TINJAUAN PUSTAKA Teknik Isolasi DNA Dari Darah

BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA

DNA Deoxyribose Nucleic Acid Asam deoksiribonukleat Deoxyribose Nucleic Acid, DNA adalah suatu makromelekul yang mengandung informasi genetik pada makhluk hidup, termasuk juga virus. Komposisi DNA berupa polimer nukleotida yang terdiri atas gula deoksiribosa, gugus fosfat dan 2 macam basa nitrogen yakni purin adenin dan guanin atau pirimidin timin atau sitosin. Gugus fosfat akan berikatan dengan gula deoksiribosa pada posisi 5’ atau 3’ melalui ikatan fosfodiester, sedangkan basa nitrogen akan berikatan dengan gula deoksiribosa pada posisi 1’ melalui ikatan glikosida. DNA pada eukariot maupun prokariot, memiliki struktur heliks ganda gambar 1. Struktur tersebut dibentuk dari dua rantai polinukleotida yang saling berkomplemen antara basa purin di rantai yang satu, berpasangan dengan basa pirimidin di rantai yang lainnya melalui ikatan hidrogen. Kedua rantai polinukleotida tersebut memiliki arah ikatan yang berbeda antiparalel, dengan satu rantai berarah 5’ ke 3’ sedangkan rantai lainnya berarah 3’ ke 5’. Stabilitas struktur DNA disebabkan oleh interaksi hidrofobik antara tumpukan pasangan basa aromatik antar nukleotida. Meskipun begitu tetap dapat mengalami gangguan yang menyebabkan terjadinya hidrolisis ataupun denaturasi. DNA dapat mengalami hidrolisis dalam suasana asam yang kuat, sedangkan denaturasi dapat terjadi akibat temperatur tinggi, suasana basa pH ≥9 dan penambahan urea atau formamida. Gambar 1. Sketsa Struktur DNA 3 Universitas Sumatera Utara 4 Informasi genetik pada DNA dapat mengalami perubahan melalui mutasi. Mutasi yang terjadi pada tingkat DNA dapat berupa mutasi yang tidak menyebabkan perubahan asam amino yakni mutasi diam silent, mutasi yang membuat susunan polipeptida menjadi berubah bentuk fungsi yakni mutasi missense, dan mutasi yang menyebabkan terhentinya sintesis peptida yakni mutasi nonsense. Sebagai konsekuensi, mutasi pada gen dapat mengakibatkan perubahan pada struktur maupun aktivitas protein. Lebih lanjut lagi dapat menyebabkan terjadinya perubahan tampilan fenotif pada individu dengan kata lain terjadi manifestasi klinis. Ekspresi Genetik DNA sebagai materi genetik berfungsi menyimpan informasi jenis protein yang akan dihasilkan pada proses ekspresi gen. Perlengkapan untuk ekspresi gen seperti tRNA dan rRNA juga disandikan dari DNA. Urut-urutan nukleotida pada DNA yang diterjemahkan menjadi urut-urutan asam amino pada protein disebut sebagai kode genetik atau kodon dengan 3 nukleotida terurut triplet sebagai satu kodon. Satu kodon dapat menyandikan satu jenis asam amino sedangkan satu macam asam amino dapat disandi oleh beberapa jenis kodon. Penterjemahan kodon menjadi polipeptida terjadi melalui suatu proses transkripsi DNA menjadi RNA mRNA, rRNA, dan tRNA. Selanjutnya mRNA akan ditranslasi dalam kompleks ribosom yang mengandung rRNA menjadi jenis asam amino yang dibawakan oleh tRNA, susunan asam-asam amino yang tersusun membentuk polipeptida yang kemudian mengalami proses paskatranslasi menjadi bentuk protein yang dimaksud. Protein-protein tersebut kemudian akan berfungsi secara struktural, berperan dalam pensinyalan, transport, imunitas, nutrisi, regulasi, maupun secara katalitik menghasilkan fenotif tertentu pada individu. Isolasi DNA Isolasi DNA merupakan tahap awal yang dilakukan sebelum kita melakukan penelitian lebih lanjut pada DNA. Apabila kita sudah meng-isolasi DNA, maka tahap berikutnya kita dapat melakukan amplifikasi DNA, Polymerase Chain Reaction, Sequencing, dan lain-lain. Dalam isolasi maupun pemeriksaan DNA, mutu sample harus diperhatikan. Jika penelitian hanya melibatkan individu hidup, maka darah merupakan sampel yang baik. Universitas Sumatera Utara 5 Alternatif lainnya adalah cairan semen, akar rambut, saliva atau urin. Sampel segar merupakan sample yang paling baik, tetapi jika tidak memungkinkan, misalnya lokasi pemeriksaanpengambilan yang cukup jauh, maka bercak darah atau sperma kering merupakan pilihan yang cukup baik. Tabel 1. Kandungan DNA pada berbagai jaringan JARINGAN MANUSIA KANDUNGAN DNA 1. Cairan amnion 65 ngml 2. Darah 40 gml 3. SSP 8 lmg 4. Kultur fibroblast 6,5 lfl T 25 5. Akar rambut 250 ngakar 6. Hati 15 lmg 7. Otot 3 lmg 8. Kulit 3 lmg 9. Sperma 3,3 pgsel Kirby LT, 1990 DNA rantai ganda secara kimia bersifat sangat inert tetapi secara fisika bersifat sangat rapuh fragile. Karena panjang dan berpilin, dengan stabilitas lateral yang rendah, DNA dengan BM yang tinggi mudah terpotong oleh tekanan hidrodinamik. Aliran hidrodinamik yang dihasilkan dari pipetting, pengocokan, dan pengadukan memiliki kemampuan untuk memotong kedua rantai DNA. Makin panjang rantai DNA, makin rendah tekanan yang dibutuhkan untuk menghancurkannya. Oleh karena itu DNA genom mudah diperoleh dalam bentuk terfragmentasi. Modifikasi metode isolasi DNA dari sel mamalia banyak dilakukan untuk keperluan penggunaan DNA tersebut lebih lanjut. Contohnya untuk konstruksi pada vector bacteriophage λ, diperlukan DNA 100-150 kb. Untuk keperluan tersebut, biasanya sel mamalia didigesti menggunakan proteinase K dengan penambahan EDTA dan detergen misalnya SDS Sodium Dodecyl Sulphate, selanjutnya dilakukan ekstraksi menggunakan fenol. Sedangkan untuk konstruksi dalam cosmid, panjang DNA harus 200 kb. Sulit untuk memperoleh isolate DNA dengan ukuran sebesar itu bila digunakan metode isolasi menggunakan pelarut organic dan mechanical shearing karena DNA akan banyak yang hilang. Universitas Sumatera Utara Beberapa prosedur isolasi DNA dari sel dan jaringan mamalia : 1. Cara Blind dan Stafford 1976; Isolasi dilakukan menggunakan proteinase K dengan penambahan EDTA dan SDS. EDTA berfungsi menghilangkan kation divalent dan menghambat DNA-se, sedangkan SDS berfungsi untuk melarutkan membrane sel serta men-denaturasi protein. Selanjutnya dilakukan ekstraksi menggunakan pelarut organik seperti fenol. RNA kontaminan dieliminasi dengan RNA-se, sedangkan kontaminan dengan BM rendah dihilangkan dengan dialysis. DNA yang dihasilkan berukuran 100- 150 kb, cukup untuk konstruksi genome DNA libraries dalam vector bakteriophage . 2. Cara Kupiec, dkk 1987; Mencakup proses digesti menggunakan proteinase K, disosiasi kompleks DNA-protein dengan formamide konsentrasi tinggi, dan residu proteinase K dihilangkan dengan dialysis. Metode ini membutuhkan waktu yang lebih lama dan konsentrasi DNA yang dihasilkan lebih rendah ~ 10 µgml. 3. Cara Bowteli 1987; Menggunakan guanidine HCl untuk menghancurkan sel. DNA yang dihasilkan lebih kecil ~ 80 kb. Keuntungannya, metode ini lebih cepat dan dapat digunakan untuk mengekstraksi DNA secara simultan dari sel-sel yang berasal dari jaringan yang berbeda. Untuk kuantifikasi DNARNA dapat digunakan alat spektrofotometer. Pengukuran harus dilakukan pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Pengukuran pada 260 nm digunakan untuk menghitung konsentrasi asam nukleat dalam sample. 1 OD Optical Density sebanding dengan ± 50 µgml dsDNA. Dari nilai perbandingan antara OD 260 OD 280 dapat diperkirakan kemurnian asam nukleat tersebut. Kemurnian hasil preparasi DNA memiliki nilai : OD 260 OD 280 1,75 Apabila ada kontaminasi oleh protein atau fenol maka nilainya akan lebih rendah. 6 Universitas Sumatera Utara

BAB 3. PEMBUATAN REAGENSIA UNTUK ISOLASI DNA