150-20 dan dibuat kurva standar yang menunjukkan hubungan antara absorbansi dan konsentrasi larutan.
3.3.1.3 ..
Pengujian Produksi Nitrogenase oleh Azotobacter sp. dengan
Metode Acetylene Reduction Assay ARA Abidin, 2005
Penyiapan kultur. Sebanyak satu ose isolat Azotobacter sp. dikultivasi
dalam tabung berulir berisi 7 mL media NFB kemudian divorteks dan diinkubasi pada suhu ruang selama 3-5 hari. Kultur sel dipanen setelah
terjadi perubahan kekeruhan pada media. Sebagai kontrol diberikan media NFB yang tidak diinokulasikan bakteri. Kultur selanjutnya
digunakan untuk pengujian aktivitas nitrogenase dan produksi AIA.
Pembuatan kurva standar etilen. Sebanyak 5 µmol, 10 µmol, 15 µmol
gas etilen diinjeksikan ke dalam kolom kromatografi gas. Kurva yang dihasilkan dibaca dan dikonversi ke dalam satuan mmjam. Hasil yang
diperoleh kemudian diplotkan menjadi kurva standar hubungan antara konsentrasi etilen dan luas kurva.
Pengukuran aktivitas nitrogenase. Sebanyak 1 mL kultur yang telah
disiapkan dipipet ke dalam Eppendorf 1.5 mL dan disentrifugasi kecepatan 5000 rpm selama 5 menit. Pelet yang dihasilkan diresuspensi
dan dipipet ke dalam tabung reaksi yang berisi media Ashby semi cair kemudian diinkubasi selama 3 hari. Pada hari ketiga inkubasi, tutup
kapas tabung diganti dengan penutup karet rubber stopper bersih. Sebanyak 10 udara dalam tabung diambil menggunakan microsyringe
dan menggantinya dengan gas asetilen kemudian diinkubasi pada sehu ruang selama 5 jam. Gas etilen yang terbentuk kemudian diambil dan
dianalisis menggunakan kromatografi gas.
3.3.2 Pengujian Kemampuan Tiga Isolat Terpilih Azotobacter sp. dalam
Menghasilkan Zat Pengatur Tumbuh Sitokinin dan Giberelin
Pengujian ini merupakan pengujian lanjutan untuk mengetahui zat pengatur tumbuh sitokinin yang dihasilkan oleh tiga isolat terpilih
Azotobacter. Kandungan sitokinin dan giberelin dilukur di Balai Besar
Pasca Panen, Cimanggu-Bogor menggunakan High Performance Liquid Chromatography HPLC. Pengukuran dilakukan sesuai dengan prosedur
Rivier dan Crozier 1987.
Penentuan Kandungan Sitokinin
Isolat ditumbuhkan pada media Ashby cair selama 72 jam masa inkubasi. Setelah itu, disentrifuse untuk didapatkan supernatannya. 0.2 ml
supernatan diekstraksi dengan McOH 80 100 ml x 3 pada 5
o
C selama 48 jam. Filtrat diuapkan dengan vacum pada 35
o
C sampai tingkat fase cair. Kemudian diencerkan dengan H
2
O sampai 50 ml. Atur pH sampai 2.5 dengan HCl 1 N. Lalu tambahkan dengan PVP 1 g dan disaring. Ekstraksi
dengan etil asetat 10 ml. Filtrat dalam fase cair tersebut disaring dengan Dowex 50Wx4, lalu elusi dengan 200 ml NH
4
OH 5 N, sehingga dihasilkan eluat amoniak yang kemudian diukur dengan menggunakan HPLC.
Penentuan Kandungan Giberelin
Isolat ditumbuhkan pada media Ashby cair selama 72 jam masa inkubasi. Setelah itu, disentrifuse untuk didapatkan supernatannya. 10 ml
supernatan diekstraksi dengan McOH 80 100 ml x 3 pada 5
o
C selama 48 jam. Filtrat diuapkan dengan vacum pada 35
o
C sampai tingkat fase cair. Kemudian diencerkan dengan H
2
O sampai 50 ml. Atur pH sampai 2.5 dengan HCl 1 N. Lalu tambahkan dengan PVP 1 g dan disaring. Ekstraksi
dengan etil asetat 10 ml x 4. Etil asetat dibuang, kemudian fase air biasa ditambahkan dengan petroleum eter 10 ml x 3. Petroleum eter dibuang, pH
diatur 2.5 dengan HCl 1 N, kemudian etil asetat 10 ml x 4 dibuang. Etil asetat diuapkan dalam vacum, lalu disaring dengan membran 0.45 µm.
Selanjutnya diukur dengan menggunakan HPLC.
3.3.3 Pengaruh Inokulasi Tiga Isolat Terpilih Azotobacter terhadap Berat
