116
Lampiran 4
. Prosedur baku analisis SSR kelapa sawit
A. Persiapan bahan PCR
Menghitung konsentrasi DNA total
• Konsentrasi DNA total diestimasi berdasarkan hasil pembacaan alat spectrophotometer UV.
• Sebanyak 100 µl larutan DNA stok diencerkan dengan aquades menjadi 6 ml pengenceran 60x. Bila volume akhir DNA hasil pengenceran pada cuvet =
3000 ml, maka dengan pengenceran 60x diperlukan 50 µl DNA stok untuk dilarutkan pada 2950 µl aquades steril.
• Blanko disiapkan pada volume yang sama dengan menggunakan aquades. Absorban A diukur pada panjang gelombang
λ 260 dan 280 nm. • Kemurnian DNA ditetapkan berdasarkan nilai perbandingan A pada
λ260 dengan
λ280. Bila pembacaan absorbansi = 1 berarti konsentrasi DNA adalah 50 µgml dan dianggap sebagai faktor konversi, maka konsentrasi DNA
µgml dalam stok diperoleh dari hasil perkalian faktor konversi, faktor pengenceran dan nilai A pada
λ260 nm. • Tingkat kemurnian yang baik dicapai bila nilai tersebut terletak pada kisaran
1.8-2.0 Sambrook et al., 1989. • Rumus yang digunakan adalah : [DNA] = FK x FP x OD
260
[DNA] : konsentrasi DNA µgml. FK : factor konversi
FP : factor pengenceran • Untuk membuat aliquot dengan konsentrasi 25 ng µl dengan volume akhir
100 µl maka jumlah DNA stok yang diiperlukan dapat dihitung dengan menggunakan rumus :
DNA
s
= [DNA
a
] X volume akhir aliquot OD
260
DNA
s
: Volume DNA stok µl yang diperlukan [DNA
a
] : Konsentrasi DNA aliquot per µl yang diinginkan OD
260
: Nilai OD
260
DNA stok hasil pembacaan spektrofotometer UV Bila jumlah DNA untuk PCR-SSR ditetapkan sebanyak 25ng per µl maka
DNA stok yang dibutuhkan adalah : DNA
s
= 2500OD
260
117
Pengenceran Primer Bahan kimia :
• Pasangan primer SSR, Operon • Air bebas ion ddH
2
O • Pecahan es atau es yang telah diserut
Alat :
• Microcentrifuge • Deepfreezer
Prosedur :
• Pasangan primer SSR desalted terdiri atas dua buah primer yaitu primer forward dan primer reverse.
• Sebelum diencerkan primer terlebih dahulu disentrifusi pada mode short spin sebanyak 3 kali untuk mengendapkan primer.
• Persiapkan tray berisi pecahan es atau es yang telah diserut sebagai wadah primer untuk menjaga agar suhu tetap dingin.
• Selanjutnya ditambahkan air bebas ion ddH
2
O atau buffer TE sesuai petunjuk teknis dari katalog terlampir. Untuk pengenceran, bahan pengencer dapat
digunakan air bebas ion ddH
2
O atau buffer TE. Dalam penelitian ini bahan pengencer yang digunakan adalah air bebas ion ddH
2
O. Sebagai contoh Primer SSR 001 forward dengan kuantitas 5379 pmol agar
konsentrasi akhir menjadi 100 µM maka, ddH
2
O yang harus ditambahkan adalah 537,9 µl. Primer yang sudah diencerkan ini merupakan primer stok.
• Untuk membuat primer sebagai larutan kerja, dengan konsentrasi akhir 10 µM maka primer stok diencerkan kembali sebesar 10x. Untuk tiap 1 µl primer stok
ditambahkan 9 µl ddH
2
O. • Selanjutnya primer stok dan primer kerja disimpan pada freezer suhu -20
C.
118
Master mix PCR-SSR 1 reaksi 25 µl dan 25 reaksi 625 µl Bahan kimia :
• Go taq-green, cat No. • DNA kerja
• Primer SSR • Nuclease
• Pecahan es atau es yang telah diserut
Alat :
• Microcentrifuge • Deepfreezer
Prosedur :
• Persiapkan tray berisi pecahan es atau es yang telah diserut sebagai wadah master mix, primer dan DNA untuk menjaga agar suhu tetap dingin.
• Komposisi master mix 25 reaksi dengan volume 625 µl sebagai berikut. Komposisi
Kuantitas 1X µl Kuantitas 25X µl
Go taq-green master mix : 12,5
312,5 Nuclease-free water
: 9,5 237,5
Untuk primer dan DNA bukan merupakan komponen master mix, kecuali : Bila kita ingin menganalisis DNA dari satu primer yang sama, maka primer
dapat dimasukkan sebagai komponen dari master mix. Bila kita ingin menganalisis primer dari satu DNA yang sama, maka DNA
dapat dimasukkan sebagai komponen dari master mix. Komposisi
Kuantitas 1X µl Kuantitas 25X µl
Forward primer : 1 25
Reverse primer : 1
25 DNA template
: 1 25
• Selanjutnya master mix didistribusikan ke 25 mikro tube PCR 200 µl lalu diikuti dengan pendistribusian komponen yang bukan master mix ke tiap tube
PCR. Sebelum dilakukan PCR bahan disimpan di freezer suhu -20 C.
119
B. Prosedur PCR – SSR kelapa sawit
