cerana Gen COI Cytochrome Oxidase Subunit I (COI) Gene Variations of Mitochondrial DNA of Apis cerana
Lapisan atas yang berisi DNA dipindah- kan ke tabung baru. Presipitasi DNA
dilakukan dengan menambahkan 600 µl iso- propanol murni dan disimpan selama 12 jam
pada suhu 4 °C. Pengendapan DNA dilakukan dengan sentrifugasi 188.942x g selama 30
menit pada suhu 4 °C. Larutan berisi isopropanol dibuang, kemudian ditambahkan
500 µl etanol 70 dan disentrifugasi 188.942x g selama 10 menit pada suhu 4 °C.
Etanol 70 dibuang, kemudian pelet DNA dikeringkan dengan cara divakum selama 30
menit. Pelet DNA kemudian disuspensikan dalam TE 0.5 mM sebanyak 30-50 µl dan
disimpan pada suhu –4 °C.
Amplifikasi DNA A. cerana Gen COI
DNA hasil ekstraksi diamplifikasi dengan menggunakan teknik Polymerase Chain
Reaction PCR
menggunakan mesin
thermocycler ESCO SWIFT MAXI-BLC1. Segmen DNA yang diamplifikasi adalah gen
COI pada A. cerana. DNA target diampli- fikasi menggunakan pasangan primer yang
didisain dari genom lengkap mitokondria A. mellifera dengan kode akses L06178. Primer
forward
Am_COX1b_F dengan
urutan nukleotida
5’AGGAGGTGGAGATCCAA- TTC 3’ dan primer reverse Am_COX1b_R
5’TGGATAGTCTGAATAACGTCGTG 3’. Posisi primer forward pada gen tersebut di
urutan nukleotida 2455-2475 sedangkan primer reverse di urutan nukleotida 3096-
3120. Lokasi gen COI pada nukleotida 1794- 3359 Crozier Crozier 1993
Total pereaksi yang digunakan 20 µl PCR
campuran. Campuran tersebut terdiri atas 5.9 µl akuades steril, 0.8 µl primer forward 10
µM, 0.8 µl primer reverse 10 µM, 10 µl KAPA Taq ReadyMix DNA Polymerase
buffer Mg
2+
1.5 mM, dNTP 0.4 mM, KAPA Taq
DNA Polymerase
0.05 U
µl, penambahan 1 µl MgCl
2
1.5 mM, dan 1.5 µl
DNA hasil ekstraksi. Kondisi PCR sebagai berikut; inisiasi denaturasi DNA selama 4
menit pada suhu 95 °C, denaturasi DNA sebanyak 30 siklus pada suhu 94 °C,
penempelan primer 1 menit pada suhu 50 °C, elongasi DNA selama 2 menit pada suhu 72
°C dan 20 menit untuk ekstensi DNA.
Visualisasi DNA A. cerana Gen COI
Amplikon gen COI A. cerana di- migrasikan
dengan menggunakan
Poly- acrilamyde Gel Electrophoresis PAGE
konsentrasi 6. Komposisi PAGE 6 yaitu 12 ml akuades; 4 ml TBE 5x Tris 0.5 M,
asam borat 0.65 M, EDTA 0.02M; 4 ml acrylamide 30; 15 µl tetramethylethylene-
diamine TEMED; 150 µl Amonium Peroxo Sulfat APS 10. Pemisahan amplikon
tersebut dilakukan pada tegangan 200 V selama 55 menit.
DNA divisualisasi
dengan metode
pewarnaan perak nitrat Byun et al. 2009. Gel hasil elektroforesis dicuci dengan akuades,
lalu direndam di dalam larutan satu 200 ml akuades, 0.2 g AgNO
3
, 80 µl NaOH 4 g10
ml akuades, dan 0.8 ml NH
4
OH selama 8 menit, kemudian dibilas kembali dengan
akuades, selanjutnya gel direndam dalam larutan dua 200 ml akuades, 6 g NaOH, dan
100 µl formalin hingga pita DNA muncul.
Tahap akhir yaitu gel tersebut direndam di dalam larutan tiga 100 ml akuades dan 100
µl asam asetat untuk pengawetan gel hasil
visualisasi
Sekuens dan Alignment DNA A. cerana Gen
COI
Variasi genetik gen COI untuk A. cerana dianalisis menggunakan metode sekuensing.
DNA disekuens dengan menggunakan mesin sekuens 3730XL dan ABI 3100 di perusahaan
jasa pelayanan sekuens. Hasil sekuens nukleotida diedit dan dianalisis dengan
menggunakan program Genetyx Win Version 4.0. Hasil sekuens forward dan reverse di-
alignment untuk mendapatkan sekuens utuh DNA, dengan menggunakan program Clustal
X Thompson et al. 1997. Analisis homologi dilakukan melalui BLASTN untuk urutan basa
melalui
situs National
Center for
Biotechnology Information NCBI. Keseluruhan sekuens DNA A. cerana di-
alignment dengan basis data gen COI A. cerana di GenBank NCBI. Kode akses basis
data yang digunakan yaitu AF153101- AF153109 www.ncbi.nlm.nih.gov Tabel 1.
Sekuens DNA yang telah diedit kemudian dideduksi menjadi asam amino dengan
menggunakan
Program Genetyx.
Hasil deduksi asam amino di-alignment dengan
menggunakan program Clustal X dan di edit dengan menggunakan program MEGA 4
Tamura et al. 2007.
Analisis Jarak Genetik dan Konstruksi Filogeni