1.
Hasil Fraksinasi dengan Amonium Sulfat
Proses fraksinasi dengan penambahan garam ammonium sulfat kedalam larutan enzim akan
menyebabkan menurunnya kelarutan enzim tersebut, sehingga terbentuk endapan protein. Dengan adanya penambahan garam, kelarutan protein akan meningkat hal ini dikarenakan
karena pada konsentrasi garam yang tinggi, garam akan lebih cenderung mengikat air dan menyebabkan agregasi Sehingga molekul protein mengalami pengendapan. Peristiwa ini
disebut salting out. Proses fraksinasi ini dilakukan pada suhu 0-4
o
C, hal ini betujuan agar kemungkinan hilangnya aktivitas enzim oleh adanya denaturasi dapat diminimalkan.
Pemurnian enzim pada tahap pertama ini dilakukan dengan menambahkan garam amonium sulfat dalam 5 tingkat fraksi kejenuhan Fraksi kejenuhan amonium sulfat yang digunakan
pada penelitian ini adalah 0-20, 20-40, 40-60, 60-80, dan 80-100 jenuh. Pada tahapan pemurnian ini tidak dilakukan uji aktivitas unit, kadar protein dan aktivitas
spesifiknya tetapi pengujiannya dilakukan setelah tahap dialisis. Hal ini dilakukan agar garam yang ada dalam larutan enzim dapat terpisah terlebih dahulu, sehingga garam yang
digunakan untuk mengendapkan protein tidak mempengaruhi pengukuran aktivitas enzim amilasenya, yang menyebabkan aktivitas unit enzim amilase menurun.
2. Aktivitas Dialisis Terpilih
Proses pemurnian dialisis dilakukan karena adanya molekul garam dari hasil fraksinasi yang dapat mempengaruhi aktivitas dan kestabilan enzim. Oleh karena itu, dengan
dilakukan tahapan pemurnian dialisis dapat mengeluarkan ion pengganggu garam tersebut
agar didapatkan enzim dengan aktivitas lebih tinggi dan kemurnian meningkat. Tahapan dialisis ini dilakukan pada kondisi dingin untuk mencegah terjadinya kerusakan protein
enzim yang dimurnikan dan juga dilakukan dengan menggunakan membran berdasarkan difusi partikel zat terlarut yang menyebabkan protein enzim akan terpisah dari ion-ion
garamnya dan membran yang digunakan adalah kantung selofan Reed et al, 1998. Pada setiap pergantian buffer phospat yang dilakukan setiap 4 jam sekali, dilakukan
pengujian dengan cara meneteskan larutan BaOH
2
0,1M pada buffer untuk mengetahui masih ada tidaknya garam ammonium sulfat pada enzim. Jika pada larutan buffer tersebut
tidak terdapat endapan putih setelah ditetesi larutan BaOH
2
, maka tahap dialisis telah selesai.
Gambar 13 Lampiran 2, Tabel 6 menunjukan hubungan antara fraksi enzim pada berbagai
tingkat kejenuhan amonium sulfat setelah didialisis dengan aktivitas unit enzim amilase.
0.5 1
1.5 2
2.5 3
0-20 20-40
40-60 60-80
80-100
Fraksi Dialisis
A k
ti vi
tas U
n it
U m
L
Gambar 13. Kurva aktivitas amilolitik setelah fraksinasi amonium sulfat dan dialisis
Pada Gambar diatas dapat dilihat enzim amilase yang memiliki aktivitas unit tertinggi yaitu pada fraksi 40-60 sebesar 2.6 UmL. Pada fraksi-fraksi sesudah fraksi 40-60, masih
terlihat tinggi aktivitas enzimnya, yang menandakan bahwa amonium sulfat masih dapat mengendapkan protein enzim pada fraksi-fraksi tersebut. Aktivitas unit tiap fraksi berbeda
karena dipengaruhi oleh tinkat kejenuhan garam amonim sulfat yang semakin meningkat. Berikut adalah Tabel Pemurnian enzim amilase dari actinomycetes pada berbagai tahap
pemurnian. Dapat dilihat bahwa pada Tabel di bawah ini terjadi peningkatan aktivitas dan tingkat kemurnian enzim amilase pada tahap pemurnian dialisis dari fraksi 40-60
dibandingkan dengan ekstrak kasar.
Tabel 2. Hasil Pemurnian Enzim Amilase
Tahap Volume
Aktivitas Aktivitas
Kadar Aktivitas
Tingkat Perolehan
Enzim Unit
Total Protein
Spesifik kemurnian
mL UmL
U mgmL
Umg kali
Ektrak Kasar
500 1.4
697 0.26
5.4 1
100 Fraksi
23.5 2.6
60.8 0.35
7.4 1.37
10 40-60
Setelah Dialisis
Hasil dialisis menunjukan aktivitas enzim yang meningkat dengan tingkat kemurnian yang lebih tinggi yaitu 1,37 kali lebih murni dibandingkan ekstrak kasar dan dengan perolehan
10 .
F. Enzim Amilase Hasil Karakterisasi
