Transformasi Genetik Kentang (Solanum tuberosum L.) Kultivar Agria dengan Gen Pembungaan Hd3a
TRANSFORMASI GENETIK KENTANG (Solanum
tuberosum L.) KULTIVAR AGRIA DENGAN GEN
PEMBUNGAAN Hd3a
LIYANA SALSABILA
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Transformasi Genetik
Kentang (Solanum tuberosum L.) Kultivar Agria dengan Gen Pembungaan Hd3a
adalah benar karya bersama saya dengan komisi pembimbing dan belum diajukan
dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang
berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari
penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di
bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Pebruari 2015
Liyana Salsabila
NIM G34100010
ABSTRAK
LIYANA SALSABILA. Transformasi Genetik Kentang (Solanum tuberosum L.)
Kultivar Agria dengan Gen Pembungaan Hd3a. Dibimbing oleh SUHARSONO
dan UTUT WIDYASTUTI.
Kentang merupakan komoditas sayuran penting di Indonesia. Kentang
kultivar Agria merupakan kultivar yang mempunyai potensi untuk dikembangkan
sebagai bahan baku french fries. Induksi pembungaan pada kultivar ini menjadi
sangat penting agar dapat disilangkan dengan kultivar lain. Hd3a dapat
menginduksi pembungaan dan perkembangan umbi pada kentang kultivar
Andigena. Penelitian ini bertujuan melakukan transformasi genetik kentang
kultivar Agria dengan gen pembungaan Hd3a yang dikendalikan oleh promoter
rolC. Bahan tanaman kentang diperbanyak secara in vitro pada media MS2 makro.
Transformasi genetik dilakukan terhadap ruas (internode) sebagai eksplan dan
melalui bantuan Agrobacterium tumefaciens dengan metode ko-kultivasi. Seleksi
kalus dan tunas transgenik putatif dilakukan masing-masing di media MS dan
MS2 makro yang mengandung 10-20 mg/l higromisin. Hasil penelitian
menunjukkan bahwa rata-rata efisiensi transformasi sangat rendah yaitu 5.01%
dengan efisiensi regenerasi yang tinggi yaitu 100%. Rata-rata tunas yang
dihasilkan tiap kalus adalah satu. Tanaman transgenik putatif yang ditanam pada
media MS2 menghasilkan umbi, sedangkan tunas non-transgenik tidak
menghasilkan umbi. Hal ini menunjukkan bahwa Hd3a menginduksi
pembentukan umbi pada tanaman kentang kultivar Agria transgenik putatif.
Kata kunci : gen pembungaan Hd3a, kultivar Agria, Solanum tuberosum L.,
trasformasi genetik
ABSTRACT
LIYANA SALSABILA. Genetic Transformation of Potato (Solanum tuberosum
L.) Cultivar Agria with Hd3a Flowering Gene. Supervised by SUHARSONO and
UTUT WIDYASTUTI.
Potato is an important vegetables commodity in Indonesia. Agria has a
potential cultivar to be used as french fries material. Flowering induction of this
cultivar is very important to use this cultivar as a parent in the crossing with other
cultivar. The aim of this research was to transform genetically potato cultivar
Agria with Hd3a flowering gene controlled by rolC promoter. Potato plants were
propagated in vitro on MS2 macro medium. Genetic transformation was carried
out by co-cultivation method by using Agrobacterium tumefaciens. Putative
transgenic calli and shorts were selected in MS and MS2 macro media respectively
containing 10-20 mg/L hygromycin. The results showed that the transformation
efficiency was 5.01% with regeneration efficiency relatively high 100%. Putative
transgenic shoot regeneration per calli was one. Putative transgenic plants
produced tuber in MS2 macro media whereas all non-transgenic plants did not.
This result indicated that Hd3a induced formation of tuber of putative transgenic
potato cultivar Agria.
Keywords: cultivar Agria, genetic transformation, Hd3a flowering gene, Solanum
tuberosum L.
TRANSFORMASI GENETIK KENTANG (Solanum
tuberosum L.) KULTIVAR AGRIA DENGAN GEN
PEMBUNGAAN Hd3a
LIYANA SALSABILA
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang
dipilih dalam penelitian dilaksanakan sejak bulan Januari sampai Juli 2014 ialah
Genetika Molekuler, dengan judul Transformasi Genetik Kentang (Solanum
tuberosum L.) Kultivar Agria dengan Gen Pembungaan Hd3a.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Prof Dr Ir Suharsono, DEA
dan Ibu Dr Ir Utut Widyastuti, MSi selaku pembimbing atas waktu yang telah
disediakan, segala bimbingan, dukungan dan arahan yang telah diberikan selama
penelitian dan penulisan karya ilmiah ini. Penulis mengucapkan terima kasih
kepada Ibu Dr Sri Listiyowati selaku dosen penguji atas saran dan masukan
terhadap tulisan ini. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Proyek
Penelitian Desentralisasi Baru IPB yang berjudul "Rekayasa genetika tanaman
dengan gen toleransi alumunium dan pembungaan" dengan kontrak no:
48/IT3.11/LT/2014 atas nama Prof Dr Ir Suharsono, DEA yang telah membiayai
penelitian ini. Terima kasih juga penulis sampaikan kepada seluruh staf di
laboratorium Biologi Molekuler dan Seluler Tanaman (BMST) dan BIORIN,
khususnya Ibu Nia Dahniar SP, Mbak Pepy Elvina Amd, Mbak Sarah, Pak Asep,
Pak Mulya, Pak Iri, dan Pak Yanto atas segala bantuan, Bapak Diky Indrawibawa
SP dari CV BA Farm Bandung atas bantuan aklimatisasi tanaman transgenik,
rekan-rekan seperjuangan S1: Ica, Ika, Eka, Ina, Bustomi, Scarinta, aje, Dwika,
Hasbi, PH7 dan rekan-rekan S2: Mas Baso, Mas Ari, Mas rudi, Mbak Isni, Mbak
Wiwin, Mbak Destik, Mbak Fajri, Mbak Tiwi, Mbak Uuf, Mbak Nadea, Mbak
Efa, Mbak Lia, Mas Wawan, Mbak Nurul, Mbak Nuril, Mbak Holifah, Mbak Seni
dan Mas Lutfhi, dan rekan-rekan S3 Ibu Ifah, Ibu Ida, Pak Ilyas dan Pak Asri serta
teman-teman Biologi 47 atas segala dukungan dan kebersamaan selama ini.
Penghargaan terbesar penulis sampaikan kepada kedua orang tua: Ibu Zahrotun
Nasiha, Bapak Mahrus Ma’shum, kakak Risalatiddiniyah, adik M Dzikrullah Idfi,
adik Putri Nabila Jusepha, dan seluruh keluarga atas segala do’a dan kasih sayang,
dan dukungan yang telah diberikan.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Pebruari 2015
Liyana Salsabila
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
PENDAHULUAN
1
Latar Belakang
1
METODE PENELITIAN
2
Waktu dan Tempat
2
Bahan
2
Perbanyakan tanaman in vitro
3
Perbanyakan Agrobacterium tumefaciens
3
Transformasi genetik kentang kultivar Agria
3
Aklimatisasi
4
HASIL DAN PEMBAHASAN
4
SIMPULAN DAN SARAN
7
Simpulan
7
Saran
8
UCAPAN TERIMA KASIH
8
DAFTAR PUSTAKA
8
LAMPIRAN
13
RIWAYAT HIDUP
15
DAFTAR TABEL
1 Rata-rata efisiensi regenerasi kalus dan jumlah tunas tiap kalus kentang
kultivar Agria transgenik putatif
........ 5
2 Rata-rata efisiensi transformasi kentang kultivar Agria ................................... 5
DAFTAR GAMBAR
1 Posisi Gen Hd3a pada daerah T-DNA di dalam plasmid p2K1-Hd3a
2 Eksplan ruas kentang yang telah di ko-kultivasi dengan A. tumefaciens
umur 4 MST
3 Beberapa tunas transgenik putatif yang dihasilkan oleh kalus kentang
kultivar Agria yang resisten terhadap higromisin 10 mg/l.
4 Pengujian tunas transgenik putatif dan non-transgenik pada media
seleksi yang mengandung 20 mg/l higromisin
5 Tanaman kentang kultivar Agria in vitro yang berumur 4 minggu
6 Kentang transgenik putatif kultivar Agria yang ditanam di screen house
2
4
5
6
6
7
DAFTAR LAMPIRAN
1 Komposisi media MS (Murashige dan Skoog 1962)
2 Komposisi media MS2 makro
3 Rumus efisiensi transformasi dan efisiensi regenerasi
10
11
12
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Kentang merupakan komoditas sayuran penting di Indonesia. Kentang dapat
digunakan sebagai alternatif makanan pokok dan sangat baik bagi penderita
beberapa penyakit. Berdasarkan data dari Deptan (2012), permintaan kentang di
Indonesia dari tahun 1992 sampai dengan tahun 2011 mengalami peningkatan.
Pola konsumsi masyarakat dewasa ini menjadikan kentang sebagai menu makanan
sehari-hari turut berpartisipasi dalam peningkatan permintaan. Kentang kultivar
Agria merupakan kentang yang mempunyai potensi untuk dikembangkan menjadi
kentang olahan di Indonesia. Kultivar Agria memiliki kandungan pati sebesar
18,3% sehingga kultivar ini cocok digunakan sebagai bahan baku french fries
(Haasse dan Anton 2006). Kultivar ini merupakan introduksi dari Belanda, dan
mempunyai karakteristik di antaranya umbi berukuran besar, kulit umbi berwarna
kuning mulus, daging berwarna kuning tua, dan pertumbuhan tanaman tergolong
cepat (Smith 1968). Kultivar Agria tahan terhadap virus PVY, nematoda, dan
Phytophthora sp. (Sahat dan Assandi 1995).
Agria merupakan kultivar yang sangat baik untuk digunakan sebagai bahan
persilangan. Berdasarkan karakter yang dimilikinya organ yang dibutuhkan dalam
persilangan adalah bunga. Pembungaan merupakan hasil transisi pucuk meristem
tanaman dari fase vegetatif ke fase reproduktif. Faktor yang mempengaruhi
pembungaan yaitu faktor eksternal dan faktor internal. Faktor eksternal antara lain
adalah suhu, cahaya, kelembapan, unsur hara, sedangkan faktor internal antara
lain adalah fitohormon dan gen. Gen-gen penting pengatur waktu pembungaan
telah dipetakan dengan baik oleh beberapa peneliti, seperti Yamamoto et al.
(1998) berhasil melakukan pemetaan beberapa gen Hd (Hd-1, Hd-2, Hd-3) pada
padi dari persilangan kultivar Kasalath dan Nipponbare. Identifikasi gen Hd3a
telah dilakukan pada padi yang disinyalir dapat menginduksi pembungaan
(Kojima et al. 2002). Beberapa studi juga telah menunjukkan bahwa gen yang
terlibat dalam respon fotoperiodik terhadap pembungaan pada tanaman padi
mempunyai kesamaan dengan gen pada Arabidopsis (Yano et al. 2001).
Gen Hd3a pertama kali diidentifikasi sebagai quantitative trait locus (QTL)
yang proteinnya dapat menginduksi pembungaan padi pada kondisi hari pendek
(Kojima et al. 2002). Gen Hd3a yang berasal dari padi telah diisolasi oleh Tamaki
et al. (2007) yang mempunyai homologi dengan gen flowering locus T (FT) dari
Arabidopsis thaliana. FT/Hd3a merupakan sinyal florigen pembungaan bertipe
cepat (Tamaki et al. 2007). Protein Hd3a berinteraksi dengan faktor transkripsi
bZIP untuk menginduksi transisi dari fase vegetatif ke fase reproduktif di dalam
meristem apikal (Tsuji et al. 2008). Introduksi gen Hd3a dapat menginduksi
pembungaan pada tanaman seperti Saussurea involucrata (Li et al. 2011),
Jatropha curcas L (Sulistyaningsih 2012) dan Nicotiana benthamiana (Syafitri
2012; Senjaya 2013).
Introduksi gen Hd3a pada tanaman kentang dengan cara transformasi
menggunakan Agrobacterium tumefaciens telah banyak dilakukan, di antaranya
oleh Nurhasanah et al. (2003), Bustomi (2014), dan Mardiyyah (2014). Navarro et
al. (2011) telah mengekspresikan Hd3a secara berlebihan pada kentang kultivar
2
Andigena yang merupakan kentang hari pendek. Kentang transgenik yang
mengekspresikan Hd3a secara berlebihan tersebut dapat berbunga dan berumbi di
daerah hari panjang, sedangkan tanaman kentang non-transgenik dari kultivar
yang sama tidak berbunga dan berumbi. Hal ini menunjukkan bahwa Hd3a dapat
menginduksi pembungaan dan pengumbian pada kentang hari pendek.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan melakukan transformasi genetik kentang (Solanum
tuberosum L.) kultivar Agria dengan gen pembungaan Hd3a yang dikendalikan
oleh promoter rolC.
METODE PENELITIAN
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Januari 2014 sampai dengan
bulan Juli 2014 di Laboratorium Biotechnology Research Indonesia-The
Netherlands (BIORIN), dan Laboratorium Biologi Molekuler dan Seluler
Tanaman (BMST), Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi
(PPSHB), LPPM, Institut Pertanian Bogor.
Bahan
Kentang (Solanum tuberosum L.) kultivar Agria digunakan sebagai
bahan tanaman yang ditransformasi secara genetik, Agrobacterium tumefaciens
galur LBA4404 yang mengandung plasmid p2K1-Hd3a yang membawa gen
Hd3a yang dikendalikan promoter rolC (Tamaki et al. 2007) digunakan untuk
melakukan transformasi genetik, peta fisik daerah T-DNA dari plasmid p2K1Hd3a disajikan pada Gambar 1, media tumbuh MS (Murashiage dan Skoog 1962)
(Lampiran 1) digunakan sebagai media dasar kultur in vitro.
LB
Kpn I
prolC
5’ UTR
Hind III
Xba I
Hd3a
Spe I
GFP
NosT
hpt
RB
aaaa
Gambar 1 Posisi Gen Hd3a pada daerah T-DNA di dalam plasmid p2K1-Hd3a.
LB: left border, RB: right border, prol C: promoter dari A. rhizogenes,
Perbanyakan
planlet
Hd3a: gen heading
date dari padi,
GFP: Green Fluorescent Protein,
hpt: higromycin phosphotransferase (Tamaki et al. 2007).
3
Perbanyakan tanaman in vitro
Tanaman kentang kultivar agria diperbanyak secara in vitro dengan stek
buku tunggal pada media MS0 dan MS2 makro (MS0 yang mengandung 2 kali
unsur makro) (Lampiran 2). Stek ditanam secara in vitro selama 4 minggu di
ruang kultur pada suhu 24-25 oC, dengan pencahayaan 2000-3000 lux dan
fotoperiode 16 jam.
Perbanyakan Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404 diambil dari stok koleksi yang
disimpan dalam gliserol. Bakteri tersebut mengandung plasmid p2KI yang
mengandung gen Hd3a. Gen Hd3a dikendalikan oleh promoter rolC.
Agrobacterium tumefaciens dibiakkan selama 36 jam pada medium LB cair (1%
tripton, 0,5% yeast extract, 1% NaCl) yang mengandung 50 mg/l kanamisin, 25
mg/l rifampisin. Kecepatan penggoyangan biakan 150 rpm, suhu 28oC pada
ruangan gelap. Sebanyak 100 µl biakan dibiakkan kembali di dalam 10 ml
medium LB cair dengan kondisi yang sama seperti perbanyakan awal hingga
OD600 0,5-0,7.
Transformasi genetik kentang kultivar Agria
Transformasi dilakukan dengan metode ko-kultivasi menggunakan A.
tumefaciens. Sebelum ko-kultivasi, biakan A. tumefaciens di sentrifugasi dengan
kecepatan 5000 rpm selama 15 menit. Endapan yang terbentuk diresuspensi
dengan 10 ml media ko-kultivasi cair yaitu media MS yang mengandung 0,5 mg/l
BAP dan 0,1 mg/l IAA hingga OD600 0,5-0,7. Eksplan yang ditransformasi adalah
ruas (internode) berukuran 0,5-1 cm. Transformasi dilakukan dengan merendam
eksplan di dalam suspensi A. tumefaciens selama 10 menit, digoyang dengan
kecepatan 100 rpm pada suhu ruang. Eksplan dikeringkan dengan tisu steril,
kemudian ditanam pada media ko-kultivasi padat selama 3 hari di ruang gelap.
Eksplan dicuci dengan aquades steril sebanyak empat kali dan pada bilasan
terakhir eksplan direndam selama 10 menit dengan penambahan 100 mg/l larutan
cefotaxime. Eksplan dikeringkan dengan tisu steril yang selanjutnya ditanam pada
media induksi kalus yaitu media MS yang mengandung 3 mg/l BAP, 2 mg/l IAA,
1 mg/l GA3, 100 mg/l Acetocyringon, 30 g/l sukrosa, dan 2,8 g/l gelrite selama
dua minggu. Eksplan kemudian ditanam di media seleksi yaitu media induksi
kalus yang mengandung 10 mg/l higromisin selama 2 minggu. Kalus yang tumbuh
kemudian dipindahkan ke media regenerasi yaitu media yang sama dengan media
induksi kalus hingga kalus beregenerasi membentuk tunas. Tunas yang terbentuk
dipindahkan ke media pemanjangan tunas yaitu media MS2 makro yang
mengandung 20 mg/l higromisin. Kalus yang resisten higromisin dan yang
beregenerasi membentuk tunas dihitung untuk mengetahui efisiensi transformasi
dan efisiensi regenerasi dari tanaman transgenik. Efisiensi transformasi dan
efisiensi regenerasi dihitung berdasarkan rumus yang disajikan pada Lampiran 3.
4
Aklimatisasi
Tanaman kentang kultivar Agria yang memiliki batang dan akar lebih dari
2 cm dibersihkan dari agar-agar, dipindahkan ke dalam tray berukuran 3 cm x 3
cm x 5 cm yang berisi tanah dan kompos. Tanaman dipindahkan ke dalam
polybag yang mengandung tanah, pasir, dan pupuk kandang dengan perbandingan
1:1:1 setelah tiga minggu.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Ruas yang di ko-kultivasi dengan A. tumefaciens yang membawa plasmid
p2K1-Hd3a mulai menghasilkan kalus pada umur 2 minggu setelah tanam (MST)
di media induksi kalus tanpa higromisin. Eksplan yang mulai menghasilkan kalus
ini disubkultur di media selektif yang mengandung higromisin sebagai agen
seleksi dengan dosis 10 mg/l (Gambar 2).
Gambar 2 Eksplan ruas batang kentang umur 2 MST sebagai hasil ko-kultivasi
dengan A. tumefaciens di media seleksi.
Efisiensi transformasi kentang kultivar Agria yang dilakukan sebanyak
empat kali berkisar antara 2.00% sampai 7.50% dengan rata-rata efisiensi sebesar
5.01% (Tabel 1). Efisiensi transformasi yang didapatkan jauh lebih rendah
dibandingkan dengan efisiensi transformasi yang dilakukan pada penelitian
sebelumnya yang juga menggunakan gen Hd3a, seperti pada kentang kultivar
Baraka yang memiliki nilai rata-rata efisiensi sebesar 16.36% (Bustomi 2014),
kentang kultivar Diamant sebesar 21,21% (Mardiyyah 2014), Jatropha curcas
sebesar 26.67% (Sulistyaningsih 2012), dan pada Nicotiana benthamiana dengan
efisiensi transformasi sebesar 86% (Syafitri 2012). Nilai efisiensi transformasi
yang rendah dapat disebabkan karena beberapa hal, antara lain genotipe tanaman,
jaringan eksplan rusak selama proses transformasi, pencucian eksplan yang tidak
bersih, eksplan yang terkontaminasi oleh cendawan dan bakteri, penggunaan alat
tanam yang masih panas ketika proses pemindahan tunas ke media regenerasi.
Selain itu penggunaan cefotaxime untuk menghilangkan A. tumefaciens juga dapat
menghambat pertumbuhan kalus.
5
Tabel 1 Rata-rata efisiensi transformasi kentang kultivar Agria
Ulangan
Jenis Eksplan
Jumlah
Eksplan
Ruas
Ruas
Ruas
Ruas
40
26
46
50
1
2
3
4
Rata-rata
Jumlah Kalus
Resisten
Higromisin
3
1
3
1
Efisiensi
Transformasi
(%)
7.50
4.00
6.52
2.00
5.01
Kalus yang resisten terhadap higromisin 10 mg/l selanjutnya dipindahkan ke
medium regenerasi agar beregenerasi membentuk tunas transgenik. Efisiensi
regenerasi yang dihasilkan pada penelitian ini adalah 100% yang menandakan
bahwa semua kalus dapat beregenerasi dengan baik (Gambar 3), dan rata-rata
tunas yang dihasilkan tiap kalus adalah satu tunas sehingga jumlah tunas
transgenik putatif adalah delapan tunas (Tabel 2)
Gambar 3 Beberapa tunas transgenik putatif yang dihasilkan oleh kalus kentang
kultivar Agria yang resisten terhadap higromisin 10 mg/l.
Tabel 2 Rata-rata efisiensi regenerasi kalus dan jumlah tunas tiap kalus kentang
kultivar Agria transgenik putatif
Ulangan
1
2
3
4
Rata-rata
Jenis
Eksplan
Ruas
Ruas
Ruas
Ruas
Jumlah
Kalus
Beregenerasi
3
1
3
1
Jumlah
Kalus
Efisiensi Jumlah
Resisten Regenerasi Tunas
Higromisin
3
100
3
1
100
1
3
100
3
1
100
1
100
Jumlah
Kalus/
Tunas
1
1
1
1
1
Semua tunas yang telah dipisahkan dari kalus yaitu sebanyak delapan tunas
putatif ditanam di media MS2 yang mengandung 20 mg/l higromisin untuk
pertumbuhan tunas dan membuktikan bahwa galur-galur tersebut (StAHd3a-1,
StAHd3a-2, StAHd3a-3, StAHd3a-4, StAHd3a-5, StAHd3a-6, StAHd3a-7, dan
StAHd3a-8) adalah transgenik. Konsentrasi 20 mg/l higromisin digunakan untuk
membedakan tunas transgenik dan tunas non-transgenik. Tunas transgenik putatif
6
dapat tumbuh pada media yang mengandung 20 mg/l higromisin, sedangkan tunas
non-transgenik tidak tumbuh (Gambar 4).
A
B
Gambar 4 Pengujian tunas transgenik putatif dan non-transgenik pada media
seleksi yang mengandung 20 mg/l higromisin. (a) tunas transgenik,
(b) tunas non-transgenik yang mengalami klorosis pada media
selektif yang mengandung 20 mg/l higromisin.
Sebanyak lima dari delapan tunas transgenik putatif menghasilkan umbi
pada umur 4 MST, sedangkan tunas non-transgenik tidak berumbi pada umur
yang sama (Gambar 5). Tunas non-transgenik berumbi pada umur 12 MST. Hasil
penelitian ini menunjukkan bahwa gen Hd3a dapat memicu pembentukan umbi
pada kentang kultivar Agria. Hasil ini mendukung penelitian Navarro et al. (2011)
yang menjelaskan bahwa, Hd3a selain dapat menginduksi pembentukan bunga
juga dapat menginduksi pembentukan umbi pada kentang kultivar Andigena yang
merupakan kentang hari pendek dan berumur genjah bila ditanam di hari panjang.
Kentang Andigena non-transgenik tidak berbunga dan tidak berumbi bila ditanam
di daerah yang mempunyai hari panjang. Berbeda dengan kultivar Andigena,
Agria merupakan kultivar yang berumur agak genjah. Hd3a mempunyai pengaruh
yang sama yaitu menginduksi pembentukan umbi yang lebih awal dibandingkan
dengan tanaman non-transgenik, walaupun pada kultivar yang mempunyai tipe
umur yang berbeda dengan kultivar Andigena. Hal ini sangat menguntungkan
dalam produksi kentang karena kentang transgenik yang mengekspresikan Hd3a
berumbi lebih cepat pada umur yang sama sehingga dapat dipanen lebih cepat.
A
B
Gambar 5 Tanaman kentang kultivar Agria in vitro yang berumur 4 minggu.
(a) tanaman transgenik, (b) tanaman non-transgenik.
7
Tunas transgenik putatif ditanam di media tanah di dalam polybag atau pot
untuk mengetahui pengaruh gen Hd3a terhadap pembungaan kentang kultivar
Agria. Tunas transgenik ditumbuhkan terlebih dahulu di media MS2 makro agar
batang dan daunnya tumbuh besar dan kuat. Tunas transgenik yang telah
dibersihkan dari agar-agar yang menempel ditanam di dalam tray yang berisi
coco-peat, dan ditutup dengan plastik. Tanaman ditempatkan di screen house
yang bersuhu sekitar 20oC. Saat ini tanaman transgenik putatif sedang ditanam di
pot (Gambar 6.)
Gambar 6 Kentang transgenik putatif kultivar Agria galur StAHd3a-1 yang
ditanam di screen house
Gen Hd3a yang diintroduksikan pada kentang kultivar Agria belum
dideteksi, tetapi gen hpt yang bertanggung jawab terhadap resistensi higromisin
telah dipautkan (linked) secara fisik dengan gen Hd3a, sehingga tanaman yang
resisten higromisin menyandi gen Hd3a. Meskipun demikian analisis molekuler
untuk mengetahui integrasi gen Hd3a ditanaman transgenik harus dilakukan.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Transformasi genetik kentang kultivar Agria telah berhasil dilakukan dan
menghasilkan delapan tunas transgenik putatif. Rata-rata efisiensi transformasi
pada penelitian ini adalah sangat rendah yaitu 5.01%, dan rata-rata efisiensi
regenerasinya sangat tinggi yaitu 100%. Sebanyak lima dari delapan tunas
transgenik telah berumbi pada waktu empat minggu setelah tanam, sedangkan
tunas non-transgenik membutuhkan waktu 12 minggu setelah tanam. Hal tersebut
menunjukkan bahwa gen Hd3a selain dapat menginduksi pembungaan juga dapat
menginduksi pembentukan umbi pada kentang kultivar Agria.
8
Saran
Tanaman kentang kultivar Agria transgenik perlu dilakukan analisis
molekuler untuk mengetahui integrasi dari gen Hd3a dan perlu dilakukan
pengujian penanaman di lapang.
UCAPAN TERIMA KASIH
Terima kasih disampaikan kepada Proyek Penelitian Desentralisasi
Baru IPB yang berjudul “Rekayasa genetika tanaman dengan gen toleransi
aluminium dan pembungaan” dengan kontrak Nomor: 48/ IT3.11/LT/2014 atas
nama Prof. Dr. Suharsono yang telah membiayai penelitian ini.
DAFTAR PUSTAKA
Bustomi. 2014. Transformasi genetik kentang (Solanum tuberosum L) kultivar
Baraka dengan gen pembungaan Hd3a [skripsi]. Bogor (ID): Institut
Pertanian Bogor.
[Deptan] Departemen Pertanian. 2012. Permintaan Kentang Tahun 1992-2011.
[Internet]. [diunduh 2013 Desember 28 ]. Tersedia pada:
http://www.deptan.go.id
Haasse NU, Anton JH. 2006. Potato Development in a Changing Europe.
Netherlands (NL): Wageningen Academic Publishers.
Kojima S, Takahashi Y, Kobayashi Y, Monna L, Sasaki T, Araki T, Yano M.
2002. Hd3a, a rice ortholog of the Arabidopsis FT gene, promotes
transition to flowering downstream of Hd1 under short-day conditions.
Plant Cell Physiol 43 (10):1096–1105.
Li M, Li H, Hu X, Pan X, Wu G. 2011. Genetic transformation and
overexpression of a rice Hd3a induces early flowering in Saussurea
involucrata Kar.et Kir. ex Maxim. Plant Cell Tiss Organ Cult 106:363371.
Mardiyyah IM. 2014. Introduksi gen pembungaan Hd3a ke dalam tanaman
kentang (Solanum tuberosum L.) kultivar Diamant [makalah seminar].
Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Murashige T, Skoog F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays
with tobacco culture. Physiol Plant 15: 473-497.
Navarro C. Abelanda JA, Cruz EO, Carlos A, Tamaki S, Silva J, Shimamoto K,
Prat S. 2011. Control of flowering and storage organ formation in potato
by flowering locus T. Nature 478: 119-123.
Nurhasanah, Wattimena GA, Purwito A, Wiendi NMA, Suharsono. 2003.
Transformasi genetik tanaman kentang cv. Atlantik dengan
9
mengintroduksikan gen hordothionin untuk mendapatkan ketahanan
terhadap penyakit bakteri. Buletin Agronomi 31(2): 63-67
Sahat S, Ashandi AA. 1995. Percobaan kultivar komersial kentang di dataran
tinggi Ngablak, Magelang. J Hort 5(4): 16-21
Senjaya SK. 2013. Pewarisan genetik transgen Hd3a pada tanaman Nicotiana
benthamiana transgenik [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Smith O. 1968. Potatoes: Production, storing, processing. London (GB): Avi
Publishing Company.
Sulistyaningsih YC. 2012. Rekayasa ekspresi gen pembungaan Hd3a pada
tanaman jarak pagar (Jatropha curcas L.) [disertasi]. Bogor (ID): Institut
Pertanian Bogor.
Syafitri LN. 2012. Transformasi genetik Nicotiana benthamiana dengan gen
pembungaan Hd3a dari padi [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Tamaki S, Matsuo S, Wong H, Yokoi S, Shimamoto K. 2007. Hd3a protein is a
mobile flowering signal in rice. Science 36:1033-1036.
Tsuji H, Tamaki S, Komiya R, Shimamoto K. 2008. Florigen and the
photoperiodic control of flowering in rice. Rice 1:25-35.
Yamamoto T, Kuboki SY, Lin T, Sasaki, Yano M. 1998. Fine mapping of
quantitative trait locus hd-1, hd-2, hd-3, controlling heading date of rice, as
single mendelian factors. Theor Appl Genet 97: 37-44.
Yano et al. 2001. Hd 1, A major photoperiod sensitivity quantitative trait locus in
rice, is closely related to the Arabidopsis flowering time gene constans.
The Plant Cell 12: 2473-2483.
10
Lampiran 1 Komposisi media MS (Murashige dan Skoog 1962)
Bahan
*
NH4NO3
KNO3
KH2PO4
H3BO3
Na2MoO4.2H2O
CoCl2.6H2O
KI
*
CaCl2.2H2O
MgSO4.7H2O
MnSO4.4H2O
ZnSO4.7H2O
CuSO4.5H2O
Na2EDTA
FeSO4.7H2O
Thiamine-HCl
Niacin (asam
nikotinat)
Pyridoxine-HCl
Glycine
Myo inositol
Gula pasir
Agar
*
Konsentrasi
senyawa dalam
media (mg/L)
1650
1900
170
6.2
0.25
0.025
0.83
440
370
22.3
8.6
0.025
37.3
27.8
0.1
0.5
0.5
2.0
100
30 g/L
8 g/L
11
Lampiran 2 Komposisi media MS2 makro
Bahan
*
NH4NO3
KNO3
KH2PO4
H3BO3
Na2MoO4.2H2O
CoCl2.6H2O
KI
*
CaCl2.2H2O
MgSO4.7H2O
MnSO4.4H2O
ZnSO4.7H2O
CuSO4.5H2O
Na2EDTA
FeSO4.7H2O
Thiamine-HCl
Niacin (asam
nikotinat)
Pyridoxine-HCl
Glycine
Myo inositol
Gula pasir
Agar
*
Konsentrasi
senyawa dalam
media (mg/L)
3300
3800
170
6.2
0.25
0.025
0.83
440
370
22.3
8.6
0.025
37.3
27.8
0.1
0.5
0.5
2.0
100
30 g/L
8 g/L
12
Lampiran 3 Rumus efisiensi transformasi dan efisiensi regenerasi
% ET =
Jumlah KRH
ETT
X 100 %
% ER =
Jumlah KRG
KTT
X 100 %
Keterangan:
ET = Efisiensi Transformasi
KRH = Kalus Resisten Higromisin
ETT = Eksplan total yang ditransformasi
ER = Efisiensi Regenerasi
KRG = Kalus yang beregenerasi
KTT = Kalus total hasil transformasi
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Indramayu, 28 Juli 1992 sebagai anak kedua dengan
satu kakak dan dua adik dari pasangan Bapak Mahrus Ma’shum dan Ibu Zahrotun
Nasiha. Pendidikan dasar diselesaikan pada tahun 2004 Di SD Negeri
Pekandangan V. Pendidikan lanjutan menengah pertama diselesaikan pada tahun
2007 di SMP Negeri 1 Indramayu, kemudian melanjutkan pendidikan menengah
atas di MAN Model Ciwaringin Cirebon dan lulus pada tahun 2010. Melalui jalur
USMI Institut Pertanian Bogor penulis melanjutkan pendidikannya sebagai salah
satu mahasiswa Biologi, Fakultas Matematika dan Pengetahuan Alam, Insitut
Pertanian Bogor pada tahun 2010.
Selama menjalani pendidikan sebagai mahasiswa, penulis aktif dalam
berbagai kegiatan termasuk menjadi asisten praktikum Biologi Dasar pada tahun
ajaran 2013/2014 dan 2014/2015, dan asisten praktikum Pengantar Genetika
Molekuler pada tahun ajaran 2013/2014, pengajar privat di Generasi Cendekia
tahun 2013-2015, Anggota Divisi Kajian Budaya tahun 2011/2012 dan Anggota
Divisi Informasi dan Komunikasi tahun 2012/2013 UKM Gentra Kaheman IPB,
Anggota Organisasi Mahasiswa Daerah (OMDA) Cirebon tahun 2011, Praktik
Lapangan di PT. Pertamina RU VI Balongan Bagian: Hubungan Masyarakat
tahun 2013.
Penulis juga turut berpartisipasi dalam berbagai kegiatan seperti menjadi
Ketua Divisi Hubungan Masyarakat Festival Budaya IPB tahun 2012, Anggota
Divisi Fundrising MPKMB IPB tahun 2011, Anggota divisi Logistik dan
Transportasi Masa Orientasi Biologi tahun 2012, Anggota Divisi Publikasi,
Dekorasi dan Dokumentasi Bogor City Series tahun 2011, Ketua Divisi Konsumsi
Ki Sunda Midang tahun 2011, Bendahara Pamitran Gentra Kaheman tahun 2011,
Sekertaris penampilan OMDA Cirebon Gebyar Nusantara IPB tahun 2012,
Sekertaris IPB Canvasing OMDA Cirebon tahun 2011, Anggota Divisi Hubungan
Masyarakat IPB Goes to School OMDA Cirebon tahun 2011, Partisipasi dalam
Kegiatan Kunjungan Industri ke PT. Yakult dan PT. Amerta tahun 2013,
Partisipasi Kegiatan Eksplorasi Alam ke “Gua Bawah Tanah Buni Ayu”
Sukabumi HIMABIO IPB tahun 2013.
tuberosum L.) KULTIVAR AGRIA DENGAN GEN
PEMBUNGAAN Hd3a
LIYANA SALSABILA
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Transformasi Genetik
Kentang (Solanum tuberosum L.) Kultivar Agria dengan Gen Pembungaan Hd3a
adalah benar karya bersama saya dengan komisi pembimbing dan belum diajukan
dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang
berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari
penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di
bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Pebruari 2015
Liyana Salsabila
NIM G34100010
ABSTRAK
LIYANA SALSABILA. Transformasi Genetik Kentang (Solanum tuberosum L.)
Kultivar Agria dengan Gen Pembungaan Hd3a. Dibimbing oleh SUHARSONO
dan UTUT WIDYASTUTI.
Kentang merupakan komoditas sayuran penting di Indonesia. Kentang
kultivar Agria merupakan kultivar yang mempunyai potensi untuk dikembangkan
sebagai bahan baku french fries. Induksi pembungaan pada kultivar ini menjadi
sangat penting agar dapat disilangkan dengan kultivar lain. Hd3a dapat
menginduksi pembungaan dan perkembangan umbi pada kentang kultivar
Andigena. Penelitian ini bertujuan melakukan transformasi genetik kentang
kultivar Agria dengan gen pembungaan Hd3a yang dikendalikan oleh promoter
rolC. Bahan tanaman kentang diperbanyak secara in vitro pada media MS2 makro.
Transformasi genetik dilakukan terhadap ruas (internode) sebagai eksplan dan
melalui bantuan Agrobacterium tumefaciens dengan metode ko-kultivasi. Seleksi
kalus dan tunas transgenik putatif dilakukan masing-masing di media MS dan
MS2 makro yang mengandung 10-20 mg/l higromisin. Hasil penelitian
menunjukkan bahwa rata-rata efisiensi transformasi sangat rendah yaitu 5.01%
dengan efisiensi regenerasi yang tinggi yaitu 100%. Rata-rata tunas yang
dihasilkan tiap kalus adalah satu. Tanaman transgenik putatif yang ditanam pada
media MS2 menghasilkan umbi, sedangkan tunas non-transgenik tidak
menghasilkan umbi. Hal ini menunjukkan bahwa Hd3a menginduksi
pembentukan umbi pada tanaman kentang kultivar Agria transgenik putatif.
Kata kunci : gen pembungaan Hd3a, kultivar Agria, Solanum tuberosum L.,
trasformasi genetik
ABSTRACT
LIYANA SALSABILA. Genetic Transformation of Potato (Solanum tuberosum
L.) Cultivar Agria with Hd3a Flowering Gene. Supervised by SUHARSONO and
UTUT WIDYASTUTI.
Potato is an important vegetables commodity in Indonesia. Agria has a
potential cultivar to be used as french fries material. Flowering induction of this
cultivar is very important to use this cultivar as a parent in the crossing with other
cultivar. The aim of this research was to transform genetically potato cultivar
Agria with Hd3a flowering gene controlled by rolC promoter. Potato plants were
propagated in vitro on MS2 macro medium. Genetic transformation was carried
out by co-cultivation method by using Agrobacterium tumefaciens. Putative
transgenic calli and shorts were selected in MS and MS2 macro media respectively
containing 10-20 mg/L hygromycin. The results showed that the transformation
efficiency was 5.01% with regeneration efficiency relatively high 100%. Putative
transgenic shoot regeneration per calli was one. Putative transgenic plants
produced tuber in MS2 macro media whereas all non-transgenic plants did not.
This result indicated that Hd3a induced formation of tuber of putative transgenic
potato cultivar Agria.
Keywords: cultivar Agria, genetic transformation, Hd3a flowering gene, Solanum
tuberosum L.
TRANSFORMASI GENETIK KENTANG (Solanum
tuberosum L.) KULTIVAR AGRIA DENGAN GEN
PEMBUNGAAN Hd3a
LIYANA SALSABILA
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang
dipilih dalam penelitian dilaksanakan sejak bulan Januari sampai Juli 2014 ialah
Genetika Molekuler, dengan judul Transformasi Genetik Kentang (Solanum
tuberosum L.) Kultivar Agria dengan Gen Pembungaan Hd3a.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Prof Dr Ir Suharsono, DEA
dan Ibu Dr Ir Utut Widyastuti, MSi selaku pembimbing atas waktu yang telah
disediakan, segala bimbingan, dukungan dan arahan yang telah diberikan selama
penelitian dan penulisan karya ilmiah ini. Penulis mengucapkan terima kasih
kepada Ibu Dr Sri Listiyowati selaku dosen penguji atas saran dan masukan
terhadap tulisan ini. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Proyek
Penelitian Desentralisasi Baru IPB yang berjudul "Rekayasa genetika tanaman
dengan gen toleransi alumunium dan pembungaan" dengan kontrak no:
48/IT3.11/LT/2014 atas nama Prof Dr Ir Suharsono, DEA yang telah membiayai
penelitian ini. Terima kasih juga penulis sampaikan kepada seluruh staf di
laboratorium Biologi Molekuler dan Seluler Tanaman (BMST) dan BIORIN,
khususnya Ibu Nia Dahniar SP, Mbak Pepy Elvina Amd, Mbak Sarah, Pak Asep,
Pak Mulya, Pak Iri, dan Pak Yanto atas segala bantuan, Bapak Diky Indrawibawa
SP dari CV BA Farm Bandung atas bantuan aklimatisasi tanaman transgenik,
rekan-rekan seperjuangan S1: Ica, Ika, Eka, Ina, Bustomi, Scarinta, aje, Dwika,
Hasbi, PH7 dan rekan-rekan S2: Mas Baso, Mas Ari, Mas rudi, Mbak Isni, Mbak
Wiwin, Mbak Destik, Mbak Fajri, Mbak Tiwi, Mbak Uuf, Mbak Nadea, Mbak
Efa, Mbak Lia, Mas Wawan, Mbak Nurul, Mbak Nuril, Mbak Holifah, Mbak Seni
dan Mas Lutfhi, dan rekan-rekan S3 Ibu Ifah, Ibu Ida, Pak Ilyas dan Pak Asri serta
teman-teman Biologi 47 atas segala dukungan dan kebersamaan selama ini.
Penghargaan terbesar penulis sampaikan kepada kedua orang tua: Ibu Zahrotun
Nasiha, Bapak Mahrus Ma’shum, kakak Risalatiddiniyah, adik M Dzikrullah Idfi,
adik Putri Nabila Jusepha, dan seluruh keluarga atas segala do’a dan kasih sayang,
dan dukungan yang telah diberikan.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Pebruari 2015
Liyana Salsabila
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
PENDAHULUAN
1
Latar Belakang
1
METODE PENELITIAN
2
Waktu dan Tempat
2
Bahan
2
Perbanyakan tanaman in vitro
3
Perbanyakan Agrobacterium tumefaciens
3
Transformasi genetik kentang kultivar Agria
3
Aklimatisasi
4
HASIL DAN PEMBAHASAN
4
SIMPULAN DAN SARAN
7
Simpulan
7
Saran
8
UCAPAN TERIMA KASIH
8
DAFTAR PUSTAKA
8
LAMPIRAN
13
RIWAYAT HIDUP
15
DAFTAR TABEL
1 Rata-rata efisiensi regenerasi kalus dan jumlah tunas tiap kalus kentang
kultivar Agria transgenik putatif
........ 5
2 Rata-rata efisiensi transformasi kentang kultivar Agria ................................... 5
DAFTAR GAMBAR
1 Posisi Gen Hd3a pada daerah T-DNA di dalam plasmid p2K1-Hd3a
2 Eksplan ruas kentang yang telah di ko-kultivasi dengan A. tumefaciens
umur 4 MST
3 Beberapa tunas transgenik putatif yang dihasilkan oleh kalus kentang
kultivar Agria yang resisten terhadap higromisin 10 mg/l.
4 Pengujian tunas transgenik putatif dan non-transgenik pada media
seleksi yang mengandung 20 mg/l higromisin
5 Tanaman kentang kultivar Agria in vitro yang berumur 4 minggu
6 Kentang transgenik putatif kultivar Agria yang ditanam di screen house
2
4
5
6
6
7
DAFTAR LAMPIRAN
1 Komposisi media MS (Murashige dan Skoog 1962)
2 Komposisi media MS2 makro
3 Rumus efisiensi transformasi dan efisiensi regenerasi
10
11
12
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Kentang merupakan komoditas sayuran penting di Indonesia. Kentang dapat
digunakan sebagai alternatif makanan pokok dan sangat baik bagi penderita
beberapa penyakit. Berdasarkan data dari Deptan (2012), permintaan kentang di
Indonesia dari tahun 1992 sampai dengan tahun 2011 mengalami peningkatan.
Pola konsumsi masyarakat dewasa ini menjadikan kentang sebagai menu makanan
sehari-hari turut berpartisipasi dalam peningkatan permintaan. Kentang kultivar
Agria merupakan kentang yang mempunyai potensi untuk dikembangkan menjadi
kentang olahan di Indonesia. Kultivar Agria memiliki kandungan pati sebesar
18,3% sehingga kultivar ini cocok digunakan sebagai bahan baku french fries
(Haasse dan Anton 2006). Kultivar ini merupakan introduksi dari Belanda, dan
mempunyai karakteristik di antaranya umbi berukuran besar, kulit umbi berwarna
kuning mulus, daging berwarna kuning tua, dan pertumbuhan tanaman tergolong
cepat (Smith 1968). Kultivar Agria tahan terhadap virus PVY, nematoda, dan
Phytophthora sp. (Sahat dan Assandi 1995).
Agria merupakan kultivar yang sangat baik untuk digunakan sebagai bahan
persilangan. Berdasarkan karakter yang dimilikinya organ yang dibutuhkan dalam
persilangan adalah bunga. Pembungaan merupakan hasil transisi pucuk meristem
tanaman dari fase vegetatif ke fase reproduktif. Faktor yang mempengaruhi
pembungaan yaitu faktor eksternal dan faktor internal. Faktor eksternal antara lain
adalah suhu, cahaya, kelembapan, unsur hara, sedangkan faktor internal antara
lain adalah fitohormon dan gen. Gen-gen penting pengatur waktu pembungaan
telah dipetakan dengan baik oleh beberapa peneliti, seperti Yamamoto et al.
(1998) berhasil melakukan pemetaan beberapa gen Hd (Hd-1, Hd-2, Hd-3) pada
padi dari persilangan kultivar Kasalath dan Nipponbare. Identifikasi gen Hd3a
telah dilakukan pada padi yang disinyalir dapat menginduksi pembungaan
(Kojima et al. 2002). Beberapa studi juga telah menunjukkan bahwa gen yang
terlibat dalam respon fotoperiodik terhadap pembungaan pada tanaman padi
mempunyai kesamaan dengan gen pada Arabidopsis (Yano et al. 2001).
Gen Hd3a pertama kali diidentifikasi sebagai quantitative trait locus (QTL)
yang proteinnya dapat menginduksi pembungaan padi pada kondisi hari pendek
(Kojima et al. 2002). Gen Hd3a yang berasal dari padi telah diisolasi oleh Tamaki
et al. (2007) yang mempunyai homologi dengan gen flowering locus T (FT) dari
Arabidopsis thaliana. FT/Hd3a merupakan sinyal florigen pembungaan bertipe
cepat (Tamaki et al. 2007). Protein Hd3a berinteraksi dengan faktor transkripsi
bZIP untuk menginduksi transisi dari fase vegetatif ke fase reproduktif di dalam
meristem apikal (Tsuji et al. 2008). Introduksi gen Hd3a dapat menginduksi
pembungaan pada tanaman seperti Saussurea involucrata (Li et al. 2011),
Jatropha curcas L (Sulistyaningsih 2012) dan Nicotiana benthamiana (Syafitri
2012; Senjaya 2013).
Introduksi gen Hd3a pada tanaman kentang dengan cara transformasi
menggunakan Agrobacterium tumefaciens telah banyak dilakukan, di antaranya
oleh Nurhasanah et al. (2003), Bustomi (2014), dan Mardiyyah (2014). Navarro et
al. (2011) telah mengekspresikan Hd3a secara berlebihan pada kentang kultivar
2
Andigena yang merupakan kentang hari pendek. Kentang transgenik yang
mengekspresikan Hd3a secara berlebihan tersebut dapat berbunga dan berumbi di
daerah hari panjang, sedangkan tanaman kentang non-transgenik dari kultivar
yang sama tidak berbunga dan berumbi. Hal ini menunjukkan bahwa Hd3a dapat
menginduksi pembungaan dan pengumbian pada kentang hari pendek.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan melakukan transformasi genetik kentang (Solanum
tuberosum L.) kultivar Agria dengan gen pembungaan Hd3a yang dikendalikan
oleh promoter rolC.
METODE PENELITIAN
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Januari 2014 sampai dengan
bulan Juli 2014 di Laboratorium Biotechnology Research Indonesia-The
Netherlands (BIORIN), dan Laboratorium Biologi Molekuler dan Seluler
Tanaman (BMST), Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi
(PPSHB), LPPM, Institut Pertanian Bogor.
Bahan
Kentang (Solanum tuberosum L.) kultivar Agria digunakan sebagai
bahan tanaman yang ditransformasi secara genetik, Agrobacterium tumefaciens
galur LBA4404 yang mengandung plasmid p2K1-Hd3a yang membawa gen
Hd3a yang dikendalikan promoter rolC (Tamaki et al. 2007) digunakan untuk
melakukan transformasi genetik, peta fisik daerah T-DNA dari plasmid p2K1Hd3a disajikan pada Gambar 1, media tumbuh MS (Murashiage dan Skoog 1962)
(Lampiran 1) digunakan sebagai media dasar kultur in vitro.
LB
Kpn I
prolC
5’ UTR
Hind III
Xba I
Hd3a
Spe I
GFP
NosT
hpt
RB
aaaa
Gambar 1 Posisi Gen Hd3a pada daerah T-DNA di dalam plasmid p2K1-Hd3a.
LB: left border, RB: right border, prol C: promoter dari A. rhizogenes,
Perbanyakan
planlet
Hd3a: gen heading
date dari padi,
GFP: Green Fluorescent Protein,
hpt: higromycin phosphotransferase (Tamaki et al. 2007).
3
Perbanyakan tanaman in vitro
Tanaman kentang kultivar agria diperbanyak secara in vitro dengan stek
buku tunggal pada media MS0 dan MS2 makro (MS0 yang mengandung 2 kali
unsur makro) (Lampiran 2). Stek ditanam secara in vitro selama 4 minggu di
ruang kultur pada suhu 24-25 oC, dengan pencahayaan 2000-3000 lux dan
fotoperiode 16 jam.
Perbanyakan Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404 diambil dari stok koleksi yang
disimpan dalam gliserol. Bakteri tersebut mengandung plasmid p2KI yang
mengandung gen Hd3a. Gen Hd3a dikendalikan oleh promoter rolC.
Agrobacterium tumefaciens dibiakkan selama 36 jam pada medium LB cair (1%
tripton, 0,5% yeast extract, 1% NaCl) yang mengandung 50 mg/l kanamisin, 25
mg/l rifampisin. Kecepatan penggoyangan biakan 150 rpm, suhu 28oC pada
ruangan gelap. Sebanyak 100 µl biakan dibiakkan kembali di dalam 10 ml
medium LB cair dengan kondisi yang sama seperti perbanyakan awal hingga
OD600 0,5-0,7.
Transformasi genetik kentang kultivar Agria
Transformasi dilakukan dengan metode ko-kultivasi menggunakan A.
tumefaciens. Sebelum ko-kultivasi, biakan A. tumefaciens di sentrifugasi dengan
kecepatan 5000 rpm selama 15 menit. Endapan yang terbentuk diresuspensi
dengan 10 ml media ko-kultivasi cair yaitu media MS yang mengandung 0,5 mg/l
BAP dan 0,1 mg/l IAA hingga OD600 0,5-0,7. Eksplan yang ditransformasi adalah
ruas (internode) berukuran 0,5-1 cm. Transformasi dilakukan dengan merendam
eksplan di dalam suspensi A. tumefaciens selama 10 menit, digoyang dengan
kecepatan 100 rpm pada suhu ruang. Eksplan dikeringkan dengan tisu steril,
kemudian ditanam pada media ko-kultivasi padat selama 3 hari di ruang gelap.
Eksplan dicuci dengan aquades steril sebanyak empat kali dan pada bilasan
terakhir eksplan direndam selama 10 menit dengan penambahan 100 mg/l larutan
cefotaxime. Eksplan dikeringkan dengan tisu steril yang selanjutnya ditanam pada
media induksi kalus yaitu media MS yang mengandung 3 mg/l BAP, 2 mg/l IAA,
1 mg/l GA3, 100 mg/l Acetocyringon, 30 g/l sukrosa, dan 2,8 g/l gelrite selama
dua minggu. Eksplan kemudian ditanam di media seleksi yaitu media induksi
kalus yang mengandung 10 mg/l higromisin selama 2 minggu. Kalus yang tumbuh
kemudian dipindahkan ke media regenerasi yaitu media yang sama dengan media
induksi kalus hingga kalus beregenerasi membentuk tunas. Tunas yang terbentuk
dipindahkan ke media pemanjangan tunas yaitu media MS2 makro yang
mengandung 20 mg/l higromisin. Kalus yang resisten higromisin dan yang
beregenerasi membentuk tunas dihitung untuk mengetahui efisiensi transformasi
dan efisiensi regenerasi dari tanaman transgenik. Efisiensi transformasi dan
efisiensi regenerasi dihitung berdasarkan rumus yang disajikan pada Lampiran 3.
4
Aklimatisasi
Tanaman kentang kultivar Agria yang memiliki batang dan akar lebih dari
2 cm dibersihkan dari agar-agar, dipindahkan ke dalam tray berukuran 3 cm x 3
cm x 5 cm yang berisi tanah dan kompos. Tanaman dipindahkan ke dalam
polybag yang mengandung tanah, pasir, dan pupuk kandang dengan perbandingan
1:1:1 setelah tiga minggu.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Ruas yang di ko-kultivasi dengan A. tumefaciens yang membawa plasmid
p2K1-Hd3a mulai menghasilkan kalus pada umur 2 minggu setelah tanam (MST)
di media induksi kalus tanpa higromisin. Eksplan yang mulai menghasilkan kalus
ini disubkultur di media selektif yang mengandung higromisin sebagai agen
seleksi dengan dosis 10 mg/l (Gambar 2).
Gambar 2 Eksplan ruas batang kentang umur 2 MST sebagai hasil ko-kultivasi
dengan A. tumefaciens di media seleksi.
Efisiensi transformasi kentang kultivar Agria yang dilakukan sebanyak
empat kali berkisar antara 2.00% sampai 7.50% dengan rata-rata efisiensi sebesar
5.01% (Tabel 1). Efisiensi transformasi yang didapatkan jauh lebih rendah
dibandingkan dengan efisiensi transformasi yang dilakukan pada penelitian
sebelumnya yang juga menggunakan gen Hd3a, seperti pada kentang kultivar
Baraka yang memiliki nilai rata-rata efisiensi sebesar 16.36% (Bustomi 2014),
kentang kultivar Diamant sebesar 21,21% (Mardiyyah 2014), Jatropha curcas
sebesar 26.67% (Sulistyaningsih 2012), dan pada Nicotiana benthamiana dengan
efisiensi transformasi sebesar 86% (Syafitri 2012). Nilai efisiensi transformasi
yang rendah dapat disebabkan karena beberapa hal, antara lain genotipe tanaman,
jaringan eksplan rusak selama proses transformasi, pencucian eksplan yang tidak
bersih, eksplan yang terkontaminasi oleh cendawan dan bakteri, penggunaan alat
tanam yang masih panas ketika proses pemindahan tunas ke media regenerasi.
Selain itu penggunaan cefotaxime untuk menghilangkan A. tumefaciens juga dapat
menghambat pertumbuhan kalus.
5
Tabel 1 Rata-rata efisiensi transformasi kentang kultivar Agria
Ulangan
Jenis Eksplan
Jumlah
Eksplan
Ruas
Ruas
Ruas
Ruas
40
26
46
50
1
2
3
4
Rata-rata
Jumlah Kalus
Resisten
Higromisin
3
1
3
1
Efisiensi
Transformasi
(%)
7.50
4.00
6.52
2.00
5.01
Kalus yang resisten terhadap higromisin 10 mg/l selanjutnya dipindahkan ke
medium regenerasi agar beregenerasi membentuk tunas transgenik. Efisiensi
regenerasi yang dihasilkan pada penelitian ini adalah 100% yang menandakan
bahwa semua kalus dapat beregenerasi dengan baik (Gambar 3), dan rata-rata
tunas yang dihasilkan tiap kalus adalah satu tunas sehingga jumlah tunas
transgenik putatif adalah delapan tunas (Tabel 2)
Gambar 3 Beberapa tunas transgenik putatif yang dihasilkan oleh kalus kentang
kultivar Agria yang resisten terhadap higromisin 10 mg/l.
Tabel 2 Rata-rata efisiensi regenerasi kalus dan jumlah tunas tiap kalus kentang
kultivar Agria transgenik putatif
Ulangan
1
2
3
4
Rata-rata
Jenis
Eksplan
Ruas
Ruas
Ruas
Ruas
Jumlah
Kalus
Beregenerasi
3
1
3
1
Jumlah
Kalus
Efisiensi Jumlah
Resisten Regenerasi Tunas
Higromisin
3
100
3
1
100
1
3
100
3
1
100
1
100
Jumlah
Kalus/
Tunas
1
1
1
1
1
Semua tunas yang telah dipisahkan dari kalus yaitu sebanyak delapan tunas
putatif ditanam di media MS2 yang mengandung 20 mg/l higromisin untuk
pertumbuhan tunas dan membuktikan bahwa galur-galur tersebut (StAHd3a-1,
StAHd3a-2, StAHd3a-3, StAHd3a-4, StAHd3a-5, StAHd3a-6, StAHd3a-7, dan
StAHd3a-8) adalah transgenik. Konsentrasi 20 mg/l higromisin digunakan untuk
membedakan tunas transgenik dan tunas non-transgenik. Tunas transgenik putatif
6
dapat tumbuh pada media yang mengandung 20 mg/l higromisin, sedangkan tunas
non-transgenik tidak tumbuh (Gambar 4).
A
B
Gambar 4 Pengujian tunas transgenik putatif dan non-transgenik pada media
seleksi yang mengandung 20 mg/l higromisin. (a) tunas transgenik,
(b) tunas non-transgenik yang mengalami klorosis pada media
selektif yang mengandung 20 mg/l higromisin.
Sebanyak lima dari delapan tunas transgenik putatif menghasilkan umbi
pada umur 4 MST, sedangkan tunas non-transgenik tidak berumbi pada umur
yang sama (Gambar 5). Tunas non-transgenik berumbi pada umur 12 MST. Hasil
penelitian ini menunjukkan bahwa gen Hd3a dapat memicu pembentukan umbi
pada kentang kultivar Agria. Hasil ini mendukung penelitian Navarro et al. (2011)
yang menjelaskan bahwa, Hd3a selain dapat menginduksi pembentukan bunga
juga dapat menginduksi pembentukan umbi pada kentang kultivar Andigena yang
merupakan kentang hari pendek dan berumur genjah bila ditanam di hari panjang.
Kentang Andigena non-transgenik tidak berbunga dan tidak berumbi bila ditanam
di daerah yang mempunyai hari panjang. Berbeda dengan kultivar Andigena,
Agria merupakan kultivar yang berumur agak genjah. Hd3a mempunyai pengaruh
yang sama yaitu menginduksi pembentukan umbi yang lebih awal dibandingkan
dengan tanaman non-transgenik, walaupun pada kultivar yang mempunyai tipe
umur yang berbeda dengan kultivar Andigena. Hal ini sangat menguntungkan
dalam produksi kentang karena kentang transgenik yang mengekspresikan Hd3a
berumbi lebih cepat pada umur yang sama sehingga dapat dipanen lebih cepat.
A
B
Gambar 5 Tanaman kentang kultivar Agria in vitro yang berumur 4 minggu.
(a) tanaman transgenik, (b) tanaman non-transgenik.
7
Tunas transgenik putatif ditanam di media tanah di dalam polybag atau pot
untuk mengetahui pengaruh gen Hd3a terhadap pembungaan kentang kultivar
Agria. Tunas transgenik ditumbuhkan terlebih dahulu di media MS2 makro agar
batang dan daunnya tumbuh besar dan kuat. Tunas transgenik yang telah
dibersihkan dari agar-agar yang menempel ditanam di dalam tray yang berisi
coco-peat, dan ditutup dengan plastik. Tanaman ditempatkan di screen house
yang bersuhu sekitar 20oC. Saat ini tanaman transgenik putatif sedang ditanam di
pot (Gambar 6.)
Gambar 6 Kentang transgenik putatif kultivar Agria galur StAHd3a-1 yang
ditanam di screen house
Gen Hd3a yang diintroduksikan pada kentang kultivar Agria belum
dideteksi, tetapi gen hpt yang bertanggung jawab terhadap resistensi higromisin
telah dipautkan (linked) secara fisik dengan gen Hd3a, sehingga tanaman yang
resisten higromisin menyandi gen Hd3a. Meskipun demikian analisis molekuler
untuk mengetahui integrasi gen Hd3a ditanaman transgenik harus dilakukan.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Transformasi genetik kentang kultivar Agria telah berhasil dilakukan dan
menghasilkan delapan tunas transgenik putatif. Rata-rata efisiensi transformasi
pada penelitian ini adalah sangat rendah yaitu 5.01%, dan rata-rata efisiensi
regenerasinya sangat tinggi yaitu 100%. Sebanyak lima dari delapan tunas
transgenik telah berumbi pada waktu empat minggu setelah tanam, sedangkan
tunas non-transgenik membutuhkan waktu 12 minggu setelah tanam. Hal tersebut
menunjukkan bahwa gen Hd3a selain dapat menginduksi pembungaan juga dapat
menginduksi pembentukan umbi pada kentang kultivar Agria.
8
Saran
Tanaman kentang kultivar Agria transgenik perlu dilakukan analisis
molekuler untuk mengetahui integrasi dari gen Hd3a dan perlu dilakukan
pengujian penanaman di lapang.
UCAPAN TERIMA KASIH
Terima kasih disampaikan kepada Proyek Penelitian Desentralisasi
Baru IPB yang berjudul “Rekayasa genetika tanaman dengan gen toleransi
aluminium dan pembungaan” dengan kontrak Nomor: 48/ IT3.11/LT/2014 atas
nama Prof. Dr. Suharsono yang telah membiayai penelitian ini.
DAFTAR PUSTAKA
Bustomi. 2014. Transformasi genetik kentang (Solanum tuberosum L) kultivar
Baraka dengan gen pembungaan Hd3a [skripsi]. Bogor (ID): Institut
Pertanian Bogor.
[Deptan] Departemen Pertanian. 2012. Permintaan Kentang Tahun 1992-2011.
[Internet]. [diunduh 2013 Desember 28 ]. Tersedia pada:
http://www.deptan.go.id
Haasse NU, Anton JH. 2006. Potato Development in a Changing Europe.
Netherlands (NL): Wageningen Academic Publishers.
Kojima S, Takahashi Y, Kobayashi Y, Monna L, Sasaki T, Araki T, Yano M.
2002. Hd3a, a rice ortholog of the Arabidopsis FT gene, promotes
transition to flowering downstream of Hd1 under short-day conditions.
Plant Cell Physiol 43 (10):1096–1105.
Li M, Li H, Hu X, Pan X, Wu G. 2011. Genetic transformation and
overexpression of a rice Hd3a induces early flowering in Saussurea
involucrata Kar.et Kir. ex Maxim. Plant Cell Tiss Organ Cult 106:363371.
Mardiyyah IM. 2014. Introduksi gen pembungaan Hd3a ke dalam tanaman
kentang (Solanum tuberosum L.) kultivar Diamant [makalah seminar].
Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Murashige T, Skoog F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays
with tobacco culture. Physiol Plant 15: 473-497.
Navarro C. Abelanda JA, Cruz EO, Carlos A, Tamaki S, Silva J, Shimamoto K,
Prat S. 2011. Control of flowering and storage organ formation in potato
by flowering locus T. Nature 478: 119-123.
Nurhasanah, Wattimena GA, Purwito A, Wiendi NMA, Suharsono. 2003.
Transformasi genetik tanaman kentang cv. Atlantik dengan
9
mengintroduksikan gen hordothionin untuk mendapatkan ketahanan
terhadap penyakit bakteri. Buletin Agronomi 31(2): 63-67
Sahat S, Ashandi AA. 1995. Percobaan kultivar komersial kentang di dataran
tinggi Ngablak, Magelang. J Hort 5(4): 16-21
Senjaya SK. 2013. Pewarisan genetik transgen Hd3a pada tanaman Nicotiana
benthamiana transgenik [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Smith O. 1968. Potatoes: Production, storing, processing. London (GB): Avi
Publishing Company.
Sulistyaningsih YC. 2012. Rekayasa ekspresi gen pembungaan Hd3a pada
tanaman jarak pagar (Jatropha curcas L.) [disertasi]. Bogor (ID): Institut
Pertanian Bogor.
Syafitri LN. 2012. Transformasi genetik Nicotiana benthamiana dengan gen
pembungaan Hd3a dari padi [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Tamaki S, Matsuo S, Wong H, Yokoi S, Shimamoto K. 2007. Hd3a protein is a
mobile flowering signal in rice. Science 36:1033-1036.
Tsuji H, Tamaki S, Komiya R, Shimamoto K. 2008. Florigen and the
photoperiodic control of flowering in rice. Rice 1:25-35.
Yamamoto T, Kuboki SY, Lin T, Sasaki, Yano M. 1998. Fine mapping of
quantitative trait locus hd-1, hd-2, hd-3, controlling heading date of rice, as
single mendelian factors. Theor Appl Genet 97: 37-44.
Yano et al. 2001. Hd 1, A major photoperiod sensitivity quantitative trait locus in
rice, is closely related to the Arabidopsis flowering time gene constans.
The Plant Cell 12: 2473-2483.
10
Lampiran 1 Komposisi media MS (Murashige dan Skoog 1962)
Bahan
*
NH4NO3
KNO3
KH2PO4
H3BO3
Na2MoO4.2H2O
CoCl2.6H2O
KI
*
CaCl2.2H2O
MgSO4.7H2O
MnSO4.4H2O
ZnSO4.7H2O
CuSO4.5H2O
Na2EDTA
FeSO4.7H2O
Thiamine-HCl
Niacin (asam
nikotinat)
Pyridoxine-HCl
Glycine
Myo inositol
Gula pasir
Agar
*
Konsentrasi
senyawa dalam
media (mg/L)
1650
1900
170
6.2
0.25
0.025
0.83
440
370
22.3
8.6
0.025
37.3
27.8
0.1
0.5
0.5
2.0
100
30 g/L
8 g/L
11
Lampiran 2 Komposisi media MS2 makro
Bahan
*
NH4NO3
KNO3
KH2PO4
H3BO3
Na2MoO4.2H2O
CoCl2.6H2O
KI
*
CaCl2.2H2O
MgSO4.7H2O
MnSO4.4H2O
ZnSO4.7H2O
CuSO4.5H2O
Na2EDTA
FeSO4.7H2O
Thiamine-HCl
Niacin (asam
nikotinat)
Pyridoxine-HCl
Glycine
Myo inositol
Gula pasir
Agar
*
Konsentrasi
senyawa dalam
media (mg/L)
3300
3800
170
6.2
0.25
0.025
0.83
440
370
22.3
8.6
0.025
37.3
27.8
0.1
0.5
0.5
2.0
100
30 g/L
8 g/L
12
Lampiran 3 Rumus efisiensi transformasi dan efisiensi regenerasi
% ET =
Jumlah KRH
ETT
X 100 %
% ER =
Jumlah KRG
KTT
X 100 %
Keterangan:
ET = Efisiensi Transformasi
KRH = Kalus Resisten Higromisin
ETT = Eksplan total yang ditransformasi
ER = Efisiensi Regenerasi
KRG = Kalus yang beregenerasi
KTT = Kalus total hasil transformasi
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Indramayu, 28 Juli 1992 sebagai anak kedua dengan
satu kakak dan dua adik dari pasangan Bapak Mahrus Ma’shum dan Ibu Zahrotun
Nasiha. Pendidikan dasar diselesaikan pada tahun 2004 Di SD Negeri
Pekandangan V. Pendidikan lanjutan menengah pertama diselesaikan pada tahun
2007 di SMP Negeri 1 Indramayu, kemudian melanjutkan pendidikan menengah
atas di MAN Model Ciwaringin Cirebon dan lulus pada tahun 2010. Melalui jalur
USMI Institut Pertanian Bogor penulis melanjutkan pendidikannya sebagai salah
satu mahasiswa Biologi, Fakultas Matematika dan Pengetahuan Alam, Insitut
Pertanian Bogor pada tahun 2010.
Selama menjalani pendidikan sebagai mahasiswa, penulis aktif dalam
berbagai kegiatan termasuk menjadi asisten praktikum Biologi Dasar pada tahun
ajaran 2013/2014 dan 2014/2015, dan asisten praktikum Pengantar Genetika
Molekuler pada tahun ajaran 2013/2014, pengajar privat di Generasi Cendekia
tahun 2013-2015, Anggota Divisi Kajian Budaya tahun 2011/2012 dan Anggota
Divisi Informasi dan Komunikasi tahun 2012/2013 UKM Gentra Kaheman IPB,
Anggota Organisasi Mahasiswa Daerah (OMDA) Cirebon tahun 2011, Praktik
Lapangan di PT. Pertamina RU VI Balongan Bagian: Hubungan Masyarakat
tahun 2013.
Penulis juga turut berpartisipasi dalam berbagai kegiatan seperti menjadi
Ketua Divisi Hubungan Masyarakat Festival Budaya IPB tahun 2012, Anggota
Divisi Fundrising MPKMB IPB tahun 2011, Anggota divisi Logistik dan
Transportasi Masa Orientasi Biologi tahun 2012, Anggota Divisi Publikasi,
Dekorasi dan Dokumentasi Bogor City Series tahun 2011, Ketua Divisi Konsumsi
Ki Sunda Midang tahun 2011, Bendahara Pamitran Gentra Kaheman tahun 2011,
Sekertaris penampilan OMDA Cirebon Gebyar Nusantara IPB tahun 2012,
Sekertaris IPB Canvasing OMDA Cirebon tahun 2011, Anggota Divisi Hubungan
Masyarakat IPB Goes to School OMDA Cirebon tahun 2011, Partisipasi dalam
Kegiatan Kunjungan Industri ke PT. Yakult dan PT. Amerta tahun 2013,
Partisipasi Kegiatan Eksplorasi Alam ke “Gua Bawah Tanah Buni Ayu”
Sukabumi HIMABIO IPB tahun 2013.