3 Mencit mati
3.4 Alat dan Bahan 3.4.1 Alat
a. Kandang mencit
b. Tempat makan dan minum mencit
c. Timbangan mencit, timbangan analitik
d. Logbook dan alat tulis
e. Automatic Biochemistry Analyser Kenza 240 TX
f. Alat treadmill listrik
g. Micropipet
h. Spuit 1 cc
i. Flacon
j. Tip
k. Vacutainer
3.4.2 Bahan
a. Mencit jantan usia 6-8 minggu
b. Pakan Tinggi Lemak Protein TLP
c. Pakan standar
d. Larutan anestesi ketaminexylazine
e. Reagen HDL-Cholesterol REF 90206 direct method
f. Reagen LDL-Cholesterol REF 90416 direct method
g. Reagen Cholesterol REF 80106 CHOD-PAP method
h. Reagen Trigliserida REF 80019 GPO method
3.5 Identifikasi Variabel dan Definisi Operasional Variabel
3.5.1 Identifikasi Variabel
a. Variabel bebas independent variable dalam penelitin ini adalah pemberian perlakuan treadmill dan diet tinggi
lemak dan protein kepada mencit jantan Mus musculus l.. b. Variabel terikat dependent variable P1da penelitian ini
adalah profil lipid darah fraksi lemak total, Trigliserida, HDL, LDL mencit jantan Mus musculus l..
3.5.2 Definisi Operasional Variabel
Pada tabel 1 dilampirkan definisi konsep dan operasional untuk memudahkan penjelasan dan memperlihatkan variabel-variabel
yang terlibat dalam penelitian ini:
No. Variabel
Definisi Hasil Ukur
Jenis Variabel 1.
Treadmill Treadmill adalah
alat olahraga
listrik yang
digunakan untuk berlari
memiliki Panjang 40 cm.
Treadmill yang
digunakan dalam 0=
tidak dilakukan
treadmill 1 = 1 x 10
menit 2= 2 x 10
menit Nominal
penelitian ini
adalah treadmill
yang berukuran
kecil dan
disambungkan ke listrik,
untuk memberi
perlakuan kepada hewan coba agar
bisa berlari
di atasnya
tanpa berhenti
dengan kecepatan
20 meter per menit
dan waktu yang telah
peneliti tetapkan.
Kelompok perlakuan
P1 dilakukan
treadmill selama
10 menit sehari sekali selama 28
hari, dan
P2 dilakukan
treadmill selama
Lanjutan tabel 4
10 menit 2 kali sehari selama 28
hari.
2. Profil Lipid
Metode yang
dilakuan untuk
evaluasi lipid
berupa kadar
fraksi lemak total, HDL, LDL dan
trigliserida. Kadar dalam
plasma mgdL
Numerik
4.
Mencit Obesitas Mencit
Mus musculus
jantan galur
DDY dengan
berat badan lebih dari
30 gram gram
Tabel 4 . Definisi Operasional Variabel
3.6 Prosedur Penelitian
3.6.1 Alur Penelitian
Penelitian ini adalah uji eksperimental laboratorium dalam bidang ilmu Biologi-Biokimia Molekuler dan Patologi Klinik. Penelitian
dilakukan untuk mengetahui pengaruh perlakuan treadmill terhadap profil lipid mencit obesitas. Mencit dibagi atas 4 kelompok besar
yang terdiri dari 7 mencit jantan tiap kelompoknya, dengan total mencit jantan yang digunakan adalah sebanyak 28 ekor. Kelompok
Lanjutan tabel 4
perlakuan dalam penelitian ini adalah kelompok kontrol normal K yaitu mencit dengan berat badan normal, kontrol positif KP yaitu
mencit obesitas, dan kelompok perlakuan 1 P1 yaitu mencit obesitas yang diberi perlakuan treadmill selama 10 menit sehari
sekali selama 28 hari, perlakuan 2 P2 yaitu mencit obesitas yang diberi perlakuan treadmill selama 10 menit sehari 2 kali selama 28
hari.
Sebelum dilakukan penelitian, mencit malalui masa adaptasi di laboratorium selama 7 hari. Suhu kandang dijaga sekitar 25
˚
C dan ada pertukaran gelap dan terang setiap 12 jam.
• Kelompok K diberi pakan standar dan minum ad libitum selama
28 hari. •
Kelompok KP diberi pakan dengan kombinasi makanan tinggi lemak dan protein serta minum ad libitum selama 28 hari.
• Kelompok P1 diberi pakan dengan kombinasi makanan tinggi
lemak dan protein serta minum ad libitum dan diberi perlakuan treadmill selama 10 menit sehari sekali selama 28 hari.
• Kelompok P2 diberi pakan dengan kombinasi makanan tinggi
lemak dan protein serta minum ad libitum dan diberi perlakuan treadmill selama 10 menit sehari dua kali selama 28 hari.
Pada hari ke-29 mencit dipuasakan dahulu selama 10 jam, kemudian dilakukan terminasi pada mencit lalu dilakukan cardiac
puncture untuk pemeriksaan profil lipid.
3.6.2 Prosedur Pemberian Perilaku Treadmill
Pada penelitian ini digunakan alat treadmill khusus yang disambungkan dengan listrik dan memiliki panjang lintasan 40cm.
Setelah alat treadmill dihidupkan, mencit diletakkan di atasnya dan dibiarkan berlari selama 10 menit untuk satu kali pemberian
perlakuan pada kelompok P1 dan selama 10 menit sehari 2 kali untuk kelompok P2.
3.6.3 Prosedur Pengambilan darah mencit
Prosedur pengambilan darah mencit diawali dengan prosedur terminasi. Mencit diberikan obat anestesi Ketaminexylazine 75-100
mgkg + 5-10 mgkg secara IP. Kemudian tikus di euthanasia menggunakan metode cervical dislocation Leary et al. 2013.
Setelah tikus dipastikan mati, dilakukan bedah kemudian dilakukan cardiac puncture dan diambil organ jantung.
Darah mencit diambil menggunakan spuit
sebanyak 1cc menggunakan metode cardiac puncture. Darah dimasukkan ke
dalam vacutainer. Komponen darah yang digunakan untuk pemeriksaan profil lipid adalah komponen serum.
3.6.3 Prosedur Penentuan Profil Lipid
Darah mencit terlebih dahulu dibuat dalam bentuk serum dengan melakukan sentrifugasi Pada kecepatan 12.000 rpm selama 2 menit.
Setelah sentrifugasi selesai, serum akan terbentuk berupa warna bening pada bagian atas. Serum akan digunakan dalam analisis
profil lipid yang meliputi kolesterol total, trigliserida, HDL, dan LDL. Pada pemeriksaan ini akuades digunakan sebagai larutan
blanko.
Analisis kolesterol dilakukan melalui metode CHOD-PAP dengan pengambilan 10 μ L serum darah ditambahkan 1 ml reagen. Larutan
blanko menggunakan akuades sebanyak 10 μ L lalu ditambahkan 1 ml reagen. Larutan standar dipersiapkan sebanyak 10 μ L dan
ditambhkan 1 ml reagen. Selanjutnya serum, larutan blanko dan larutan standar yang telah diberi reagen dimasukkan ke dalam alat
untuk dilakukan pemeriksaan fotometri pada absorbansi 500nm.
Analisis trigliserida dilakukan melalui metode GPO dengan pengambilan 10 μ L serum darah ditambahkan 1 ml reagen. Larutan
blanko menggunakan akuades sebanyak 10 μ L lalu ditambahkan 1 ml reagen. Larutan standar dipersiapkan sebanyak 10 μ L dan
ditambhkan 1 ml reagen. Selanjutnya serum, larutan blanko dan
larutan standar yang telah diberi reagen dimasukkan ke dalam alat untuk dilakukan pemeriksaan fotometri pada absorbansi 500nm
Analisis HDL dilakukan melalui metode direct melalui dua tahap pemeriksaan fotometri. Pertama, serum sebanyak 3 μ L
ditambahkan 300 μ L reagen R1 accelerator. Larutan calibrator disiapkan menggunakan reagen kalibrator CK-MB sebanyak 3μ L
dan dicampur dengan 300 μ L reagen R1. Larutan blanko dipersiapkan dengan mengambil 300 μ reagen R1. Masing-masing
larutan yang telah dicampur dengan reagen dimasukkan ke dalam alat pada pemeriksaan absorbansi 600nm. Setelah itu, masing-
masing larutan blanko, kalibartor dan serum ditambahkan 100 μ L reagen R2 selective detergent dan kembali diperiksa pada
absorbansi 600 nm.
Analisis LDL dilakukan melalui metode direct melalui dua tahap pemeriksaan fotometri. Pertama, serum sebanyak 3 μ L
ditambahkan 300 μ L reagen R1 reagent enzymes. Larutan calibrator disiapkan menggunakan reagen kalibrator CK-MB
sebanyak 3μ L dan dicampur dengan 300 μ L reagen R1. Larutan blanko dipersiapkan dengan mengambil 300 μ reagen R1. Masing-
masing larutan yang telah dicampur dengan reagen dimasukkan ke dalam alat pada pemeriksaan absorbansi 546 nm. Setelah itu,
masing-masing larutan blanko, kalibartor dan serum ditambahkan
100 μ L reagen R2 selective detergent dan kembali diperiksa pada absorbansi 546 nm.
ALUR PENELITIAN
Bagan 3 . Alur Penelitian
Mencit diadaptasikan di laboratorium selama 7 hari
P2 P1
KP K
Mencit di beri pakan standar
dan minum ad libitum selama
28 hari Mencit di beri
pakan TLP dan minum ad
libitum selama 28 hari.
Mencit di beri pakan TLP dan
minum ad libitum +
treadmill 10 menithari,
selama 28 hari. Mencit di beri
pakan TLP dan minum ad
libitum + treadmill 2x10
menithari selama 28 hari.
Pada hari ke-29, mencit dipuasakan dahulu selama 10 jam, kemudian di anestesi Mencit dilakukan cardiac puncture
Darah mencit sebanyak 1 cc disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 2 menit
Serum diambil masing-masing sebanyak 10 μ l Kolesterol , 10 μ l Trigliserida, 3 μ l LDL, 3 μ l HDL ditambah reagen kolesterol dan trigliserida sebanyak 1 ml dan
reagen HDL dan LDL sebanyak 300 μ l R1 dan 100 μ l R2
Membandingkan profil lipid mencit K,KP, P1, dan P2 Analisis data
Interpretasi hasil pengamatan Larutan Blanko, standar dan kalibrator dipersiapkan
Pengukuran menggunakan alat menggunakan Automatic Biochemistry Analyzer pada absorbansi 500 nm Kolesterol dan Trigliserida, 600 nm HDL dan 546 nm
LDL
Keterangan : K = Kelompok Kontrol Normal Tidak Obesitas, Tidak Treadmill
KP = Kelompok Kontrol Obesitas Obesitas, Tidak Treadmill P1 = Obesitas, Kelompok Perlakuan Treadmill 10 menithari
P2 = Obesitas, Kelompok Perlakuan Treadmill 2 x 10 menithari Pakan TLP = Pakan Tinggi Lemak dan Protein
3.7 Rancangan Analisis Data
Analisis data pada penelitian ini diproses pada program statistik dengan menggunakan tingkat signifikasi p0,05. Prosedur pengolahan data yang
dilakukan adalah sebagai berikut :
3.7.1 Uji Normalitas Data p0,05
Pengujian normalitas data menggunakan Shapiro Wilk test untuk mengetahui data berdistribusi normal atau tidak normal karena
jumlah populasi yang digunakan 50. Selanjutnya digunakan analisis parametrik bila data berdistribusi normal. Jika data berdistribusi
tidak normal, tetapi homogen, atau berdistribusi normal tetapi tidak homogen, maka dilakukan transformasi data. Jika hasil transformasi
data didapatkan data normal dan homogen, maka dilakukan analisis parametrik. Apabila hasil transformasi data masih berdistribusi tidak
normal, homogen, atau berdistribusi normal, tidak homogen, maka dilakukan analisis non parametrik Kruskal Wallis.
3.7.2 Uji Homogenitas Data p0,05
Uji Leven’s digunaan untuk mengetahui data homogen atau tidak homogen. Hasil uji homogenitas ini untuk menentukan analisis
berikutnya, yaitu analisis Parametrik bila data berdistribusi normal atau non parametrik apabila data tidak berdistribusi normal.
3.7.3 Uji Parametri Dependent t-test
Uji parametri dependent T-Test dilakukan untuk menguji pengaruh perlakuan pada kelompok kontrol K, kelompok kontrol obesitas
KP, dan kelompok perlakuan P1 dan P2 terhadap profil lipid dan gambaran histopatologi arteri koronaria mencit obesitas yang diberi
perlakuan treadmill
3.7.3 Uji Parametrik One way- Anova
Uji parametrik One way-Anova dilakukan
untuk menguji perbedaan pengaruh kelompok kontrol 1 K, kelompok kontrol 2
KP, dan kelompok perlakuan P1 dan P2 terhadap profil lipid dan gambaran histopatologi mencit obesitas yang diberi perlakuan
treadmill. Uji non Parametrik Kruskal-Wallis digunakan apabila data tidak memenuhi syarat uji parametrik. Hipotesis dianggap bermakna
bila p0,05. Jika pada uji One way-Anova atau Kruskal-Wallis menghasilkan nilai p0,05, maka dilanjutkan dengan melakukan
analisis Post-Hoc LSD untuk melihat perbedaan pengaruh antar kelompok.
3.8 Dummy Table
3.8.1 Pengaruh perlakuan treadmill terhadap kadar kolesterol total
Kelompok Perlakuan Rerata Kadar Kolesterol total
mgdL P
K KP
P1 P2
3.8.2 Pengaruh perlakuan treadmill terhadap kadar trigliserida
Kelompok Perlakuan Rerata kadar trigliserida
mgdL P
K KP
P1 P2
3.8.3 Pengaruh perlakuan treadmill terhadap kadar HDL
Kelompok Perlakuan Rerata Kadar HDLmgdL
P K
KP P1
P2
3.8.4 Pengaruh perlakuan treadmiil terhadap kadar LDL
Kelompok Perlakuan Rerata Kadar LDLmgdL
P K
KP P1
P2
3.9 Ethical Clearance
Surat persetujuan etik penelitian akan disampaikan kepada komisi etik Fakultas Kedokteran Universitas Lampung agar mendapat persetujuan dan
lulus syarat etik penelitian.
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
5.1.1 Perlakuan treadmill 2x10 menit per hari menurunkan kadar kolesterol lebih tinggi pada mencit Mus musculus obesitas dengan nilai p=0,000
5.1.2 Perlakuan treadmill 2x10 menit per hari menurunkan kadar trigliserida lebih tinggi pada mencit Mus musculus obesitas dengan nilai p=0,000
5.1.3 Perlakuan treadmill 1x10 menit per hari menaikkan kadar HDL lebih tinggi pada mencit Mus musculus obesitas dengan nilai p=0,000
5.1.4 Perlakuan treadmill 2x10 menit per hari menurunkan kadar LDL lebih tinggi pada mencit Mus musculus obesitas dengan nilai p=0,000
5.1.5 Perlakuan treadmill berpengaruh terhadap profil lipid mencit Mus musculus Obesitas dengan nilai p=0,000
5.2 Saran
Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui rentang durasi treadmill yang masih berpengaruh terhadap penurunan profil lipid mencit
obesitas.
DAFTAR PUSTAKA
American Physiological Society. 2006. Resource Book for the Design of Animal Exercise Protocols. hlm.43-47
Barret K, Barman SM, Brooks HL, Boitano S. 2010. Ganong’s review of medical
physiology. Edisi ke-23. United States: McGrawHill Bautista M, Esquel SJ, Esquivel CS, Durant MI, Valadez VC. 2011.Inflammation,
oxidative stress, and obesity. International Journal of Molecular Sciences. 1210:117
–132. Baynard T, Vieira VJ, Valentine RJ, Woods JA. 2012. Exercise training effects on
inflammatory gene expression in white adipose tissue of young mice. Hindawi Publishing Corporation. 2012:1
–7. Bernlohr DA, Jenkins AE Bennaars AA. 2002. Adipose tissue and lipid
metabolism. In: Vance DE and Vance JE, editors. Biochemistry of Lipids, Lipoproteins and Membranes. 4
th
Edition. USA. Elsevier Science. hlm. 263 –
289. Coker SOW. 2002. Red blood cell hemolysis during processing. Transfussion
Medicine Reviews. 161:46-60 Eisinger K, Liebisch G, Schmitz G, Aslanidis C, Krautbauer S, Buechler C.
2014. Lipidomic analysis of serum from high fat diet induced obese mice. International journal of molecular sciences. 15:91
–102 Flier JS Maratos E. 2010. Biology of Obesity. Dalam: Jameson JL, penyunting.
Harrison ’s endocrinology. Second Edition. USA:Mc Graw Hill. hlm.242
Fox JG, Barthold S, Davisson M, Newcomer CE, Quimby FW, Smith A. 2006. The mouse in biomedical research: normative biology, husbandry, and
models. Second edition. Philadelphia:Academic Press. hlm.455
Good, Deborah J. 2005. Using obese mouse models in research: special considerations for IACUC members, animal care technicians, and
researchers. Univesity Masatchussets. 342:30 –37.
Guerra RLF, Prado WL, Cheik NC, Viana FP, Botero JP, Vendramini RC et al., 2007. Effects of 2 or 5 consecutive exercise days on adipocyte area and lipid
parameters in Wistar rats. Lipids in health and disease, 6:1-8
Guyton AC Hall JE. 1996. Metabolisme Lemak. Dalam: Setiawan I, penyunting. Buku ajar fisiologi kedokteran. Jakarta: EGC. hlm.1088
Haastrup AT, Stepniakowski KT, Goodfriend T L, Egan BM. 1998. Intralipid enhances alpha1-adrenergic receptor mediated pressor sensitivity. Journal of
Hypertension. 32:693 –698.
Hashimoto T, Sato K, Iemitsu M. 2013. Exercise-inducible factors to activate lipolysis in adipocytes. J Appl Physiol.115:260
–267. ITIS Report. 2015. Mus musculus taxonomy. Integrated Taxonomic Information
System on-line database. Available online at: http:www.itis.gov. Diakses pada tanggal 17 September 2015
Jo J, Gavrilova O, Pack S. Jou W. Mullen S. Sumner AE et al., 2009. Hypertrophy andor hyperplasia: Dynamics of adipose tissue growth. PLoS
Computational Biology. 53:1-11
John MFA. 2009. Dislipidemia. Dalam: Sudoyo AW, Setiyohadi B, Alwi I, Simadibrata M, Setiati S, penyunting. Buku Ajar Ilmu Penyakit Dalam Jilid
III. Edisi ke-4. Jakarta:FKUI. hlm.1948 –1954.
Joyner MJ, Green DJ. 2009. Exercise protects the cardiovascular system :
effects beyond traditional risk factors. Journal of Physiology. 58723:51 –58.
Kawanishi N, Yano H, Yokogawa Y, Suzuki K. 2010. Exercise training inhibits inflammation in adipose tissue via both suppression of macrophage
infiltration and acceleration of phenotypic switching from M1 to M2 macrophages in high-fat-diet- induced obese mice. Dalam: Hirumi Yano,
penyunting. Exercise and machropage phenotype in obese mice. Okayama:Univesity of medical Walfare.hlm.105-118
Kementrian Kesehatan RI, 2013. Riset kesehatan dasar. Jakarta Kemi OJ, Loennechen JP, Wisloff U. Ellingsen O. 2002. Intensity-controlled
treadmill running in mice: cardiac and skeletal muscle hypertrophy. Journal of applied physiology. 93:301
–309. Khan WA, Blobe G, Halpern A, Taylor W, Wetsel WC, Burns D et al., 1993.
Selective regulation of protein kinase C isoenzymes by oleic acid in human platelets. Journal of Biological Chemistry, 2687:63
–68. Klein S, Burke LE, Bray GA, Blair S, Allison DB, Pi SX et al., 2004. Clinical
implications of obesity with specific focus on cardiovascular disease: A
statement for professionals from the American Heart Association Council on Nutrition, Physical Activity, and Metabolism. Circulation. 110:52
–67. Klop B, Elte JWF, Cabezas MC. 2013. Dyslipidemia in Obesity: Mechanisms
and Potential Targets. Nutrients. 5:218 –240.
Kotsos V, Stabouli S, Papakatsika S, Rizos Z Parati G. 2010. Mechanisms of obesity-induced hypertension Mechanisms of obesity-induced hypertension.
Hypertension Research. 33:386 –393.
Kumar V, Cotran RS, Robbins SL, Salzer MJC, Crawford JM. 2007. Pankreas. Dalam: Hartanto H, Darmaniah N, Wulandari N, penyunting. Buku ajar
Patologi Volume 2. Edisike-7. Jakarta: EGC. hlm. 723-724.
Lau DCW, Dhillon B, Yan H, Szmitko PE, Verma S. 2005. Adipokines: molecular links between obesity and atheroslcerosis. American journal of
physiology Heart and circulatory physiology. 288:031 –041.
Leary S, Underwood W, Lilly E, Anthony R, Cartner S, Corey D. et al., 2013. AVMA Guidelines for the euthanasia of animals :Scamburg. hlm. 38
Mann S, Beedie C, Jimenez, A. 2014. Differential effects of aerobic exercise, resistance training and combined exercise modalities on cholesterol and the
lipid profile : review, synthesis and recommendations. Sports Medicine. 44:211
–221. Marchon C, Marco OE, Silva V, Katia A, Lacchini S, Souza RR. et al., 2015.
Effects of moderate exercise on the biochemical, physiological, morphological and functional parameters of the aorta in the presence of
estrogen deprivation and dyslipidemia: an experimental model. Cellular Physiology and Biochemistry, 35:397
–405. McArdle MA, Finucane OM, Connaughton RM, McMorrow AM, Roche HM. et
al., 2013. Mechanisms of obesity-induced inflammation and insulin resistance: Insights into the emerging role of nutritional strategies. Frontiers
in Endocrinology.4May:1 –23.
Moore KJ Tabas I. 2011. Review macrophages in the pathogenesis of atherosclerosis. Cell, 1453:341
–355. Murray RK, Granner DK, Rodwell VW, Botham KM, Mayes PA, Bender DA, et
al., 2009. Pengangkutan dan penyimpanan lipid. Dalam: Wulandari N, Randy L, Dwijayanthi L, Liena, Dany F, rachman LY, penyunting. Biokimia
Harper. Jakarta: EGC. hlm.225-238
Nikolac, N. 2014. Lipemia: causes, interference mechanisms, detection and management. Biochemia Medica. 241: 57-67
