132
VII. PEMBAHASAN UMUM
Dari penelitian ini diperoleh beberapa regeneran mutan manggis yang waktu pembentukan tunas lebih cepat dan tingkat keragaman genetik yang luas baik dilihat
dari segi penampilan fenotipikmorfologi, struktur anatomi daun dan pola pita DNA. Regenaran tersebut diharapkan merupakan mutan yang solid, karena bahan tanaman
yang diiradiasi berupa kalus nodular berasal dari daun. Kalus nodular diperoleh dari eksplan daun setelah ditanam pada medium MS yang diberi suplemen 2,22
µ M BAP
dan 2,27 µ
M TDZ. Kalus nodular dapat beregenerasi membentuk tunas setelah ditanam pada medium WPM yang diberi suplemen 2,2
µ M BAP. Berbeda dengan
bahan tanaman yang diiradiasi dalam bentuk biji, tunas yang muncul akan bersifat kimera karena tunas yang muncul berasal dari jaringan multiseluler dari biji.
Penggunaan kultur in vitro sangat penting dalam menunjang pemuliaan mutasi mutation breeding, karena mempunyai keuntungan sebagai berikut : 1 materi
tanaman yang mendapat perlakuan mutagen dapat bersifat seragam, 2 dapat mengurangi pembentukan kimera, 3 isolasi jaringan termutasi dari jaringan kimera
lebih mudah, 4 penggunaan kultur individu sel seperti kultur kalus atau embrio somatik yang diiradiasi kemungkinan besar akan menghasilkan mutan solid, 5
dapat mempercepat proses pemuliaan dari mulai pembentukan keragaman genetik, proses seleksi dan multiplikasi yang diharapkan Maluszynski et al., 1995. Induksi
mutasi pada kultur in vitro telah banyak dikembangkan, seperti pada ubi kayu, pisang, kentang dan ubi jalar Maluszynski et al., 1995.
Menurut van Harten 1998, keberhasilan program induksi mutasi sangat tergantung pada materi tanaman yang mendapat perlakuan mutagen. Pada penelitian
ini materi tanaman yang digunakan adalah eksplan pada kultur in vitro. Penggunaan eksplan mempunyai banyak keuntungan, yaitu: 1 materi tanaman yang mendapat
perlakuan mutagen relatif lebih seragam dan jumlahnya banyak, 2 komposisi medium dan kondisi lingkungan dapat diatur, 3 tidak membutuhkan tempat yang
luas. Penelitian lain yang dilakukan Harahap 2005 menggunakan biji atau pucuk bibit in vitro manggis sebagai eksplan yang diiradiasi sinar gamma. Namun
133 penggunaan biji atau pucuk in vitro dapat menghasilkan mutasi sektoralmeriklinal,
karena biji atau pucuk merupakan jaringan multiseluler. Jika jaringan multiseluler diiradiasi tidak seluruhnya jaringan tersebut termutasi sehingga mutan yang
dihasilkan bersifat kimera. Untuk mendapatkan mutan solid manggis secara langsung, materi yang
diiradiasi dapat berupa kalus nodular. Tunas adventif dari kalus nodular akan menghasilkan mutan solid, karena tunas adventif yang muncul berasal dari sel-sel
tunggal yang belum mengalami diferensiasi organogenesis tidak langsung. Tunas adventif manggis juga dapat berasal dari eksplan daun organogenesis langs ung.
Perlakuan mutagen pada eksplan daun akan menghasilkan mutan solid, karena tunas adventif yang muncul berasal dari lapisan sel epidermal George, 1993.
Kalus nodular manggis yang digunakan dalam penelitian ini berasal dari eksplan daun manggis in vitro atau daun seedling. Kalus nodular muncul dari tulang
daun setelah eksplan ditanam pada medium MS yang diberi suplemen kombinasi 2,22 µ
M BAP dan 2,27 µ
M TDZ. Kalus nodular berkembang dan berdiferensiasi membentuk tunas multipel setelah kalus nodular ditanam pada medium WPM yang
diberi suplemen 2,2 µ
M BAP. Dari hasil penelitian ini nampak bahwa peranan BAP sangat penting dalam memacu sitokinesis, karena BAP dapat memacu pembelahan
sel dan produksi sel lebih cepat, sehingga sel-sel meristematis menga lami diferensiasi
membentuk tunas.
Faktor-faktor yang berpengaruh terhadap pembentukan tunas adalah: 1 genotip, 2 lingkungan fisik, 3 komposisi media, dan 4 zat pengatur tumbuh.
Interaksi antara empat komponen tersebut sangat penting dalam menentukan arah pertumbuhan tanaman. Zat pengatur tumbuh auksin dan sitokinin sangat penting
dalam meregulasi pembentukan organ tanaman George, 1993. Pembentukan tunas adventif diinduksi oleh adanya konsentrasi sitokinin yang tinggi dibandingkan auksin
Phillips et al., 1995. Peranan BAP eksogen sangat penting dalam mempersingkat waktu berlangsungnya tahap S sintesis dalam siklus sel sehingga merangsang
pertumbuhan dan diferensiasi membentuk organ George, 1993. Penggunaan BAP juga dapat meningkatkan rasio tunas terhadap akar, meningkatkan produksi etilen dan
134 meningkatkan laju sintesis protein Staden Crouch, 1996. Pembentukan tunas dari
kalus biasanya membutuhkan adanya auksin dan sitokinin. Pembentukan tunas dari kalus membutuhkan konsentrasi auksin yang rendah dan sitokinin yang tinggi
George, 1993. Auksin berpengaruh terhadap replikasi DNA fase sintesis, sedangkan sitokinin berpengaruh terhadap pembelahan mitosis dalam pembelahan
sel George, 1993. Pembentukan tunas manggis melalui organogenesis tidak langsung sangat membutuhkan BAP. Diduga BAP eksogen dapat merangsang
pertumbuhan dan diferensiasi membentuk tunas dengan memacu pembelahan mitosis dan meningkatkan laju sintesa protein dalam sel tanaman.
Sinar gamma banyak digunakan untuk meningkatkan keragaman genetik tanaman, karena : 1 mempunyai panjang gelombang yang lebih pendek 10–0,01
nm, 2 mempunyai spektrum yang luas Briggs Constantin, 1979, 3 penetrasi ke jaringan tanaman relatif lebih mudah, 4 frekuensi mutasi yang terjadi cukup
tinggi, 5 mudah diaplikasikan. Sinar gamma telah digunakan pada tanaman buah- buahan seperti, apel, jeruk peach, pisang, dan anggur Broertjes van Harten,1988.
Keberhasilan induksi mutasi sangat tergantung pada genotip yang digunakan, bagian tanaman yang diiradiasi dan dosis mutagen yang diaplikasikan Donini et al.,
1990. Genotip yang mempunyai konstitusi genetik yang berbeda, maka kompetensi genotip membentuk tunas berbeda pula. Selain konstitusi genetik tingkatan ploidi dari
suatu genotip juga sangat pengaruh terhadap pembentukan tunas akibat radiasi. Genotip yang mempunyai tingkatan ploidi lebih besar poliploid lebih tahan
terhadap iradiasi dibandingkan genotip diploid pada spesies yang sama. Begitu juga, ukuran kromosom sangat berpengaruh terhadap sensitivitas iradiasi. Genotip yang
mempunyai ukuran kromosom besar lebih sensitif dibandingkan ukuran kromosom kecil pada spesies yang sama Mohr Shopfer, 1995. Bagian tanaman yang
diiradiasi dalam bentuk kalus, suspensi sel, embrio somatik dan protoplas lebih sensitif dibandingkan dengan jaringan. Peningkatan dosis iradiasi sinar gamma akan
mengalami penurunan regenerasi membentuk tunas. Dosis terlalu tinggi akan menyebabkan perubahan genetik dan kerusakan fisiologis yang lebih besar, sehingga
menyebabkan pertumbuhan yang terhambat Mohr Schopfer, 1995.
135 Hasil penelitian menunjukkan bahwa pada dosis rendah 5 dan 10 Gy terdapat
regeneran yang munculnya tunas lebih cepat dibandingkan regeneran kontrol. Menurut Pierik 1987, dosis rendah dapat memberi pengaruh positif terhadap
pertumbuhan tunas karena dosis rendah dapat menyebabkan degradasi auksin sehingga menggeser kesimbangan hormonal ke arah yang mendorong pertumbuhan.
Van Harten 1998 menyatakan radiasi dosis rendah akan menstimulasi perubahan fisiologi tanaman dan pada saat ini perlakuan dosis rendah banyak digunakan untuk
peningkatan perkecambahan dan peningkatan hasil tanaman. Pada kentang, penggunaan sinar gamma pada dosis rendah 2,5 Gy dapat meningkatkan berat umbi
mikro kentang Al-Safadi, 2000. Frekuensi mutasi dapat ditingkatkan dengan meningkatnya dosis iradiasi dan
laju dosis. Akan tetapi, penggunaan dosis tinggi dapat menyebabkan survival dan kemampuan kalus untuk regenerasi menurun dengan meningkatnya dosis Bhagwat
Duncan, 1998. Oleh karena itu, digunakan PD
50
untuk mendapatkan peluang mutan putatif yang diharapkan lebih besar. Pada penelitian ini diperoleh PD
50
adalah 25 Gy.
Radikal hidroksil dan hidrogen peroksida yang dihasilkan oleh pancaran iradiasi sinar gamma akan bersenyawa dengan bahan tanaman yang diiradiasi dan
menyebabkan kerusakan fisiologis berupa terhambatnya proses pembelahan dan diferensiasi sel dan kerusakan gen. Mohr Schopfer 1995 menyatakan radiasi
pengion iradiasi gamma akan menghasilkan ion dan radikal dalam bentuk hidroksil OH
-
. Jika radikal hidroksil menempel pada rantai nukleotida dalam DNA, maka utas tunggal atau ganda DNA akan patah, sehingga akan mengalami perubahan gen.
Sedangkan van Harten 1998 menyatakan kerusakan DNA akibat iradiasi sinar gamma dapat berupa transisi atau transversi antara purin dan pirimidin, tali utas
tunggal ataupun ganda akan patah. Iradiasi sinar gamma dapat menyebabkan perubahan morfologi, fisiologi dan
mutasi pada manggis. Perubahan morfologi regeneran mutan dibuktikan adanya ukuran regeneran, bentuk daun, dan perakaran. Sedangkan perubahan fisiologis dapat
dibuktikan adanya ketidak seimbangan hormonal di dalam tanaman. Ada empat
136 macam perubahan genetik yang mungkin terjadi, yaitu : 1 perubahan jumlah genom,
2 perubahan jumlah kromosom, 3 perubahan struktur kromosom, 4 perubahan gen. Jika radiasi pengion merusakan benang spindel, maka akan terjadi perubahan
jumlah genom sehingga menyebabkan terjadinya enauploidi. Jika radiasi pengion memutuskan rantai kromosom, maka dapat merubah struktur kromosom aberasi
kromosom seperti delesi, inversi, duplikasi dan translokasi. Jika radiasi pengion dapat menyebabkan perubahan pada sekuen DNA, maka disebut mutasi gen. Mutasi
juga dapat terjadi di luar kromosom atau pada sitoplasma, yaitu pada kloroplas dan mitokondria van Harten, 1998.
Pada kultur jaringan sering terjadi keragaman yang disebabkan oleh variasi somaklonal dan perubahan jumlah genom. Variasi somaklonal dapat terjadi dalam
kultur jaringan, karena adanya transposable genetic element yang menempel pada sekuen DNA yang meneyebabkan terjadi perubahan fenotipik. Perubahan jumlah
genom terjadi melalui mekanisme endoreduplikasi terjadi duplikasi jumlah kromosom pada tahap profase, endomitosis tidak terjadi pembelahan pada tahap
anafase dan restitusi tidak terjadi pembagian pada metafase I atau II pada pembelahan meiosis.
Peluang terjadinya mutasi pada kalus nodular yang diiradiasi adalah perubahan struktur kromosom dibandingkan tipe mutasi lainnya, karena kalus nodular
merupakan kumpulan masa sel yang tidak terorganisasi yang belum mengalami diferensiasi dan membelah diri secara terus- menerus George, 1993. Kalus nodular
manggis sangat peka terhadap iradiasi karena sel-sel pada kalus nodular sedang aktif membelah diri sehingga peluang terjadinya mutasi sangat besar. Pada sel yang aktif
membelah diri pengaruh iradiasi dapat terjadi pada tahap sintesis DNA, G
1
, G
2
dan mitosis. Jika radiasi pengion mengenai sel pada tahap G
1
dimana kromatin DNA belum disintesis, maka sel mengalami duplikasi dan terjadi pemotongan kromosom,
sedangkan pada tahaf G
2
dimana kromatin DNA sudah disintesis, maka sebagian kromosom akan terpotong. Menurut van Harten 1998, tahap sintesis DNA dan G
2
merupakan target untuk perlakuan mutagen, karena pada tahap ini sel mengalami penggandaan kromosom, sehingga mutasi kromatid lebih mudah terjadi.
137 Iradiasi sinar gamma dapat berpengaruh terhadap perubahan fisiologis
regeneran. Perubahan tersebut berkaitan dengan energi iradiasi yang diserap oleh jaringan tanaman sehingga menyebabkan stimulasi sintesis auksin endogen
terganggu. Selain perubahan fisiologis, perubahan genetik dapat terjadi akibat iradiasi sinar gamma. Perubahan tersebut dapat berupa aberasi kromosom
abnormalitas mitosis, mutasi somatik, dua sister kromatid patah, dan pada tahap profase akhir setengah kromatid mengalami aberasi kromosom, sehingga
pertumbuhan tanaman menjadi terhambat Desrosier Rosenstock, 1960. Perubahan fisiologis dan genetik diekspresikan adanya perubahan penampilan
fenotipik regeneran yang sangat bervariasi. Pada umumnya, ukuran tanaman regeneran sangat pendek dan ukuran daun kecil, bahkan ada tunas albino yang
muncul. Pada generasi selanjutnya kerusakan fisiologis berangsur pulih. Sel-sel yang mengalami kerusakan mengalami recovery, sedangkan gen termutasi dapat
diwariskan pada generasi berikutnya. Iradiasi sinar gamma dapat berpengaruh terhadap pertumbuhan tanaman
manggis. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pada dosis lebih dari 25 Gy membutuhkan waktu 129 hari untuk membentuk tunas. Hal ini menunjukkan bahwa
regeneran pada dosis tinggi menyebabkan pertumbuhan yang terhambat, sulit berakar bahkan sama sekali tidak tumbuh. Pengaruh pertumbuhan tersebut disebabkan oleh
kerusakan fisiologis akibat iradiasi sinar gamma. Iradiasi sinar gamma dapat menyebabkan perubahan struktur anatomi daun.
Ukuran stomata regeneran mengalami peningkatan akibat iradiasi sinar gamma, namun kenaik an ukuran tidak berdasarkan dosis iradiasi yang diberikan. Ketebalan
daun dan parenkim palisade cenderung mengalamai peningkatan akibat iradiasi sinar gamma, meskipun kisaran nilai yang muncul sangat bervariasi. Ukuran stomata
sangat terkait dengan laju fo tosintesis, karena stomata berfungsi sebagai tempat pertukaran gas atau masuknya CO
2
ke dalam interseluler daun. Sedangkan parenkim palisade berfungsi sebagai tempat berlangsungnya fotosintesis dalam daun, karena
parenkim palisade banyak mengandung kloroplas.
138 Iradiasi sinar gamma dapat mempengaruhi sekuen DNA genom tanaman.
Perubahan sekuen DNA dapat terjadi delesi, subtitusi, dan duplikasi. Delesi akan terjadi jika sekuen DNA hilang oleh radikal hidroksil dan primer acak tidak dapat
mengenali situs DNA, sehingga pita DNA menjadi hilang. Subtitusi akan terjadi jika pertukaran sekuen DNA tertentu dengan sekuen DNA yang lain. Duplikasi akan
terjadi jika banyak sekuen DNA mengalami pengulangan. Iradiasi pengion dapat juga menyebabkan basa-basa nitrogen salah berpasangan. Dalam keadaan normal timin
akan berpasangan dengan adenin, jika timin kehilangan 1 proton akibat radiasi pengion, maka timin akan dapat berpasangan dengan guanin, sehingga struktur DNA
akan berubah. Penggunaan metode RAPD telah banyak digunakan untuk analisis keragaman
genetik pada berbagai jenis tanaman, karena metode ini relatif lebih sederhana, lebih cepat dan murah. Analisis tingkat keragaman genetik 21 genotip mutan dan 1 kontrol
berdasarkan analisis RAPD adalah koefisien kemiripan ge netik 60 atau atau keragaman genetik 40 . Hal ini membuktikan bahwa iradiasi sinar gamma dapat
meningkatkan keragaman. Hasil penelitian Harahap 2005 menunjukkan bahwa koefisien kemiripan genetik 80 tanaman sampel akibat iradiasi sinar gamma adalah
62 atau keragaman genetik 38 . Perubahan pada tingkat DNA dan histologi tidak seluruhnya diekspresikan
dalam bentuk perubahan morfologi, karena suatu gen dapat diekspresikan melalui proses transkripsi dan translasi. Transkripsi merupakan transfer informasi genetik dari
DNA ke RNA, sedangkan translasi penerjemahan informasi genetik yang terdapat RNA ke dalam polipeptida protein. Perubahan pada tingkat morfologi merupakan
cerminan adanya perubahan pada tingkat DNA atau enzim protein. Dari hasil penelitian ini diperoleh regeneran mutan yang diharapkan solid.
Adanya mutan dibuktikan dengan adanya perbedaan struktur anatomi daun. Meskipun regeneran tersebut mengalami pertumbuhan yang lambat, akan tetapi hal
tersebut disebabkan oleh kerusakan fisiologis, sehingga pada generasi berikutnya pengaruh kerusakan fisiologis akan berangsur hilang. Bukti lain adanya mutan pada
regeneran mutan adalah perbedaan pada pola pita DNA.
139
VIII. KESIMPULAN UMUM DAN SARAN
Kategori