- Uji Triple Sugar Iron Agar bertujuan untuk membedakan antara anggota enterobacteriaceae dengan kelompok lain dari bakteri basilus dalam usus, dimana
semua bakteri basilus Gram negatif akan dapat memfermentasi glukosa dengan menghasilkan asam. Pembagian ini didasarkan pada perbedaan pola fermentasi
pada karbohidrat dan pembentukan hidrogen sulfida. - Uji IMViC yang terdiri atas beberapa uji sebagai berikut : uji pembentukan indol,
uji metil merah, uji Voges Preskauer, dan uji sitrat.semua pengujian ini bertujuan untuk membedakan kelompok dalam family enterobacteriaceae yang merupakan
bakteri gram negatif, tidak membentuk spora dimana jenis yang termasuk dalam family ini adalah bakteri patogen, patogen okasional, dan flora normal.
- Uji hidrogen sulfida untuk mengetahui kemampuan mikroorganisme untuk menghasilkan hidrogen sulfida dari senyawa seperti asam amino yang mengandung
sulfur atau senyawa sulfur anorganik. - Uji katalase untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam mendegradasi hidrogen
peroksida dengan menghasilkan enzim katalase. - Uji oksidase untuk mengetahui dan membedakan bakteri berdasarkan pada
aktivitas oksidasi sitokromnya. Cappucino, 1996
BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN
3.1 Alat - Alat
a. Cawan petri b. Jarum ose lurus
Universitas Sumatera Utara
c. Jarum ose bengkok d. Tabung reaksi
Pyrex e. Tabung durham
Pyrex f. Neraca analitis
Sturdy g. Spatula
h. Beaker glass 250 ml Pyrex
i. Gelas ukur 100ml Duran
j. Gelas ukur 50ml Pyrex
k. Rak tabung reaksi l. Kaca preparat
m. Mikroskop cahaya n. Botol akuades
o. Aluminium foil p. Pipet tetes
q. Bunsen r. Vortex
s. Inkubator t. Laminary
u. Kapas steril v. Cover glass
w. Penjepit tabung x. Oksidase strip
Merck y. Blank disk
z. Pinset aa. Jangka sorong
bb. Hockey stick cc. Autoklaf
Sturdy CE
3.2 Bahan
a. Etanol 70 b. Akuades steril
c. Kristal violet Merck
d. Gram’s iodine Merck
e. Aseton alcohol Merck
Universitas Sumatera Utara
f. Safranin Merck
g. Media sukrosa h. Media fruktosa
i. Media maltosa j. Media laktosa
k. Media glukosa l. Media sorbitol
m. Media salisin n. Media inositol
o. Media manitol p. Media GSP
Merck q. Media MacConkey Agar
Merck r. Simon’s Citrate Agar
Merck s. Media MIO motility indol ornitin
Merck t. Media MR-VP methyl red vorges proskauer
Merck u. Media Miring Triple Sugar Iron Agar
Merck v. Media Miring LIA lysine Iron Agar
Merck w. Media Gelatin
Merck x. Media OF basal
Merck y. H
2
O
2
3 z. Reagen Kovac’s
Merck aa. Indikator metil merah
bb. Larutan alfa naftol cc. Larutan KOH-Kreatin
dd. Parafin cair ee. Media Tryptone Soya Agar
Merck ff. Asap cair
3.3 Cara Kerja A. Persiapan Analisa
A.1 Penyediaan sampel
Sampel ikan Lele Dumbo Clarias sp yang akan dianalisa berasal dari satu sumber yaitu Pasar Sore Padang Bulan. Pemilihan sampel dilakukan berdasarkan
pertimbangan bahwa sampel yang berasal dari pasar akan langsung menjangkau
Universitas Sumatera Utara
konsumen. Sebelum dianalisa, sampel dikarantina pada instalasi Balai Karantina Ikan Bandara Polonia Medan selama dua hari dan setelah itu akan dilakukan isolasi bakteri
dari sampel pada bagian daging sesuai dengan prosedur selanjutnya. Setelah dilakukan isolasi dan pemurnian bakteri, maka akan dilanjutkan dengan uji identifikasi untuk
menentukan apakah bakteri yang didapat termasuk dalam hama dan penyakit ikan karantina atau tidak. Identifikasi dilakukan sesuai dengan referensi hasil uji biokimia
pada lampiran
A.2 Isolasi dan Uji Biokimia Metabolisme Bakteri - Isolasi Bakteri dari Daging Ikan Lele Dumbo Clarias sp
Prosedur
a. Disterilkan area kerja yaitu laminary dan tangan dengan etanol 70 b. Dipersiapkan ikan Lele Dumbo yang akan digunakan pada wadah pembedahan
setelah dimatikan c. Disediakan media TSA
d. Dilakukan pembedahan terhadap ikan Lele Dumbo pada bagian badan e. Diambil bakteri dari daging ikan Lele Dumbo bagian dalam
f. Dikulturisasi bakteri pada media TSA yang telah disediakan dengan metode cawan gores
g. Diinkubasi secara terbalik pada suhu 28 - 30
o
C selama 24-48 jam
- Teknik Biakan Murni Prosedur
a. Disterilkan area kerja dan tangan dengan etanol 70 b. Dihidupkan bunsen
c. Disediakan media TSA yang telah diberi label d. Disterilkan jarum ose bengkok dengan insenerasi dan dibiarkan hingga dingin
e. Disentuh permukaan koloni yang akan dimurnikan dengan jarum ose bengkok, pilih koloni yang terpisah untuk mendapatkan hasil yang optimal
f. Digoreskan pada permukaan media TSA g. Diinkubasikan secara terbalik pada suhu 28
o
– 30
o
C selama 24 – 48 jam h. Diamati pertumbuhan koloni
i. Diulangi perlakuan yang sama sampai diperoleh biakan yang murni
- Teknik Pewarnaan Gram
Universitas Sumatera Utara
Prosedur
a. Disterilkan area kerja dan tangan dengan etanol 70 b. Dipindahkan biakan bakteri dengan jarum ose bengkok
- Jika biakan berupa cairan maka transfer 1 – 2 lup ose biakan ke permukaan slide, sebarkan secara merata kemudian difiksasi
- Jika biakan berbentuk padat maka disentuh koloni dengan jarum ose steril kemudian transfer ke permukaan slide, ose diinsenerasi kembali.
Teteskan 1 – 2 tetes akuades steril pada olesan, kemudian dengan ose steril sebarkan secara merata lalu slide difiksasi
c. Diberi zat warna kristal violet dan biarkan selama 1 menit d. Dibilas dengan akuades kemudian dikering anginkan
e. Diteteskan Gram’s iodin dan dibiarkan selama 30 detik f. Dibilas dengan aseton alkohol untuk dekolorisasi
g. Dibilas dengan akuades h. Digenangi slide dengan larutan safranin selama 1 menit
i. Dibilas kembali dengan akuades kemudian dikeringkan j. Diamati preparat di bawah mikroskop
- Uji Karbohidrat Prosedur
h. Diberi label pada setiap media karbohidrat i. Disterilkan tangan dan area kerja engan etanol 70
j. Disterilkan jarum ose dengan insenerasi k. Diinokulasikan 1 lup ose biakan murni bakteri kedalam media sukrosa secara
aseptis l. Diinkubasikan biakan pada suhu 28 – 30
o
C selama ±
48 jam m. Diamati hasilnya
n. Dilakukan perlakuan yang sama untuk media fruktosa, glukosa, maltosa, laktosa, salisin, inositol, manitol serta sorbitol
- Uji Media Selektif dan Media Diferensial Prosedur
a. Diberi label pada media GSP yang akan digunakan b. Disterilkan area kerja dan tangan dengan etanol 70
c. Disterilkan jarum ose bengkok dengan insenerasi
Universitas Sumatera Utara
d. Disentuh koloni bakteri kemudian secara aseptis dikultur pada media GSP dengan metode cawan gores streak plate
e. Diinkubasikan secara terbalik pada suhu 28 – 30
o
C selama ±
48 jam f. Diamati hasilnya
g. Dilakukan perlakuan yang sama untuk media MacConkey Agar
- Uji Sitrat Prosedur
a. Diberi label pada media Simon’s Citrate Agar yang akan digunakan b. Disterilkan area kerja dan tangan dengan etanol 70
c. Disterilkan jarum ose bengkok dengan insenerasi d. Disentuh koloni bakteri kemudian secara aseptis dikultur pada media SCA
dengan metode cawan gores streak plate e. Diinkubasikan secara terbalik pada suhu 28 – 30
o
C selama ±
48 jam f. Diamati hasilnya
- Uji Motilitas Indol dan Ornitin Prosedur
a. Diberi label pada media MIO yang akan digunakan b. Disterilkan area kerja dan tangan dengan etanol 70
c. Disterilkan jarum ose lurus dengan insenerasi d. Diinokulasikan biakan bakteri secara aseptis dengan cara menusukkan jarum
ose lurus hingga setengah kedalaman pada media e. Diinkubasikan selama 48 jam pada suhu 28
o
– 30
o
C f. Diamati hasilnya
- Uji Methyl Red Voges-Proskauer Prosedur
a. Diberi label pada media MR-VP cair yang akan digunakan b. Disterilkan tangan dan area kerja dengan etanol 70
c. Disterilkan jarum ose bengkok dengan insenerasi d. Diinokulasikan 1 – 2 lup ose biakan murni bakteri kedalam media MR-VP
secara aseptis e. Diinkubasikan biakan pada suhu 28
o
– 30
o
C selama 48 jam f. Dilakukan pengamatan hasil sesuai dengan prosedur B.1
- Uji Triple Sugar Iron Agar
Universitas Sumatera Utara
Prosedur
a. Diberi label pada media miring TSIA yang akan digunakan b. Disterilkan area kerja dan tangan dengan etanol 70
c. Disterilkan jarum ose lurus dengan insenerasi d. Diinokulasikan biakan bakteri secara aseptis ke bagian butt media dengan cara
menusukkan jarum ose lurus hingga setengahnya kemudian pada bagian slunt dilakukan dengan cara penggoresan streak
e. Diinkubasikan selama 48 jam pada suhu 28
o
– 30
o
C f. Diamati hasilnya
- Uji Lysine Iron Agar Prosedur
a. Diberi label pada media LIA yang akan digunakan b. Disterilkan area kerja dan tangan dengan etanol 70
c. Disterilkan jarum ose lurus dengan insenerasi d. Diinokulasikan biakan bakteri secara aseptis dengan cara menusukkan jarum
ose lurus hingga setengah kedalaman pada media e. Diinkubasikan selama 48 jam pada suhu 28
o
– 30
o
C f. Diamati hasilnya
- Uji Gelatin Prosedur
a. Diberi label pada media gelatin yang akan digunakan b. Disterilkan tangan dan area kerja dengan etanol 70
c. Disterilkan jarum ose bengkok dengan insenerasi d. Diinokulasikan 1 – 2 lup ose biakan murni bakteri kedalam media gelatin
secara aseptis e. Diinkubasikan biakan pada suhu 28
o
– 30
o
C selama 48 jam f. Dilakukan pengamatan hasil sesuai prosedur B.2
- Uji Respirasi Oksidasi dan Fermentasi Glukosa Prosedur
a. Disediakan dua tabung media O F kemudian diberi label pada pada masing – masing media I dan II
b. Disterilkan tangan dan area kerja dengan etanol 70 c. Disterilkan jarum ose lurus dengan insenerasi
Universitas Sumatera Utara
d. Diinokulasikan biakan murni bakteri pada kedua media O F secara aseptis dengan cara menusukkan jarum ose lurus hingga setengah kedalaman media
e. Diteteskan beberapa tetes larutan parafin pada tabung I f. Diinkubasikan kedua biakan pada suhu 28
o
– 30
o
C selama 48 jam g. Diamati hasilnya
- Uji Oksidase Prosedur
a. Disterilkan tangan dan area kerja dengan etanol 70 b. Disterilkan jarum ose bengkok dengan insenerasi
c. Diinokulasikan 1 – 2 lup ose biakan bakteri pada oksidase strip secara aseptis d. Disterilkan kembali jarum ose
e. Diamati perubahan warna yang terjadi
- Uji Katalase Prosedur
a. Disediakan kaca preparat yang bersih b. Disterilkan jarum ose bengkok dengan insenerasi
c. Diambil 1 – 2 lup ose biakan murni bakteri secara aseptis d. Ditempatkan pada tengah kaca preparat
e. Diteteskan 2 – 3 tetes H
2
O
2
3 pada permukaan olesan bakteri f. Diamati perubahan yang terjadi
A.3 Uji Indeks Anti-Mikrobial Asap Cair A.3.1 Persiapan Isolat Bakteri
Prosedur
a. Disterilkan area kerja dan tangan dengan etanol 70 b. Diambil biakan murni bakteri secara aseptis, diinokulasikan ke dalam tabung
reaksi yang berisi ±
10 mL akuades steril, ditutup dengan kapas steril c. Divortex inokulum hingga homogen
d. Disediakan media TSA steril yang telah diberi label e. Diinsenerasikan jarum ose bengkok kemudian didinginkan
f. Diambil dua lup ose suspensi biakan secara aseptis kemudian diinokulasikan ditengah media
g. Disebarkan suspensi secara merata pada permukaan media dengan menggunakan hockey stick steril
Universitas Sumatera Utara
h. Diinkubasikan biakan secara terbalik pada suhu 28
o
– 30
o
C selama 24 jam i. Diamati pertumbuhan koloni dan diulangi prosedur yang sama jika
pertumbuhan bakteri tidak merata
A.3.2 Uji Indeks Anti-mikrobial Asap Cair Tempurung Kelapa Prosedur
a. Disterilkan blank disk dengan autoklaf pada suhu 121
o
C dan tekanan 15psi selama 15 menit
b. Dicelupkan blank disk secara septis kedalam asap cair dan dibiarkan c. Disterilkan tangan dan area kerja dengan etanol 70
d. Diambil isolat bakteri yang telah tumbuh merata e. Diambil disk yang telah berisi asap cair dengan pinset kemudian ditempatkan
ditengah – tengah media isolat bakteri f. Diinkubasikan kembali selama 24 jam
g. Dihitung indeks mikrobialnya
Perhitungan Indeks Anti-mikrobial
Indeks Anti-Mikrobial = Diameter zona hambat – diameter disk
Diameter disk B. Pembacaan Hasil Uji Biokimia Metabolisme Bakteri
B.1 Uji Methyl Red – Voges Proskauer Prosedur
a. Hasil biakan bakteri dibagi kedalam dua tabung reaksi dan masing- masing diberi label tabung I dan tabung II
b. Pada tabung I diteteskan beberapa tetes indikator metil merah dan diguncang c. Pada tabung II diteteskan beberapa tetes larutan alfa naftol dan diguncang
d. Ditambahkan beberapa tetes larutan KOH – keratin pada tabung II dan diguncang kembali
e. Diamati perubahan warna yang terjadi
B.2 Uji Gelatin Prosedur
a. Diambil biakan bakteri pada media gelatin dan ditempatkan didalam lemari pendingin selama 10-15 menit
Universitas Sumatera Utara
b. Dikeluarkan biakan bakteri dan diamati jika terdapat bagian cair pada permukaan media maka didapatkan hasil yang positif, jika tidak terdapat
bagian cair pada permukaan media maka didapatkan hasil negative c. Jika hasil yang didapatkan kurang meyakinkan maka biakan bakteri dapat
kembali diinkubasi selama 24 jam kemudian diamati kembali dengan perlakuan yang sama
BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN
