoes: production, storing, processing. London (GB): Avi
Publishing Company.
Sulistyaningsih YC. 2012. Rekayasa ekspresi gen pembungaan Hd3a pada
tanaman jarak pagar (Jatropha curcas L.) [disertasi]. Bogor (ID): Sekolah
Pascasarjana, IPB.
Syafitri LN. 2012. Transformasi genetik Nicotiana benthamiana dengan gen
pembungaan Hd3a dari padi [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Tamaki S, Matsuo S, Wong H, Yokoi S, Shimamoto K. 2007. Hd3a protein is a
mobile flowering signal in rice. Science. 36:1033-1036.
Wardana R. 2014. Transformasi genetik padi (Oryza sativa L.) dengan gen PaCS
penyandi sitrat sintase menggunakan perantara Agrobacterium tumefaciens
[tesis]. Bogor (ID): Sekolah Pascasarjana, IPB.
Wattimena GA. 1992. Bioteknologi Tanaman I. Bogor (ID): Pusat Antar
Universitas Biotekhnologi IPB.
10
Lampiran 1 Komposisi Media MS (Murashige dan Skoog 1962)
Bahan
NH4NO3
KNO3
KH2PO4
H3BO3
Na2MoO4.2H2O
CoCl2.6H2O
KI
CaCl2.2H2O
MgSO4.7H2O
MnSO4.4H2O
ZnSO4.7H2O
CuSO4.5H2O
Na2EDTA
FeSO4.7H2O
Thiamine-HCl
Niacin (asam
nikotinat)
Pyridoxine-HCl
Glycine
Myo inositol
Gula pasir
Agar
Konsentrasi
Senyawa dalam
media (mg/L)
1650
1900
170
6.2
0.25
0.025
0.83
440
370
22.3
8.6
0.025
37.3
27.8
0.1
0.5
0.5
2.0
100
30 g/L
8 g/L
11
Lampiran 2 Perhitungan persentase efisiensi transformasi dan efisiensi regenerasi
% efisiensi transformasi =
ℎ
% efisiensi regenerasi =
ℎ
�
ℎ
�
ℎ
ℎ
X
X 100%
%
12
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 1 Juni 1992 dari ayah Hoesni
dan ibu Nunung Kartini. Penulis merupakan anak pertama dari tiga bersaudara.
Penulis lulus dari SMA Negeri 74 Jakarta pada tahun 2010. Pada tahun yang sama
penulis lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB
(USMI) dan diterima pada program studi Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam (FMIPA).
Selama mengikuti perkuliahan, penulis aktif di Himpunan Mahasiswa
Biologi (HIMABIO) sebagai staf divisi Observasi Wahana Alam (OWA) pada
tahun 2012/2013 dan 2013/2014. Penulis pernah menjadi asisten praktikum mata
kuliah Biologi Dasar Tingkat Persiapan Bersama pada tahun 2013 dan 2014, serta
asisten praktikum Pengantar Genetika Molekuler pada tahun 2014. Penulis pernah
melaksanakan studi lapang di Taman Nasional Gunung Gede Pangarango Jawa
Barat pada tahun 2012, dengan judul makalah “Epitifikasi Cendawan pada
Serasah Bambu di Kebun Raya Cibodas”. Penulis juga pernah melaksanakan
praktik lapangan di Balai Penelitian Tanaman Padi Kebun Percobaan Muara,
Bogor pada bulan Juli-Agustus 2013, dengan judul makalah “Ketahanan Galur
Padi Hibrida Terhadap Wereng Batang Coklat (Nilaparvata lugens Stal.)”.
(Solanum tuberosum L.) KULTIVAR KENNEBEC DENGAN
GEN Hd3a
EKA MAULANI
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Transformasi Genetik
Kentang (Solanum tuberosum L.) Kultivar Kennebec dengan Gen Hd3a adalah
benar karya bersama saya dan komisi pembimbing dan belum diajukan dalam
bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang
berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari
penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di
bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Pebruari 2015
Eka Maulani
NIM G34100043
ABSTRAK
Eka Maulani. Transformasi Genetik Kentang (Solanum tuberosum L.) Kultivar
Kennebec dengan Gen Hd3a. Dibimbing oleh SUHARSONO dan UTUT
WIDYASTUTI.
Kentang merupakan salah satu tanaman hortikultura yang ditanam secara
luas di dunia. Kentang mengandung karbohidrat yang tinggi dan asam amino
esensial yang baik untuk nutrisi manusia sehingga dapat digunakan sebagai salah
satu bahan diversifikasi pangan. Pembungaan sangat penting untuk perakitan
varietas baru melalui persilangan seksual. Hd3a dapat menginduksi pembungaan
pada beberapa spesies dan menginduksi pembentukan umbi pada kentang kultivar
Andigena. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk melakukan transformasi genetik
kentang (Solanum tuberosum L.) kultivar Kennebec dengan gen Hd3a dibawah
kendali promoter rolC. Transformasi genetik dilakukan melalui bantuan
Agrobacterium tumefaciens LBA4404 yang mengandung plasmid p2KI-Hd3a
dengan metode ko-kultivasi. Ruas tanaman digunakan sebagai eksplan. Seleksi
terhadap kalus dan tunas transgenik putatif dilakukan dengan media MS 20 mg/L
higromisin. Hasil penelitian menunjukkan bahwa transformasi terhadap kentang
kultivar Kennebec menghasilkan efisiensi transformasi sebesar 20%, sedangkan
efisiensi regenerasi sebesar 100%. Penelitian ini menghasilkan dua tunas
transgenik putatif.
Kata kunci: Hd3a, kultivar Kennebec, Solanum tuberosum L., transformasi
genetik
ABSTRACT
Eka Maulani. Genetical Transformation of Potato (Solanum tuberosum L.)
Kennebec Cultivar with Hd3a Gene. Supervised by SUHARSONO and UTUT
WIDYASTUTI.
Potato is one of the most important horticultural crops. This commodity is
cultivated in many area in the world. It contains high carbohydrate and essential
amino acid which are important nutrition for human, so it can be used for food
diversification. Flowering has an important role in the creation of new varieties
through sexual crossing. Hd3a induces flowering in several species and tuber
formation of potato cultivar Andigena. The objective of this research was to
transform genetically the potato (Solanum tuberosum L.) cultivar Kennebec with
Hd3a gene under the control of rolC promoter. Transformation of potato was
done by using Agrobacterium tumefaciens LBA4404 containing p2KI-Hd3a
plasmid by co-cultivation method using internodes as explants. Putative
transgenic calli and shoots were selected in the MS medium containing 20 mg/L
of hygromycin. The efficiency of transformation was 20 % and the efficiency of
regeneration of putative transgenic shoot was 100%. This research resulted two
putative transgenic shoots.
Keywords: Cultivar Kennebec, genetic transformation, Hd3a, Solanum tuberosum
L.
TRANSFORMASI GENETIK KENTANG
(Solanum tuberosum L.) KULTIVAR KENNEBEC DENGAN
GEN Hd3a
EKA MAULANI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Penelitian ini
berjudul Transformasi Genetik Kentang (Solanum tuberosum L.) Kultivar
Kennebec dengan Gen Hd3a. Penelitian dilaksanakan sejak bulan Januari sampai
dengan September 2014.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Prof Dr Ir Suharsono, DEA dan Dr Ir
Utut Widyastuti, MSi selaku pembimbing atas bimbingan, saran, dan ilmu yang
bermanfaat selama melaksanakan penelitian ini. Terima kasih kepada Dr Berry
Juliandi, MSi selaku penguji atas saran dan masukan pada tulisan ini. Terima
kasih kepada Kepala Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi
LPPM IPB beserta seluruh staf dan jajarannya atas sarana, prasarana, dan
bantuannya selama penulis melakukan penelitian di laboratorium BIORIN dan
Biologi Molekuler Seluler Tanaman. Penulis juga menyampaikan terima kasih
kepada Nia Dahniar SP, Pepi Elvavina, Abdul Mulya, Sairi, Yulianto, Sarah, Asep
Saripudin atas bantuan dan masukannya. Terima kasih kepada rekan-rekan
seperjuangan yaitu Bustomi, Ika, Ica, Lisa, Ina, Dwika, Aditya, Carin, Kak Isni,
Mas Ari, Mas Baso, Mas Rudi, Kak Destik, Kak Effa, Kak Wiwin, Kak Fajri, dan
Kak Tiwi atas ilmu, bimbingan, dan kerjasama yang diberikan. Terima kasih pula
untuk seluruh teman-teman Biologi 47, OWA 13, rekan-rekan seperjuangan di
Pondok Pink Muss (Rahma, Wulan dan Indah) atas segala masukan dan
semangatnya. Ungkapan terima kasih yang tak terhingga penulis sampaikan
kepada keluarga tercinta khususnya kepada ibunda dan ayahanda, Hoesni dan
Nunung Kartini, adik-adikku yang tersayang Akhyat Maulana dan Akmal Firdausi
atas segala do’a, dukungan dan kasih sayang yang telah diberikan.
Akhir kata, penulis berharap agar karya ilmiah ini dapat bermanfaat dan
dapat memberikan sumbangan bagi perkembangan ilmu pengetahuan.
Bogor, Pebruari 2015
Eka Maulani
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
PENDAHULUAN
1
Latar Belakang
1
Tujuan Penelitian
2
BAHAN DAN METODE
2
Waktu dan Tempat
2
Bahan
2
Metode
3
Perbanyakan tanaman in vitro
3
Perbanyakan Agrobacterium tumefaciens
3
Transformasi genetik kentang kultivar Kennebec
3
HASIL DAN PEMBAHASAN
4
Pembentukan kalus
4
Pembentukan tunas transgenik putatif
5
SIMPULAN DAN SARAN
8
Simpulan
8
Saran
8
UCAPAN TERIMA KASIH
8
DAFTAR PUSTAKA
8
LAMPIRAN
10
RIWAYAT HIDUP
12
DAFTAR GAMBAR
1 Peta daerah T-DNA yang mengandung gen Hd3a dan gen hpt didalam
plasmid p2KI-Hd3a
2 Kalus kentang kultivar Kennebec yang terbentuk di media induksi
kalus yang berumur 2 minggu setelah ko-kultivasi dengan A.
tumefaciens
3 Regenerasi tunas kentang kultivar Kennebec dari kalus transgenik
putatif yang berumur 3 minggu
4 Tunas kentang kultivar Kennebec yang diseleksi dengan media yang
mengandung 20 mg/L higromisin
5 Uji viabilitas tanaman kentang non-transgenik di media non selektif
dan media selektif
3
5
5
6
7
DAFTAR LAMPIRAN
1 Komposisi Media MS (Murashige dan Skoog 1962)
2 Perhitungan persentase efisiensi transformasi dan efisiensi regenerasi
10
11
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Hortikultura merupakan bagian dari sektor pertanian yang terdiri atas
sayuran, buah-buahan, dan tanaman hias. Hortikultura menjadi sektor yang sangat
penting bagi pertanian, karena mempunyai nilai ekonomi yang tinggi. Komoditas
hortikultura, khususnya sayuran dan buah-buahan berperan penting dalam
pemenuhan kebutuhan pangan manusia. Kentang merupakan salah satu komoditas
hortikultura yang penting untuk pangan. Di Indonesia kentang termasuk kedalam
35 komoditas unggulan nasional yang mendapat prioritas pengembangan oleh
pemerintah. Kentang merupakan tanaman sayuran musiman yang berbentuk
semak dan perdu, serta berumur pendek (Andarwati 2011). Tanaman ini berasal
dari Amerika Selatan (Peru, Chili, Bolivia, dan Argentina) dan beberapa daerah di
Amerika Tengah (Hawkes 1990).
Kentang mengandung karbohidrat yang tinggi dan asam amino esensial
yang baik untuk nutrisi manusia. Cuaca sangat berpengaruh terhadap tanaman
kentang. Suhu rendah (15-20oC), kelembaban udara tinggi dan sinar matahari
yang cukup, serta sedikit hujan merupakan syarat yang baik untuk pertumbuhan,
pembungaan dan pembentukan umbi (Sahat 1991).
Bunga mempunyai peranan yang sangat penting dalam perakitan varietas
baru melalui persilangan. Kentang kultivar Kennebec mempunyai karakteristik
yang sangat cocok sebagai kentang olahan khususnya french fries, sehingga
kultivar ini sangat potensial dijadikan sebagai sumber gen dan disilangkan dengan
kultivar lainnya. Tanaman kentang kultivar Kennebec dikembangkan oleh
Departemen Pertanian Amerika Serikat dan dilepas pada tahun 1948 dari
persilangan USDA 127x96-56. Kentang kultivar Kennebec memiliki batang yang
panjang dan lebar, serta daun yang berwarna hijau gelap dan umbi yang berbentuk
lonjong (Smith 1968).
Pembungaan merupakan hasil transisi pucuk meristem tanaman dari fase
vegetatif ke fase reproduktif. Pertumbuhan bunga suatu jenis tanaman sangat
dipengaruhi oleh lama penyinaran yang diperoleh ditempat tumbuhnya. Untuk
menghasilkan bunga, tanaman kentang memerlukan panjang hari sekitar 16-18
jam (Sahat 1991).
Gen Hd3a menyandi suatu protein yang menginduksi gen-gen pembungaan.
Gen Hd3a pertama kali diidentifikasi sebagai quantitative trait locus (QTL) yang
proteinnya menginduksi pembungaan padi dibawah kondisi hari pendek (Monna
et al. 2002). Ekspresi berlebihan (over expression) gen Hd3a dengan promoter
konstitutif (Kojima et al. 2002) atau promoter spesifik (Tamaki et al. 2007)
menghasilkan pembungaan dini. Supresi Hd3a dengan RNA interference (RNAi)
menunda pembungaan (Komiya et al. 2008). Hal ini menunjukkan bahwa Hd3a
berperan penting dalam menginduksi pembungaan.
Penemuan gen pembungaan ini memungkinkan dilakukannya rekayasa
genetik untuk berbagai keperluan. Tanaman transgenik yang mengandung gen
Hd3a sampai saat ini telah mampu untuk menginduksi pembungaan pada
beberapa spesies seperti Saussurea involucrate (Li et al. 2011), Jatropha curcas
L. (Sulistyaningsih 2012) dan Nicotiana benthamiana (Syafitri 2012; Senjaya
2
2013). Selain menginduksi pembentukan bunga, Hd3a juga menginduksi
pembentukan umbi pada kentang kultivar Andigena (Navarro et al. 2011).
Introduksi gen Hd3a kedalam kentang kultivar Baraka telah menghasilkan
tanaman transgenik putatif yang berumbi lebih awal dari pada tanaman nontransgenik (Bustomi 2014). Pada penelitian ini, gen Hd3a dibawah kendali
promoter rolC diintroduksikan kedalam genom kentang kultivar Kennebec.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk melakukan transformasi genetik kentang
(Solanum tuberosum L.) kultivar Kennebec dengan gen Hd3a di bawah kendali
promoter rolC.
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Januari sampai dengan September
2014 di Laboratorium Biotechnology Research Indonesia-The Netherlands
(BIORIN), dan Laboratorium Biologi Molekuler dan Seluler Tanaman (BMST) di
Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB), Lembaga
Penelitian dan Pengabdian kepada Masyarakat (LPPM), Institut Pertanian Bogor.
Bahan
Bahan yang digunakan berupa tanaman kentang kultivar Kennebec in vitro
yang digunakan sebagai bahan tanaman untuk transformasi genetik. Media
tumbuh MS (Murashige and Skoog 1962) (Lampiran 1) digunakan sebagai media
dasar kultur in vitro dan media MS yang mengandung higromisin sebagai media
seleksi. Agrobacterium tumefaciens galur LBA4404 yang mengandung plasmid
p2KI-Hd3a dan membawa gen Hd3a di bawah kendali promoter rolC (Tamaki et
al. 2007), digunakan untuk melakukan transformasi genetik. Gen Hd3a berasal
dari pemberian Prof. Ko Shimamoto (Nara Institute of Science & Technology,
Jepang). Peta fisik daerah T-DNA dari plasmid p2K1-Hd3a disajikan pada
Gambar 1.
3
LB
rolC
Kpn I
5’ UTR
Hind III
Xba I
Hd3a
Spe I
GFP NosT hpt
RB
Gambar 1 Peta daerah T-DNA yang mengandung gen Hd3a dan gen hpt di
dalam plasmid p2K1-Hd3a. LB: left border, RB: right border, rolC:
promoter dari Agrobacterium rhizogenes, Hd3a: gen heading date dari
padi, GFP: gen penanda Green Fluorescent Protein, hpt: gen
resistensi terhadap higromisin (Tamaki et al. 2007).
Metode
Perbanyakan tanaman in vitro. Tanaman kentang diperbanyak secara in
vitro dengan menggunakan stek buku (node) tunggal yang terdiri dari satu mata
tunas yang ditanam pada media MS (Murashige dan Skoog 1962) tanpa zat
pengatur tumbuh (MS0) dan MS2 makro yaitu MS yang mengandung dua kali
konsentrasi unsur hara makro ditambah 2 mg/L pantothenic acid selama 4
minggu. Eksplan ditumbuhkan di ruang kultur pada suhu 20 oC, dengan
pencahayaan 2000-3000 lux dan fotoperiode 16 jam.
Perbanyakan Agrobacterium tumefaciens. Agrobacterium tumefaciens
strain LBA4404 yang mengandung plasmid p2KI-Hd3a (Tamaki et al. 2007) yang
berasal dari stok gliserol dibiakkan di dalam media LB cair (1% tripton, 0,5%
yeast extract, 1% NaCl) yang mengandung 50 mg/L kanamisin dan 20 mg/L
rifampisin, digoyang dengan kecepatan 150 rpm di dalam ruang gelap pada suhu
28 oC. Sebanyak 100 µL dari biakan tersebut kemudian dibiakkan kembali di
dalam 10 mL media LB cair dengan kondisi yang sama dengan sebelumnya
hingga mencapai OD600=0.5-0.7.
Transformasi genetik kentang kultivar Kennebec. Transformasi
dilakukan melalui metode ko-kultivasi dengan menggunakan bantuan A.
tumefaciens. Sebelum ko-kultivasi, biakan A. tumefaciens disentrifugasi pada
kecepatan 5000 rpm selama 15 menit dan endapannya diresuspensi dengan media
ko-kultivasi cair (media MS yang mengandung 0,5 mg/L BAP dan 0,1 mg/L IAA)
hingga OD600 0.5-0.7. Eksplan ruas (internode) dengan ukuran 0.5 cm - 1 cm
direndam dalam A. tumefaciens OD600 0.5-0.7, digoyang dengan kecepatan 100
rpm pada suhu ruang selama 10 menit. Eksplan dikering anginkan dengan tisu
steril, kemudian eksplan ditanam di media ko-kultivasi selama 3 hari di ruang
gelap pada suhu 25 oC. Setelah itu eksplan dicuci dengan air steril dan cefotaxime
100 mg/L, kemudian ditanam di media induksi kalus yaitu MS yang mengandung
1 mg/L BAP selama 2 minggu. Kalus yang terbentuk kemudian ditanam di media
yang sama lalu ditambah dengan 20 mg/L higromisin sebagai agen seleksi selama
2 minggu. Kalus yang hidup ditanam di media regenerasi yaitu MS yang
mengandung 0.1 mg/L BAP dan 20 mg/L higromisin. Eksplan yang menghasilkan
kalus resisten higromisin dan kalus yang menghasilkan tunas transgenik putatif
4
dihitung untuk mengetahui efisiensi transformasi dan efisiensi regenerasinya.
Efisiensi transformasi dan regenerasi dihitung berdasarkan rumus yang disajikan
pada Lampiran 2.
Eksplan non-transgenik (kontrol) yang tidak ditransformasi dengan A.
tumefaciens ditanam dalam media yang tidak mengandung agen seleksi dan media
seleksi yang mengandung higromisin sebagai kontrol positif dan kontrol negatif.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Pembentukan kalus
Eksplan ruas yang diko-kultivasi dengan A. tumefaciens LBA4404 yang
mengandung plasmid p2K1-Hd3a mulai membentuk kalus pada minggu ke-2
(Gambar 2). Kalus terbentuk pada kedua ujung eksplan. Kalus yang ditanam di
media seleksi sebanyak 10 eksplan dan diperoleh hanya 2 kalus yang dapat
tumbuh karena resisten terhadap higromisin sehingga efisiensi transformasi pada
penelitian ini adalah 20%. Kedua kalus tersebut disebut sebagai kalus transgenik
putatif. Sedikitnya jumlah kalus yang ditanam di media seleksi ini karena
sebagian eksplan ruas mengalami kontaminasi pada saat ditanam di media induksi
kalus. Selain itu, kentang kultivar Kennebec sangat sulit untuk membentuk kalus,
sehingga tidak semua eksplan ruas dapat membentuk kalus untuk diseleksi.
Efisiensi transformasi pada penelitian ini lebih besar dibandingkan dengan
transformasi kentang kultivar Baraka dengan gen yang sama (Hd3a), yaitu
16.36% (Bustomi 2014) dan transformasi kentang kultivar Atlantik dengan gen
penyandi lisozim yaitu 16.67% (Manguntungi 2014), tetapi lebih kecil
dibandingkan dengan transformasi Jatropha curcas dengan gen Hd3a yaitu
26.67% (Sulistyaningsih 2012) dan Nicotiana benthamiana dengan gen Hd3a
yaitu 86% (Syafitri 2012). Perbedaan efisiensi transformasi ini disebabkan oleh
beberapa faktor antara lain genotipe tanaman, keefektifan asetosiringon, dan
kondisi pH media ko-kultivasi. Selain itu, persentase efisiensi transformasi juga
tergantung dari jumlah eksplan yang ditransformasi. Asetosiringon merupakan
senyawa kimia yang berfungsi sebagai inducer spesifik dari ekspresi gen vir.
Secara alami, pelukaan dapat menyebabkan sel tanaman menjadi rentan terhadap
Agrobacterium. Selain asetosiringon, ekspresi gen-gen vir juga sangat dipengaruhi
oleh pH. pH optimum untuk ekspresi gen-gen vir berkisar 5-5.8 (Wattimena
1992). Perlakuan fisik pada saat proses transformasi mulai dari pemotongan
eksplan, inokulasi eksplan dengan A. tumefaciens, pembilasan untuk membuang
A. tumefaciens yang menempel pada eksplan, dan perlakuan antibiotik cefotaxime
untuk membunuh A. tumefaciens juga dapat menyebabkan kematian sel dan
jaringan.
5
1 cm
Gambar 2 Kalus kentang kultivar Kennebec yang terbentuk di media induksi
kalus yang berumur 2 minggu setelah ko-kultivasi dengan A.
tumefaciens (tanda panah)
Pembentukan tunas transgenik putatif
Kalus yang resisten terhadap 20 mg/L higromisin beregenerasi untuk
membentuk tunas mulai umur 3 minggu setelah ditanam di media regenerasi yang
konsentrasi BAPnya diturunkan menjadi 0.1 mg/L. Penurunan konsentrasi BAP
ini penting agar kalus tidak tumbuh terus, tetapi mengalami diferensiasi
membentuk organ. Kedua kalus transgenik putatif ini menghasilkan dua tunas
transgenik putatif (Gambar 3) sehingga efisiensi regenerasi pada penelitian ini
100%. Setiap kalus hanya menghasilkan satu tunas transgenik putatif, sehingga
penelitian ini menghasilkan 2 tunas transgenik putatif yang merupakan galur
transgenik yang berbeda (independent transgenic line). Kedua tunas tersebut
kemudian dinamakan StK Hd3a-1 dan StK Hd3a-2.
1 cm
Gambar 3 Regenerasi tunas kentang kultivar Kennebec dari kalus transgenik
putatif yang berumur 3 minggu (tanda panah)
Regenerasi tanaman merupakan tahapan yang penting dalam transformasi.
Keberhasilan regenerasi tanaman secara in vitro dapat dipengaruhi oleh beberapa
faktor antara lain genotipe, media, lingkungan tumbuh dan fisiologi jaringan
tanaman sebagai eksplan (Wattimena 1992). Pada umumnya famili Solanaceae
mudah diregenerasikan walaupun memiliki daya regenerasi yang berbeda.
6
Efisiensi regenerasi kentang kultivar Kennebec ini sama dengan regenerasi
kentang kultivar Baraka yaitu sebesar 100% dari 19 kalus yang resisten
higromisin (Bustomi 2014), tetapi berbeda dengan kentang kultivar Atlantik dari
20 kalus yang tahan higromisin hanya 4 eksplan yang beregenerasi sehingga
didapatkan efisiensi regenerasi sebesar 20% (Manguntungi 2014).
Tunas transgenik putatif kentang kultivar Kennebec kemudian dipisahkan
dari kalusnya dan ditumbuhkan di media MS2 makro untuk membentuk akar yang
mengandung 20 mg/L higromisin sebagai agen seleksi. Kedua tunas transgenik
putatif dapat tumbuh baik di media tersebut dengan membentuk akar. Tunas nontransgenik kentang kultivar Kennebec juga ditumbuhkan di media yang sama
sebagai pembanding. Hasilnya, tunas non-transgenik tidak dapat tumbuh ditandai
dengan daunnya yang mengering karena mengalami klorosis dan sulit membentuk
akar (Gambar 4).
A
1 cm
B
1 cm
Gambar 4 Tunas kentang kultivar Kennebec yang diseleksi dengan media yang
mengandung 20 mg/L higromisin. (A) tunas transgenik, (B) tunas
non-transgenik yang daunnya mengalami klorosis (tanda panah)
Uji viabilitas eksplan digunakan untuk mengetahui eksplan viable pada
media seleksi yang mengandung 20 mg/L higromisin. Tunas kentang nontransgenik ditanam di media non-selektif yang tidak mengandung higromisin dan
media selektif yang mengandung higromisin. Tunas kentang non-transgenik yang
ditanam di media yang tidak mengandung higromisin tumbuh dengan baik dengan
membentuk daun dan akar sedangkan yang ditanam di media seleksi tidak dapat
membentuk daun dan akar setelah lima minggu (Gambar 5). Hal ini menunjukkan
bahwa tunas kentang non-transgenik mempunyai viabilitas yang baik dan 20 mg/L
higromisin dapat digunakan sebagai agen seleksi kentang transgenik kultivar
Kennebec yang mengandung gen penanda seleksi hpt. Konsentrasi 20 mg/L
higromisin juga digunakan untuk menyeleksi padi transgenik (Wardana 2014).
Pada kentang kultivar Atlantik, 10 mg/L higromisin dapat digunakan untuk
menyeleksi kentang transgenik (Manguntungi 2014), tetapi seleksi kentang
kultivar Baraka transgenik dilakukan dengan menggunakan 40 mg/L higromisin
(Bustomi 2014), dan seleksi Nicotiana benthamina transgenik dilakukan dengan
menggunakan 30 mg/L higromisin (Syafitri 2012; Senjaya 2013).
7
A
1 cm
B
1 cm
Gambar 5 Uji viabilitas tanaman kentang non-transgenik di media non selektif
dan media selektif. A= tunas di media non-selektif yang tidak
mengandung 20 mg/L higromisin, B= tunas di media selektif yang
mengandung 20 mg/L higromisin yang mengalami kematian yang
ditandai dengan daunnya yang mengering (tanda panah)
Resistensi terhadap higromisin dapat digunakan untuk menyeleksi tanaman
yang mengandung gen hpt. Penggunaan gen hpt sebagai gen penanda seleksi pada
transformasi genetik sangat penting untuk menyeleksi atau mendeteksi sel
transgenik, yang menandakan bahwa gen sudah berada di dalam sel tanaman.
Tanaman kentang yang mampu tumbuh dengan baik pada media seleksi
higromisin adalah tanaman transgenik yang mengandung gen hpt. Hal ini
menunjukkan bahwa tanaman kentang kultivar Kennebec telah berhasil
ditransformasi dengan gen hpt. Karena gen hpt pada plasmid p2KI-Hd3a terpaut
dengan gen Hd3a, maka tanaman transgenik yang resisten terhadap higromisin
juga mengandung gen Hd3a, sehingga transformasi tanaman kentang kultivar
Kennebec dengan gen Hd3a telah berhasil dilakukan.
Walaupun pada kentang kultivar Baraka, gen Hd3a dan promoter rolC yang
sama dapat menginduksi pembentukan umbi tanaman in vitro (Bustomi 2014)
tetapi pada penelitian ini tanaman kentang kultivar Kennebec transgenik putatif in
vitro belum sampai pada tahap pembungaan maupun pengumbian. Hal ini
kemungkinan disebabkan oleh belum cukup umur untuk berbunga dan berumbi
serta genotipe yang berbeda. Genotipe tanaman juga sangat berpengaruh terhadap
ekspresi suatu gen. Penelitian Navarro et al. (2011) menunjukkan bahwa gen
Hd3a dibawah kendali promoter rolC juga dapat menginduksi pembungaan dan
pembentukan umbi pada kentang kultivar Andigena. Kentang kultivar Andigena
dapat berbunga dan berumbi pada hari pendek tetapi tidak berbunga dan tidak
berumbi di hari panjang. Ekspresi berlebih gen Hd3a, menyebabkan kentang
Andigena dapat berbunga dan berumbi di hari panjang. Hal ini menunjukkan
bahwa Hd3a menginduksi pembungaan dan pembentukan umbi.
8
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Transformasi genetik kentang kultivar Kennebec dengan gen Hd3a telah
berhasil dilakukan dengan efisiensi transformasi 20% dan efisiensi regenerasi
sebesar 100%. Transformasi kentang kultivar Kennebec menghasilkan dua tunas
transgenik putatif yang tahan terhadap 20 mg/L higromisin. Karena gen hpt
dipautkan dengan gen Hd3a maka tanaman transgenik ini juga mengandung gen
Hd3a dibawah kendali promoter rolC.
Saran
Tanaman transgenik putatif perlu dianalisis secara molekuler untuk
mengetahui integrasi gen Hd3a. Tanaman transgenik perlu diaklimatisasi dan
ditanam di pot atau polybag untuk mengetahui pengaruh gen Hd3a terhadap
pembungaan dan pembentukan umbi.
UCAPAN TERIMA KASIH
Terima kasih disampaikan kepada Proyek Penelitian Desentralisasi Baru
IPB yang berjudul “Rekayasa genetika tanaman dengan gen toleransi aluminium
dan pembungaan” dengan kontrak no: 48/IT3.11/LT/2014 atas nama: Prof Dr Ir
Suharsono, DEA yang telah membiayai penelitian ini.
DAFTAR PUSTAKA
Andarwati AU. 2011. Efisiensi teknis usaha tani kentang dan faktor yang
mempengaruhi di Kecamatan Batur Kabupaten Banjarnegara [skripsi]. Bogor
(ID): Institut Pertanian Bogor.
Bustomi. 2014. Transformasi genetik kentang (Solanum tuberosum L.) kultivar
Baraka dengan gen pembungaan Hd3a [skripsi]. Bogor (ID): Institut
Pertanian Bogor.
Hawkes JG. 1990. The potato, evolution, biodiversity, and genetic resources.
London (GB): Balhaven Press.
Kojima et al. 2002. Hd3a, a rice ortholog of the arabidopsis FT gene, promotes
transition to flowering downstream of Hd1 under short-day conditions. Plant
Cell Physiol. 43:1096–1105.
Komiya R, Ikegami A, Tamaki S, Yokoi S, Shimamoto K. 2008. Hd3a and RFT1
are essential for flowering in rice. Development. 135:767-774.
Li M, Li H, Hu X. 2011. Genetic transformation and overexpression of a rice
Hd3a induces early flowering in Saussurea involucrata Kar.et Kir. ex Maxim.
Plant Cell Tiss Org. 106:363-371.
9
Manguntungi B. 2014. Transformasi genetik kentang (Solanum tuberosum)
kultivar Atlantik dengan gen penyandi lisozim melalui perantara
Agrobacterium tumefaciens [tesis]. Bogor (ID): Sekolah pascasarjana, IPB.
Monna L, Lin H.X, Kojima S, Sasaki T, Yano M. 2002. Genetic dissection of a
genomic region for A quantitative trait locus, Hd3, into two loci, Hd3a and
Hd3b, controlling heading date in rice. Theor Appl Ganet. 104:772-778.
Murashige T, Skoog F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays
with tobacco culture. Physiol Plantarum. 15:473-497.
Navarro C, Abelanda JA, Cruz EO, Carlos A, Tamaki S, Silva J, Shimamoto K,
Prat S. 2011. Control of flowering and storage organ formation in potato by
flowering locus T. Nature. 478: 119-123. doi: 10.1038/nature10431.
Sahat S. 1991. Pengaruh cara stimulasi perbungaan terhadap produksi bunga,
buah, dan biji beberapa kultivar kentang (Solanum tuberosum L.). Bull Penel
Hort. 20(4):105-111.
Senjaya SK. 2013. Pewarisan genetik transgen Hd3a pada tanaman Nicotiana
benthamiana transgenik [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Smith O. 1968. Potatoes: production, storing, processing. London (GB): Avi
Publishing Company.
Sulistyaningsih YC. 2012. Rekayasa ekspresi gen pembungaan Hd3a pada
tanaman jarak pagar (Jatropha curcas L.) [disertasi]. Bogor (ID): Sekolah
Pascasarjana, IPB.
Syafitri LN. 2012. Transformasi genetik Nicotiana benthamiana dengan gen
pembungaan Hd3a dari padi [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Tamaki S, Matsuo S, Wong H, Yokoi S, Shimamoto K. 2007. Hd3a protein is a
mobile flowering signal in rice. Science. 36:1033-1036.
Wardana R. 2014. Transformasi genetik padi (Oryza sativa L.) dengan gen PaCS
penyandi sitrat sintase menggunakan perantara Agrobacterium tumefaciens
[tesis]. Bogor (ID): Sekolah Pascasarjana, IPB.
Wattimena GA. 1992. Bioteknologi Tanaman I. Bogor (ID): Pusat Antar
Universitas Biotekhnologi IPB.
10
Lampiran 1 Komposisi Media MS (Murashige dan Skoog 1962)
Bahan
NH4NO3
KNO3
KH2PO4
H3BO3
Na2MoO4.2H2O
CoCl2.6H2O
KI
CaCl2.2H2O
MgSO4.7H2O
MnSO4.4H2O
ZnSO4.7H2O
CuSO4.5H2O
Na2EDTA
FeSO4.7H2O
Thiamine-HCl
Niacin (asam
nikotinat)
Pyridoxine-HCl
Glycine
Myo inositol
Gula pasir
Agar
Konsentrasi
Senyawa dalam
media (mg/L)
1650
1900
170
6.2
0.25
0.025
0.83
440
370
22.3
8.6
0.025
37.3
27.8
0.1
0.5
0.5
2.0
100
30 g/L
8 g/L
11
Lampiran 2 Perhitungan persentase efisiensi transformasi dan efisiensi regenerasi
% efisiensi transformasi =
ℎ
% efisiensi regenerasi =
ℎ
�
ℎ
�
ℎ
ℎ
X
X 100%
%
12
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 1 Juni 1992 dari ayah Hoesni
dan ibu Nunung Kartini. Penulis merupakan anak pertama dari tiga bersaudara.
Penulis lulus dari SMA Negeri 74 Jakarta pada tahun 2010. Pada tahun yang sama
penulis lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB
(USMI) dan diterima pada program studi Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam (FMIPA).
Selama mengikuti perkuliahan, penulis aktif di Himpunan Mahasiswa
Biologi (HIMABIO) sebagai staf divisi Observasi Wahana Alam (OWA) pada
tahun 2012/2013 dan 2013/2014. Penulis pernah menjadi asisten praktikum mata
kuliah Biologi Dasar Tingkat Persiapan Bersama pada tahun 2013 dan 2014, serta
asisten praktikum Pengantar Genetika Molekuler pada tahun 2014. Penulis pernah
melaksanakan studi lapang di Taman Nasional Gunung Gede Pangarango Jawa
Barat pada tahun 2012, dengan judul makalah “Epitifikasi Cendawan pada
Serasah Bambu di Kebun Raya Cibodas”. Penulis juga pernah melaksanakan
praktik lapangan di Balai Penelitian Tanaman Padi Kebun Percobaan Muara,
Bogor pada bulan Juli-Agustus 2013, dengan judul makalah “Ketahanan Galur
Padi Hibrida Terhadap Wereng Batang Coklat (Nilaparvata lugens Stal.)”.