DETEKSI MUTAN MANGGIS IN VITRO DENGAN MARKA RAPD

114

VI. DETEKSI MUTAN MANGGIS IN VITRO DENGAN MARKA RAPD

Abstrak Informasi keragaman genetik sangat penting untuk menunjang program pemuliaan manggis. RAPD Random Amplified Polymorphyc DNA adalah marka molekuler yang dapat membantu dalam proses seleksi dalam program pemuliaan tanaman manggis.Tujuan penelitian untuk mempelajari keragaman genetik akibat iradiasi sinar gamma. DNA 22 regeneran manggis yang sudah diseleksi diamplifikasi menggunakan random primer dalam mesin PCR. Primer yang digunakan adalah SBH 13, SBH 18, SB 13, SB 12, dan SB 19. Pembuatan dendogram dilakukan dengan program NTSys-pc versi 2.1. Hasil analisis RAPD menunjukkan perubahan pita lima primer acak berkisar 250-2000 pasang basa pb. Primer SB 19 menghasilkan jumlah pita paling banyak, sedangkan primer SBH 13 menghasilkan jumlah pita paling sedikit. Berdasarkan dendogram analisis RAPD 22 rege neran, nilai kemiripan genetik antara 60 - 91 atau keragaman genetik 9 - 40. Pada nilai kemiripan genetik 60 terbagi menjadi dua kelompok, yaitu kelompok E berbeda dengan kelompok lainnya A, B, C, D, sehingga secara keseluruhan kelompok regeneran dan tanaman kontrol yang dianalisis menghasilkan lima kelompok utama. Sedangkan dendogram analisis morfologi regeneran dan kontrol dikelompokkan menjadi dua kelompok utama, yaitu kelompok utama A dan B dengan kemiripan genetik 59 atau variasi genetik 41 . Kata kunci : Manggis, RAPD, keragaman genetik, Pendahuluan Deteksi mutan dapat dilakukan dengan membedakan fenotipik tanaman karakter morfologi, analisis kandungan biokimia tanaman Gallego Martinez, 1996. Deteksi berdasarkan karakter morfologi tanaman mempunyai kelemahan karena penampakan karakter tersebut diketahui setelah tanaman mencapai fase pertumbuhan tertentu dan membutuhkan waktu yang lama seperti pada tanaman tahunan Meunir, 1992. Selain itu, karakter morfologi sangat dipengaruhi oleh faktor lingkungan Gallego Martinez, 1996, adanya pengaruh pleiotropi dan epistasis George Sadasivam, 1997. Pengamatan sitologi jarang sekali digunakan 115 karena sulit untuk mengamati perbedaan kromosom terutama untuk tanaman-tanaman yang mempunyai jumlah kromosom banyak dan berukuran kromosom kecil. Marka DNA merupakan alternatif dalam menganalisis keragaman genetik tanaman, karena mampu memberikan polimorfik pita DNA dalam jumlah banyak, konsistenstabil, dan tidak dipengaruhi oleh faktor lingkungan. Saat ini telah banyak ditemukan marka molekuler yang didasari pada penggunaan enzim restriksi seperti RFLP maupun dengan penggunaan amplifikasi PCR, antara lain RAPD, AFLP dan SSR Karp et al., 1997. Marka molekuler telah banyak digunakan dalam : 1 penapisan plasma nutfah, 2 estimasi diversitas genetik, 3 identifikasi strain dan proteksi varietas tanaman, 4 introgresi dan piramidisasi gen, 5 pengembangan galur murni dan hibrida Mohapatra, 1997, 6 deteksi mutasi Varghese, 1997. Marka RAPD dihasilkan melalui proses amplifikasi DNA seperti halnya dalam melakukan PCR, perbedaannya terletak pada penggunaan primer oligonukleotida dengan panjang 10 basa yang sekuennya dibuat secara random. Teknik RAPD dapat mendeteksi variasi dengan ada atau tidak adanya amplifikasi polimorfik DNA oleh PCR Dowling et al., 1996. RAPD digunakan untuk mengidentifikasi variasi genetik di dalam atau di antara populasi, dan pemetaan genom Mayer et al., 1997. Teknik RAPD mempunyai beberapa keuntungan dibandingkan teknik lain, yaitu membutuhkan sampel DNA yang lebih sedikit 10 – 25 ng, tidak bersifat radioaktif, pelaksanaanya relatif lebih mudah dan menghasilkan estimasi yang lebih tinggi untuk kesamaan interspesifik Powell et al., 1996. Namun demikian teknik RAPD juga mempunyai beberapa keterbatasan, antara lain tidak dapat membedakan individu homosigot dan heterosigot karena bersifat dominan Ronning Schnell, 1995, perubahan kecil dalam kondisi reaksi dapat merubah jumlah dan intensitas produk amplifikasi sehingga reprodusibilitas sulit dipertahankan Dowling et al., 1996, kesulitan dalam skoring data Karp et al., 1997. Iradiasi sinar gamma dapat menyebabkan mutasi dan perubahan fisiologis. Hasil penelitian sebelumnya tela h diperoleh regeneran manggis in vitro berasal dari beberapa dosis iradiasi sinar gamma. Akan tetapi belum diketahui pola pita DNA regeneran manggis in vitro. 116 Tujuan penelitian untuk mendeteksi regeneran manggis in vitro berdasarkan marka RAPD dan morfolo gi serta mengetahui keragaman genetik regeneran manggis in vitro berdasarkan analisis dendogram. Bahan dan Metode Tempat dan Waktu Percobaan Percobaan dilaksanakan di Laboratorium Kultur Jaringan dan Molekuler Pusat Kajian Buah-buahan Tropika PKBT IPB. Waktu percobaan dilaksanakan bulan Oktober 2004 sampai dengan Februari 2005. Bahan dan Alat Bahan tanaman untuk analisis RAPD adalah DNA 22 regeneran yang terdiri dari 21 regeneran yang telah diseleksi dan satu kontrol Tabel 11. Bahan-bahan yang digunakan untuk analisis RAPD adalah nitrogen cair, PVPP Polyvinyl polypyrrolidone, merkaptoetanol, CTAB, akuades steril, larutan KIA kloroform: isoamil: alkohol, alkohol absolut, isopropanol, etanol 70 , natrium asetat, agarose, air bebas ion, agarose, parafilm, bufer TAE, loading dye, PCR kit, oil mineral , lima primer acak, yaitu SBH 13 3’-GACGCCACAC-5’, SBH 18 3’-ACGCGCATGT- 5’, SB 13 3’-AGTCAGCCAC-5’, SB 12 3’-GAATCGGCCA-5’, SB 19 3’- CAGCACCCAC-5’ Operon Tech Alameda, Calipornia dan 1 kb DNA ladder Promega. Alat-alat yang digunakan tabung mikro, mortal, mikropipet Gilson, vorteks, shaker, freezer, sentrifuge Kubota 1-13, waterbath tipe Memmert, spektrometer UV 200-RS, mesin PCR Temp Control PC 707, bak elektroforesis, UV transiluminator. Ekstraksi DNA Metode isolasi DNA mengikuti prosedur yang dikembangkan oleh Doyle dan Doyle 1990 yang dimodifikasi dengan penambahan 1 PVPP Polyvinyl Poly 117 Pyrolidon. Isolasi DNA dimulai dari jaringan daun manggis yang berasal dari planlet, yaitu seberat 0.25 g ditambah 10 mg PVPP dan nitrogen cair kemudian digerus sampai halus di dalam mortal. Serbuk daun yang didapatkan kemudian dimasukan ke dalam tabung mikro berisi 700 µ l bufer ekstraksi CTAB 3 ; 1.4 M NaCl; 20 Mm EDTA; 100 mM Tris-HCl pH 8.0; dan â- mercaptoethanol. Selanjutnya campuran dikocok dengan menggunakan vorteks dan diinkubasikan dalam waterbath pada suhu 65 o C selama 30 menit. Setelah inkubasi kemudian didinginkan sampai suhu kamar dan ditambahkan 570 µ l buffer kloroform : isoamil alkohol 24:1 ke dalam campuran tersebut, dikocok dengan vortek kemudian dipisahkan dengan sentrifus 12.000 rpm selama 15 menit. Cairan bagian atas supernatan diambil dengan pipet mikro dan dimasukan ke dalam tabung mikro baru. Selanjutnya supernatan ditambah dengan 600 µ l isopropanol dingin kemudian disentrifugasi 12.000 selama 15 menit. Kemudian dibuang bagian atas, pelet DNA ditambah dengan 100 µ l etanol 80 , dan disentrifugasi selama 5 menit. Pelet dikeringkan sampai kering 1 jam di freezer atau semalam dalam suhu kamar, pelet diberi air bebas ion 100 µ l dan disimpan dalam freezer. Pemurnian DNA dilakukan mengikuti prosedur yang dikembangkan Sambrook et al. 1989. Larutan DNA yang diperoleh dimurnikan dengan penambahan 100 µ l bufer fenol dan 100 µ l KIA kloroform : isoamil alkohol dengan perbandingan 24 : 1. Campuran disentrifus 12.000 rpm selama 15 menit, supernatan diambil dan dimasukan ke dalam tabung mikro baru dan ditambah dengan 10 µ l natrium asetat dan 600 µ l isopropanol dingin. Campuran dikocok dan diinkubasi dalam freezer selama 30 menit. Campuran disentrifus 12.000 rpm selama 15 menit, pelet DNA yang diperoleh dicuci dengan 200 µ l etanol 70 kemudian disentrifus 12.000 rpm selama 5 menit. Tabung mikro dibalikan di atas tisu semalam. Setelah kering pelet DNA dilarutkan dengan 100 µ l air bebas ion dan disimpan dalam freezer sebagai stok DNA. 118 Analisis Kuantitas dan Kualitas DNA Kuantitas dan kemurnian DNA dari masing- masing hasil ekstraksi ditentukan dengan menggunakan spektrometer dengan membaca absorban pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Pembacaan absorbans λ 260 = 1 berarti konsentrasi DNA yang didapat sebesar 50 ìgml. Konsentrasi DNA yang didapat dihitung dengan rumus sebagai berikut : DNA ìgml = absorbans λ 260 x faktor pengenceran x 50 Kemurnian DNA ditetapkan berdasarkan nilai rasio absorbans λ 260 280, batas kemurniaan yang biasa dipakai dalam analisis molekuler mempunyai nilai rasio absorbans λ 260 280 sekitar 1.8 – 2.0 Sambrook et al., 1989. Uji kualitas DNA dilakukan dengan mencampur 10 µ l larutan DNA ditambah 2 µ l loading dye di atas kertas parafilm. Campuran DNA dimasukan dalam sumur gel. Proses pembuatan gel, yaitu menimbang 0,8 gr agar agarose Promega ditambah larutan TAE 1X sebanyak 40 ml kemudian dipanaskan dalam microwave selama 5 menit. Elektroforesis dilakukan pada voltase konstan sebesar 60 volt selama 45 jam di dalam bak elektroporesis yang berisi buffer TAE 1X. DNA yang telah dielektroforesis direndam dalam larutan etidium bromida 0,5 mgl selama 45 menit, kemudian divisualisasikan di atas Ultraviolet transiluminator dan didokumentasikan. Amplifikasi DNA manggis dengan menggunakan primer acak dapat dilakukan mengikuti metode yang dikembangkan oleh William et al. 1990. Setiap reaksi amplifikasi menggunakan volume 25 ìl campuran larutan yang terdiri dari 14,37 ìl H 2 O, 2,5 ìl thermophillic DNA poli 10X buffer 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 9.0, 0.1 Triton X-100, 2,5 ìl PCR Nucleotide Mix dNTP 2 mM, 2,5 ìl MgCl 2 25 mM, 0,13 ìl Taq DNA polimerase Promega, 1 ìl primer, dan 2 ìl DNA 50 ng. Primer-primer yang digunakan adalah SB 12, SBH 13, SBH 18, SB 13 dan SB 19. Campuran larutan tersebut ditambah oil mineral sebanyak 20 ìl Promega. Tabung- tabung mikro tersebut dimasukan ke dalam blok mesin PCR Temp Control System PC 707 yang diprogram dengan tahapan sebagai berikut: a. Pre PCR denaturasi awal pada suhu 94 o C selama dua menit sebanyak satu siklus 119 b. PCR : denaturasi suhu 94 o C selama 1 menit, annealing penempelan primer pada suhu 36 o C selama 1 menit dan extention perpanjangan pada 72 o C selama 2 menit dan dilakukan 45 siklus. c. Perpanjangan akhir pada suhu 72 o C selama 4 menit. Hasil amplifikasi PCR di analisis dengan menggunakan elektroforesis 1.4 gel agarose Promega dengan voltase konstan 50 Volt selama 45 menit di dalam bak elektroporesis yang berisi buffer TAE 1X. DNA yang telah dielektroforesis direndam dalam larutan etidium bromida 1 selama 45 menit, kemudian divisualisasikan di atas UV transiluminator dan didokumentasikan. Analisis statistik Produk RAPD hasil pemotretan gel berupa pola pita DNA dengan ukuran tertentu. Ukuran DNA ditentukan dengan membandingkan marka dengan berat molekul 1 kb DNA ladder. Perbedaan antar individu tanaman ditunjukkan dengan adanya jumlah pita dan jarak migrasinya. Pita-pita DNA diubah menjadi data biner dengan melakukan skoring data. Pita diskor “1” bila ada pita atau diskor “0” bila tidak ada pita. Variasi genetik di antara tanaman sampel dihitung dengan menggunakan model jarak genetik 1-F. Nilai F diperoleh berdasarkan estimasi fraksi dari pita F di antara dua populasi sebagai berikut Nei Li,1979 : 2 m xy F =  m x + m y Keterangan : F = koefisien kemiripan genetik m xy = Jumlah pita RAPD dari dua populasi m x = jumlah pita pada individu x m y = jumlah pita pada individu y Data karakter morfo logi juga diubah menjadi data biner dengan skoring data berdasarkan kriteria-kriteria yang sudah ditetapkan pada setiap variabel. Bila ada nilai pada kriteria tersebut diskor “1” atau tidak ada nilai diskor “0”. Data biner hasil marka RAPD dan data morfologi dilakukan analisis dengan menggunakan UPGMA Unweighted pair group method with aritmathic means dengan fungsi SIMQUAL 120 menjadi dendogram melalui program NTSYSpc 2.02 for Windows Rohlf, 1998. Hasil analisis tersebut dapat diketahui hubungan kekerabatan antara tanaman yang satu dengan yang lain berdasarkan jarak genetik. Hasil dan Pembahasan Proses ekstraksi DNA manggis cukup sulit, karena daun manggis mengandung senyawa polifenol yang sangat tinggi. Ketika daun dipotong kecil-kecil, maka potongan daun mengeluarkan latek kuning yang mengandung senyawa polifenol. Proses ekstraksi dan pemurnian DNA akan mengalami kegagalan apabila masih terdapat polifenol Touran et al.,1999. Senyawa polifenol dapat dioksidasi oleh enzim fenol oksidase membentuk senyawa komplek dan asam nukleat yang dapat menyebabkan kerusakan DNA Yu Paul, 1994. Untuk menghambat oksidasi senyawa fenolik ditambahkan ß- mercaptoetanol senyawa antioksidan pada larutan bufer ekstraksi kloroform Sauder Parkes, 1999. Senyawa fenolik dapat dihilangkan dengan penambahan PVPP pada saat penggerusan daun pada mortal. Yu Paul 1994 menyatakan kontaminan lain seperti RNA dapat mengganggu proses PCR. RNA dapat mengganggu teknik kuantitas DNA dalam menentukan konsentrasi stok DNA dan proses amplifikasi oleh primer. RNA dapat dihilangkan dengan melakukan pemurnian DNA dengan penambahan RNAse Sauder Parkes, 1999. Kuantitas kemurnian DNA dihitung dengan menggunakan alat spektrometer. Kisaran nilai absorbans rasio λ 260280 pada 22 regeneran adalah 1,025 – 1,400. Nilai rasio absorbans yang paling tinggi terdapat pada regeneran R-151 1,400, sedangkan yang paling rendah pada regeneran R-252 1,025 Lampiran 9. Kemurnian DNA 22 sampel regeneran tersebut tergolong rendah. Hal ini disebabkan masih terdapat kontaminan yang terdiri dari RNA, protein dan polifenol. Menurut Sambrook et al. 1989, batas kemurnian DNA yang biasa dipakai dalam analisis molekuler mempunyai rasio absorbans λ 260280 adalah 1,8 – 2,0. Komponen RNA dapat 121 terserap pada λ 260 nm sehingga berpengaruh terhadap konsentrasi DNA total Sauder Parkes, 1999. Amplifikasi DNA dilakukan untuk melihat polimorfisme DNA 22 regeneran dan kontrol tanaman manggis dengan menggunakan lima primer acak. Pita DNA terbagi ke dalam dua kelompok, yaitu pita polimorfik dan pita monomorfik. Primer yang menghasilkan jumlah pita yang paling banyak adalah primer SB 19, sedangkan yang paling sedikit adalah primer SBH 13 dan SBH 18. Pita DNA polimorfik yang dihasilkan berjumlah 23 pita. Setiap primer menghasilkan jumlah pita berkisar antara 4 – 6 pita, jumlah pita DNA per regeneran berkisar 1 pita – 6 pita dengan ukuran pita 250 – 2.500 pasang basa pb. Tingey et al. 1992 mengatakan umumnya ukuran pita DNA hasil amplifikasi adalah 200-2000 pb, namun dapat juga mencapai 3000 pb dan bahkan 5000 pb. Perbedaan profil pita DNA hasil amplifikasi terutama jumlah dan ukuran pita berperan sangat penting dalam menentukan tingkat keragaman genetik regeneran akibat iradiasi sinar gamma. Jumlah pita pada masing- masing primer disajikan pada Tabel 14. Tabel 14. Jumlah pita hasil amplifikasi lima primer acak pada analisis RAPD Primer acak Ukuran pita pb Jumlah pita monomorfik Jumlah pita polimorfik Jumlah pita SBH 13 500-1.500 4 4 SB 19 250-2.000 6 6 SB 12 500-2.000 1 4 5 SB 13 500-2.000 5 5 SBH 18 500-2.000 4 4 Total 1 21 23 Primer SBH 13 3’-GACGCCACAC-5’ menghasilkan jumlah pita keseluruhan 37 pita, ukuran pita 500 – 1.500 pb. Jumlah pita masing- masing regeneran berjumlah 1 – 4 pita. Kesamaan pola pita dapat dilihat tanaman kontrol dengan regeneran R-53, R-54, R-103, R-201, R-251, R-301, R-302, R-352, tanaman regeneran R-52 dengan R-102, R-153, R-401, sedangkan regeneran lainnya memperlihatkan variasi pola pita, kecuali regeneran R-202 tidak memunculkan pita Gambar 38. 122 Primer SBH 13 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 Primer SB 19 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 Primer SB 12 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 M 16 17 18 19 20 21 22 M Primer SB 13 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 M 17 18 19 20 21 22 Primer SBH 18 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 M 16 17 18 19 20 21 22 M Gambar 38. Pola pita DNA 21 regeneran dan tanaman kontrol pada lima primer. Lajur M Marker 1 kb DNA Ladder; 1 kontrol; 2 R-51; 3 R-52; 4 R-53; 5 R-54; 6 R-101; 7 R-102; 8 R-103; 9 R-104; 10 R-151; 11 R-152; 12 R-153; 13 R-201; 14 R-202; 15 R-203; 16 R-251; 17 R-252; 18 R-301; 19 R-302; 20 R-351; 21 R-352; 22 R-401 250 bp 1.000 bp 2.000 bp 10.000 bp 10.000 bp 1.000 bp 250 bp 10.000 bp 1.000 bp 250 bp 250 bp 10.000 bp 2.000 bp 1.000 bp 250 bp 1.000 bp 2.000 bp 10.000 bp 2.000 bp 123 Primer SB 19 3’-CAGCACCCAC-5’ menghasilkan jumlah pita keseluruhan 62 pita, ukuran pita 250 – 2.000 pb. Jumlah pita masing- masing regeneran berjumlah 1–6 pita. Kesamaan pola pita dapat dilihat pada kontrol dengan regeneran R-52, R- 53, R-54, R-151, R-202, R-351, R-352, dan R-401, Regeneran R-51 dengan R-102, R-103, R-153, R-203, R-251, R-252, R-301, dan R-302, sedangkan regeneran lainnya memperlihatkan variasi pola pita Gambar 38. Primer SB 12 3’-CAGCACCCAC-5’ menghasilkan jumlah pita keseluruhan 44 pita, ukuran pita 500 – 2.000 pb. Jumlah pita masing- masing regeneran berjumlah 1–4 pita. Kesamaan pola pita dapat dilihat pada kontrol dengan regenaran R-53, R-102, R-103, dan R-352, regeneran R-51 dengan R-151, R-152, regeneran R- 101 dengan R-153, R-251, R-351, R-401, sedangkan regeneran lainnya memperlihatkan variasi pola pita Gambar 38. Primer SB 13 3’- AGTCAGCCAC -5’ menghasilkan jumlah pita keseluruhan 58 pita, ukuran pita 500 – 2.000 pb. Jumlah pita masing- masing regeneran berjumlah 1 – 5 pita. Kesamaan pola pita dapat dilihat pada kontrol dengan regeneran R-52, regeneran R-51 dengan R-104, R-202, R-301, sedangkan regeneran lainnya memperlihatkan variasi pola pita Gambar 38. Primer SBH 18 3’-ACGCGCATGT-5’ menghasilkan jumlah pita keseluruhan 40 pita, ukuran pita 500 – 2.000 pb. Jumlah pita masing- masing regeneran berjumlah 1 – 3 pita. Kesamaan pola pita dapat dilihat pada kontrol dengan regeneran R-51, R-104, R-203, R-251, R-401, regeneran R-52 dengan regeneran R-102, R-151, R-152, R-252, R-301, R-302, regeneran R-53 dengan R-20, sedangkan regeneran lainnya memperlihatkan variasi pola pita Gambar 38. Pola pita DNA dari 21 regeneran dan kontrol dari lima primer acak RAPD menunjukkan sangat bervariasi. Pola pita regeneran pada umumnya berbeda dengan kontrol. Pola pita DNA antar regeneran bersifat individual tanaman, meskipun berasal dari perlakuan dosis iradiasi sinar gamma yang sama, maka pola pita DNA yang dihasilkan belum tentu sama. Hal ini menunjukkan bukti adanya mutasi genetik pada regeneran manggis in vitro yang disebabkan oleh induksi mutasi dengan sinar gamma, sehingga menyebabkan variasi pola pita DNA berdasarkan marka RAPD. 124 Ada dua tipe polimorfik pola pita DNA yang teramplifikasi, yaitu ada atau tidak adanya pita dan perbedaan ukuran pita. Pada regeneran R-202 primer SBH 13 dan regeneran R-52 primer SB 12 pita DNA tidak teramplifikasi. Hal ini disebabkan sekuen DNA tidak sesuai dengan primer. Sedangkan regeneran lainnya menunjukkan perbedaan ukuran pita DNA, hal ini menunjukkan sekuen DNA mengalami perubahan yang diakibatkan oleh iradiasi gamma. William et al. 1990 menyatakan ukuran pita DNA yang sama dalam dua regeneran menunjukkan adanya tingkat sekuen homolog DNA yang tinggi, sebaliknya adanya pita dalam satu regeneran tetapi tidak terdapat pada regeneran lainnya akan menunjukkan sekuen DNA berbeda. Menurut Mohr Schopfer 1995, radiasi pengion dapat menyebabkan ikatan kimia basa nukleotida putus rusak. Radikal hidrogen dan hidroksil yang terbentuk akibat radiasi pengion akan menempel pada utas tunggal DNA, sehingga utas tunggal DNA menjadi patah. Van Harten 1998 menyatakan kerusakan DNA akibat iradiasi sinar gamma dapat berupa transisi atau transversi antara purin dan pirimidin, tali utas tunggal atau ganda akan patah. Van Harten 1998 menyatakan iradiasi sinar gamma dapat menyebabkan perubahan sekuen DNA dapat berupa delesi, insersi, atau subtitusi. Marka RAPD dapat mendeteksi perubahan basa pada sekuen DNA dengan menggunakan lima primer acak yang menempel pada situs sekuen genom tanaman manggis in vitro. Marka RAPD dapat digunakan untuk menjelaskan keragaman genetik pada tanaman peach yang disebabkan oleh variasi somaklonal Hashmi et al., 1997, intra populasi dan inter populasi alami orchardgrass Metin Tuna et al., 2004, Brassica napus Dulson et al., 1998, interspesifik dan intraspesifik hibrid somatik kentang Baird et al., 1992, aksesi apel Mulcahy et al., 1993. Pola pita DNA hasil RAPD dapat dianalisis dengan mengubah data pita polimorfik menjadi data biner barupa matrik peubah ganda multivariate matrix. 125 Analisis yang dilakukan di antaranya analisis dendogram cluster analysis Keragaman genetik dapat diketahui melalui analisis dendogram dengan melihat individu secara langsung pada diagram pohon. Berdasarkan dendogram analisis RAPD menunjukkan bahwa nilai koefisien kemiripan genetik antar tanaman sampel antara 0,60 – 0,91 60 - 91 atau keragaman genetik 9 - 40 Gambar 37,. Pada nilai koefisien kemiripan genetik 60 terbagi menjadi dua kelompok, yaitu kelompok E berbeda dengan kelompok lainnya A, B, C, D, sehingga secara keseluruhan kelompok regeneran dan tanaman kontrol yang dianalisis menghasilkan lima kelompok utama. Kelompok A berjumlah 8 regeneran, terbagi ke dalam dua sub kelompok. Tanaman kontrol termasuk sub kelompok A 1 yang mempunyai kekerabatan dekat dengan regeneran R-202 dan R-203 dengan koefisien kemiripan genetik 77 atau variasi genetik 23 . Sub kelompok A 2 terdiri dari regeneran R- 201, R-252, R-352, R-52, dan R-151 mempunyai kekerabatan yang paling dekat dengan koefisien kemiripan genetik 82 atau variasi genetik 18 . Koefisien Kemiripan 0.58 0.65 0.71 0.78 0.84 0.91 Kontrol M-202 M-203 M-201 M-252 M-352 M-52 M-151 M-251 M-302 M-351 M-401 M-51 M-101 M-153 M-102 M-152 M-103 M-301 M-104 M-53 M-54 Gambar 39. Dendogram tanaman regeneran manggis in vitro berdasarkan analisis RAPD A 1 A 2 B 1 C 1 C 2 E D A B C D D E 126 Kelompok B berjumlah 4 regeneran terdiri dari regeneran R-251, R-302, R- 351, R-401 dengan koefisien kemiripan genetik 69 atau variasi genetik 31 . Kelompok C berjumlah 7 regeneran, terbagi ke dalam dua sub kelompok. Sub kelompok C 1 terdiri dari regeneran R-51, R-101, R-153 dengan koefisien kemiripan genetik 69 atau variasi genetik 31 , sedangkan sub kelompok C 2 terdiri dari regeneran R-102, R-152, R-103, R-301 dengan koefisien kemiripan genetik 71 atau variasi genetik 29 . Kelompok D hanya satu regeneran R-104. Kelompok E berjumlah dua regeneran, yaitu R-53 dan R-54 dengan koefisien kemiripan genetik 60 atau variasi genetik 40 Tabel 15. Tabel 15. Pengelompokan 22 regeneran dan kontrol berdasarkan dendogram analisis RAPD Kelompok utama Sub kelompok Koefisien kemiripan genetik regeneran A A 1 77 Kontrol, R-202, R-203 A 2 82 R-201, R-252, R-352, R-52, R-151 B B 1 69 R-251, R-302, R-351, R-401 C C 1 69 R-51, R-101, R-153 C 2 71 R-102, R-152, R-103, R-301 D D 1 63 R-104 E E 1 60 R-53, R-54 Nilai koefisien kemiripan menunjukkan kesamaan individu dalam suatu populasi, semakin tinggi nilai koefisien kemiripan antar individu menunjukkan kekerabatan genetik yang dekat antar individu tersebut. Regeneran R-201 dan R-252 mampunyai koefisien kemiripan yang paling tinggi, yaitu 0,91 91 , kedua regeneran tersebut menunjukkan kekerabatan genetik dekat. Regeneran R-104 mempunyai koefisien kemiripan paling rendah, yaitu 0,63 63 , regeneran tersebut menunjukkan kekerabatan genetik jauh dengan regeneran lainnya dan tidak ditemukan kemiripan genetik individu 100 . Matrik kesamaan genetik regeneran dan kontrol berdasarkan analisis RAPD tersaji dalam Tabel 16. 127 Tabel 16. Matrik kesamaan genetik 22 regeneran manggis dan kontrol berdasarkan marka RAPD genotip Kontrol R-51 R-52 R-53 R-54 R-101 R-102 R-103 R-104 R-151 R-152 R-153 R-201 R-202 R-203 Kontrol - R-51 0,88 - R-52 0,84 0,80 - R-53 0,80 0,76 0,80 - R-54 0,84 0,80 0,76 0,80 - R-101 0,72 0,68 0,72 0,76 0,89 - R-102 0,76 0,64 0,76 0,81 0,84 0,88 - R-103 0,92 0,80 0,84 0,82 0,76 0,80 0,76 - R-104 0,96 0,84 0,88 0,83 0,80 0,76 0,84 0,96 - R-151 0,92 0,80 0,76 0,84 0,92 0,82 0,85 0,84 0,89 - R-152 0,84 0,72 0,84 0,96 0,84 0,76 0,86 0,83 0,87 0,92 - R-153 0,72 0,76 0,72 0,76 0,88 0,82 0,83 0,82 0,88 0,80 0,81 - R-201 0,84 0,72 0,84 0,96 0,84 0,83 0,81 0,63 0,68 0,92 0,98 0,84 - R-202 0,88 0,76 0,88 0,84 0,80 0,73 0,85 0,87 0,88 0,87 0,87 0,68 0,87 - R-203 0,84 0,72 0,84 0,80 0,68 0,63 0,68 0,86 0,92 0,76 0,83 0,64 0,84 0,86 - R-251 0,80 0,84 0,80 0,76 0,72 0,72 0,65 0,85 0,85 0,72 0,71 0,62 0,72 0,76 0,80 R-252 0,84 0,72 0,84 0,96 0,84 0,84 0,87 0,82 0,84 0,94 0,97 0,65 0,98 0,88 0,84 R-301 0,72 0,60 0,72 0,84 0,80 0,84 0,89 0,77 0,81 0,85 0,88 0,84 0,87 0,76 0,80 R-302 0,84 0,72 0,76 0,88 0,92 0,92 0,85 0,78 0,76 0,92 0,93 0,88 0,92 0,80 0,76 R-351 0,84 0,80 0,84 0,82 0,84 0,82 0,78 0,85 0,83 0,84 0,84 0,72 0,84 0,88 0,84 R-352 0,80 0,68 0,80 0,76 0,86 0,68 0,81 0,82 0,86 0,87 0,82 0,61 0,81 0,92 0,88 R-401 0,72 0,76 0,80 0,83 0,84 0,83 0,86 0,82 0,73 0,89 0,84 0,68 0,83 0,84 0,64 128 Analisis dendogram banyak digunakan untuk menjelaskan kekerabatan genetik tanaman, seperti kelapa Roslim et al., 2003, Dactylis glomerata L. Metin Tuna et l., 2004, Brassica napus Dulson et al.,1998, manggis Ramage et al., 2004; Mansyah et al., 2003. Hasil analisis dendogram berdasarkan karakter morfologi menunjukkan bahwa regeneran dan kontrol dikelompokkan menjadi dua kelompok utama, yaitu kelompok utama A dan B dengan koefisien kemiripan genetik 59 atau variasi genetik 41 Gambar 38. Kelompok utama A berjumlah 14 regeneran terbagi menjadi tiga sub kelompok. Tanaman kontrol termasuk ke sub kelompok A 1 yang mempunyai kekerabatan dekat dengan regeneran R-51 dan R-53 dengan nilai koefisien kemiripan genetik 75 , sub kelompok A 2 terdiri dari regeneran R-153, R-201, R- 202, R-302, R-352, R-301, R-351 mempunyai nilai koefisien kemiripan 75 dan sub kelompok A 3 terdiri dari regeneran R-203, R-252, R-251, R-401 mempunyai nilai koefisien kemiripan genetik 83 . kelompok utama B terdiri dari 8 regeneran terbagi menjadi dua sub kelompok. Sub kelompok B 1 terdiri dari regeneran R-52, R- 54, R-101 mempunyai nilai koefisien kemiripan genetik 79 , sedangkan sub kelompok B 2 terdiri dari R-103, R-104, R-152, R-151, R-104 Tabel 16. Matrik kesamaan genetik regeneran dan kontrol berdasarkan karakter morfologi tersaji dalam Tabel 17. 129 Tabel 17. Matrik kesamaan genetik 22 regeneran manggis dan kontrol berdasarkan karakter morfologi Kontrol R-51 R-52 R-53 R-54 R-101 R-102 R-103 R-104 R-151 R-152 R-153 R-201 R-202 R-203 Kontrol - R-51 0,75 - R-52 0,55 0,63 - R-53 0,60 0,76 0,43 - R-54 0,73 0,80 0,46 0,73 - R-101 0,62 0,68 0,42 0,46 0,55 - R-102 0,76 0,64 0,76 0,51 0,67 0,68 - R-103 0,62 0,80 0,84 0,52 0,76 0,88 0,83 - R-104 0,76 0,84 0,78 0,63 0,52 0,76 0,63 0,76 - R-151 0,42 0,80 0,46 0,74 0,62 0,52 0,70 0,72 0,89 - R-152 0,74 0,72 0,54 0,56 0,74 0,76 0,67 0,78 0,87 0,70 - R-153 0,72 0,76 0,72 0,66 0,48 0,72 0,47 0,72 0,88 0,67 0,84 - R-201 0,44 0,72 0,84 0,56 0,54 0,43 0,61 0,52 0,68 0,70 0,67 0,74 - R-202 0,68 0,76 0,58 0,44 0,30 0,33 0,63 0,78 0,88 0,57 0,53 0,62 0,67 - R-203 0,44 0,72 0,74 0,60 0,68 0,63 0,68 0,66 0,92 0,77 0,63 0,60 0,74 0,62 - R-251 0,50 0,84 0,50 0,36 0,72 0,72 0,65 0,52 0,85 0,72 0,47 0,43 0,58 0,57 0,89 R-252 0,74 0,72 0,44 0,26 0,64 0,64 0,57 0,57 0,84 0,62 0,57 0,50 0,80 0,38 0,62 R-301 0,52 0,60 0,72 0,44 0,70 0,84 0,58 0,63 0,81 0,85 0,68 0,67 0,82 0,57 0,67 R-302 0,44 0,72 0,76 0,68 0,32 0,72 0,81 0,54 0,76 0,62 0,63 0,63 0,66 0,53 0,73 R-351 0,74 0,80 0,54 0,42 0,64 0,52 0,76 0,42 0,83 0,84 0,44 0,42 0,55 0,40 0,84 R-352 0,40 0,68 0,60 0,66 0,76 0,48 0,23 0,54 0,86 0,57 0,52 0,50 0,81 0,67 0,82 R-401 0,72 0,76 0,51 0,33 0,24 0,73 0,43 0,82 0,73 0,59 0,44 0,42 0,67 0,53 0,74 130 Koefisien Kemiripan 0.59 0.69 0.79 0.90 1.00 Kontrol M-51 M-53 M-153 M-201 M-202 M-302 M-352 M-301 M-351 M-203 M-252 M-251 M-401 M-52 M-54 M-101 M-103 M-104 M-152 M-151 M-104 Gambar 40. Dendogram tanaman regeneran manggis in vitro berdasarkan karakter morfologi Tabel 18. Pengelompokan 22 regeneran dan kontrol berdasarkan dendogram karakter morfologi Kelompok utama Sub kelompok Nilai koefisien kemiripan genetik regeneran A A 1 75 Kontrol, R-51, R-53 A 2 75 R-153, R-201, R-202, R-302, R-352, R-301, R-351 A 3 83 R-203, R-252, R-251, R-401 B B 1 79 R-52, R-54, R-101 B 2 68 R-103, R-104, R-152, R-151, R-104 A 1 A 2 A 3 B 1 B 2 A B 131 Kesimpulan dan Saran Marka RAPD dapat digunakan untuk mendeteksi mutan manggis akibat iradiasi sinar gamma sejak kondisi tanaman masih dalam fase juvenil. Berdasarkan dendogram analisis RAPD 22 regeneran, nilai kemiripan genetik antara 60 - 91 atau keragaman ge netik 9 - 40. Pada nilai kemiripan genetik 60 terbagi menjadi dua kelompok, yaitu kelompok E berbeda dengan kelompok lainnya A, B, C, D, sehingga secara keseluruhan kelompok regeneran dan tanaman kontrol yang dianalisis menghasilkan lima kelompok utama. Sedangkan dendogram analisis morfologi regeneran dan kontrol dikelompokkan menjadi dua kelompok utama, yaitu kelompok utama A dan B dengan kemiripan genetik 59 atau variasi genetik 41 . Keuntungan penggunaan marka RAPD dapat menghasilkan pita polimorfik dalam jumlah banyak, konsistenstabil dan tidak dipengaruhi faktor lingkungan. Dimasa yang akan datang, marka DNA RAPD dapat digunakan sebagai indikator seleksi tidak langsung terhadap karakter yang diharapkan, sehingga dapat mempersingkat program pemuliaan dan menghemat biaya dan waktu yang dikeluarkan. Ekstraksi dan amplifikasi DNA manggis sangat sulit disarakan mencari protokol yang baku, agar hasil pita yang dihasilkan bersifat stabil. 132

VII. PEMBAHASAN UMUM