Kloning Dan Ekspresi Gen Β-1,4-Glukanase Dari Burkholderia Cepacia Ke Dalam Sistem Escherichia Coli Serta Optimasi Dan Karakterisasinya.

KLONING DAN EKSPRESI GEN β-1,4-GLUKANASE DARI
Burkholderia cepacia KE DALAM SISTEM Escherichia coli
SERTA OPTIMASI DAN KARAKTERISASINYA

FITRIANI WINANGSIH

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul Kloning dan
Ekspresi Gen β-1,4-glukanase dari Burkholderia cepacia ke dalam Sistem
Escherichia coli serta optimasi dan karakterisasinya adalah benar karya saya
dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun
kepada perguruan tinggi mana pun. Tesis ini merupakan bagian dari proyek
penelitian Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan
Sumberdaya Genetik Pertanian (BB Biogen). Sumber informasi yang berasal atau
dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah

disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir
tesis ini.

Bogor, Januari 2015

Fitriani Winangsih
G851120031

RINGKASAN
FITRIANI WINANGSIH. Kloning dan Ekspresi Gen β-1,4-glukanase dari
Burkholderia cepacia ke dalam Sistem Escherichia coli serta optimasi dan
karakterisasinya. Dibimbing oleh MARIA BINTANG dan TRI PUJI PRIYATNO.
Glukanase merupakan salah satu enzim yang dapat menghidrolisis dinding
sel kapang patogen yang menginfeksi tanaman padi. Glukanase dihasilkan dari
bakteri endofitik yaitu Burkholderia cepacia. Tujuan penelitian ini adalah
menganalisis hasil kloning dan ekspresi gen penyandi enzim β-1,4-glukanase dari
Burkholderia cepacia ke dalam sistem Escherichia coli serta mengkarakterisasi
enzim rekombinannya. Gen glukanase diisolasi dari bakteri B. cepacia yang
berasal dari tanaman padi dengan teknik PCR menggunakan primer Glu 1320
yang dirancang berdasarkan sekuen glukanase melalui akses internet

menghasilkan fragmen DNA berukuran 1300 bp. Hasil analisis BlastN dan BlastX
dari sekuen klon rekombinan menunjukkan bahwa gen berukuran 1300 bp yang
telah diklon dengan vektor pGEM-T Easy dan sekuensing urutan DNA yang
diperoleh menunjukkan bahwa fragmen DNA memiliki kemiripan dengan gen
Endo-1,4-D-glucanase pada Burkholderia mallei dan Burkholderia pseudomallei.
Hal tersebut ditunjukkan dengan nilai kemiripan (Identity) 99% dan E-value 0.0.
Analisis proteomik hasil sekuen asam amino menggunakan Server Expasy
Proteomic menunjukkan gen rekombinan glukanase memiliki jumlah asam amino
451, bobot molekul 48.363 kDa dan memiliki titik isoelektrik (pI) sekitar 5.87.
Hasil signal peptide memiliki nilai cleavage site berada pada posisi 23 dan 24
yang terletak pada asam amino AAA-AE. Protein klon rekombinan diperoleh dari
database Protein Data Bank (PDB) dengan kode 4q2b.2.A. Protein ini terdiri atas
349 residu yang membentuk struktur sekunder berupa 7 pasang beta-hairpin, 20
turn, 3 helix-3/10, dan 17 alpha-helix. Protein hasil purifikasi memiliki bobot
molekul protein fusi sekitar 65 kDa. Aktivitas spesifik enzim glukanase
menunjukkan 1207.976 U mg-1 dengan yield 27.0% dan tingkat kemurnian 3.9fold. pH dan suhu optimum dalam menghidrolisis β-glukan adalah pH 6.0 dan
suhu 40 oC dengan aktivitas enzim 293.71 U mL-1.
Kata kunci: Burkholderia cepacia, gen β-1,4-glukanase, Escherichia coli

SUMMARY

FITRIANI WINANGSIH. Cloning and expression gene β-1,4-glucanase from
Burkholderia cepacia into Escherichia coli system, optimize and characterize the
recombinant enzyme. Supervised by MARIA BINTANG and TRI PUJI
PRIYATNO.
Glucanase is the one of enzyme that hydrolyze cell wall of fungal pathogen
that was infection of rice plant. Glucanase enzyme was produced by endophytic
bacteria Burkholderia cepacia. The object of this research was to analyze cloning
and expression result of gene encoding β-1,4-glucanase from B. cepacia into
Escherichia coli system and characterize the recombinant enzyme. The clone of
glucanase gene was isolated by PCR technique using DNA fragment of B. cepacia
from rice plants. The Glu 1320 primer pairs were designed based on the glucanase
sequence online database, with the length of the amplicon DNA of 1300 bp.
Result from BlastN and BlastX analysis showed that the DNA fragment which
was cloned into pGEM-T Easy vector had similarity with Endo-1,4-D-glucanase
gene of Burkholderia mallei and Burkholderia pseudomallei. The identity of the
cloned DNA fragment that was 99% and E-value 0.0.
Proteomic analysis of the amino acid sequence was done using Server
Expasy Proteomic and the total of amino acid were 451 with molecular weight of
48.363 kDa and the isoelectric point (pI) of 5.87. The signal peptide had cleavage
sites on position 23 and 24 in amino acid AAA-AE. Protein clone recombinant

was obtained from Protein Data Bank (PDB) database with the code of 4q2b.2.A.
The protein consist of 349 residu which formed the secondary structure like of 7
beta-hairpin pairs, 20 turn, 3 helix-3/10, and 17 alpha-helix. The purified protein
had a fusion protein with molecular mass of 65 kDa. The specific activity of
glucanase enzyme showed that the activity 1207.976 U mg-1 with yield 27.0%
and purification 3.9-fold. The optimal pH and temperature for hydrolysis of βglucan were in the pH 6.0 and 40 oC with enzyme activity of 293.71 U mL-1.
Keywords: Burkholderia cepacia, β-1,4-glucanase gene, Escherichia coli

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

KLONING DAN EKSPRESI GEN β-1,4-GLUKANASE DARI
Burkholderia cepacia KE DALAM SISTEM Escherichia coli

SERTA OPTIMASI DAN KARAKTERISASINYA

FITRIANI WINANGSIH

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Biokimia

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr. Suryani, SP., M.Sc

Judul Tesis : Kloning dan Ekspresi Gen β-1,4-glukanase dari Burkholderia
cepacia ke dalam Sistem Escherichia coli serta optimasi dan
karakterisasinya

Nama
: Fitriani Winangsih
NIM
: G851120031

Disetujui oleh
Komisi Pembimbing

Prof Dr drh Maria Bintang, MS
Ketua

Ir Tri Puji Priyatno, MSc PhD
Anggota

Diketahui oleh

Ketua Program Studi
Biokimia

Dekan Sekolah Pascasarjana

Prof Dr drh Maria Bintang, MS

Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr

Tanggal Ujian: 29 Desember 2014

Tanggal Lulus:

PRAKATA
Puji dan syukur penulis haturkan kehadirat Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala rahmat, hidayah dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan
penyusunan tesis. Tesis ini disusun sebagai keseluruhan rangkaian penelitian yang
telah dilaksanakan guna memenuhi syarat dalam menyelesaikan pendidikan di
Program Magister Biokimia Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor,
Departemen Biokimia. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan
pada bulan September 2013 sampai Agustus 2014 ialah kloning dan ekpresi gen,
dengan judul Kloning dan Ekspresi Gen β-1,4-glukanase dari Burkholderia
cepacia ke dalam Sistem Escherichia coli serta optimasi dan karakterisasinya.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Prof. Dr. drh. Maria Bintang, MS

dan Ir. Tri Puji Priyatno, MSc.,PhD selaku pembimbing yang dengan ikhlas dan
sabar membimbing penulis dari awal penulisan hingga saat ini. Ucapan terima
kasih kepada Pimpinan dan Staf Peneliti terutama Bapak Ir. Tri Puji Priyatno,
MSc.,PhD pada Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan
Sumberdaya Genetik Pertanian (BB Biogen). Tak lupa penulis sampaikan terima
kasih kepada PEMDA Kabupaten Manokwari atas beasiswa yang diberikan
selama studi.
Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada ayah, ibu, suami serta
seluruh keluarga atas segala doa, dukungan dan kasih sayangnya. Semoga hasil
penelitian dan rangkaian tesis ini dapat bermanfaat bagi kemajuan ilmu
pengetahuan dan teknologi.

Bogor, Januari 2015
Fitriani Winangsih

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL

vi

DAFTAR GAMBAR

vi

DAFTAR LAMPIRAN

vi

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
Hipotesis

1
1
2
2
2

2 METODE
Alat dan Bahan
Waktu dan Tempat
Prosedur Penelitian

3
3
3
3

3 HASIL DAN PEMBAHASAN
Kloning Gen β-1,4-glukanase
Sekuensing dan Analisis Sekuen DNA
Analisis Proteomik
Domain dan Motif
Subkloning dan Ekspresi Rekombinan Glukanase
Karakterisasi Protein Rekombinan Glukanase
Aktivitas Glukanase
Suhu dan pH Optimum

9
9
11
13
16
17
19
21
22

4 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran

24
24
24

DAFTAR PUSTAKA

25

LAMPIRAN

28

RIWAYAT HIDUP

38

DAFTAR TABEL
1 Hasil BlastN Gen β-1,4-glukanase
2 Hasil BlastX Gen β-1,4-glukanase
3 Hasil prediksi beberapa parameter gen β-1,4-glukanase menggunakan
Server Expasy Proteomic
4 Hasil pemurnian enzim β-1,4-glukanase

12
13
14
21

DAFTAR GAMBAR
1 Elektroforegram amplikon gen β-1,4-glukanase B. cepacia
2 Elektroforegram amplikon koloni terpilih menggunakan primer
Glu1320-F dan Glu1320-R
3 Pohon filogenetik Gen β-1,4-glukanase
4 Struktur protein 4q2b.2.A (Endo-1,4-beta-D-glukanase)
5 Struktur sekunder 4q2b.2.A (Endo-1,4-beta-D-glucanase)
6 PCR koloni klon glukanase (pGEM-GluBH) yang ditransformasi dalam
inang E. coli DH5
7 Pemotongan plasmid pGEM-GluBH dengan enzim BamH1-HindIII
8 Hasil PCR koloni klon glukanase dari transformasi dalam sel inang E.
coli BL21(D3)-pLyss
9 Pemotongan plasmid pET-Glu dengan enzim BamHI-HindIII
10 Hasil SDS-PAGE sampel protein dari supernatan
11 Hasil SDS-PAGE sampel protein dari pelet
12 Hasil pemurnian glukanase
13 Optimasi suhu terhadap aktivitas glukanase (A) dan aktivitas relatif
enzim (B)
14 Optimasi pH terhadap aktivitas glukanase (A) dan aktivitas relatif
enzim (B)

10
11
12
15
16
17
18
18
19
20
20
21
22
23

DAFTAR LAMPIRAN
1 Diagram alir penelitian
2 Hasil sekuensing gen penyandi β-1,4-glukanase
3 Hasil prediksi beberapa parameter gen β-1,4-glukanase menggunakan
Server Expasy Proteomic
4 Hasil penjajaran sekuen gen glukanase klon rekombinan dengan gen
endo-1,4-D-glucanase pada B. mallei dan B. pseudomallei
5 Hasil prediksi Signal Peptide glukanase menggunakan server SignalIP
4.1
6 Struktur domain hasil analisis Conserved Domain Database (CDD)NCBI
7 Motif sekuen protein gen penyandi glukanase B. cepacia
8 Daerah sisi aktif gen penyandi glukanase B. cepacia
9 Konstruk plasmid pET-32b dengan posisi His-Trx pada ujung 5' dan
His pada ujung 3'

29
31
32
34
35
36
36
37
37

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Peningkatan produksi tanaman padi sering mengalami beberapa kendala.
Salah satu diantaranya disebabkan oleh adanya infeksi patogen. Infeksi patogen
pada tanaman dapat terjadi karena bakteri, virus atau kapang. Penyakit blas yang
disebabkan oleh kapang Pyricularia grisea merupakan penyakit utama padi. Salah
satu upaya pengendalian kapang patogen dapat dilakukan dengan memanfaatkan
bakteri endofitik antagonistik yang menghasilkan enzim penghancur dinding sel
kapang. Salah satu enzim yang dimanfaatkan untuk menghambat pertumbuhan
kapang patogen yaitu enzim β-glukanase karena komponen utama dinding sel
kapang adalah glukan. Enzim β-glukanase merupakan enzim golongan hidrolitik
yang dapat mencegah infeksi kapang dengan menghidrolisis senyawa glukan
sebagai substratnya, sehingga integritas dinding sel kapang menurun dan tidak
dapat menginfeksi sel inang (Shetty et al. 2009).
Secara alami enzim ini merupakan salah satu upaya pertahanan tanaman
terhadap kapang patogen, namun keberadaannya belum efektif menghambat
perkembangan kapang patogen (Shaikh 2005). Salah satu bakteri endofitik yang
diisolasi dari tanaman padi dan memiliki aktivitas enzim glukanase, adalah
Burkholderia cepacia (No. Aksesi Biogen-CCE76). Bakteri ini dapat ditemukan
pada jaringan tanaman dan juga ditemukan pada ruang antarsel tanaman tebu
(Omarjee dan Balandreau 2005). Menurut Bacon & Hinton (2006), bakteri
endofitik bersimbiosis secara mutualistik dengan tumbuhan inangnya. Hasil
penelitian yang dilakukan oleh Fathin (2012) menunjukkan bahwa B. cepacia
menghasilkan enzim β-1,3-1,4-glukanase.
Enzim β-glukanase bekerja pada ikatan β-glikosidik dalam struktur β-glukan.
Penggolongan enzim ini pun cukup beragam tergantung pada ikatan glikosidik
yang dihidrolisisnya. Enzim β-glukanase yang menghidrolisis ikatan β-1,3 dikenal
sebagai laminarinase (EC 3.2.1.39) (Doxey et al. 2007), sedangkan yang
menghidrolisis ikatan β-1,4 lebih dikenal sebagai selulase (EC 3.2.1.4)
(Nishiyama et al. 2001). Menurut Celestino et al. (2006) tingkat spesifikasi
aktivitas dari β-glukanase tergantung pada perbedaan struktur geometri molekul
glukan. β-glukanase yang dihasilkan oleh Rhizopus microporus var. microporus
hanya spesifik terhadap glukan dari oat (β-1,3-1,4-glukan), tetapi tidak terhadap
laminarinase (β-1,3-glukan) maupun karboksimetil selulosa (β-1,4-glukan).
Berbagai tumbuhan menghasilkan enzim ini untuk mempertahankan diri
dari serangan kapang patogen, sehingga enzim ini digolongkan dalam
phatogenesis-related protein (protein PR). Saccharomyces cerevisiae merupakan
jenis khamir yang menghasilkan β-glukanase yang berperan dalam proses
reproduksi aseksual dan pertumbuhannya. Enzim ini dihasilkan juga untuk
remodeling β-glukan dinding sel (Adams 2004). Menurut Shaikh (2005) kapang
jenis Trichoderma spp. menggunakan β-glukanase sebagai agen infeksi pada
dinding sel tumbuhan inang.
Enzim β-glukanase mengalami perkembangan yang sangat pesat dalam
proses pemanfaatannya. Potensi enzim β-glukanase B. cepacia dapat
dimanfaatkan untuk peningkatan ketahanan tanaman melalui pendekatan rekayasa

2
genetik. Salah satu metode yang diterapkan untuk meningkatkan produksi βglukanase dengan menggunakan protein rekombinan yang dihasilkan. Penelitian
untuk mengembangkan upaya alternatif sebagai sumber gen ketahanan terhadap
infeksi kapang patogen pada bidang pertanian diharapkan dapat mengurangi
ketergantungan terhadap bahan kimia yang memiliki efek negatif terhadap
lingkungan sekitarnya. Pemanfaatan enzim pendegradasi dinding sel (cell wall
degrading) untuk pengembangan tanaman rekayasa genetik tahan kapang patogen
sudah banyak dilaporkan. Ekspresi tertinggi enzim tersebut pada tanaman terbukti
efektif mencegah infeksi patogen. Budiani et al. (2004) melaporkan bahwa
peningkatan ekspresi gen enzim β-1.3-glukanase dan kitinase pada tanaman kopi
arabika (Coffea arabica L.) menunjukkan tanaman lebih tahan terhadap karat
daun. Permasalahannya tidak semua tanaman potensial memiliki aktivitas enzim
pendegradasi dinding sel sehingga perlu diintroduksi dari luar organisme itu
sendiri.
Enzim β-glukanase dapat diproduksi dengan menggunakan teknologi
protein rekombinan menggunakan bakteri Escherichia coli. Produksi protein
rekombinan secara maksimal dapat dilakukan melalui pemilihan vektor dan inang
ekspresi yang ideal. Penggunaan vektor ekspresi pET-32b dalam membawa gen
glukanase hingga akhirnya ditransformasi dan diekspresikan ke dalam sel inang E.
coli BL21 sebagai dasar pembuatan protein rekombinan glukanase belum
diketahui. Oleh karena itu, perlu dilakukan kloning yang dapat mengekspresikan
gen β-glukanase B. cepacia untuk memproduksi protein rekombinan enzim βglukanase, optimasi dan karakterisasinya, serta dipelajari potensinya sebagai
sumber gen ketahanan terhadap kapang patogen.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk melakukan kloning gen penyandi enzim β1,4-glukanase dari Burkholderia cepacia, optimasi dan karakterisasi rekombinan
enzim β-1,4-glukanase pada Escherichia coli serta pemurnian enzim
rekombinannya.
Manfaat Penelitian
Manfaat dari penelitian ini adalah diperolehnya isolat rekombinan yang
potensial memproduksi β-1,4-glukanase yang nantinya digunakan dalam bidang
pertanian sebagai gen ketahanan tanaman terhadap kapang patogen.
Hipotesis
Hipotesis yang diajukan pada penelitian ini adalah gen penyandi enzim β1,4-glukanase dari B. cepacia dapat dikloning sebagai gen penghasil enzim yang
fungsional pada sistem ekspresi Escherichia coli. Enzim β-1,4-glukanase hasil
rekombinan dapat dimurnikan dan ditentukan karakternya.

3

2 METODE
Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan diantaranya adalah inkubator, shaker inkubator
(Kuhner), vortex mixer, spektrofotometer UV-Vis, mini spin (Eppendorf), thermal
cycler PCR (Eppendorf), termomixer (Eppendorf), perangkat elektroforesis
(Mupid), autoklaf, pH meter, Cold sentrifuse (Sorvale Fresco), dan alat-alat gelas
yang biasa digunakan di laboratorium.
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah bakteri endofitik B.
cepacia yang digunakan dalam penelitian ini adalah strain Biogen CCE76 yang
diisolasi dari tanaman padi. Primer yang digunakan adalah primer Glu 1320-F dan
Glu 1320-R. Medium kultur terdiri atas Luria-Bertani (LB) dengan komposisi 10
g L-1 tripton, 10 g L-1 NaCl, dan 5 g L-1 ekstrak khamir. DNA Extraction Kit (1st
Base), Miniprep Kit (1st Base), Gel DNA Fragments Extraction Kit (1st base),
PCR Extraction Kit (1st Base). Antibiotik yang digunakan terdiri atas ampisilin,
kanamisin, dan streptomisin. Vektor kloning yang digunakan adalah pGEM-T
Easy dan sel inang untuk kloningnya digunakan E. Coli DH5α.
Waktu dan Tempat
Penelitian dilaksanakan pada bulan September 2013 sampai Agustus 2014
di Laboratorium Biokimia, BB Biogen, Bogor-Jawa Barat.
Prosedur Penelitian
Peremajaan isolat bakteri B. cepacia
Bakteri dipelihara dan disubkultur setiap 3 minggu sekali pada media agar
miring Luria-Bertani (LB) dalam tabung reaksi. Komposisi medium terdiri atas 10
g L-1 tripton, 10 g L-1 NaCl, dan 5 g L-1 ekstrak khamir. Biakan diinkubasi pada
suhu ruangan. Diagram alir tergambar pada Lampiran 1(A).
Perancangan primer β-1,4-glukanase
Primer spesifik dirancang untuk amplifikasi daerah konservatif gen β-1,4glukanase melalui tahapan inventarisasi sekuen glukanase. Koleksi sekuen terpilih
dijajarkan (aligment) untuk mendapatkan daerah yang tinggi homologi sekuennya
(conserved
region)
menggunakan
program
Bioedit
ClustalW
(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/). Daerah dengan homologi tinggi ini digunakan
sebagai acuan perancangan primer menggunakan program Primer3
(http://www.biotools.umassmed.edu/) dengan mempertimbangkan persyaratan
primer yang ideal. Pasangan primer yang dirancang yaitu Glu1320-F
(ATGGCGAGCTTCTCGTGATGG) dan Glu1320-R (TCAACGCGCGGGCGT
CAGCAC). Diagram alir tergambar pada Lampiran 1(A).
Ekstraksi DNA genomik B. cepacia
B. cepacia dibiakan pada 15 mL medium cair LB dalam Erlenmeyer 100
mL selama 24 jam pada suhu ruang sambil digoyang menggunakan orbital shaker

4
dengan kecepatan 75 rpm. Biakan dipanen menggunakan sentrifugasi dengan
kecepatan 12.000 rpm pada suhu 4 oC selama 10 menit agar sel dapat mengendap.
Endapan sel bakteri diresuspensi dengan buffer, lalu DNA diekstraksi
menggunakan DNA Extraction Kit (1st Base). DNA hasil ektraksi disimpan pada
suhu _20 oC (Modifikasi Sambrook dan Russell 2001).
Amplifikasi gen β-1,4-glukanase
Gen β-1,4-glukanase diamplifikasi dari B. cepacia menggunakan primer
Glu1320-F (ATGGCGAGCTTCTCGTGATGG) dan Glu1320-R (TCAACGCGC
GGGCGTCAGCAC). Komposisi reaksi PCR terdiri atas 1 μL DNA B. cepacia
dengan konsentrasi 200 μg, 1 μL primer forward 20 ρmol, 1 μL primer reverse 20
ρmol, 0.5 unit (U) Taq Polymerase, 10 μmol MgSO4, 0.5 μL dNTP (10 mM), 2
μL 10× PCR buffer, dan mili-Q water ditambahkan hingga total volume reaksi
PCR 20 μL. Reaksi PCR dijalankan dengan program sebagai berikut satu siklus
inisiasi (94 oC, 4 menit) dilanjutkan dengan 35 siklus yang terdiri dari: denaturasi
pada suhu 94 oC selama 1 menit; annealing (penempelan) primer pada suhu 58 oC,
selama 1 menit; pemanjangan pada suhu 72 oC selama 3 menit; serta 5 menit
ekstensi pada suhu 72 oC (Modifikasi Sambrook dan Russell 2001). Hasil PCR
diverifikasi dengan elektroforesis pada gel agarosa 1%.
Elektroforesis gel agarosa
Elektroforesis dilakukan dengan menggunakan media gel agarosa
(Sambrook dan Russell 2001). Gel agarosa (1%) dibuat dengan cara mencairkan
agarosa 0.3 gr dalam 30 mL buffer TAE (40mM Tris-ate, 1 mM EDTA pH 8)
dengan pemanasan. Gel agarosa kemudian ditambahkan dengan Gel Red sambil di
goyang hingga homogen dan dituang ke dalam cetakan. Sampel DNA
ditambahkan dengan loading dye (0.25% brom phenol blue dan 40% sukrosa).
Campuran ini dihomogenisasi menggunakan mikropipet dan dimasukkan ke
dalam sumur gel agarosa. Elektroforesis dilakukan dengan menghubungkan arus
listrik positif dan negatif pada tegangan 100 volt selama 25 – 30 menit. Setelah
elektroforesis, visualisasi pita DNA yang terbentuk dapat dilakukan dengan
penyinaran sinar UV dan pita DNA yang tampak didokumentasikan untuk
dianalisis bobot molekulnya.
Ekstraksi DNA dari gel agarosa
Fragmen pada gel agarosa yang tervisualisasi dengan ukuran 1300 bp
dipotong dengan skapel, kemudian dimasukkan dalam tabung mikro untuk
diekstraksi menggunakan Gel DNA fragments Extraction Kit (1st base). Sebanyak
500 µL DF buffer ditambahkan ke dalam tabung yang berisi potongan DNA,
kemudian di vortex dan diinkubasi pada suhu 55 – 60 oC selama 10 – 15 menit
sambil dibolak-balik setiap 2 – 3 menit. DF kolom (microtube) ditempatkan pada
collection tube (microtube 2 mL) dan campuran sampel dimasukkan ke dalam DF
kolom, kemudian disentrifugasi pada 16.000 × g selama 30 detik. Setelah itu, DF
kolom ditempatkan lagi pada collection tube yang baru, kemudian 400 µLW1
buffer dimasukkan dan disentrifugasi 16.000 × g selama 30 detik. Setelah itu, DF
kolom ditempatkan lagi pada collection tube yang baru, kemudian 600 µL Wash
buffer (buffer pencuci yang mengandung etanol) dimasukkan dan disentrifugasi
16.000 × g selama 30 detik. DF kolom ditempatkan lagi pada collection tube yang
baru dan disentrifugasi 16.000 × g selama 3 menit. DF kolom dipindahkan ke

5
microtube ukuran 1.5 mL, kemudian ditambahkan 20 – 50 µL buffer elusi atau
buffer TE dan didiamkan selama 2 menit lalu disentrifugasi 16.000 × g selama 2
menit. Hasil ekstraksi DNA digunakan untuk mengklon gen.
Ligasi produk PCR pada vektor pGEM-T Easy
Ligasi dilakukan dengan menggunakan vektor pGEM-T Easy berdasarkan
panduan ligasi Promega. Sebanyak 3 μL hasil PCR (gen β-1,4-glukanase), 1 μL
vektor pGEM-T Easy, 5 μL buffer ligase 2×, dan 1 μL T4 DNA ligase dicampur
dalam microtube dan diinkubasi pada suhu 4 oC semalaman. Hasil ligasi ini akan
mendapatkan vektor rekombinan pGEM-Gln. Diagram alir kloning gen seperti
yang tergambar pada Lampiran 1(B).
Pembuatan sel kompeten E. coli DH5α
Pembuatan sel kompeten dilakukan sebelum proses transformasi hasil ligasi.
Pembuatan sel kompeten menggunakan bakteri E. coli strain DH5α dan dilakukan
berdasarkan metode Inoue (Sambrook dan Russel 2001). Kultur E. coli DH5α dari
stok di gores pada media LB agar dan diinkubasi pada suhu 37 oC, selama ± 16
jam. Sebanyak 1 ose koloni dari cawan Petri biakan diinokulasi ke dalam 50 mL
medium SOB (Super Optimal Broth) cair, kemudian diinkubasi pada inkubator
shaker pada suhu 30 oC dengan kecepatan 150 rpm sampai nilai OD600 sebesar
0.4 – 0.8. Setelah nilai OD600 mencapai angka 0.4 – 0.8, kultur bakteri diinkubasi
di dalam es dan kemudian di sentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm pada suhu 4
o
C, selama 10 menit. Supernatan dibuang secara aseptis dan pelet disuspensi
dengan menambahkan 16.75 mL TB buffer dingin, diinkubasi di dalam es selama
10 menit dan disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm pada suhu 4 oC, selama
10 menit. Supernatan dibuang secara aseptis dan pelet disuspensi kembali dengan
menambahkan 4 mL TB buffer dingin, diinkubasi di dalam es selama 10 menit.
Dimetil Sulfoxida (DMSO) sebanyak 0.3 mL ditambahkan ke dalam suspensi lalu
diinkubasi dalam es selama 10 menit. Suspensi dipindahkan ke dalam beberapa
tabung mikro tubes masing-masing sebanyak 0.2 mL dan disimpan dalam tabung
nitrogen cair.
Transformasi
Proses transformasi DNA rekombinan pada sel inang dilakukan dengan
metode heat shock (kejut panas) (Sambrook dan Russel 2001). Sel kompeten
dicampurkan dengan 10 μL hasil ligasi dan diinkubasi di dalam es selama 30
menit. Campuran kemudian diinkubasi di dalam thermomixer pada suhu 42 oC
selama 1 menit, kemudian diinkubasi kembali dalam es selama 2 menit.
Campuran kemudian ditambahkan dengan medium SOC (SOB with Catabolite
repression) cair sebanyak 800 μL dan diinkubasi dalam inkubator shaker pada
suhu 37 oC dengan kecepatan 150 rpm selama 1 jam. Campuran disentrifugasi
dengan kecepatan 6000 × g selama 5 menit. Supernatan sebanyak 800 μL di
buang dan 200 μL sisa supernatan yang terbentuk digunakan untuk
mensuspensikan pellet. Hasil suspensi disebar merata ke dalam medium LB agar,
yang mengandung antibiotik ampisilin dengan konsentrasi 100 μg mL-1, Isopropyl
β-D-1-thiogalactopyranosidase (IPTG) 0.1 M dan 5-bromo-4-chloro-3-indolylbeta-D-galactopyranosidase (X-GAL) 4%. Medium seleksi diinkubasi pada suhu
37 oC selama semalaman. Proses selanjutnya dilakukan skrining koloni putih-biru
dan PCR koloni putih (koloni yang diduga positif), serta membuat duplikat koloni

6
putih pada media LB agar, yang mengandung ampisilin. Selanjutnya, klon positif
ditumbuhkan pada media LB cair-ampisilin untuk isolasi plasmid rekombinan.
Isolasi plasmid rekombinan
Isolasi plasmid dilakukan menggunakan Miniprep Kit (1st Base). Isolasi
DNA plasmid dilakukan terhadap kultur E. coli rekombinan terpilih. Ekstraksi
dilakukan sesuai dengan protokol yang diberikan dalam Kit. Kultur bakteri
sebanyak 1.5 mL dimasukkan ke dalam microtube dan sentrifugasi dengan
kecepatan 12.000 rpm selama 3 menit. Pelet yang diperoleh diresuspensi dengan
200 μL PD1 buffer (larutan resuspensi yang mengandung RNase). Sebanyak 200
μL PD2 buffer (larutan lisis) ditambahkan ke dalam tabung dan dibolak-balik
selama 10 menit, kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 2 menit. Sebanyak
300 μL PD3 buffer (larutan netralisasi) ditambahkan ke dalam tabung, dibolakbalik selama 10 menit dan sentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 3
menit. PD kolom ditempatkan pada collection tube dan supernatan dipindahkan ke
dalam PD kolom, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama
30 detik. Cairan yang tertampung di dalam collection tube dibuang. PD kolom
ditempatkan pada collection tube, kemudian buffer pencuci (W1) dimasukkan
sebanyak 400 μL ke dalam PD kolom, diinkubasi pada suhu ruang selama 1 menit
dan disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 30 detik. Cairan di dalam
collection tube dibuang. PD kolom ditempatkan pada collection tube yang baru
dan dimasukkan 600 μL buffer pencuci yang mengandung etanol, kemudian
disentrifugasi dengan kondisi yang sama. Setelah itu, PD kolom ditempatkan pada
collection tube yang baru dan disentrifugasi selama 3 menit. PD kolom
ditempatkan pada microtube yang baru dan ditambahkan 50 μL buffer elusi,
kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 2 menit. Setelah diinkubasi, tabung
disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 2 menit. Larutan tersebut
kemudian diverifikasi dengan elektroforesis gel agarosa 1%.
Sekuensing dan analisis sekuen DNA
Plasmid rekombinan pGEM-Gln disekuensing untuk memastikan bahwa
fragmen yang telah diklon adalah gen β-1,4-glukanase. Sekuensing dilakukan di
Laboratorium 1st Base PT. Genetika Science, Singapura dengan mengirimkan
sampel plasmid DNA rekombinan. Sekuensing dilakukan dua arah menggunakan
primer T7 dan SP6. Hasil sekuensing yang berupa grafik elektroforegram dan data
urutan nukleotida akan dianalisis dengan menggunakan perangkat lunak Bioedit
versi 7.0.9. Elektroforegram dan urutan nukleotida dibuka dengan program
Bioedit dicari sekuen forward dan reverse gen β-1,4-glukanase. Urutan nukleotida
yang diperoleh kemudian dianalisis menggunakan program bioinformatika Basic
local Alignment search tool (BlastN dan BlastX) pada situs
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast (Altschul et al. 1990).
Analisis proteomik
Hasil BlastX dianalisis menggunakan situs http://web.expasy.org/protparam.
Selanjutnya dilakukan analisis signal peptide menggunakan server SignalIP 4.1
secara on-line. Pembuatan model struktur protein dilakukan menggunakan
program SWISS-MODEL pada situs http://swissmodel.expasy.org/workspace.
Penelusuran
conserved
domain
protein
diakses
pada
situs
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml. Penelusuran motif sekuen

7
protein dilakukan menggunakan situs http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan
dan penelusuran daerah sisi aktif enzim diakses pada
situs
http://prosite.expasy.org.
Subkloning gen β-1,4-glukanase dalam vektor ekspresi
Proses subkloning gen β-1,4-glukanase ke dalam vektor ekspresi pET-32b
dilakukan dengan mengamplifikasi gen glukanase dari plasmid pGEM-Glu
dengan primer Glu-B dan Glu-H yang masing-masing mengandung adaptor site
untuk enzim restriksi BamHI dan HindIII, yaitu GluB-F (GATGGGATCCGG
GCGAGCTTCTCG) dan GluH-R (TCAAGCTTCGGGCGTCAGCAC). Fragmen
hasil PCR diligasikan ke dalam pGEM-T Easy untuk mendapatkan rekombinan
pGEM-GluBH yang kemudian ditransformasikan ke dalam E. coli DH5α.
Selanjutnya plasmid pGEM-GluBH di potong dengan enzim BamHI dan HindIII,
lalu fragmen gen glukanase diligasikan ke dalam vektor pET-32b yang juga sudah
dipotong dengan enzim yang sama. Konstruk pET32-Glu ditransformasikan ke
dalam E. coli DH5α. E. coli positif membawa plasmid rekombinan dibiakan pada
media LB cair yang mengandung ampisilin dan kanamisin untuk diekstraksi
plasmidnya. Plasmid rekombinan ditransformasi ke dalam E. coli BL21(DE3)pLyss dan diseleksi pada media LB agar yang telah ditambahkan antibiotik
ampisilin, kanamisin, dan streptomisin. Diagram alir tergambar pada Lampiran
1(C).
Ekstraksi β-Glukan
Substrat glukan dipreparasi dari oatmeal mengikuti metode Wood dan
Weisz (1984). Sebanyak 20 g oatmeal dilarutkan dalam 200 mL akuades yang
pH-nya diatur dengan Na2CO3 20% (b/v) hingga mencapai pH 10 sambil diaduk
dengan magnetic stirrer dan dipanaskan sampai suhu 45 oC selama 30 menit.
Kemudian, larutan oatmeal disentrifugasi dengan kecepatan 4000 × g selama 15
menit pada suhu 4 oC. Supernatan dipindahkan ke gelas piala dan diatur pH-nya
menjadi pH 4.5 menggunakan HCl 1 M, lalu disentrifugasi lagi dengan kecepatan
17000 × g selama 20 menit pada suhu 4 oC. Endapan dibuang, sedangkan
supernatannya ditambahkan dengan 80 mL etanol 96% secara perlahan sambil
diaduk. Setelah diinkubasi selama 16 – 18 jam pada suhu 4 oC, campuran
disentrifugasi dengan kecepatan 17000 × g selama 10 menit untuk mendapatkan
pelet glukan yang selanjutnya diresuspensi dengan 5 – 10 mL PBS (phosphat
buffer saline).
Seleksi klon rekombinan glukanase secara kualitatif
Untuk memastikan klon rekombinan yang positif membawa gen glukanase
mampu mengekspresikan glukanase maka akan diseleksi pada media agar yang
mengandung glukan sebagai substrat. Media glukan terdiri atas 1% gel agarosa,
0.2% glukan, 1% tripton, 1% ekstrak khamir dan 1% NaCl, kemudian media
disterilisasi pada suhu 110 oC dan tekanan 1 atm selama 10 menit. Setelah agar
dingin, media ditambahkan dengan IPTG steril 1 mM dan dituangkan dalam
cawan Petri yang berdiameter 12 cm sebanyak 20 mL. Koloni hasil skrining PCR
kemudian diuji aktivitasnya pada media glukan. Koloni yang menunjukkan
adanya aktivitas glukanase selanjutnya digunakan untuk pemurnian rekombinan
dan diuji aktivitasnya.

8
Optimasi ekspresi E. coli rekombinan glukanase
Ekspresi gen β-1,4-glukanase dalam rekombinan E. coli BL21(DE3)-pLyss
diinduksi dengan menggunakan IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside).
Konsentrasi IPTG dan suhu inkubasi sangat mempengaruhi tingkat ekspresi. Oleh
karena, untuk mengetahui tingkat ekspresi yang optimal dari gen β-1.4 glukanase
dalam rekombinan E. coli akan diuji pengaruh konsentrasi IPTG (0, 2.5, 5 dan 10
mM) dan suhu biakan (25 oC, 30 oC, dan 35 oC). E. coli rekombinan dibiakan
dalam 10 mL media LB cair yang mengandung ampisilin, kanamisin, dan
streptomisin pada suhu inkubasi yang berbeda sambil digoyang dengan orbital
shaker 75 rpm. Setelah konsentrasi sel dalam biakan mencapai OD600 sekitar 0.5,
biakan ditambahkan IPTG dengan konsentrasi yang berbeda untuk menginduksi
ekspresi glukanase, lalu diinkubasikan lagi hingga 16 jam. Sel bakteri kemudian
dipanen dan protein rekombinan yang terekspresi diekstraksi dengan
menggunakan buffer lysis bugbuster (Invitrogen) yang mengandung lysogenase.
Profil ekspresi divisualisasikan pada SDS-PAGE (12%). Diagram alir tergambar
pada Lampiran 1(D).
SDS-PAGE
Sampel protein yang akan dimasukkan ke dalam gel sebelumnya
dicampurkan dengan buffer sampel yang mengandung mercaptoetanol dan SDS,
kemudian didihkan selama 5 menit untuk mereduksi protein sampel hingga
bermuatan negatif dan sampel didinginkan pada suhu ruang. Proses pemisahan
dilakukan dengan cara cetakan gel ditempatkan ke dalam kotak gel, kemudian
reservoir atas dan bawah diisi dengan buffer pemisah. Sebanyak 10 μL sampel
dimasukkan ke dalam sumur (well) tempat sampel, dan pada sumur pertama
dimasukkan protein standar, setelah itu dihubungkan dengan arus listrik dengan
tegangan 200 V. Arus listrik dihentikan setelah pewarna protein standar (biru
bromofenol) mencapai batas akhir sekitar 1 cm dari ujung gel, kemudian gel
dimasukkan dalam wadah pewarnaan.
Pewarnaan dilakukan dengan cara merendam gel dalam larutan pewarna
Commassie Blue selama 6 jam sambil digoyang dengan gerakan 50 – 100 rpm.
Gel yang dihasilkan dalam pewarnaan dicuci dengan aquades dan direndam dalam
larutan pencuci warna (larutan destaining) dengan komposisi metanol, asam asetat
dan aquades hingga dihasilkan gel yang jernih.
Pemurnian glukanase rekombinan
Protein rekombinan dimurnikan dengan teknik Fast Protein Liquid
Chromatography (FPLC) menggunakan kolom Histag (Amersham). Elusi protein
dari kolom Histag dilakukan dengan menggunakan larutan imidazol 300 mM.
Selanjutnya, suspensi protein dihilangkan kandungan imidazol (desalting)
menggunakan 50 mM buffer fosfat pH 6.0 dan kolom membran Centricon
(Millipore, cut-off 12 kDa) melalui sentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm, pada
suhu 4 oC. Protein hasil pemurnian diukur konsentrasinya, divisualisasi pada SDSPAGE, dan diuji aktivitasnya menggunakan substrat glukan dari oatmeal.
Pengukuran aktivitas glukanase
Pengukuran aktivitas glukanase dengan Metode DNS (Modifikasi Ghose
1987) . Sebanyak 50 μL ekstrak enzim kasar yang telah diisolasi dimasukkan ke
dalam tabung reaksi lalu ditambahkan 250 μL glukan 0.5% dan 200 μL buffer

9
fosfat pH 4.8 hingga volume akhir campuran 500 μL. Campuran ditutup dengan
aluminium foil kemudian dikocok dengan vorteks. Selanjutnya campuran
diinkubasi pada suhu 48 oC selama 60 menit dan dipanaskan l00 oC selama 10
menit untuk menghentikan reaksinya. Campuran ditambahkan reagen DNS
sebanyak 1.5 mL lalu dipanaskan pada suhu 100 oC selama 15 menit. Campuran
didinginkan selama 20 menit dan serapannya dibaca pada panjang gelombang 575
nm. Pengukuran dilakukan secara triplo. Media LB digunakan sebagai blanko
untuk ekstrak enzim kasar dari supernatan, sedangkan blanko untuk ekstrak enzim
kasar dari pelet menggunakan buffer lisis. Nilai konsentrasi gula pereduksi yang
dihasilkan dikonversi dari nilai absorban yang terbaca melalui kurva standar,
dengan glukosa sebagai larutan standar. Satu unit aktivitas enzim glukanase
sebanding dengan satu μmol glukosa yang dihasilkan per menit, dengan
perhitungan:
.......... (1)
Aktivitas spesifik enzim dihitung dengan rumus :
.......... (2)
Penentuan suhu dan pH optimum aktivitas glukanase
Penentuan pengaruh suhu terhadap aktivitas glukanase ditentukan pada
kisaran suhu 40 – 70 oC. Prosedur pengujian aktivitas glukanase pada berbagai
suhu dilakukan dengan prosedur yang sama dengan pengukuran aktivitas
glukanase. Suhu yang menghasilkan aktivitas tertinggi ditetapkan sebagai suhu
optimum.
Pengaruh pH terhadap aktivitas glukanase ditentukan pada kisaran pH 3.0 –
9.0 dengan berbagai variasi buffer yang sesuai dengan konsentrasi 50 mM pada
suhu optimum. Buffer yang digunakan adalah Sodium asetat (pH 3.0 – 6.0),
Sodium fosfat (pH 7.0), dan Tris-HCl (pH 8.0 – 9.0). Prosedur pengujian aktivitas
glukanase pada berbagai pH dilakukan dengan prosedur yang sama dengan
pengukuran aktivitas glukanase. Nilai pH yang menghasilkan aktivitas tertinggi
ditetapkan sebagai pH optimum.

3 HASIL DAN PEMBAHASAN
Kloning gen β-1,4-glukanase
Kloning gen β-1,4-glukanase dilakukan dengan mengamplifikasi gen β-1,4glukanase dari DNA genom B. cepacia menggunakan primer spesifik. Proses
amplifikasi menggunakan teknik PCR merupakan metode enzimatis yang
dilakukan untuk melipatgandakan (amplifikasi) molekul DNA dan mRNA serta
kuantitasi molekul mRNA dalam waktu singkat secara in vitro (Bintang 2010).
Amplifikasi gen β-1,4-glukanase B. cepacia menggunakan pasangan primer
Glu1320-F dan Glu1320-R menghasilkan ukuran fragmen DNA 1300 bp seperti
yang ditargetkan (Gambar 1).

10

Gambar 1 Elektroforegram amplikon gen β-1,4-glukanase B. cepacia (M =
Marker 100 bp; 1 = produk PCR)
Hasil pada Gambar 1 menunjukkan produk PCR yang dianalisis pada gel
elektroforesis dengan ukuran fragmen DNA 1300 bp seperti yang ditargetkan.
Keberhasilan amplifikasi tergantung pada kemurnian DNA yang digunakan dalam
reaksi PCR, selain itu juga dipengaruhi oleh tingkat spesifisitas dan suhu
penempelan primer. Primer yang ideal dirancang memenuhi beberapa ketentuan
umum, diantaranya panjang primer antara 18 hingga 28 nukleotida, komposisi
G+C sekitar 50 – 60%, dan sepasang primer mempunyai titik leleh (Tm) yang
seimbang, yakni tidak melebihi 70 oC (Innis & Gelfand 1990; Yuwono 2006).
Fragmen DNA dengan ukuran 1300 bp yang merupakan produk PCR
dimurnikan untuk membersihkan garam-garam dalam reaksi PCR yang
kemungkinan masih terdapat sisa genom sehingga mempengaruhi proses
selanjutnya. Hasil pemurnian digunakan sebagai insert (sisipan) dalam proses
transformasi. Fragmen DNA hasil pemurnian dengan ukuran 1300 bp diligasikan
ke dalam vektor kloning pGEM-T Easy dan ditransformasikan dalam sel
kompeten E. coli DH5α. E. coli DH5α merupakan sel inang yang baik untuk
proses pengklonan DNA karena memiliki efisiensi transformasi yang tinggi.
Selain itu, bakteri ini memiliki beberapa kelebihan lainnya seperti memiliki
kemudahan untuk dikultur dan dimanipulasi, tingkat pertumbuhannya cepat, dapat
menerima gen asing dengan berbagai teknik, serta informasi sifat biokimianya
telah dipahami dengan baik (Campbell et al. 2009).
Vektor kloning (vektor DNA) memiliki karakter substansial diantaranya
mempunyai situs multiple cloning untuk memasukkan DNA asing ke dalamnya,
melakukan propagasi di dalam sel inang, dan mempunyai gen marker sebagai gen
yang memungkinkan untuk seleksi bakteri rekombinan yang mengandung plasmid
dengan DNA asing (Helianti 2010). Penggunaan vektor pGEM-T Easy memiliki
keunggulan, diantaranya memiliki dua buah origin of replication dan gen
ketahanan terhadap ampisilin (Amp). Plasmid ini mengandung Multiple Cloning
Site (MCS) dan memiliki kelebihan timin yang menggantung di ujung terbuka
plasmid (T overhang). Plasmid ini sering digunakan sebagai vektor untuk produk
PCR yang selalu memiliki kelebihan adenin pada ujungnya tanpa memerlukan
tahapan pemotongan terlebih dahulu. Plasmid pGEM-T Easy juga termasuk
plasmid high copy number yang cocok untuk menyimpan gen insert dalam suatu
inang.
Skrining dan verifikasi klon transforman dilakukan dengan beberapa metode,
yaitu PCR colony screening, isolasi vektor rekombinan, analisis restriksi, dan juga
sekuensing. Metode skrining dan verifikasi bertujuan memastikan keberhasilan

11
ligasi gen glukanase pada vektor pGEM-T Easy membentuk plasmid rekombinan
dan juga keberhasilan transformasi ke inang kloning E. coli DH5α. Metode PCR
koloni merupakan metode yang mudah dan sederhana untuk skrining klon bakteri
(Azhahianambi et al. 2008). Transformasi plasmid rekombinan pGEM-Glu ke
inang E. coli DH5α menghasilkan puluhan koloni biru-putih. Sebanyak lima
koloni terseleksi positif mengandung fragmen DNA berukuran 1300 bp (Gambar
2) yang merupakan hasil PCR koloni putih yang tumbuh pada media LB agar
mengandung ampisilin, IPTG, dan X-Gal.

Gambar 2 Elektroforegram amplikon koloni terpilih dengan menggunakan primer
Glu1320-F dan Glu1320-R (M= Marker 100 bp; 1, 2, 3, 4 dan 5= koloni
positif)
Berdasarkan Gambar 2 sebanyak lima koloni positif hasil transformasi
diambil untuk kemudian dilakukan isolasi plasmid untuk memastikan bahwa
koloni positif hasil transformasi membawa insert gen glukanase. Pada isolasi
plasmid, pemisahan DNA plasmid dari DNA kromosom bakteri yang terdapat
dalam sel didasarkan pada perbedaan konformasi antara DNA plasmid dan DNA
bakteri. Bentuk plasmid tidak hanya sirkular, tetapi dapat berbentuk supercoilled
(berlilitan) sedangkan DNA kromosom bakteri berbentuk sirkular dan pada saat
terjadi preparasi, ekstrak sel akan pecah menjadi fragmen-fragmen linear (Brown
2010).
Sekuensing dan analisis sekuen DNA
Hasil sekuensing diperoleh dua sekuen dari arah forward dan reverse yang
masing-masing dengan panjang 793 bp dan 821 bp. Sekuen kontaminasi vektor
pGEM-T Easy dihilangkan, sehingga sekuen reverse dikonversi menjadi reverse
komplement pada analisis overlapping dengan sekuen forward. Hasil analisis ini
memperoleh sekuen β-1,4-glukanase dengan panjang 1314 bp. Gen β-1,4glukanase memiliki kodon start ATG dan kodon stop TGA. Sekuen hasil
sekuensing gen penyandi β-1,4-glukanase dalam bentuk elektroforegram diubah
ke dalam bentuk FASTA Format menggunakan software Bioedit (Lampiran 2).
Analisis Blast dilakukan untuk mengetahui dan memastikan identitas
lengkap gen penyandi β-1,4-glukanase. Hasil BlastN menunjukkan bahwa sekuen
gen glukanase memiliki tingkat homologi yang tinggi 99% dengan spesies
Burkholderia mallei dan Burkholderia psedomallei pada database NCBI (Tabel
1).

12
Tabel 1 Hasil BlastN gen β-1,4-glukanase
Nomor Accession

Deskripsi Spesies

E-value

Identitas (%)

CP000547.1

Burkholderia mallei NCTC 10247
chromosome II, complete sequence
Burkholderia mallei NCTC 10229
chromosome II, complete sequence
Burkholderia mallei ATCC 23344
chromosome 2, complete sequence
Burkholderia pseudomallei BPC006
chromosome II, complete sequence
Burkholderia pseudomallei 1106a
chromosome II, complete sequence
Burkholderia pseudomallei genome
assembly BP_3921g , chromosome : 2
Burkholderia pseudomallei 1710b
chromosome II, complete sequence
Burkholderia pseudomallei strain
K96243, chromosome 2, complete
sequence
Burkholderia
pseudomallei
668
chromosome II, complete sequence
Burkholderia
pseudomallei
MSHR146 chromosome 2, complete
sequence

0.0

99

0.0

99

0.0

99

0.0

99

0.0

99

0.0

99

0.0

99

0.0

99

0.0

99

0.0

99

CP000545.1
CP000011.2
CP003782.1
CP000573.1
LK936443.1
CP000125.1
BX571966.1

CP000571.1
CP004043.1

Data hasil Blast kemudian disajikan dalam bentuk pohon filogenetik
(Gambar 3) untuk menunjukkan hubungan evolusi antara spesies yang satu
dengan lainnya. Pohon filogenetik dibuat untuk memvisualisasikan hubungan
evolusi diantara berbagai spesies atau benda-benda lain. Pohon filogenetik berupa
diagram bercabang-cabang dapat dikonstruksi berdasarkan kesamaan atau
perbedaan sifat fisik atau genetik seperti sekuen DNA, sekuen asam amino
(protein), pola pemotongan enzim restriksi, dan ukuran alel pada analisa
microsatellite. Pohon filogenetik dibuat dengan menggunakan software Mega
5.05 (Tamura et al. 2011).

Gambar 3 Pohon filogenetik gen penyandi β-1,4-glukanase

13
Diagram pohon filogeni menunjukkan bahwa gen penyandi β-1,4-glukanase
B. cepacia memiliki tingkat kekerabatan yang dekat dengan gen glukanase pada B.
mallei-NCTC.
Selain melakukan analisis BlastN, juga dilakukan analisis BlastX untuk
melihat homologi di tingkat proteinnya. Hasil analisis BlastX sekuen DNA gen
penyandi β-1,4-glukanase menunjukkan bahwa fragmen DNA mempunyai tingkat
homologi yang tinggi dengan endo-1,4-D-glukanase pada B. mallei (99%) dan B.
pseudomallei (98%) (Tabel 2).
Tabel 2 Hasil BlastX gen β-1,4-glukanase
Nomor Accession

Deskripsi Spesies

WP 011857778.1
WP 011832151.1
WP 011204605.1
WP 004557798.1

endo-1,4-D-glucanase Burkholderia mallei
endo-1,4-D-glucanase Burkholderia mallei
endo-1,4-D-glucanase Burkholderia mallei
endo-1,4-D-glucanase Burkholderia
pseudomallei
1,4-D-glucanase Burkholderia pseudomallei
endo-1,4-D-glucanase Burkholderia
pseudomallei

WP 024428480.1
WP 011857712.1

E-value

Identitas (%)

0.0
0.0
0.0
0.0

99
99
99
98

0.0
0.0

98
98

Secara teoritis hasil analisis Blast dengan nilai E-value ≥ e-04
mengindikasikan tingkat kemiripan yang tinggi (Claverie & Notredame 2007).
Dengan demikian dapat dipastikan bahwa fragmen DNA 1300 bp yang diklon dari
B. cepacia adalah gen glukanase.
Analisis Proteomik
Sekuen basa nukleotida kemudian diubah menjadi sekuen asam amino
menggunakan Server Expasy Proteomic. Hasil sekuen asam amino yang diperoleh
adalah:
>Sekuen_1 glukanase
MASFSVMAFAAATLPVSWRVAAAAERTRSGGDRAGGLRDTAGLLEISAAAPASTPIPA
APRRFAQPFAQPARAFAVASACAPSWPRWDRFKRDFVSADGRVIDVGSADERTVSEG
QAYGLFFALVANDRAAFDALLRWTEDSLAQGDLSARLPAWLWGRAADGAWRVLDA
NAASDADLWLAYALLEAGRLWRERSYTARGALLAMRVLDEETATLPGLGLVLLPGPM
GFRPARDAWRLNPSYSPPQAIRGIGAHVPDDARWARLAAGFGRVLTDSAPRGFAPDW
ALYRAGRGFEPDAETHAVSAYTAIRVYLWAGMLDAGDPLARPLVAHFAPFAEHVAAH
GAPPEAVDATTGAAAPRDGNAGFSAAAVPFLEARGERASADAQLARVARLERETASG
YYANVLTLFGLGWRDGRYRFAADGTLRVRWSEPCSTPAR*

Tanda bintang yang terdapat pada akhir urutan asam amino merupakan asam
amino yang disandikan oleh kodon stop. Urutan asam amino tersebut tidak
terdapat kodon stop di tengah urutan sehingga diduga dapat diekspresikan menjadi
asam amino yang dalam hal ini adalah glukanase.
Hasil beberapa parameter menggunakan Server Expasy Proteomic pada
web http://web.expasy.org/protparam/ menunjukkan gen rekombinan glukanase
memiliki jumlah asam amino 451, bobot molekul 48.363 kDa dan memiliki titik
isoelektrik (pI) sekitar 5.87 (Lampiran 3). Hasil tersebut dibandingkan dengan gen
endo-1,4-D-glucanase pada B. mallei dan B. pseudomallei pada database
Genebank terdapat beberapa perbedaan parameter diantaranya dapat dilihat pada
Tabel 3.

14
Tabel 3 Hasil Prediksi Beberapa Parameter Gen β-1,4-glukanase menggunakan
Server Expasy Proteomic
Nama spesies
(No. Accession)

Bobot Molekul
(kDa)

Theoretical pI

Jumlah Asam
amino

Burkholderia cepacia
(Glukanase)
Burkholderia mallei (endo-1,4-Dglucanase/ WP 011857778.1)
Burkholderia mallei (endo-1,4-Dglucanase/ WP 011832151.1)
Burkholderia mallei (endo-1,4-Dglucanase/ WP 011204605.1)
Burkholderia pseudomallei
(endo-1,4-D-glucanase/ WP
004557798.1)
Burkholderia pseudomallei (1,4D-glucanase/ WP 024428480.1)
Burkholderia pseudomallei
(endo-1,4-D-glucanase/ WP
011857712.1)

48.363

5.87

451

45.555

8.59

425

45.555

8.59

425

45.507

8.59

425

45.449

8.59

425

45.449

8.59

425

45.449

8.59

425

Hasil prediksi beberapa parameter pada Tabel 3 menunjukkan adanya
perbedaan parameter yang disebabkan karena perbedaan sekuen asam amino pada
gen rekombinan glukanase dengan yang terdapat pada database Genebank.
Perbedaan sekuen asam amino dapat diketahui dengan melakukan alignment
menggunakan software ClustalW (Larkin et al. 2007). Data hasil alignment
(Lampiran 4) sekuen gen glukanase pada klon rekombinan dengan gen endo-1,4D-glucanase pada B. mallei dan B. pseudomallei menunjukkan bahwa pada
sekuen tertentu terdapat persamaan dan perbedaan. Persamaan kode asam amino
antara gen klon rekombinan dengan gen endo-1,4-D-glucanase pada B. mallei (No.
Accession WP011204605.1, WP011857778.1, WP011832151.1) terdapat pada
asam amino Metionin (M) sekuen ke-227 dan Valin (V) sekuen ke-302, selain itu
Fenilalanin (F) pada sekuen ke-268 sama dengan sekuen pada B. mallei (No.
Accession WP011857778.1 dan WP011832151.1). Sedangkan perbedaan terletak
pada asam amino Asam Aspartat (D) sekuen ke-32, Leusin (L) sekuen ke-44,
Serin (S) sekuen ke-142, Metionin (M) sekuen ke-205, dan Threonin (T) sekuen
ke-306 .
Hasil signal peptide (Lampiran 5) dari gen klon rekombinan menunjukkan
nilai cleavage site berada pada posisi 23 dan 24 yang terletak pada asam amino
AAA-AE. Hal tersebut berarti enzim rekombinan ini mature protein pada posisi
24. Hasil signal peptide diperoleh dengan menggunakan server SignalIP 4.1
secara on-line (Petersen et al. 2011). Keberadaan signal peptide dan kaitannya
dengan sekresi protein secara ekstraselular terbukti dengan adanya zona lisis
pertumbuhan B. cepacia pada media glukan.
Pembuatan model struktur dapat dilakukan dengan menggunakan program
SWISS-MODEL (http://swissmodel.expasy.org/workspace) (Arnold et al. 2006).
Protein dari klon rekombinan diperoleh dari database Protein Data Bank (PDB)
dengan kode 4q2b.2.A pada model homologi struktur protein menggunakan mode
SWISS-MODEL. Kualitas model yang dihasilkan tergantung pada persamaan
residu antar protein homologi yaitu protein yang memiliki kesamaan sekuen.
Model yang diperoleh pada program SWISS-MODEL menunjukkan adanya

15
kemiripan hasil dengan model yang dimiliki Endo-1,4-beta-D-glukanase seperti
pada Gambar 4. Enzim endo-1,4-beta-D-glukanase merupakan salah satu bagian
dari enzim selulase. Selulase merupakan enzim ekstraseluler yang pada dasarnya
memiliki mekanisme pemotongan rantai ikatan yang sangat kompleks karena
melibatkan sinergitas kerja 3 komponen besar yaitu endo-1,4-β-D-glukanase yang
berfungsi memutuskan ikatan selulosa (ikatan glikosidik β-1,4) secara random
dengan memulai serangan acak pada sisi internal amorf dari serat selulosa
sehingga sisi yang terbuka dapat diserang oleh ekso-β-1,4-glukanase. Ekso-β-1,4glukanase memotong ujung-ujung rantai individu selulosa, yaitu menyerang
bagian luar non-reducing dari selulosa sehingga dihasilkan selobiosa sebagai
struktur utamanya. Selanjutnya β-glukosidase yang berfungsi memotong selobiosa
menjadi molekul-molekul glukosa.

Gambar 4 Struktur protein 4q2b.2.A (Endo-1,4-beta-D-glucanase)
Protein ini terdiri dari 349 residu yang membentuk struktur sekunder
berupa 7 pasang beta-hairpin, 20 turn, 3 helix-3/10, dan 17 alpha-helix (Gambar
5). Strukt