98
Lampiran 2
. Prosedur baku pembuatan larutan kimia dan ekstraksi DNA daun kelapa sawit
A. Prosedur baku pembuatan larutan kimia untuk ekstraksi DNA
CTAB 5 bv Larutan stok, 100 ml Rogers dan Bendich 1998
Bahan kimia :
• CTAB N-cetyl, N-trimethyl-ammoniumbromide, MERCK, cat. No. 1.02342.0100.
• NaCl Natrium Chloride, MERCK cat. No. 1.06404.1000. • Aquades steril
Alat :
• Magnetik stirrer • Hot plate stirrer
Prosedur :
• Sebanyak 5,00 g CTAB dan 2,05 g NaCl dimasukkan ke dalam beaker glass 250 ml.
• Ditambahkan 100 ml Aquades steril lalu diletakkan pada hot plate stirrer. • Pelarutan dilakukan dengan menggunakan magnetic stirrer pada hot plate
stirrer .
• Setelah bahan-bahan benar-benar melarut, larutan dimasukkan pada botol kaca bening 100 ml tertutup, lalu disimpan pada suhu ruang.
NaCl 5 M larutan stok, 100 ml Sambrook et al. 1989
Bahan kimia :
• NaCl Natrium Chloride, MERCK cat. No. 1.06404.1000. • Aquades steril
Alat :
• Magnetik stirrer • Hot plate stirrer
99
Prosedur :
• Disiapkan 65 ml aquades steril kemudian ditimbang sebanyak 29,22 g NaCl. • Secara bertahap dilarutkan NaCl dengan aquades ke dalam beaker glass 250 ml
menggunakan magnetic stirrer pada hot plate stirrer. • Pelarutan dilakukan sedikit demi sedikit karena NaCl pekat sukar larut dalam
air. • Setelah seluruh bahan-bahan benar-benar melarut, volume larutan ditepatkan
100 ml dengan menambahkan aquades steril. • Larutan dimasukkan pada botol kaca bening 100 ml tertutup, lalu disimpan
pada suhu ruang.
EDTA 0,5 M pH 8,0 larutan stok, 100 ml
Sambrook et al. 1989
Bahan kimia :
• Na-EDTA Tritriplex III, MERCK cat. No. 1.08418.0250. • NaOH Natrium Hydroxide, MERCK cat. No. 1.06498.0500.
• Aquades steril • Kertas Lakmus
Alat :
• Magnetik stirrer • Hot plate stirrer
• pH meter
Prosedur :
• Sebanyak 18,6 g Na-EDTA dan 2,0 g NaOH dimasukkan ke dalam beaker glass 250 ml.
• Bahan dilarutkan dengan menambahkan 80 ml aquades steril, kemudian pelarutan dilakukan dengan menggunakan magnetic stirrer pada hot plate
stirrer. • Setelah seluruh bahan melarut pengecekan pH dilakukan dengan mencelupkan
kertas lakmus atau pH meter pada larutan.
100 • Pengaturan pH 8,0 dilakukan dengan menambahkan NaOH 2,5 M setetes demi
setetes pada larutan hingga pH yang dikehendaki tercapai. • Volume larutan ditepatkan 100 ml dengan menambahkan aquades steril.
• Larutan dimasukkan pada botol kaca bening 100 ml tertutup, lalu disimpan
pada suhu ruang.
Tris-HCl 1 M pH 8,0 larutan stok, 100 ml Sambrook et al. 1989
Bahan kimia :
• Trizma base, SIGMA cat. No. T-1503. • HCl p.a
• Aquades steril • Kertas Lakmus
Alat :
• Magnetik stirrer • Hot plate stirrer
• pH meter
Prosedur :
• Sebanyak 12,11 g Trizma base dan 4,2 ml HCl dimasukkan ke dalam beaker glass 250 ml.
• Bahan dilarutkan dengan menambahkan 80 ml aquades steril, kemudian pelarutan dilakukan dengan menggunakan magnetic stirrer pada hot plate
stirrer. • Setelah seluruh bahan melarut pengecekan pH dilakukan dengan mencelupkan
kertas lakmus atau pH meter pada larutan. • Pengaturan pH 8,0 dilakukan dengan menambahkan HCl pekat setetes demi
setetes pada larutan hingga pH yang dikehendaki tercapai. • Volume larutan ditepatkan 100 ml dengan menambahkan aquades steril.
• Larutan dimasukkan pada botol kaca bening 100 ml tertutup, lalu disimpan
pada suhu ruang.
101
Tris-HCl 1 M pH 7,4 larutan stok, 50 ml
Sambrook et al. 1989
Bahan kimia :
• Trizma base, SIGMA cat. No. T-1503. • HCl p.a
• Aquades steril • Kertas Lakmus
Alat :
• Magnetik stirrer • Hot plate stirrer
• pH meter
Prosedur :
• Sebanyak 6,055 g Trizma base dan 3,5 ml HCl dimasukkan ke dalam beaker glass 100 ml.
• Bahan dilarutkan dengan menambahkan 40 ml aquades steril, kemudian pelarutan dilakukan dengan menggunakan magnetic stirrer pada hot plate
stirrer. • Setelah seluruh bahan melarut pengecekan pH dilakukan dengan mencelupkan
kertas lakmus atau pH meter pada larutan. • Pengaturan pH 7,4 dilakukan dengan menambahkan HCl pekat setetes demi
setetes pada larutan hingga pH yang dikehendaki tercapai. • Volume larutan ditepatkan 50 ml dengan menambahkan aquades steril.
• Larutan dimasukkan pada botol kaca bening 50 ml tertutup, lalu disimpan pada
suhu ruang.
Na-Asetat 3 M pH 5,2 larutan stok, 100 ml Sambrook et al. 1989
Bahan kimia :
• Na-Asetat.3H
2
O, MERCK, cat. No. 1.06268.0250. • Acetic acid glacial, MERCK, cat. No. 1.00063.2500.
• Aquades steril • Kertas Lakmus
102
Alat :
• Magnetik stirrer • Hot plate stirrer
• pH meter
Prosedur :
• Sebanyak 40,81 g Na-Asetat.3H
2
O dimasukkan ke dalam beaker glass 250 ml. • Bahan dilarutkan dengan menambahkan 55 ml aquades steril, kemudian
pelarutan dilakukan dengan menggunakan magnetic stirrer pada hot plate stirrer.
• Setelah seluruh bahan melarut pengecekan pH dilakukan dengan mencelupkan kertas lakmus atau pH meter pada larutan.
• Pengaturan pH 5,2 dilakukan dengan menambahkan acetic acid glacial setetes demi setetes pada larutan hingga pH yang dikehendaki tercapai.
• Volume larutan ditepatkan 100 ml dengan menambahkan aquades steril. • Larutan dimasukkan pada botol kaca bening 100 ml tertutup, lalu disimpan
pada suhu ruang.
TE Tris-EDTA Buffer 50X larutan stok, 50 ml Sambrook et al. 1989
Bahan kimia :
• Larutan stok Tris-HCl 1 M pH 8,0 • Larutan stok EDTA 0,5 M pH 8,0
• Aquades steril • Kertas saring kualitatif
Alat :
• Magnetik stirrer • Hot plate stirrer
Prosedur :
• Sebanyak 25 ml larutan stok Tris-HCl 1 M pH 8,0 dan 5 ml larutan stok EDTA 0,5 M pH 8,0 dimasukkan ke dalam beaker glass 100 ml.
103 • Bahan dilarutkan dengan menambahkan 20 ml aquades steril, kemudian
pelarutan dilakukan dengan menggunakan magnetic stirrer pada hot plate stirrer.
• Setelah seluruh bahan melarut, larutan disaring menggunakan kertas saring kualitatif.
• Larutan dimasukkan pada botol kaca bening 50 ml tertutup, lalu disimpan pada suhu ruang.
Buffer ekstraksi-CTAB larutan kerja, 250 ml Rogers dan Bendich 1998
Bahan kimia :
• Larutan stok CTAB 5 • Larutan stok NaCl 5 M
• Larutan stok Tris-HCl 1 M pH 8,0 • Larutan stok EDTA 0,5 M pH 8,0
• Aquades steril.
Alat :
• Magnetik stirrer • Hot plate stirrer
Prosedur :
• Sebanyak 100 ml larutan stok CTAB 5, 63 ml larutan stok NaCl 5 M, 25 ml larutan stok Tris-HCl 1 M pH 8,0 dan 10 ml larutan stok EDTA 0,5 M pH 8,0
dimasukkan ke dalam beaker glass 500 ml. • Bahan dilarutkan dengan menambahkan 52 ml aquades steril, kemudian
pencampuran dilakukan dengan menggunakan magnetic stirrer pada hot plate stirrer.
• Setelah seluruh bahan melarut, larutan dimasukkan pada botol kaca bening 250 ml tertutup, lalu disimpan pada suhu ruang.
104
KIAA 24:1 larutan kerja, 100 ml
Sambrook et al. 1989
Bahan kimia :
• Chloroform, MERCK, cat. No. 1.02445.2500. • Isoamilalkohol, MERCK, cat. No. 1.00979.1000.
• Aquades steril.
Prosedur :
• Sebanyak 96 ml Chloroform dan 4 ml isoamilalkohol dimasukkan ke dalam botol kaca bening 100 ml tertutup.
• Pencampuran dilakukan dengan mengguncang botol, lalu disimpan pada suhu ruang.
Isopropanol dingin larutan kerja, 100 ml Bahan kimia :
• Isopropanol, 2-propanol, MERCK, cat. No. 1.09634.2500.
Prosedur :
• Sebanyak 100 ml isopropanol dimasukkan ke dalam botol kaca bening 100 ml tertutup.
• Lalu disimpan di dalam lemari pendingin suhu 4 C.
Ethanol absolut larutan kerja, 100 ml Bahan kimia :
• Ethanol p.a., MERCK, cat. No. 1.00983.2500.
Prosedur :
• Sebanyak 100 ml ethanol dimasukkan ke dalam botol kaca bening 100 ml tertutup. Lalu disimpan di dalam lemari pendingin suhu 4
C.
Ethanol 70 larutan kerja, 100 ml Bahan kimia :
• Ethanol p.a., MERCK, cat. No. 1.00983.2500. • Aquades steril.
105
Prosedur :
• Sebanyak 70 ml Chloroform dan 30 ml aquades steril dimasukkan ke dalam botol kaca bening 100 ml tertutup.
• Pencampuran dilakukan dengan mengguncang botol, lalu disimpan di dalam lemari pendingin suhu 4
C.
RNAase-A larutan stok, 10 mgml Bahan kimia :
• RNAase-A, SIGMA cat. No. R-5125 • Larutan stok Na-Asetat 3 M pH 5,2
• Larutan stok Tris-HCl 1 M pH 7,4 • Aquades steril.
Alat :
• Waterbath
Prosedur :
• Sebanyak 10 mg RNAase-A, 3,3 µl larutan stok Na-Asetat 3 M pH 5,2 dan 996,7 µl aquades dimasukkan ke dalam tabung mikro 2 ml.
• Pencampuran dilakukan dengan spin manual. • Suspensi yang terbentuk diinkubasi di dalam waterbath pada suhu 100
C selama 15 menit untuk menghilangkan DNAase yang masih terdapat pada
RNAase. • Suspensi dibiarkan dingin pada suhu ruang, kemudian ditambahkan 100 µl
larutan stok Tris-HCl 1 M pH 7,4 0,1 volume. • Untuk satu stok sampel DNA volume 500 µl aplikasi larutan RNAase-A
diberikan sebanyak 5,5 µl. • Apabila larutan RNAase-A digunakan untuk jangka panjang sebaiknya
dibuatkan aliquot-nya.
106
TE Buffer 1X larutan kerja, 100 ml Bahan kimia :
• Larutan stok TE buffer 50X. • Aquades steril.
Prosedur :
• Sebanyak 2 ml larutan stok TE buffer 50X dan 98 ml aquades steril dimasukkan ke dalam botol kaca bening 100 ml tertutup.
• Pencampuran dilakukan dengan mengguncang botol, lalu disimpan pada suhu ruang.
B. Prosedur ekstraksi DNA kelapa sawit
Kategori