BAB III METODOLOGI PENELITIAN
Metode yang digunakan adalah metode eksperimental meliputi pengumpulan dan pengolahan bahan, pemeriksaan karakteristik simplisia,
pembuatan ekstrak dan uji sitotoksisitas ekstrak bunga brokoli menggunakan larva Artemia salina Leach.
3.1 Alat-alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat-alat gelas laboratorium, kertas saring, aluminium foil, kaca penutup, kaca objek, vial, bejana
penetasan telur Artemia salina Leach, lampu 18 watt Hannochs, cawan berdasar rata, botol bersumbat, krusen tang, seperangkat alat penetapan kadar air, desikator,
mikroskop Olympus, oven listrik Stork, penguap vakum putar Heidolph VV 2000, neraca analitik Vibra AJ, dandang, freeze dryer, hot plate dan penangas
air.
3.2 Bahan-bahan
Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah bunga brokoli, telur Artemia salina Leach, garam laut, ragi, aqua bidestilata, akuades, Na-CMC.
Bahan-bahan kimia yang digunakan yang berkualitas pro analisa produksi E-Merck yaitu kloroform, toluen dan etanol 96. Bahan kimia berkualitas teknis
yaitu etanol 96.
Universitas Sumatera Utara
3.3 Pengumpulan dan Pengolahan Bahan Tumbuhan 3.3.1 Pengumpulan bahan tumbuhan
Pengumpulan bahan tumbuhan dilakukan secara purposif sengaja yaitu tanpa membandingkan dengan tumbuhan yang sama dari daerah lain. Bahan yang
digunakan adalah bunga brokoli segar yang diambil dari pasar Sambu Jl. Sutomo, Medan.
3.3.2 Identifikasi tumbuhan
Identifikasi tumbuhan dilakukan di Herbarium Bogoriense, Bidang Botani, Pusat Penelitian Biologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia LIPI. Hasil
identifikasi dapat dilihat di lampiran 1 halaman 33.
3.3.3 Pengolahan bahan tumbuhan
Bahan tumbuhan yang digunakan adalah bunga brokoli sebanyak 8 kg. Bunga brokoli dibersihkan dari bagian yang tidak diinginkan, lalu dicuci di bawah
air mengalir hingga bersih, ditiriskan kemudian ditimbang beratnya. Setelah itu bunga brokoli dipotong-potong bagian kuncup bunganya. Pada perlakuan yang
dikukus, bunga brokoli dikukus selama 5 menit dan untuk pembuatan simplisia bunga brokoli dikeringkan di lemari pengering pada suhu ±40
C hingga kering, yaitu jika simplisia tersebut diremas akan hancur,. Setelah kering, ditimbang
beratnya kemudian diblender sampai menjadi serbuk.
3.4 Lokasi Penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium Farmakognosi Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara, Medan.
Universitas Sumatera Utara
3.5 Pembuatan Larutan Pereaksi 3.5.1 Larutan Kloralhidrat 70 bb
Sebanyak 50 gram kloralhidrat ditimbang dan dilarutkan dalam 20 ml air suling Ditjen POM, 1995.
3.5.2 Air-Kloroform
Sebanyak 2,5 ml kloroform dikocok dengan air suling, ditambahkan air suling hingga 1000 ml Ditjen POM, 1995.
3.6 Pemeriksaan Makroskopik Bahan Tumbuhan Segar 3.6.1 Bunga brokoli segar
Pemeriksaan makroskopik dilakukan dengan mengamati bentuk, warna, bau dan rasa bunga brokoli.
3.6.2 Bunga brokoli yang dikukus
Pemeriksaan makroskopik dilakukan dengan mengamati bentuk, warna, bau dan rasa bunga brokoli.
3.7 Pemeriksaan Karakteristik Simplisia
Pemeriksaan karakteristik simplisia meliputi pemeriksaan makroskopik dan mikroskopik, penetapan kadar air, penetapan kadar sari yang larut dalam air,
penetapan kadar sari yang larut dalam etanol, penetapan kadar abu total dan penetapan kadar abu yang tidak larut dalam asam.
3.7.1 Pemeriksaan makroskopik
Pemeriksaan makroskopik dilakukan dengan mengamati bentuk, warna, bau dan rasa simplisia bunga brokoli.
Universitas Sumatera Utara
3.7.2 Pemeriksaan mikroskopik
Pemeriksaan mikroskopik dilakukan terhadap serbuk simplisia dengan cara menaburkan serbuk simplisia di atas kaca objek yang telah ditetesi dengan
kloralhidrat kemudian ditutup dengan kaca penutup, setelah itu dilihat di bawah mikroskop. Sebagai pembanding, untuk melihat susunan anatomis maka diperiksa
juga penampang melintang bahan segar. Hasil pemeriksaan mikroskopik dapat dilihat pada lampiran 3 halaman 37.
3.7.3 Penetapan kadar air
Penetapan kadar air dilakukan dengan metode Azeotropi destilasi toluen WHO, 1998.
Cara kerja: 1.
Penjenuhan toluen Sebanyak 200 ml toluen dan 2 ml air suling dimasukkan ke dalam labu
alas bulat, didestilasi selama 2 jam. Kemudian toluen didinginkan selama 30 menit dan volume air pada tabung penerima dibaca dengan ketelitian 0,05 ml.
2. Penetapan kadar air simplisia
Sebanyak 5 g serbuk simplisia yang telah ditimbang seksama dimasukkan ke dalam labu yang berisi toluen tersebut, lalu dipanaskan hati-hati selama 15
menit. Setelah toluen mendidih, kecepatan tetesan diatur lebih kurang 2 tetesan perdetik, sampai sebagian air terdestilasi, kemudian kecepatan destilasi dinaikkan
hingga 4 tetes perdetik. Setelah semua air terdestilasi, bagian dalam pendingin dibilas dengan toluen. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung
penerima dibiarkan dingin sampai suhu kamar. Setelah air dan toluen memisah
Universitas Sumatera Utara
sempurna, volume air dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. Selisih kedua volume air dibaca sesuai dengan kandungan air yang terdapat dalam bahan yang diperiksa.
Perhitungan kadar air dapat dihitung dengan rumus:
kadar air =
100 g
sampel Berat
ml air
Volume ×
Perhitungan penetapan kadar air dapat dilihat pada lampiran 4 halaman 38.
3.7.4 Penetapan kadar sari yang larut dalam air
Sebanyak 5 gram serbuk simplisia yang telah dikeringkan di udara dimaserasi selama 24 jam dengan 100 ml air-kloroform dalam labu bersumbat
sambil berkali-kali dikocok selama 6 jam pertama kemudian dibiarkan selama 18 jam lalu disaring. Sejumlah 20 ml filtrat diuapkan hingga kering dalam cawan
penguap berdasar rata yang telah ditara. Sisa dipanaskan pada suhu 105 C sampai
bobot tetap. Kadar sari larut dalam air dihitung dengan persen terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara Ditjen POM, 1995.
Perhitungan kadar sari yang larut dalam air dapat dihitung dengan rumus: Kadar Sari Larut Dalam Air =
20 100
simplisia berat
sari berat
×
x 100 Perhitungan kadar sari yang larut dalam air dapat dilihat pada lampiran 4 halaman 39.
3.7.5 Penetapan kadar sari yang larut dalam etanol
Sebanyak 5 gram serbuk simplisia yang telah dikeringkan di udara dimaserasi selama 24 jam dengan 100 ml etanol 96 dalam labu bersumbat
sambil dikocok selama 18 jam. Kemudian disaring cepat untuk menghindari penguapan etanol 96, sejumlah 20 ml filtrat diuapkan sampai kering dalam
cawan penguap berdasar rata yang telah ditara dan sisanya dipanaskan pada suhu
Universitas Sumatera Utara
105 C sampai bobot tetap. Kadar sari larut dalam etanol dihitung dalam persen
terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara Ditjen POM, 1995. Perhitungan kadar sari yang larut dalam etanol dapat dihitung dengan rumus:
Kadar Sari Larut Dalam Etanol =
20 100
simplisia berat
sari berat
×
x 100 Perhitungan kadar sari yang larut dalam etanol dapat dilihat pada lampiran 4
halaman 40. 3.7.6 Penetapan kadar abu total
Sebanyak 2 g serbuk simplisia yang telah digerus dan ditimbang seksama dimasukkan ke dalam cawan porselen yang telah dipijar dan ditara, kemudian
diratakan. Krus dipijar perlahan-lahan sampai arang habis, pemijaran dilakukan pada suhu 500–600
°C selama 3 jam kemudian didinginkan dan ditimbang sampai diperoleh bobot tetap. Kadar abu dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan
di udara Ditjen POM, 1995. Perhitungan kadar abu total dapat dihitung dengan rumus:
Kadar Abu Total =
20 100
simplisia berat
abu berat
×
x 100 Perhitungan kadar abu total dapat dilihat pada lampiran 4 halaman 41.
3.7.7 Penetapan kadar abu yang tidak larut dalam asam
Abu yang telah diperoleh dalam penetapan kadar abu total dididihkan dalam 25 ml asam klorida encer selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam
asam dikumpulkan, disaring melalui kertas saring dipijarkan sampai bobot tetap, kemudian didinginkan dan ditimbang. Kadar abu yang tidak larut dalam asam
dihitung terhadap bahan yang dikeringkan di udara Ditjen POM, 1995.
Universitas Sumatera Utara
Perhitungan kadar abu yang tidak larut asam dapat dihitung dengan rumus: Kadar Abu Tidak Larut dalam Asam =
20 100
simplisia berat
abu berat
×
x 100 Perhitungan kadar abu yang tidak larut dalam asam dapat dilihat pada lampiran 4
halaman 42.
3.8 Pembuatan Ekstrak 3.8.1 Pembuatan ekstrak dari bahan tumbuhan segar
Sebanyak 100 g bahan tumbuhan segar yang telah dipotong-potong, dihaluskan dalam lumpang. Kemudian dimasukkan ke dalam wadah tertutup
rapat, lalu dimaserasi dengan 750 ml pelarut kloroform selama 5 hari terlindung dari cahaya matahari sambil sering diaduk, lalu diserkai, diperas dengan kain
flanel. Lalu ampas ditambahkan cairan penyari secukupnya sehingga diperoleh seluruh sari sebanyak 1000 ml, kemudian didiamkan selama 2 hari dan dienap
tuang. Maserat diuapkan dengan bantuan alat penguap rotary evaporator pada temperatur tidak lebih dari 40
C dan di freeze dryer sampai diperoleh ekstrak kental Ditjen POM, 1979. Selanjutnya ampas dikeluarkan dari wadah maserasi
dan dikeringkan dengan cara diangin-anginkan. Maserasi dengan penyari etanol dilakukan dengan cara yang sama. Bagan pembuatan ekstrak dapat dilihat pada
lampiran 5 halaman 44.
3.8.2 Pembuatan ekstrak dari bahan tumbuhan yang dikukus
Sebanyak 100 g bahan tumbuhan segar yang telah dipotong-potong, dikukus selama 5 menit, lalu diangkat dan ditiriskan. Selanjutnya dihaluskan
dalam lumpang. Kemudian dimasukkan ke dalam wadah tertutup rapat, lalu dimaserasi dengan 750 ml pelarut kloroform selama 5 hari terlindung dari cahaya
Universitas Sumatera Utara
matahari sambil sering diaduk, lalu diserkai, diperas dengan kain flanel. Lalu ampas ditambahkan cairan penyari secukupnya sehingga diperoleh seluruh sari
sebanyak 1000 ml, kemudian didiamkan selama 2 hari dan dienap tuang. Maserat diuapkan dengan bantuan alat penguap rotary evaporator pada temperatur tidak
lebih dari 40 C dan difreeze dryer sampai diperoleh ekstrak kental Ditjen POM,
1979. Selanjutnya ampas dikeluarkan dari wadah maserasi dikeringkan dengan cara diangin-anginkan. Maserasi dengan penyari etanol dilakukan dengan cara
yang sama. Bagan pembuatan ekstrak dapat dilihat pada lampiran 5 halaman 45.
3.8.3 Pembuatan ekstrak dari simplisia
Sebanyak 100 gram simplisia yang telah diserbukkan dimasukkan ke dalam wadah tertutup, lalu dimaserasi dengan 750 ml pelarut kloroform selama 5
hari terlindung dari cahaya matahari sambil sering diaduk, lalu diserkai, diperas dengan kain flanel. Lalu ampas ditambahkan cairan penyari secukupnya sehingga
diperoleh seluruh sari sebanyak 1000 ml, kemudian didiamkan selama 2 hari dan dienap tuang. Maserat diuapkan dengan bantuan alat penguap rotary evaporator
pada temperatur tidak lebih dari 40 C dan difreeze dryer sampai diperoleh ekstrak
kental Ditjen POM, 1979. Selanjutnya ampas dikeluarkan dari wadah maserasi dikeringkan dengan cara diangin-anginkan selama 1 jam. Maserasi dengan
penyari etanol dilakukan dengan cara yang sama. Bagan pembuatan ekstrak dapat dilihat pada lampiran 5 halaman 46.
Universitas Sumatera Utara
3.9 Uji Sitotoksisitas
Metode ini dilakukan terhadap ekstrak kloroform dan ekstrak etanol dari bunga brokoli segar, bunga brokoli kukus dan simplisia menggunakan larva
Artemia salina Leach, yaitu sebagai berikut: Disiapkan air laut buatan dengan melarutkan 38 gram garam laut dengan
air dua kali penyulingan dicukupkan hingga 1 liter, kemudian disaring. Bejana penetasan disekat menjadi dua bagian, yaitu bagian yang besar dan bagian yang
kecil, lalu diberi lubang pada sekatnya. Setelah air laut buatan dimasukkan ke dalam bejana, telur Artemia salina Leach ditaburkan ke dalam bagian yang kecil
kemudian bagian atasnya ditutup dengan aluminium foil sedangkan bagian yang besar dibiarkan terbuka menghadap lampu. Setelah 48 jam, telur akan menetas
menjadi larva dan siap digunakan untuk hewan uji. Disiapkan larutan uji yang terdiri dari ekstrak kloroform dan ekstrak etanol dengan konsentrasi: 1000, 100
dan 10 bpj, disiapkan 3 vial untuk masing-masing konsentrasi larutan uji sehingga semuanya menjadi 9 vial dan 1 vial untuk kontrol. Larutan induk I dibuat dengan
menimbang 50 mg ekstrak lalu dilarutkan dengan pelarut yang sesuai sampai 5 ml sehingga diperoleh konsentrasi 10.000 bpj. Dari larutan induk I dipipet 0,5 ml lalu
diencerkan sampai 5 ml sehingga diperoleh larutan induk II dengan konsentrasi 1000 bpj. Dari larutan induk II dipipet 0,5 ml lalu diencerkan sehingga diperoleh
konsentrasi 100 bpj. Dari konsentrasi 100 bpj dipipet 0,5 ml lalu diencerkan sampai 5 ml sehingga diperoleh konsentrasi 10 bpj. Dimasukkan masing-masing
larutan uji ke dalam vial, lalu pelarutnya dibiarkan menguap seluruhnya. Pada ekstrak kloroform dan kontrolnya ditambahkan 1 ml suspensi Na-CMC.
Dimasukkan kira-kira 3 ml air laut buatan ke dalam masing-masing vial.
Universitas Sumatera Utara
Dimasukkan 10 ekor larva Artemia salina Leach, lalu ditambahkan air laut buatan sampai 5 ml. Ditambahkan 1 tetes suspensi ragi sebagai makanannya kemudian
semua vial diletakkan di bawah cahaya lampu. Setelah 24 jam dihitung jumlah larva yang mati Meyer, et al, 1982. Data dianalisis dengan Analisa regresi linear
untuk menentukan LC
50
. Bagan uji sitotoksisitas dapat dilihat pada lampiran 5 halaman 47 dan perhitungan nilai LC
50
dapat dilihat pada lampiran 7 halaman 50.
Universitas Sumatera Utara
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Identifikasi Tumbuhan
Hasil identifikasi tumbuhan yang dilakukan di Herbarium Bogoriense, Bidang Botani Pusat Penelitian Biologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia
LIPI Bogor menunjukkan bahwa bahan termasuk suku Brassicaceae, spesies Brassica oleracea L. var. botrytis L.
4.2 Hasil Makroskopik Bahan Tumbuhan Segar
Hasil pemeriksaan makroskopik dari bunga brokoli segar berbentuk bulat, berwarna hijau, berbau khas dan tidak berasa. Hasil pemeriksaan makroskopik
bunga brokoli yang dikukus berbentuk bulat, berwarna lebih hijau dari bunga segar, berbau khas dan rasanya agak manis.
4.3 Hasil Karakterisasi Simplisia
Hasil makroskopik simplisia bunga brokoli menunjukkan simplisia bunga brokoli merupakan kuncup-kuncup bunga kering, berbentuk bulat, berkeriput.
Simplisia berwarna hijau kekuningan hingga hijau kecoklatan, berbau khas dan tidak berasa.
Hasil pemeriksaan mikroskopik dari serbuk simplisia menunjukkan adanya epidermis, xilem dengan penebalan bentuk spiral, jaringan gabus, kristal Ca
oksalat bentuk prisma, stomata tipe anisositik, rambut penutup dan serbuk sari.
Universitas Sumatera Utara
Kategori