Identifikasi Keragaman Gen Cytochrome Oxidase Subunit I (COI) DNA Mitokondria pada Ayam Lokal Indonesia
IDENTIFIKASI KERAGAMAN GEN CYTOCHROME
OXIDASE SUBUNIT I (COI) DNA MITOKONDRIA
PADA AYAM LOKAL INDONESIA
ROASLEIN PUTRI
DEPARTEMEN ILMU PRODUKSI DAN TEKNOLOGI PETERNAKAN
FAKULTAS PETERNAKAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Identifikasi Keragaman
Gen Cytochrome Oxidase Subunit I (COI) DNA Mitokondria pada Ayam Lokal
Indonesia adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan
belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun.
Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun
tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan
dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Mei 2013
Roaslein Putri
NIM D14090092
ABSTRAK
ROASLEIN PUTRI. Identifikasi Keragaman Gen Cytochrome Oxidase Subunit I
(COI) DNA Mitokondria pada Ayam Lokal Indonesia. Dibimbing oleh CECE
SUMANTRI dan MARIA ULFAH.
Penentuan rumpun ayam lokal merupakan hal yang sangat penting untuk
pengesahan ayam lokal di Indonesia. Diperlukan penelitian lebih lanjut untuk
menentukan perbedaan dari rumpun ayam lokal Indonesia. Penelitian ini
menggunakan gen COI DNA mitokondria sebagai DNA barcoding untuk
menentukan taksonomi ayam lokal Indonesia. DNA hasil ekstraksi dilanjutkan
pada proses amplifikasi dan sekuens DNA pada gen COI. Hasil dari sekuensing
dianalisis menggunakan MEGA5.
Setelah diurutkan didapatkan sekuens
sepanjang 653 pb dan didapatkan 5 kelompok. Kelompok 1 yaitu bangkok, walik,
arab golden, arab silver, hutan merah, kampung, pelung, gaga, kate, ayam
pedaging strain Cobb 1 dan 2. Kelompok 2 yaitu ayam petelur strain Lohman
brown. Kelompk 3 yaitu ayam pedaging strain Cobb, kelompok 4 ayam leher
gundul 4 dan kelompok 5 ayam serama. Hasil analisis menunjukan bahwa pada
parsial 653 pb gen COI merupakan daerah yang conserved sehingga tidak dapat
membedakan antar ayam lokal.
Diperlukan penelitian lanjutan untuk
menganalisis sekuen komplit COI (1 550 pb).
Kata kunci: ayam lokal, Cytochrome Oxidase I (COI), DNA barcoding
ABSTRACT
ROASLEIN PUTRI. Variation Identification of Cytochrome Oxidase Subunit I
(COI) Gene of mtDNA in Indonesian Local Chickens. Supervised by CECE
SUMANTRI and MARIA ULFAH.
Characterization of local chicken breed is very important for determination
of local chickens in Indonesia. Advance study is needed to determine the
differences of Indonesian local chicken breeds. This study used gene COI
mtDNA as a DNA barcoding to determine the taxonomy of local chickens in
Indonesia. DNA extraction and amplification process were followed with DNA
sequences of COI gene. The results of sequencing were analyzed using MEGA5.
The sequence alignments result sequence lenght of 653 bp and 5 separated group
of chickens, namely group 1 (bangkok, walik, arab golden, arab silver, hutan
merah, kampung, pelung, gaga, kate, and broiler Cobb 1 and 2), group 2 (Lohman
brown), group 3 (broiler Cobb), group 4 (leher gundul chicken 4), and group 5
(serama chicken). The study shows that the 653 bp partial conserved can not be
used as a DNA barcode in local chickens. Advance study is needed to analyze the
complete sequence of COI (1 550 bp).
Keywords: Cytochrome Oxidase I (COI), DNA barcoding, local chicken
IDENTIFIKASI KERAGAMAN GEN CYTOCHROME
OXIDASE SUBUNIT I (COI) DNA MITOKONDRIA
PADA AYAM LOKAL INDONESIA
ROASLEIN PUTRI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Peternakan
pada
Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan
DEPARTEMEN ILMU PRODUKSI DAN TEKNOLOGI PETERNAKAN
FAKULTAS PETERNAKAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
Judul Skripsi : Identifikasi Keragaman Gen Cytochrome Oxidase Subunit I (COI)
DNA Mitokondria pada Ayam Lokal Indonesia
Nama
: Roaslein Putri
NIM
: D14090092
Disetujui oleh
Prof Dr Ir Cece Sumantri, MAgrSc
Pembimbing I
Maria Ulfah, SPt, MScAgr
Pembimbing II
Diketahui oleh
Prof Dr Ir Cece Sumantri, MAgrSc
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karuniaNya sehingga karya tulis ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam
penelitian yang dilaksanakan pada bulan November 2012 sampai Maret 2013 ini
adalah ayam lokal Indonesia dengan judul Identifikasi Keragaman Gen
Cytochrome Oxidase Subunit I (COI) DNA Mitokondria pada Ayam Lokal
Indonesia. Penelitian ini didanai oleh Ibu Maria Ulfah SPt, MScAgr.
Terimakasih penulis sampaikan kepada Bapak Prof Dr Ir Cece Sumantri,
MAgrSc dan Ibu Maria Ulfah SPt, MScAgr selaku pembimbing skripsi. Penulis
juga mengucapkan terimakasih kepada Bapak Dr Jakaria SPt, Msi dan Bapak Dr
Iwan Prihantoro SPt, MSi selaku dosen penguji, juga Bapak M Sriduresta SPt,
MSi atas semua masukkan yang telah diberikan untuk skripsi ini. Di samping itu
penulis juga menyampaikan terimakasih kepada Ibu Yuni Cahya Endrawati, SPt,
MSi selaku dosen pembimbing akademik. Ungkapan terimakasih juga penulis
sampaikan kepada kedua orang tua, Bapak Jupriyadi dan Ibu Andiana, Dian, Rafli,
Fathan, serta Abdul Maruf beserta keluarga besar atas doa dan kasih sayangnya.
Tak lupa terimakasih kepada Sdr Eryk, Sdr Ferdy, dan teman-teman tim genetika
molekuler ayam (Tasya, Lusiana, dan Ayu) yang telah membantu penulis
melakukan penelitian. Penulis juga mengucapkan terimakasih kepada sahabatsahabat penulis Alit dan Rany serta seluruh keluarga besar IPTP 46 atas semua
dukungannya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Mei 2013
Roaslein Putri
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
PENDAHULUAN
1
Latar Belakang
Tujuan Penelitian
Ruang Lingkup Penelitian
METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Bahan
Alat
Prosedur
HASIL DAN PEMBAHASAN
Amplifikasi Gen Cytochrome Oxidase Subunit I (COI)
Keragaman Gen Cytochrome Oxidase Subunit I (COI)
1
1
2
2
2
2
2
3
4
4
5
SIMPULAN DAN SARAN
13
DAFTAR PUSTAKA
13
LAMPIRAN
15
DAFTAR TABEL
1 Rataan komposisi basa nukleotida setelah disejajarkan dengan sekuen
dari GenBank
2 Situs-situs delesi dan insersi basa-basa nukleotida COI
3 Jarak genetik berdasarkan metode pairwise distance daerah COI setiap
individu ayam
6
7
9
DAFTAR GAMBAR
1 Produk PCR sepanjang 651 pb
2 Visualisasi gen COI ayam lokal Indonesia di agarose 1.5% sebesar 651
pb
3 Konstruksi pohon filogeni antara individu ayam berdasarkan metode
UPGMA
2
4
12
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Indonesia sangat kaya akan keanekaragaman genetik ternak, termasuk
keanekaragaman genetik ayam lokal. Terdapat 31 rumpun ayam lokal Indonesia
yang tersebar diberbagai daerah di Indonesia berdasarkan ciri fenotipe
(Nataamijaya 2000), tetapi diperkirakan jumlahnya dapat lebih dari itu.
Disamping itu penamaan ayam lokal Indonesia masih beragam (dapat berbeda di
setiap daerah), sehingga diperlukan kajian genetik untuk menentukan rumpun
ayam lokal Indonesia.
Penentuan rumpun ayam lokal merupakan hal yang sangat penting untuk
pengesahan ayam lokal di Indonesia. Masih diperlukan kajian lebih lanjut
terhadap ayam-ayam lokal Indonesia terutama pada ayam-ayam yang belum
teridentifikasi rumpunnya berdasarkan kajian genetik.
Spesies-spesies yang belum teridentifikasi dapat diidentifikasi
menggunakan teknologi DNA barcoding dengan melihat keragaman haplotipe
dari DNA mitokondria. Situs COI pada DNA mitokondria sering digunakan
dalam melihat keragaman haplotipe melalui DNA barcode dikarenakan banyak
memiliki kelebihan antara lain konservasi keturunan, banyak memiliki variasi
sekuens serta dapat teramplifikasi dengan primer yang universal (Xiao et al.
2004).
Situs COI sudah digunakan dalam banyak penelitian untuk
mengklasifikasikan banyak hewan (Hajibabaei et al. 2006).
Penelitian
sebelumnya yang dilakukan oleh Gao et al. (2011), bahwa barcoding dengan COI
dapat diaplikasikan pada ayam, sehingga penelitian ini menggunakan COI untuk
mengidentifikasi ayam-ayam lokal Indonesia yang belum dilakukan dengan COI
pada ayam rumpun ayam lokal Indonesia.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi keragaman gen COI DNA
mitokondria pada ayam lokal Indonesia yang belum jelas rumpunnya. Selain itu
juga bertujuan untuk menggunakan teknik DNA barcoding sebagai alternatif
dalam mengidentifikasi keanekaragaman ayam lokal Indonesia.
Ruang Lingkup Penelitian
Ruang lingkup penelitian ini adalah menerapkan teknologi DNA barcoding
untuk mengidentifikasi rumpun ayam. Teknologi DNA barcoding diaplikasikan
melalui gen COI DNA mitokondria. Penelitian ini dibatasi pada subjek ayamayam lokal Indonesia.
2
METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan dari November 2012 sampai Maret 2013.
Penelitian ini dilakukan di Laboratotium Genetika Molekuler Ternak, Fakultas
Peternakan, Institut Pertanian Bogor.
Bahan
Bahan-bahan yang digunakan untuk adalah DW, 1x STE, Sodium Dodesil
Sulfat (SDS) 10%, phenol, Proteinase K (5mg/ml), Chloroform Isoamil Alkohol
(CIAA), NaCl (5M), EtOH 96%, TE 80%, sampel DNA hasil ekstraksi, 10 x
buffer, MgCl2, pasangan primer forward dan revers, enzim Taq polymerase,
dNTPs, BSA, serbuk agarose 0.45 gram, larutan 0.5 x Tris-Borat EDTA (TBE),
EtBr, produk PCR, loading dye, dan marker 100 pb. Primer yang digunakan pada
penelitian ini berdasarkan Gao et al. (2011) adalah forward: 5’
GCACAGGATGGACAGTTTAC-3’ (371-390) dan reverse: 5’ ATAGCATAG
GGGGGTCTCAT-3’ (1002-1021). Sekuens gen COI diperoleh dari GenBank
dengan nomor akses AP003323.
forward
GCACAGGATGGACAGTTTACCCCCCTTTAGCCGGCAACCTAGCCCACGCTGGCGCAT
CAGTAGACCTAGCCATCTTTTCATTACACTTAGCAGGTGTTTCCTCCATTCTAGGAGCC
ATCAACTTTATCACTACCATCATCAACATAAAACCCCCCGCACTGTCACAATACCAAA
CACCCCTATTCGTATGATCCGTCCTCATTACTGCCATCCTACTACTCCTCTCCTTACCC
GTCCTAGCAGCTGGGATTACCATACTACTTACCGACCGCAACCTTAACACCACATTCT
TCGACCCAGCTGGAGGAGGAGACCCAATCCTATACCAACACCTATTCTGATTCTTCGG
TCACCCCGAAGTTTACATCCTCATCCTCCCAGGTTTCGGAATAATTTCCCACGTAGTAG
CATACTATGCAGGAAAAAAAGAACCATTCGGATACATAGGAATAGTCTGAGCCATAC
TGTCAATCGGATTCCTTGGCTTCATTGTATGAGCCCACCATATATTCACAGTCGGAAT
GGACGTAGACACCCGAGCCTACTTTACATCAGCCACAATAATCATCGCCATCCCAACT
GGTATTAAAGTCTTCAGCTGACTAGCAACCCTGCACGGAGGAACAATTAAATGAGAC
CCCCCTATGCTAT
Reverse
Gambar 1 Produk PCR sepanjang 651 pb
Alat
Alat-alat yang digunakan untuk ekstraksi adalah tabung 1.5 ml, satu set
micropippet beserta tipnya, vortex, sentrifuge, freezer, dan inkubator. Alat-alat
yang digunakan untuk amplifikasi dan elektroforesis adalah mesin PCR
thermocycler, vortex, micro sentrifuge, tabung PCR, refrigerator, satu set tray
pencetak gel, timbangan digita, microwave, stirrer, power supply 100 volt, dan
UV Transilluminator.
3
Prosedur
Ekstraksi DNA Total
Ekstraksi DNA dilakukan dengan menggunakan acuan Sambrook et al.
(1989) yang dimodifikasi. Darah diambil sebanyak 100 µl dan ditambahkan
dengan 1 000 µl DW, kemudian divortex dan disentrifugasi dengan kecepatan
8 000 rpm selama lima menit. Endapan yang didapatkan kemudian ditambahkan
dengan 1 x STE sebanyak 300 µl, 40 µl 10% SDS, dan 10 µl proteinase K 5mg/ml
lalu diinkubasi sambil digoyang secara perlahan dengan suhu 55 oC selama dua
jam. Setelah itu ditambahkan 400 µl phenol, 400 µl CIAA, dan 40 µl NaCl 5 M,
kemudian digoyangkan secara perlahan selama satu jam dalam suhu ruang. Lalu
disentrifugasi dengan kecepatan 12 000 rpm selama lima menit.
Supernatan yang terbentuk diambil sebanyak 400 µl dan dipindahkan ke
tabung baru kemudian ditambahkan 8 000 µl EtOH absolute dan 40 µl NaCl 5 M
lalu dibekukan selama 12 jam di dalam frezeer. Sampel kemudian disentrifugasi
dengan kecepatan 12 000 rpm selama lima menit. Endapan yang didapatkan
ditiriskan dan ditambahkan dengan 100 µl TE 80%.
Amplifikasi DNA
Sampel DNA yang merupakan hasil ekstraksi diambil sebanyak 0.5 µl dan
dimasukkan ke dalam tabung Polymerase Chain Reaction (PCR), kemudian
ditambahkan larutan premix 29.5 µl. Premix dibuat dengan campuran 2 µl primer,
1 µl dNTPs, 2.5 µl MgCl2, 3.5 µl10 x buffer, 0.1 µl enzim Taq polymerase
(Fermentas), BSA 1 µl, dan 24.4 µl DW. Campuran sampel DNA dan premix
tersebut diinkubasi menggunakan mesin PCR thermocycler.
Proses amplifikasi DNA diawali dengan predenaturasi 95 oC selama lima
menit yang kemudian tahapan kedua yang terdiri dari 30 siklus, masing-masing
siklus terdiri dari proses denaturasi 95 oC selama 45 detik, annealing
58 oC
selama 1 menit dan ekstensi DNA pada suhu 72 oC selama 1 menit. Tahapan
terakhir adalah pemanjangan primer pada suhu 72 oC selama 5 menit. Hasil
amplifikasi DNA tersebut dielektroforesis.
Elektroforesis Produk PCR
Produk PCR dipisahkan dengan agarose gel 1.5%. Gel dibuat dengan
mencampurkan serbuk agarose 0.45 gram dan 0.5 x TBE 30 ml kemudian
dipanaskan di microwave dengan suhu medium high selama 5 menit. Setelah itu
dihilangkan uap panasnya dengan menggunakan stirrer dan ditambahkan EtBr 2.5
µl. Gel dicetak di tray pencetak lalu ditunggu sampai mengeras. Produk PCR
sebanyak 5 µl dilarutkan dalam loading dye 1µl.
Elektroforesis dilakukan selama 35-45 menit pada tegangan konstan 100 V.
Setelah selesai, pita-pita tampak dengan bantuan sinar ultra violet pada UV
Transilluminator. Sampel yang sudah teramplifikasi selanjutnya disekuensing (1st
Base).
Analisis Data
Hasil sekuensing diolah menggunakan BioEdit. Dilakukan perunutan dan
pensejajaran hasil sekuen dengan runutan baku dari GenBank dengan
menggunakan program Clustal W yang terdapat pada program MEGA5 dengan
acuan utama runutan basa nukleotida Gallus gallus bankiva (kode akses
4
AP003323), Gallus gallus spadiceus (kode akses AP003321), Gallus gallus gallus
(kode akses AP003322), dan sekuen ayam lokal Laos (kode akses AP003319).
Jarak rata-rata p-distance dari basa nukleotida daerah COI dihitung dengan
pairwise distance. Rekontruksi pohon filogeni dibuat dengan menggunakan
metode UPGMA berdasarkan runutan basa nukleotida.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Amplifikasi Gen Cytochrome Oxidase Subunit I (COI)
DNA hasil ekstraksi diamplifikasi menggunakan proses Polymerase Chain
Reaction (PCR). Amplifikasi gen COI pada ayam lokal Indonesia dilakukan
dengan menggunakan mesin PCR Applied Biosystem.
Gambar 2 Visualisasi gen COI ayam lokal indonesia di agarose 1.5%.
Keterangan: M = marker. Br-G: Kode sampel (Lampiran 1)
Sebanyak 26 sampel dapat diamplifikasi (Gambar 1) oleh primer forward:
5’GCACAGGATGGACAGTTTAC-3’ dan reverse: 5’ATAGCATAGGGGGGT
CTCAT-3’. Proses ini dilakukan dengan menggunakan enzim polimerase dan
primer. Primer merupakan oligonukleotida spesifik pada DNA template yang
berukuran pendek (berkisar antara 18-24 pb). Primer akan menempel pada DNA
cetakan di tempat spesifik. DNA baru dicetak dengan menggunakan bantuan dari
enzim polimerase.
Hasil PCR dapat langsung divisualisasikan dengan
elektoforesis atau dapat digunakan untuk analisis lebih lanjut (Williams 2005).
Amplifikasi gen pada sampel darah ayam optimal pada suhu 58 oC selama 1 menit
dan diperoleh produk PCR sepanjang 651 pb. Suhu optimal sangat penting untuk
diketahui karena pada proses ini primer akan menempel pada target spesifik DNA.
Keberhasilan proses amplifikasi juga dapat dikarenakan beberapa faktor
diantaranya konsentrasi DNA. Konsentrasi yang baik setara 50 µg/ml (Muladno
2010). Konsentrasi yang digunakan pada penelitian ini berkisar antara 370 –
5
2 800 µg/ml. Selain itu suhu penempelan dan konsentrasi MgCl2 juga
berpengaruh terhadap keberhasilan proses amplifikasi (Weissensteiner 2004).
Keragaman Gen Cytochrome Oxidase Subunit I (COI)
Komposisi Basa Nukleotida
Hasil sekuensing pada produk PCR dari dua arah yaitu primer forward dan
primer reverse pada penelitian ini didapatkan hasil sekuen sepanjang 653 pb.
Sekuen dari pustaka yang digunakan adalah sekuen G. g. bankiva, G. g.
spadiceus, G. g. gallus, dan sekuen ayam lokal Laos yang terdiri dari sekuen COI
sepanjang 1 550 pb.
Setelah dilakukan runutan DNA sampel dengan Clustal W dengan acuan
utama runutan basa nukleotida dari GenBank mendapatkan hasil rataan basa
nukleotida pada setiap rumpun ayam hampir semuanya sama. Perbedaan hanya
terjadi pada ayam serama, ayam petelur strain Lohman brown, leher gundul, dan
ayam pedaging strain Cobb (Tabel 1).
Hasil pensejajaran basa nukleotida yang telah dilakukan menunjukkan
bahwa setiap individu dari ayam yang diteliti memiliki jumlah basa nukleotida
yang sama, kecuali ayam serama, ayam petelur strain Lohman brown, leher
gundul, dan ayam pedaging strain Cobb. Rataan nukleotida A+T pada semua
rumpun ayam yang diteliti lebih tinggi dibandingkan dengan nukleotida C+G.
Hal ini dikarenakan sekuen yang digunakan masih terlalu pendek sehingga tidak
bisa mewakili. Seharusnya nukleotida C+G lebih tinggi dibandingkan dengan
A+T hal ini dijelaskan Muladno (2010) bahwa basa A selalu berikatan dengan
basa T dengan dua ikatan hidrogen, sedangkan basa C selalu berikatan dengan
basa G dengan tiga ikatan hidrogen sehingga basa C+G lebih stabil dibandingkan
dengan A+T. Perbedaan jumlah basa nukleotida pada ayam serama, ayam petelur
strain Lohman brown, leher gundul, dan ayam pedaging strain Cobb dikarenakan
delesi dan insersi pada ayam-ayam tersebut (Tabel 2).
6
Tabel 1 Rataan komposisi basa nukleotida setelah disejajarkan dengan sekuen
dari GenBank (panjang 653 pb)
Sampel
G. g. bankiva (GB)
G. g. gallus (GB)
G. g. spadiceus (GB)
Ayam lokal Laos (GB)
Hutan merah (G. g. bankiva)
Kampung
Arab golden
Arab silver
Walik
Leher gundul*
Bangkok
Serama
Pelung
Gaga
Kate
Ayam petelur strain Lohhman
brown
Ayam pedaging strain Cobb
Nd*
n
%
1
1
1
1
1
3
3
1
2
3
3
1
1
1
1
T(U)
24.6
24.6
24.6
24.6
24.6
24.6
24.6
24.6
24.6
24.6
24.6
24.8
24.6
24.6
24.6
C
31.7
31.7
31.5
31.5
31.5
31.5
31.5
31.5
31.5
32.0
31.5
31.5
31.5
31.5
31.5
A
27.8
27.8
27.8
27.8
27.8
27.8
27.8
27.8
27.8
27.8
27.8
27.8
27.8
27.8
27.8
G
15.8
15.8
15.8
15.8
15.8
15.8
15.8
15.8
15.8
15.8
15.8
15.8
15.8
15.8
15.8
A+T
52.5
52.5
52.5
52.5
52.5
52.5
52.5
52.5
52.5
52.0
52.5
53.0
52.5
52.5
52.5
C+G
47.5
47.5
47.5
47.5
47.5
47.5
47.5
47.5
47.5
48.0
47.5
47.0
47.5
47.5
47.5
1
3
2
24.4
24.6
24.6
31.8 27.8 16.0
32.0 27.8 15.8
31.5 27.8 15.8
52.0
52.0
52.5
48.0
48.0
47.5
Keterangan : GB = GenBank; * = belum teridentifikasi; n = jumlah sampel
7
Tabel 2 Situs-situs delesi dan insersi basa-basa nukleotida COI
Sampel
G. g. bankiva (GB)
G. g. gallus (GB)
G. g. spadiceus (GB)
Ayam lokal Laos (GB)
Hutan merah (G. g. bankiva)
Kampung 1
Kampung 2
Kampung 3
Kampung 4
Arab golden 1
Arab golden 2
Arab golden 3
Arab silver
Walik 1
Leher gundul 1*
Leher gundul 2*
Leher gundul 3*
Leher gundul 4*
Bangkok 1
Bangkok 2
Bangkok 3
Serama
Pelung
Gaga
Kate
Ayam petelur strain Lohman
brown
Ayam pedaging strain Cobb 1
Ayam pedaging strain Cobb 2
Ayam pedaging strain Cobb 3
Nd*
397
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
C
T
T
T
T
T
T
T
Urutan Basa Nukleotida
403
405 411 413
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
-
423
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
567
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
T
C
C
C
T
G
-
C
-
G
C
T
T
T
T
G
G
C
G
G
-
-
T
-
T
T
T
T
C
C
C
C
Keterangan : GB = GenBank; * = belum teridentifikasi
Basa nukleotida yang berbeda pada ayam leher gundul pada urutan basa ke
397 yaitu basa T berubah menjadi basa C, sedangkan pada ayam petelur strain
Lohman brown terdapat insersi basa C pada urutan basa ke 411 dan pada urutan
ke 423 basa T berubah menjadi basa G. Ayam pedaging strain Cobb pada urutan
basa ke 403 basa G berubah menjadi basa C, pada urutan basa ke 405 terdapat
insersi basa G dan pada basa ke 413 terdapat insersi basa T. Ayam serama pada
urutan basa ke 567 basa C berubah menjadi basa T. Hasil tersebut dapat
8
menunjukkan bahwa ayam petelur strain Lohman brown dan ayam serama
berbeda dengan ayam yang lainnya, tetapi belum bisa dijadikan penanda genetik
karena pada sekuen yang diteliti masih merupakan daerah yang memiliki
kesamaan, selain itu juga sampel yang digunakan hanya satu sehingga belum
dapat dijadikan penanda genetik. Ayam leher gundul dan ayam pedaging strain
Cobb belum dapat dikatakan berbeda karena masih ada sampel-sampel lain dari
ayam leher gundul dan ayam pedaging strain Cobb yang berbeda.
Jarak Genetik Ayam Lokal Indonesia Gen COI
Pengukuran kekerabatan pada setiap individu ayam dengan menggunakan
analisis Pairwise Distance Calculation menghasilkan jarak genetik terendah
adalah 0.000 dan tertinggi adalah 0.003 (Tabel 3). Individu-individu yang
memiliki nilai jarak genetik semakin rendah, maka individu-individu tersebut
memiliki hubungan kekerabatan yang semakin rendah. Jika jarak genetiknya
tinggi maka memiliki hubungan kekerabatan yang jauh. Individu ayam dalam
penelitian ini kecuali ayam serama, ayam petelur strain Lohman brown, ayam
leher gundul 4, dan ayam pedaging strain Cobb 3 memiliki jarak genetik yang
sama (jaraknya 0.000). Hal ini dikarenakan daerah 653 pb merupakan daerah
conserved yaitu daerah yang memiliki basa nukleotida yang sama. Ayam yang
belum teridentifikasi tidak dapat diidentifikasi karena kesamaan basa pada parsial
653 pb, sehingga antar rumpun ayam tidak spesifik dan tidak dapat dijadikan
penanda.
9
Tabel 3 Jarak genetik berdasarkan metode pairwise distance daerah COI setiap individu ayam
No
Sampel
1
2
3
4
5
6
7
8
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
Bangkok_1
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.002
16
Bangkok_2
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.002
0.000
17
Bangkok_3
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.002
0.000
0.000
18
Pelung
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.002
0.000
0.000
0.000
19
Gaga
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.002
0.000
0.000
0.000
0.000
20
Kate
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.002
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
21
Leher_gundul_1*
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.002
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
22
Leher_gundul_2*
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.002
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
23
Leher_gundul_3*
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.002
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
24
Leher_gundul_4*
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.003
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
25
Ayam_pedaging_strain_Cobb_1
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.002
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
26
Ayam_pedaging_strain_Cobb_2
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.002
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
27
Ayam_pedaging_strain_Cobb_3
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.003
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
28
Ayam_petelur_strain_Lohman_brown
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.003
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
29
Walik
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.002
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
30
Nd*
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.002
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
1
G._g._bankiva_(GB)
2
G._g._gallus_(GB)
0.000
3
G._g._spadiceus_(GB)
0.000
0.000
4
Ayam_lokal_Laos_(GB)
0.000
0.000
0.000
5
Hutan_merah_(G._g._bankiva)
0.000
0.000
0.000
0.000
6
Kampung_1
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
7
Kampung_2
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
8
9
Kampung_3
Kampung_4
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
10
Arab_golden_1
0.000
0.000
0.000
0.000
11
Arab_golden_2
0.000
0.000
0.000
12
Arab_golden_3
0.000
0.000
13
Arab_silver
0.000
14
Serama
15
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
10
Lanjutan
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.002
0.002
0.002
0.002
0.000
0.000
0.000
0.000
0.002
0.000
0.000
0.000
0.000
0.002
0.000
0.002
0.002
0.002
0.002
0.003
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.003
0.002
0.002
0.003
0.000
0.000
0.000
0.000
0.002
0.000
0.000
0.002
0.002
0.000
0.000
0.000
0.000
0.002
0.000
0.000
0.002
0.002
Keterangan : GB = GenBank; * = belum teridentifikasi
0.000
11
Analisis Filogenetik
Panjang sekuen gen COI yang dianalisis adalah 653 pb dari 1 550 pb sekuen
gen COI. Pohon filogenetik didapatkan dengan menggunakan metoda UPGMA.
Pohon filogenetik adalah pohon yang menunjukkan hubungan kekerabatan antara
berbagai spesies yang diyakini memiliki nenek moyang yang sama.
Pohon filogenetik hasil analisis ditampilkan pada Gambar 3. Setelah
dilakukan analisis pohon filogenetik, maka didapatkan 5 kelompok. Kelompok 1
yaitu ayam ayam yang belum teridentifikasi (Nd dan leher gundul 1, 2, dan 3).
bangkok, walik, arab golden, arab silver, hutan merah, kampung, pelung, gaga,
kate, ayam pedaging strain Cobb 1 dan 2, G. g. bankiva, G. g. spadiceus, G. g.
gallus, dan sekuen ayam lokal Laos. Kelompok 2 yaitu ayam petelur strain
Lohman brown. Kelompk 3 yaitu ayam pedaging strain Cobb, kelompok 4 ayam
leher gundul 4 dan kelompok 5 ayam serama. Pohon filogenetik didapatkan
dengan mengidentifikasi urutan basa nukleotida yang homolog pada DNA
mitokondria (Dawkin 2000). Analisis menggunakan pohon filogenetik bertujuan
untuk merekontruksi hubungan kekerabatan yang tepat antara organisme (Li dan
Graur 1991). Pohon filogentik tersebut terdiri dari sejumlah nodus dan cabang.
Nodus-nodus tersebut mewakili unit-unit taksonomi, sedangkan cabangcabangnya mewakili hubungan antara keturunan dengan leluhurnya. Panjang
cabang menggambarkan jumlah perubahan evolusioner yang terjadi antara dua
nodus (Zein dan Sulandari 2009).
Terdapat kesamaan basa pada setiap individu ayam yang diteliti kecuali
ayam serama, ayam petelur strain Lohman brown, satu ayam leher gundul, dan
satu ayam pedaging strain Cobb. Hal ini dikarenakan sekuen gen COI yang
dianalisis hanya 653 pb, sedangkan jumlah keseluruhan sekuen gen COI adalah
1 550 pb sehingga belum bisa mewakili keseluruhan gen COI. Selain itu juga
dikarenakan ayam-ayam yang diteliti berasal dari wilayah geografi yang
berdekatan (Lampiran 1).
Ayam-ayam yang diteliti sudah mengalami
percampuran antara banyak ayam, sehingga pada ayam-ayam yang diteliti banyak
yang memiliki basa nukleotida yang sama. Ayam serama memiliki perbedaan
dengan ayam yang lainnya karena ayam serama berasal dari Malaysia hal ini
membuktikan bahwa ayam serama berbeda dengan ayam lokal Indonesia yang
lainnya. Salah satu ayam leher gundul (4) yang diteliti juga berbeda dengan ayam
yang lainnya. Ayam leher gundul ini berasal dari kelompok kerja pelestarian
unggas lokal di Jawa Timur dan diduga kegiatan pemurnian ayam leher gundul ini
(tanpa adanya perkawinan dengan ayam lokal lainnya), menjadi salah satu
penyebab ayam leher gundul tersebut berbeda dengan ayam lokal yang lainnya.
Penelitian yang dilakukan oleh Suriana et al (2012) tentang ulat sutra liar
Cricula trifenestrata menggunakan gen COI menunjukkan bahwa 595 runutan
nukleotida yang didapatkan pada ujung 5’ gen COI C. trifenestrata bersifat
conserved pada level spesies, tetapi beragam pada level family. Penelitian tentang
COI juga dilakukan oleh Nugroho (2011) dengan objek penelitian lebah
menghasilkan 6 kelompok lebah. Perbedaan hasil penelitian sebelumnya dengan
penelitian ini diduga karena spesies dan primer yang digunakan berbeda.
Penelitian yang dilakukan menghasilkan bahwa ayam-ayam lokal mempunyai
urutan basa yang sama (kecuali ayam serama, ayam petelur strain Lohman brown,
leher gundul 4, dan ayam pedaging strain Cobb 3), sehingga antar spesies tidak
bisa dibedakan. Penelitian Zein dan Sulandari (2009) yang meneliti ayam lokal
12
Indonesia menggunakan sekuens hypervariable-1 d-loop DNA mitokondria
menghasilkan bahwa urutan basa setiap rumpun ayam berbeda.
Walik
Nd
Ayam pedaging strain Cobb 2
Ayam pedaging strain Cobb 1
Leher gundul 3
Leher gundul 2
Leher gundul 1
Kate
Gaga
Pelung
Bangkok 3
Bangkok 2
Bangkok 1
Arab silver
Arab golden 3
Arab golden 2
Arab golden 1
Kampung 4
Kampung 3
Kampung 2
Kampung 1
Hutan merah (G. g. bankiva)
Ayam lokal Laos (GB)
G. g. spadiceus (GB)
G. g. bankiva (GB)
G. g. gallus (GB)
Ayam petelur strain Lohman brown
Ayam pedaging strain Cobb 3
Leher gundul 4
Serama
0.0008
0.0006
0.0004
0.0002
0.0000
Gambar 3 Konstruksi pohon filogeni antara individu ayam berdasarkan metode
UPGMA
Keterangan :
GB: Sekuen Cytochrome Oxidase Subunit I yang diperoleh dari GenBank (2005)
Sekuen sepanjang 653 pb merupakan daerah conserved, artinya pada daerah
tersebut basa nukleotida pada setiap individu hampir sama, sehingga hasilnya
13
tidak bisa mewakili keseluruhan sekuen COI. Hal ini dapat dilihat pada sekuen
yang diambil dari GenBank, bahwa keempat data yang diambil dari GenBank
pada daerah tersebut (panjang 653 pb) urutan basa nukleotidanya sama, padahal G.
g. bankiva (GB), G. g. spadiceus (GB), G. g. gallus (GB), dan sekuen ayam lokal
Laos (GB) merupakan ayam-ayam yang berbeda spesies, oleh karena itu
diperlukan penelitian lanjutan dengan menggunakan sekuen komplit COI.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Jumlah basa nukleotida daerah COI pada setiap individu adalah sama
kecuali ayam petelur strain Lohman brown, ayam serama, leher gundul 4, dan
ayam pedaging strain Cobb 3. Daerah yang diteliti sepanjang 653 pb tidak bisa
digunakan sebagai DNA barcode dikarenakan parsial 653 pb merupakan daerah
conserved.
Saran
Penelitian lanjutan diperlukan untuk menganalisis sekuen komplit COI
sepanjang 1 550 pb. Dibutuhkan lebih banyak sampel yang berasal dari wilayah
geografi yang berbeda di Indonesia.
DAFTAR PUSTAKA
Dawkin R. 2000. Mekanisme Evolusi. Ed ke-5. Lestari R, Adil EIM, Anita N,
Andri, Wibowo WF, Manalu W, penerjemah. Jakarta (ID): Erlangga.
Terjemahan dari: Mechanism of Evolution.
Gao YS, Yun-Jie T, Xiu-Jun T, Jun-Xiang L, Xiao-Yan Z. 2011. Studies on the
DNA barcoding of two newly discovered chicken by mtDNA COI gene. J
Ani Vet Ad. 10 (13): 1711-1713.
Gen Bank. 2005. Gallus gallus mitochondrial DNA. Ncbi [Internet]. [Diunduh
2013 Maret 18]. Tersedia pada: http://www.Ncbi. nlm.nih.gov.
Hajibabaei M, Janzen DH, Burns JM, Hallwachs W, Hebert PDN. 2006. DNA
barcodes distinguish species of tropical Lepidoptera. Proc Natl Acd Sci.
103: 968-971.
Li W, Graur D. 1991. Fundamental of Molecular Evolution. Sunderland (GB):
Sinauer Associates.
Nataamijaya AG. 2000. The native of chicken of Indonesian. Bul. Plasma
Nutfah. 6:1-6.
Muladno. 2010. Teknologi Rekayasa Genetika. Ed ke-2. Bogor (ID): IPB Pr.
Nugroho C. 2011. Variasi gen Cytochrome Oxidase Subunit I (COI) DNA
mitokondria pada lebah Apis cerana [skripsi]. Bogor (ID): Institut
Pertanian Bogor.
14
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: a Loaboratory
Manual. USA (US): CSH Laboratory Pr.
Sulandari S, Zein MSA, Sartika T. 2008. Analysis ofgenetic relationship amongs
Indonesian native chicken breeds based on 355 D-loop sequence. JITV
13(4): 294-306.
Suriana, Solihin DD, Noor R, Thohari AM. 2012. The characteristics of
Cytochrome Oxidase gene subunit I in wild silkmoth Cricula trifenestrata
helfer and its evaluation for species marker. Med Pet. 35 (2): 102-110.
Weissensteiner T. 2004. Optimizing PCR with the Aid of Experimental Design.
2nd ed. London (GB): CRC Pr.
Williams JL. 2005. The use of marker-assisted selection in animal breeding and
biotechnology. Rev Sci Tech Int Epiz. 24 (1): 379-391.
Xiao JH, Xiao H, Huang DW. 2004. DNA barcoding: New approach of
biological taxonomy. Acta Zoological Sinica. 50 (1): 852-855.
Zein MSA, Sulandari S.
2009.
Investigasi asal usul ayam Indonesia
menggunakan sekuens hypervariable-1 d-loop DNA mitokondria. J Vet.
10 (1): 41-49.
15
Lampiran 1 Spesies dan rumpun ayam lokal yang digunakan dalam penelitian
Spesies
Sudah
teridentifkasi
Jumlah
Sampel
-
1
F
Arab Silver (AS)ab
Arab Golden
(AG)ab
Kampung (Kp)a
Kate (Kt)ab
Gaga (G)a
Serama (Sr)a
Walik (Wl)a
Bangkok (Bk)a
Pedaging strain
Cobb (Br)c
Petelur strain
Lohman brown
(Ly)c
Pelung (Pl)ab
2
D
3
D, D, E
3
3
3
2
3
3
D, D, D, F
D
F
F
F
E, E, D
3
E, E, D
1
E
3
D
Leher gundul (LG)
3
E, E, E, F
Nd
1
D
G. g. bankiva
G. g. domesticus
Belum
Teridentifikasi
Rumpun
Nama Latin
-
Asal
Sampel
Keterangan : a Nataamijaya (2000), b Sulandari et al. (2008), c ras komersial; D=Jawa Barat,
E=Jawa Timur, F=Sumatera
.
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Bandar Lampung pada tanggal 1 Agustus 1991 dari
pasangan Bapak Jupriyadi dan Ibu Andiana. Penulis merupakan anak kedua dari
tiga bersaudara. Tahun 2009 penulis lulus dari SMA Al-Kautsar Lampung dan
pada tahun yang sama penulis diterima di Institut Pertanian Bogor (IPB) melalui
jalur Ujian Talenta Mandiri IPB (UTMI) dan diterima di Departemen Ilmu
Produksi dan Teknologi Peternakan.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis aktif di Himpunan Mahasiswa
Produksi Ternak (Himaproter) periode 2010/2011. Penulis juga diberi
kepercayaan untuk menjadi asisten praktikum mata kuliah Teknik Pengolahan
Daging pada tahun 2012-2012 dan asisten praktikum mata kuliah Metodologi
Penelitian dan Rancangan Percobaan pada tahun 2013. Selain itu penulis juga
pernah lolos dalam PKM Pengabdian yang didanai dikti pada tahun 2011.
OXIDASE SUBUNIT I (COI) DNA MITOKONDRIA
PADA AYAM LOKAL INDONESIA
ROASLEIN PUTRI
DEPARTEMEN ILMU PRODUKSI DAN TEKNOLOGI PETERNAKAN
FAKULTAS PETERNAKAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Identifikasi Keragaman
Gen Cytochrome Oxidase Subunit I (COI) DNA Mitokondria pada Ayam Lokal
Indonesia adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan
belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun.
Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun
tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan
dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Mei 2013
Roaslein Putri
NIM D14090092
ABSTRAK
ROASLEIN PUTRI. Identifikasi Keragaman Gen Cytochrome Oxidase Subunit I
(COI) DNA Mitokondria pada Ayam Lokal Indonesia. Dibimbing oleh CECE
SUMANTRI dan MARIA ULFAH.
Penentuan rumpun ayam lokal merupakan hal yang sangat penting untuk
pengesahan ayam lokal di Indonesia. Diperlukan penelitian lebih lanjut untuk
menentukan perbedaan dari rumpun ayam lokal Indonesia. Penelitian ini
menggunakan gen COI DNA mitokondria sebagai DNA barcoding untuk
menentukan taksonomi ayam lokal Indonesia. DNA hasil ekstraksi dilanjutkan
pada proses amplifikasi dan sekuens DNA pada gen COI. Hasil dari sekuensing
dianalisis menggunakan MEGA5.
Setelah diurutkan didapatkan sekuens
sepanjang 653 pb dan didapatkan 5 kelompok. Kelompok 1 yaitu bangkok, walik,
arab golden, arab silver, hutan merah, kampung, pelung, gaga, kate, ayam
pedaging strain Cobb 1 dan 2. Kelompok 2 yaitu ayam petelur strain Lohman
brown. Kelompk 3 yaitu ayam pedaging strain Cobb, kelompok 4 ayam leher
gundul 4 dan kelompok 5 ayam serama. Hasil analisis menunjukan bahwa pada
parsial 653 pb gen COI merupakan daerah yang conserved sehingga tidak dapat
membedakan antar ayam lokal.
Diperlukan penelitian lanjutan untuk
menganalisis sekuen komplit COI (1 550 pb).
Kata kunci: ayam lokal, Cytochrome Oxidase I (COI), DNA barcoding
ABSTRACT
ROASLEIN PUTRI. Variation Identification of Cytochrome Oxidase Subunit I
(COI) Gene of mtDNA in Indonesian Local Chickens. Supervised by CECE
SUMANTRI and MARIA ULFAH.
Characterization of local chicken breed is very important for determination
of local chickens in Indonesia. Advance study is needed to determine the
differences of Indonesian local chicken breeds. This study used gene COI
mtDNA as a DNA barcoding to determine the taxonomy of local chickens in
Indonesia. DNA extraction and amplification process were followed with DNA
sequences of COI gene. The results of sequencing were analyzed using MEGA5.
The sequence alignments result sequence lenght of 653 bp and 5 separated group
of chickens, namely group 1 (bangkok, walik, arab golden, arab silver, hutan
merah, kampung, pelung, gaga, kate, and broiler Cobb 1 and 2), group 2 (Lohman
brown), group 3 (broiler Cobb), group 4 (leher gundul chicken 4), and group 5
(serama chicken). The study shows that the 653 bp partial conserved can not be
used as a DNA barcode in local chickens. Advance study is needed to analyze the
complete sequence of COI (1 550 bp).
Keywords: Cytochrome Oxidase I (COI), DNA barcoding, local chicken
IDENTIFIKASI KERAGAMAN GEN CYTOCHROME
OXIDASE SUBUNIT I (COI) DNA MITOKONDRIA
PADA AYAM LOKAL INDONESIA
ROASLEIN PUTRI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Peternakan
pada
Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan
DEPARTEMEN ILMU PRODUKSI DAN TEKNOLOGI PETERNAKAN
FAKULTAS PETERNAKAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
Judul Skripsi : Identifikasi Keragaman Gen Cytochrome Oxidase Subunit I (COI)
DNA Mitokondria pada Ayam Lokal Indonesia
Nama
: Roaslein Putri
NIM
: D14090092
Disetujui oleh
Prof Dr Ir Cece Sumantri, MAgrSc
Pembimbing I
Maria Ulfah, SPt, MScAgr
Pembimbing II
Diketahui oleh
Prof Dr Ir Cece Sumantri, MAgrSc
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karuniaNya sehingga karya tulis ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam
penelitian yang dilaksanakan pada bulan November 2012 sampai Maret 2013 ini
adalah ayam lokal Indonesia dengan judul Identifikasi Keragaman Gen
Cytochrome Oxidase Subunit I (COI) DNA Mitokondria pada Ayam Lokal
Indonesia. Penelitian ini didanai oleh Ibu Maria Ulfah SPt, MScAgr.
Terimakasih penulis sampaikan kepada Bapak Prof Dr Ir Cece Sumantri,
MAgrSc dan Ibu Maria Ulfah SPt, MScAgr selaku pembimbing skripsi. Penulis
juga mengucapkan terimakasih kepada Bapak Dr Jakaria SPt, Msi dan Bapak Dr
Iwan Prihantoro SPt, MSi selaku dosen penguji, juga Bapak M Sriduresta SPt,
MSi atas semua masukkan yang telah diberikan untuk skripsi ini. Di samping itu
penulis juga menyampaikan terimakasih kepada Ibu Yuni Cahya Endrawati, SPt,
MSi selaku dosen pembimbing akademik. Ungkapan terimakasih juga penulis
sampaikan kepada kedua orang tua, Bapak Jupriyadi dan Ibu Andiana, Dian, Rafli,
Fathan, serta Abdul Maruf beserta keluarga besar atas doa dan kasih sayangnya.
Tak lupa terimakasih kepada Sdr Eryk, Sdr Ferdy, dan teman-teman tim genetika
molekuler ayam (Tasya, Lusiana, dan Ayu) yang telah membantu penulis
melakukan penelitian. Penulis juga mengucapkan terimakasih kepada sahabatsahabat penulis Alit dan Rany serta seluruh keluarga besar IPTP 46 atas semua
dukungannya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Mei 2013
Roaslein Putri
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
PENDAHULUAN
1
Latar Belakang
Tujuan Penelitian
Ruang Lingkup Penelitian
METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Bahan
Alat
Prosedur
HASIL DAN PEMBAHASAN
Amplifikasi Gen Cytochrome Oxidase Subunit I (COI)
Keragaman Gen Cytochrome Oxidase Subunit I (COI)
1
1
2
2
2
2
2
3
4
4
5
SIMPULAN DAN SARAN
13
DAFTAR PUSTAKA
13
LAMPIRAN
15
DAFTAR TABEL
1 Rataan komposisi basa nukleotida setelah disejajarkan dengan sekuen
dari GenBank
2 Situs-situs delesi dan insersi basa-basa nukleotida COI
3 Jarak genetik berdasarkan metode pairwise distance daerah COI setiap
individu ayam
6
7
9
DAFTAR GAMBAR
1 Produk PCR sepanjang 651 pb
2 Visualisasi gen COI ayam lokal Indonesia di agarose 1.5% sebesar 651
pb
3 Konstruksi pohon filogeni antara individu ayam berdasarkan metode
UPGMA
2
4
12
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Indonesia sangat kaya akan keanekaragaman genetik ternak, termasuk
keanekaragaman genetik ayam lokal. Terdapat 31 rumpun ayam lokal Indonesia
yang tersebar diberbagai daerah di Indonesia berdasarkan ciri fenotipe
(Nataamijaya 2000), tetapi diperkirakan jumlahnya dapat lebih dari itu.
Disamping itu penamaan ayam lokal Indonesia masih beragam (dapat berbeda di
setiap daerah), sehingga diperlukan kajian genetik untuk menentukan rumpun
ayam lokal Indonesia.
Penentuan rumpun ayam lokal merupakan hal yang sangat penting untuk
pengesahan ayam lokal di Indonesia. Masih diperlukan kajian lebih lanjut
terhadap ayam-ayam lokal Indonesia terutama pada ayam-ayam yang belum
teridentifikasi rumpunnya berdasarkan kajian genetik.
Spesies-spesies yang belum teridentifikasi dapat diidentifikasi
menggunakan teknologi DNA barcoding dengan melihat keragaman haplotipe
dari DNA mitokondria. Situs COI pada DNA mitokondria sering digunakan
dalam melihat keragaman haplotipe melalui DNA barcode dikarenakan banyak
memiliki kelebihan antara lain konservasi keturunan, banyak memiliki variasi
sekuens serta dapat teramplifikasi dengan primer yang universal (Xiao et al.
2004).
Situs COI sudah digunakan dalam banyak penelitian untuk
mengklasifikasikan banyak hewan (Hajibabaei et al. 2006).
Penelitian
sebelumnya yang dilakukan oleh Gao et al. (2011), bahwa barcoding dengan COI
dapat diaplikasikan pada ayam, sehingga penelitian ini menggunakan COI untuk
mengidentifikasi ayam-ayam lokal Indonesia yang belum dilakukan dengan COI
pada ayam rumpun ayam lokal Indonesia.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi keragaman gen COI DNA
mitokondria pada ayam lokal Indonesia yang belum jelas rumpunnya. Selain itu
juga bertujuan untuk menggunakan teknik DNA barcoding sebagai alternatif
dalam mengidentifikasi keanekaragaman ayam lokal Indonesia.
Ruang Lingkup Penelitian
Ruang lingkup penelitian ini adalah menerapkan teknologi DNA barcoding
untuk mengidentifikasi rumpun ayam. Teknologi DNA barcoding diaplikasikan
melalui gen COI DNA mitokondria. Penelitian ini dibatasi pada subjek ayamayam lokal Indonesia.
2
METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan dari November 2012 sampai Maret 2013.
Penelitian ini dilakukan di Laboratotium Genetika Molekuler Ternak, Fakultas
Peternakan, Institut Pertanian Bogor.
Bahan
Bahan-bahan yang digunakan untuk adalah DW, 1x STE, Sodium Dodesil
Sulfat (SDS) 10%, phenol, Proteinase K (5mg/ml), Chloroform Isoamil Alkohol
(CIAA), NaCl (5M), EtOH 96%, TE 80%, sampel DNA hasil ekstraksi, 10 x
buffer, MgCl2, pasangan primer forward dan revers, enzim Taq polymerase,
dNTPs, BSA, serbuk agarose 0.45 gram, larutan 0.5 x Tris-Borat EDTA (TBE),
EtBr, produk PCR, loading dye, dan marker 100 pb. Primer yang digunakan pada
penelitian ini berdasarkan Gao et al. (2011) adalah forward: 5’
GCACAGGATGGACAGTTTAC-3’ (371-390) dan reverse: 5’ ATAGCATAG
GGGGGTCTCAT-3’ (1002-1021). Sekuens gen COI diperoleh dari GenBank
dengan nomor akses AP003323.
forward
GCACAGGATGGACAGTTTACCCCCCTTTAGCCGGCAACCTAGCCCACGCTGGCGCAT
CAGTAGACCTAGCCATCTTTTCATTACACTTAGCAGGTGTTTCCTCCATTCTAGGAGCC
ATCAACTTTATCACTACCATCATCAACATAAAACCCCCCGCACTGTCACAATACCAAA
CACCCCTATTCGTATGATCCGTCCTCATTACTGCCATCCTACTACTCCTCTCCTTACCC
GTCCTAGCAGCTGGGATTACCATACTACTTACCGACCGCAACCTTAACACCACATTCT
TCGACCCAGCTGGAGGAGGAGACCCAATCCTATACCAACACCTATTCTGATTCTTCGG
TCACCCCGAAGTTTACATCCTCATCCTCCCAGGTTTCGGAATAATTTCCCACGTAGTAG
CATACTATGCAGGAAAAAAAGAACCATTCGGATACATAGGAATAGTCTGAGCCATAC
TGTCAATCGGATTCCTTGGCTTCATTGTATGAGCCCACCATATATTCACAGTCGGAAT
GGACGTAGACACCCGAGCCTACTTTACATCAGCCACAATAATCATCGCCATCCCAACT
GGTATTAAAGTCTTCAGCTGACTAGCAACCCTGCACGGAGGAACAATTAAATGAGAC
CCCCCTATGCTAT
Reverse
Gambar 1 Produk PCR sepanjang 651 pb
Alat
Alat-alat yang digunakan untuk ekstraksi adalah tabung 1.5 ml, satu set
micropippet beserta tipnya, vortex, sentrifuge, freezer, dan inkubator. Alat-alat
yang digunakan untuk amplifikasi dan elektroforesis adalah mesin PCR
thermocycler, vortex, micro sentrifuge, tabung PCR, refrigerator, satu set tray
pencetak gel, timbangan digita, microwave, stirrer, power supply 100 volt, dan
UV Transilluminator.
3
Prosedur
Ekstraksi DNA Total
Ekstraksi DNA dilakukan dengan menggunakan acuan Sambrook et al.
(1989) yang dimodifikasi. Darah diambil sebanyak 100 µl dan ditambahkan
dengan 1 000 µl DW, kemudian divortex dan disentrifugasi dengan kecepatan
8 000 rpm selama lima menit. Endapan yang didapatkan kemudian ditambahkan
dengan 1 x STE sebanyak 300 µl, 40 µl 10% SDS, dan 10 µl proteinase K 5mg/ml
lalu diinkubasi sambil digoyang secara perlahan dengan suhu 55 oC selama dua
jam. Setelah itu ditambahkan 400 µl phenol, 400 µl CIAA, dan 40 µl NaCl 5 M,
kemudian digoyangkan secara perlahan selama satu jam dalam suhu ruang. Lalu
disentrifugasi dengan kecepatan 12 000 rpm selama lima menit.
Supernatan yang terbentuk diambil sebanyak 400 µl dan dipindahkan ke
tabung baru kemudian ditambahkan 8 000 µl EtOH absolute dan 40 µl NaCl 5 M
lalu dibekukan selama 12 jam di dalam frezeer. Sampel kemudian disentrifugasi
dengan kecepatan 12 000 rpm selama lima menit. Endapan yang didapatkan
ditiriskan dan ditambahkan dengan 100 µl TE 80%.
Amplifikasi DNA
Sampel DNA yang merupakan hasil ekstraksi diambil sebanyak 0.5 µl dan
dimasukkan ke dalam tabung Polymerase Chain Reaction (PCR), kemudian
ditambahkan larutan premix 29.5 µl. Premix dibuat dengan campuran 2 µl primer,
1 µl dNTPs, 2.5 µl MgCl2, 3.5 µl10 x buffer, 0.1 µl enzim Taq polymerase
(Fermentas), BSA 1 µl, dan 24.4 µl DW. Campuran sampel DNA dan premix
tersebut diinkubasi menggunakan mesin PCR thermocycler.
Proses amplifikasi DNA diawali dengan predenaturasi 95 oC selama lima
menit yang kemudian tahapan kedua yang terdiri dari 30 siklus, masing-masing
siklus terdiri dari proses denaturasi 95 oC selama 45 detik, annealing
58 oC
selama 1 menit dan ekstensi DNA pada suhu 72 oC selama 1 menit. Tahapan
terakhir adalah pemanjangan primer pada suhu 72 oC selama 5 menit. Hasil
amplifikasi DNA tersebut dielektroforesis.
Elektroforesis Produk PCR
Produk PCR dipisahkan dengan agarose gel 1.5%. Gel dibuat dengan
mencampurkan serbuk agarose 0.45 gram dan 0.5 x TBE 30 ml kemudian
dipanaskan di microwave dengan suhu medium high selama 5 menit. Setelah itu
dihilangkan uap panasnya dengan menggunakan stirrer dan ditambahkan EtBr 2.5
µl. Gel dicetak di tray pencetak lalu ditunggu sampai mengeras. Produk PCR
sebanyak 5 µl dilarutkan dalam loading dye 1µl.
Elektroforesis dilakukan selama 35-45 menit pada tegangan konstan 100 V.
Setelah selesai, pita-pita tampak dengan bantuan sinar ultra violet pada UV
Transilluminator. Sampel yang sudah teramplifikasi selanjutnya disekuensing (1st
Base).
Analisis Data
Hasil sekuensing diolah menggunakan BioEdit. Dilakukan perunutan dan
pensejajaran hasil sekuen dengan runutan baku dari GenBank dengan
menggunakan program Clustal W yang terdapat pada program MEGA5 dengan
acuan utama runutan basa nukleotida Gallus gallus bankiva (kode akses
4
AP003323), Gallus gallus spadiceus (kode akses AP003321), Gallus gallus gallus
(kode akses AP003322), dan sekuen ayam lokal Laos (kode akses AP003319).
Jarak rata-rata p-distance dari basa nukleotida daerah COI dihitung dengan
pairwise distance. Rekontruksi pohon filogeni dibuat dengan menggunakan
metode UPGMA berdasarkan runutan basa nukleotida.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Amplifikasi Gen Cytochrome Oxidase Subunit I (COI)
DNA hasil ekstraksi diamplifikasi menggunakan proses Polymerase Chain
Reaction (PCR). Amplifikasi gen COI pada ayam lokal Indonesia dilakukan
dengan menggunakan mesin PCR Applied Biosystem.
Gambar 2 Visualisasi gen COI ayam lokal indonesia di agarose 1.5%.
Keterangan: M = marker. Br-G: Kode sampel (Lampiran 1)
Sebanyak 26 sampel dapat diamplifikasi (Gambar 1) oleh primer forward:
5’GCACAGGATGGACAGTTTAC-3’ dan reverse: 5’ATAGCATAGGGGGGT
CTCAT-3’. Proses ini dilakukan dengan menggunakan enzim polimerase dan
primer. Primer merupakan oligonukleotida spesifik pada DNA template yang
berukuran pendek (berkisar antara 18-24 pb). Primer akan menempel pada DNA
cetakan di tempat spesifik. DNA baru dicetak dengan menggunakan bantuan dari
enzim polimerase.
Hasil PCR dapat langsung divisualisasikan dengan
elektoforesis atau dapat digunakan untuk analisis lebih lanjut (Williams 2005).
Amplifikasi gen pada sampel darah ayam optimal pada suhu 58 oC selama 1 menit
dan diperoleh produk PCR sepanjang 651 pb. Suhu optimal sangat penting untuk
diketahui karena pada proses ini primer akan menempel pada target spesifik DNA.
Keberhasilan proses amplifikasi juga dapat dikarenakan beberapa faktor
diantaranya konsentrasi DNA. Konsentrasi yang baik setara 50 µg/ml (Muladno
2010). Konsentrasi yang digunakan pada penelitian ini berkisar antara 370 –
5
2 800 µg/ml. Selain itu suhu penempelan dan konsentrasi MgCl2 juga
berpengaruh terhadap keberhasilan proses amplifikasi (Weissensteiner 2004).
Keragaman Gen Cytochrome Oxidase Subunit I (COI)
Komposisi Basa Nukleotida
Hasil sekuensing pada produk PCR dari dua arah yaitu primer forward dan
primer reverse pada penelitian ini didapatkan hasil sekuen sepanjang 653 pb.
Sekuen dari pustaka yang digunakan adalah sekuen G. g. bankiva, G. g.
spadiceus, G. g. gallus, dan sekuen ayam lokal Laos yang terdiri dari sekuen COI
sepanjang 1 550 pb.
Setelah dilakukan runutan DNA sampel dengan Clustal W dengan acuan
utama runutan basa nukleotida dari GenBank mendapatkan hasil rataan basa
nukleotida pada setiap rumpun ayam hampir semuanya sama. Perbedaan hanya
terjadi pada ayam serama, ayam petelur strain Lohman brown, leher gundul, dan
ayam pedaging strain Cobb (Tabel 1).
Hasil pensejajaran basa nukleotida yang telah dilakukan menunjukkan
bahwa setiap individu dari ayam yang diteliti memiliki jumlah basa nukleotida
yang sama, kecuali ayam serama, ayam petelur strain Lohman brown, leher
gundul, dan ayam pedaging strain Cobb. Rataan nukleotida A+T pada semua
rumpun ayam yang diteliti lebih tinggi dibandingkan dengan nukleotida C+G.
Hal ini dikarenakan sekuen yang digunakan masih terlalu pendek sehingga tidak
bisa mewakili. Seharusnya nukleotida C+G lebih tinggi dibandingkan dengan
A+T hal ini dijelaskan Muladno (2010) bahwa basa A selalu berikatan dengan
basa T dengan dua ikatan hidrogen, sedangkan basa C selalu berikatan dengan
basa G dengan tiga ikatan hidrogen sehingga basa C+G lebih stabil dibandingkan
dengan A+T. Perbedaan jumlah basa nukleotida pada ayam serama, ayam petelur
strain Lohman brown, leher gundul, dan ayam pedaging strain Cobb dikarenakan
delesi dan insersi pada ayam-ayam tersebut (Tabel 2).
6
Tabel 1 Rataan komposisi basa nukleotida setelah disejajarkan dengan sekuen
dari GenBank (panjang 653 pb)
Sampel
G. g. bankiva (GB)
G. g. gallus (GB)
G. g. spadiceus (GB)
Ayam lokal Laos (GB)
Hutan merah (G. g. bankiva)
Kampung
Arab golden
Arab silver
Walik
Leher gundul*
Bangkok
Serama
Pelung
Gaga
Kate
Ayam petelur strain Lohhman
brown
Ayam pedaging strain Cobb
Nd*
n
%
1
1
1
1
1
3
3
1
2
3
3
1
1
1
1
T(U)
24.6
24.6
24.6
24.6
24.6
24.6
24.6
24.6
24.6
24.6
24.6
24.8
24.6
24.6
24.6
C
31.7
31.7
31.5
31.5
31.5
31.5
31.5
31.5
31.5
32.0
31.5
31.5
31.5
31.5
31.5
A
27.8
27.8
27.8
27.8
27.8
27.8
27.8
27.8
27.8
27.8
27.8
27.8
27.8
27.8
27.8
G
15.8
15.8
15.8
15.8
15.8
15.8
15.8
15.8
15.8
15.8
15.8
15.8
15.8
15.8
15.8
A+T
52.5
52.5
52.5
52.5
52.5
52.5
52.5
52.5
52.5
52.0
52.5
53.0
52.5
52.5
52.5
C+G
47.5
47.5
47.5
47.5
47.5
47.5
47.5
47.5
47.5
48.0
47.5
47.0
47.5
47.5
47.5
1
3
2
24.4
24.6
24.6
31.8 27.8 16.0
32.0 27.8 15.8
31.5 27.8 15.8
52.0
52.0
52.5
48.0
48.0
47.5
Keterangan : GB = GenBank; * = belum teridentifikasi; n = jumlah sampel
7
Tabel 2 Situs-situs delesi dan insersi basa-basa nukleotida COI
Sampel
G. g. bankiva (GB)
G. g. gallus (GB)
G. g. spadiceus (GB)
Ayam lokal Laos (GB)
Hutan merah (G. g. bankiva)
Kampung 1
Kampung 2
Kampung 3
Kampung 4
Arab golden 1
Arab golden 2
Arab golden 3
Arab silver
Walik 1
Leher gundul 1*
Leher gundul 2*
Leher gundul 3*
Leher gundul 4*
Bangkok 1
Bangkok 2
Bangkok 3
Serama
Pelung
Gaga
Kate
Ayam petelur strain Lohman
brown
Ayam pedaging strain Cobb 1
Ayam pedaging strain Cobb 2
Ayam pedaging strain Cobb 3
Nd*
397
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
C
T
T
T
T
T
T
T
Urutan Basa Nukleotida
403
405 411 413
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
-
423
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
567
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
T
C
C
C
T
G
-
C
-
G
C
T
T
T
T
G
G
C
G
G
-
-
T
-
T
T
T
T
C
C
C
C
Keterangan : GB = GenBank; * = belum teridentifikasi
Basa nukleotida yang berbeda pada ayam leher gundul pada urutan basa ke
397 yaitu basa T berubah menjadi basa C, sedangkan pada ayam petelur strain
Lohman brown terdapat insersi basa C pada urutan basa ke 411 dan pada urutan
ke 423 basa T berubah menjadi basa G. Ayam pedaging strain Cobb pada urutan
basa ke 403 basa G berubah menjadi basa C, pada urutan basa ke 405 terdapat
insersi basa G dan pada basa ke 413 terdapat insersi basa T. Ayam serama pada
urutan basa ke 567 basa C berubah menjadi basa T. Hasil tersebut dapat
8
menunjukkan bahwa ayam petelur strain Lohman brown dan ayam serama
berbeda dengan ayam yang lainnya, tetapi belum bisa dijadikan penanda genetik
karena pada sekuen yang diteliti masih merupakan daerah yang memiliki
kesamaan, selain itu juga sampel yang digunakan hanya satu sehingga belum
dapat dijadikan penanda genetik. Ayam leher gundul dan ayam pedaging strain
Cobb belum dapat dikatakan berbeda karena masih ada sampel-sampel lain dari
ayam leher gundul dan ayam pedaging strain Cobb yang berbeda.
Jarak Genetik Ayam Lokal Indonesia Gen COI
Pengukuran kekerabatan pada setiap individu ayam dengan menggunakan
analisis Pairwise Distance Calculation menghasilkan jarak genetik terendah
adalah 0.000 dan tertinggi adalah 0.003 (Tabel 3). Individu-individu yang
memiliki nilai jarak genetik semakin rendah, maka individu-individu tersebut
memiliki hubungan kekerabatan yang semakin rendah. Jika jarak genetiknya
tinggi maka memiliki hubungan kekerabatan yang jauh. Individu ayam dalam
penelitian ini kecuali ayam serama, ayam petelur strain Lohman brown, ayam
leher gundul 4, dan ayam pedaging strain Cobb 3 memiliki jarak genetik yang
sama (jaraknya 0.000). Hal ini dikarenakan daerah 653 pb merupakan daerah
conserved yaitu daerah yang memiliki basa nukleotida yang sama. Ayam yang
belum teridentifikasi tidak dapat diidentifikasi karena kesamaan basa pada parsial
653 pb, sehingga antar rumpun ayam tidak spesifik dan tidak dapat dijadikan
penanda.
9
Tabel 3 Jarak genetik berdasarkan metode pairwise distance daerah COI setiap individu ayam
No
Sampel
1
2
3
4
5
6
7
8
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
Bangkok_1
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.002
16
Bangkok_2
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.002
0.000
17
Bangkok_3
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.002
0.000
0.000
18
Pelung
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.002
0.000
0.000
0.000
19
Gaga
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.002
0.000
0.000
0.000
0.000
20
Kate
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.002
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
21
Leher_gundul_1*
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.002
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
22
Leher_gundul_2*
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.002
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
23
Leher_gundul_3*
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.002
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
24
Leher_gundul_4*
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.003
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
25
Ayam_pedaging_strain_Cobb_1
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.002
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
26
Ayam_pedaging_strain_Cobb_2
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.002
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
27
Ayam_pedaging_strain_Cobb_3
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.003
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
28
Ayam_petelur_strain_Lohman_brown
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.003
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
29
Walik
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.002
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
30
Nd*
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.002
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
1
G._g._bankiva_(GB)
2
G._g._gallus_(GB)
0.000
3
G._g._spadiceus_(GB)
0.000
0.000
4
Ayam_lokal_Laos_(GB)
0.000
0.000
0.000
5
Hutan_merah_(G._g._bankiva)
0.000
0.000
0.000
0.000
6
Kampung_1
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
7
Kampung_2
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
8
9
Kampung_3
Kampung_4
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
10
Arab_golden_1
0.000
0.000
0.000
0.000
11
Arab_golden_2
0.000
0.000
0.000
12
Arab_golden_3
0.000
0.000
13
Arab_silver
0.000
14
Serama
15
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
10
Lanjutan
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.002
0.002
0.002
0.002
0.000
0.000
0.000
0.000
0.002
0.000
0.000
0.000
0.000
0.002
0.000
0.002
0.002
0.002
0.002
0.003
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.002
0.003
0.002
0.002
0.003
0.000
0.000
0.000
0.000
0.002
0.000
0.000
0.002
0.002
0.000
0.000
0.000
0.000
0.002
0.000
0.000
0.002
0.002
Keterangan : GB = GenBank; * = belum teridentifikasi
0.000
11
Analisis Filogenetik
Panjang sekuen gen COI yang dianalisis adalah 653 pb dari 1 550 pb sekuen
gen COI. Pohon filogenetik didapatkan dengan menggunakan metoda UPGMA.
Pohon filogenetik adalah pohon yang menunjukkan hubungan kekerabatan antara
berbagai spesies yang diyakini memiliki nenek moyang yang sama.
Pohon filogenetik hasil analisis ditampilkan pada Gambar 3. Setelah
dilakukan analisis pohon filogenetik, maka didapatkan 5 kelompok. Kelompok 1
yaitu ayam ayam yang belum teridentifikasi (Nd dan leher gundul 1, 2, dan 3).
bangkok, walik, arab golden, arab silver, hutan merah, kampung, pelung, gaga,
kate, ayam pedaging strain Cobb 1 dan 2, G. g. bankiva, G. g. spadiceus, G. g.
gallus, dan sekuen ayam lokal Laos. Kelompok 2 yaitu ayam petelur strain
Lohman brown. Kelompk 3 yaitu ayam pedaging strain Cobb, kelompok 4 ayam
leher gundul 4 dan kelompok 5 ayam serama. Pohon filogenetik didapatkan
dengan mengidentifikasi urutan basa nukleotida yang homolog pada DNA
mitokondria (Dawkin 2000). Analisis menggunakan pohon filogenetik bertujuan
untuk merekontruksi hubungan kekerabatan yang tepat antara organisme (Li dan
Graur 1991). Pohon filogentik tersebut terdiri dari sejumlah nodus dan cabang.
Nodus-nodus tersebut mewakili unit-unit taksonomi, sedangkan cabangcabangnya mewakili hubungan antara keturunan dengan leluhurnya. Panjang
cabang menggambarkan jumlah perubahan evolusioner yang terjadi antara dua
nodus (Zein dan Sulandari 2009).
Terdapat kesamaan basa pada setiap individu ayam yang diteliti kecuali
ayam serama, ayam petelur strain Lohman brown, satu ayam leher gundul, dan
satu ayam pedaging strain Cobb. Hal ini dikarenakan sekuen gen COI yang
dianalisis hanya 653 pb, sedangkan jumlah keseluruhan sekuen gen COI adalah
1 550 pb sehingga belum bisa mewakili keseluruhan gen COI. Selain itu juga
dikarenakan ayam-ayam yang diteliti berasal dari wilayah geografi yang
berdekatan (Lampiran 1).
Ayam-ayam yang diteliti sudah mengalami
percampuran antara banyak ayam, sehingga pada ayam-ayam yang diteliti banyak
yang memiliki basa nukleotida yang sama. Ayam serama memiliki perbedaan
dengan ayam yang lainnya karena ayam serama berasal dari Malaysia hal ini
membuktikan bahwa ayam serama berbeda dengan ayam lokal Indonesia yang
lainnya. Salah satu ayam leher gundul (4) yang diteliti juga berbeda dengan ayam
yang lainnya. Ayam leher gundul ini berasal dari kelompok kerja pelestarian
unggas lokal di Jawa Timur dan diduga kegiatan pemurnian ayam leher gundul ini
(tanpa adanya perkawinan dengan ayam lokal lainnya), menjadi salah satu
penyebab ayam leher gundul tersebut berbeda dengan ayam lokal yang lainnya.
Penelitian yang dilakukan oleh Suriana et al (2012) tentang ulat sutra liar
Cricula trifenestrata menggunakan gen COI menunjukkan bahwa 595 runutan
nukleotida yang didapatkan pada ujung 5’ gen COI C. trifenestrata bersifat
conserved pada level spesies, tetapi beragam pada level family. Penelitian tentang
COI juga dilakukan oleh Nugroho (2011) dengan objek penelitian lebah
menghasilkan 6 kelompok lebah. Perbedaan hasil penelitian sebelumnya dengan
penelitian ini diduga karena spesies dan primer yang digunakan berbeda.
Penelitian yang dilakukan menghasilkan bahwa ayam-ayam lokal mempunyai
urutan basa yang sama (kecuali ayam serama, ayam petelur strain Lohman brown,
leher gundul 4, dan ayam pedaging strain Cobb 3), sehingga antar spesies tidak
bisa dibedakan. Penelitian Zein dan Sulandari (2009) yang meneliti ayam lokal
12
Indonesia menggunakan sekuens hypervariable-1 d-loop DNA mitokondria
menghasilkan bahwa urutan basa setiap rumpun ayam berbeda.
Walik
Nd
Ayam pedaging strain Cobb 2
Ayam pedaging strain Cobb 1
Leher gundul 3
Leher gundul 2
Leher gundul 1
Kate
Gaga
Pelung
Bangkok 3
Bangkok 2
Bangkok 1
Arab silver
Arab golden 3
Arab golden 2
Arab golden 1
Kampung 4
Kampung 3
Kampung 2
Kampung 1
Hutan merah (G. g. bankiva)
Ayam lokal Laos (GB)
G. g. spadiceus (GB)
G. g. bankiva (GB)
G. g. gallus (GB)
Ayam petelur strain Lohman brown
Ayam pedaging strain Cobb 3
Leher gundul 4
Serama
0.0008
0.0006
0.0004
0.0002
0.0000
Gambar 3 Konstruksi pohon filogeni antara individu ayam berdasarkan metode
UPGMA
Keterangan :
GB: Sekuen Cytochrome Oxidase Subunit I yang diperoleh dari GenBank (2005)
Sekuen sepanjang 653 pb merupakan daerah conserved, artinya pada daerah
tersebut basa nukleotida pada setiap individu hampir sama, sehingga hasilnya
13
tidak bisa mewakili keseluruhan sekuen COI. Hal ini dapat dilihat pada sekuen
yang diambil dari GenBank, bahwa keempat data yang diambil dari GenBank
pada daerah tersebut (panjang 653 pb) urutan basa nukleotidanya sama, padahal G.
g. bankiva (GB), G. g. spadiceus (GB), G. g. gallus (GB), dan sekuen ayam lokal
Laos (GB) merupakan ayam-ayam yang berbeda spesies, oleh karena itu
diperlukan penelitian lanjutan dengan menggunakan sekuen komplit COI.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Jumlah basa nukleotida daerah COI pada setiap individu adalah sama
kecuali ayam petelur strain Lohman brown, ayam serama, leher gundul 4, dan
ayam pedaging strain Cobb 3. Daerah yang diteliti sepanjang 653 pb tidak bisa
digunakan sebagai DNA barcode dikarenakan parsial 653 pb merupakan daerah
conserved.
Saran
Penelitian lanjutan diperlukan untuk menganalisis sekuen komplit COI
sepanjang 1 550 pb. Dibutuhkan lebih banyak sampel yang berasal dari wilayah
geografi yang berbeda di Indonesia.
DAFTAR PUSTAKA
Dawkin R. 2000. Mekanisme Evolusi. Ed ke-5. Lestari R, Adil EIM, Anita N,
Andri, Wibowo WF, Manalu W, penerjemah. Jakarta (ID): Erlangga.
Terjemahan dari: Mechanism of Evolution.
Gao YS, Yun-Jie T, Xiu-Jun T, Jun-Xiang L, Xiao-Yan Z. 2011. Studies on the
DNA barcoding of two newly discovered chicken by mtDNA COI gene. J
Ani Vet Ad. 10 (13): 1711-1713.
Gen Bank. 2005. Gallus gallus mitochondrial DNA. Ncbi [Internet]. [Diunduh
2013 Maret 18]. Tersedia pada: http://www.Ncbi. nlm.nih.gov.
Hajibabaei M, Janzen DH, Burns JM, Hallwachs W, Hebert PDN. 2006. DNA
barcodes distinguish species of tropical Lepidoptera. Proc Natl Acd Sci.
103: 968-971.
Li W, Graur D. 1991. Fundamental of Molecular Evolution. Sunderland (GB):
Sinauer Associates.
Nataamijaya AG. 2000. The native of chicken of Indonesian. Bul. Plasma
Nutfah. 6:1-6.
Muladno. 2010. Teknologi Rekayasa Genetika. Ed ke-2. Bogor (ID): IPB Pr.
Nugroho C. 2011. Variasi gen Cytochrome Oxidase Subunit I (COI) DNA
mitokondria pada lebah Apis cerana [skripsi]. Bogor (ID): Institut
Pertanian Bogor.
14
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: a Loaboratory
Manual. USA (US): CSH Laboratory Pr.
Sulandari S, Zein MSA, Sartika T. 2008. Analysis ofgenetic relationship amongs
Indonesian native chicken breeds based on 355 D-loop sequence. JITV
13(4): 294-306.
Suriana, Solihin DD, Noor R, Thohari AM. 2012. The characteristics of
Cytochrome Oxidase gene subunit I in wild silkmoth Cricula trifenestrata
helfer and its evaluation for species marker. Med Pet. 35 (2): 102-110.
Weissensteiner T. 2004. Optimizing PCR with the Aid of Experimental Design.
2nd ed. London (GB): CRC Pr.
Williams JL. 2005. The use of marker-assisted selection in animal breeding and
biotechnology. Rev Sci Tech Int Epiz. 24 (1): 379-391.
Xiao JH, Xiao H, Huang DW. 2004. DNA barcoding: New approach of
biological taxonomy. Acta Zoological Sinica. 50 (1): 852-855.
Zein MSA, Sulandari S.
2009.
Investigasi asal usul ayam Indonesia
menggunakan sekuens hypervariable-1 d-loop DNA mitokondria. J Vet.
10 (1): 41-49.
15
Lampiran 1 Spesies dan rumpun ayam lokal yang digunakan dalam penelitian
Spesies
Sudah
teridentifkasi
Jumlah
Sampel
-
1
F
Arab Silver (AS)ab
Arab Golden
(AG)ab
Kampung (Kp)a
Kate (Kt)ab
Gaga (G)a
Serama (Sr)a
Walik (Wl)a
Bangkok (Bk)a
Pedaging strain
Cobb (Br)c
Petelur strain
Lohman brown
(Ly)c
Pelung (Pl)ab
2
D
3
D, D, E
3
3
3
2
3
3
D, D, D, F
D
F
F
F
E, E, D
3
E, E, D
1
E
3
D
Leher gundul (LG)
3
E, E, E, F
Nd
1
D
G. g. bankiva
G. g. domesticus
Belum
Teridentifikasi
Rumpun
Nama Latin
-
Asal
Sampel
Keterangan : a Nataamijaya (2000), b Sulandari et al. (2008), c ras komersial; D=Jawa Barat,
E=Jawa Timur, F=Sumatera
.
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Bandar Lampung pada tanggal 1 Agustus 1991 dari
pasangan Bapak Jupriyadi dan Ibu Andiana. Penulis merupakan anak kedua dari
tiga bersaudara. Tahun 2009 penulis lulus dari SMA Al-Kautsar Lampung dan
pada tahun yang sama penulis diterima di Institut Pertanian Bogor (IPB) melalui
jalur Ujian Talenta Mandiri IPB (UTMI) dan diterima di Departemen Ilmu
Produksi dan Teknologi Peternakan.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis aktif di Himpunan Mahasiswa
Produksi Ternak (Himaproter) periode 2010/2011. Penulis juga diberi
kepercayaan untuk menjadi asisten praktikum mata kuliah Teknik Pengolahan
Daging pada tahun 2012-2012 dan asisten praktikum mata kuliah Metodologi
Penelitian dan Rancangan Percobaan pada tahun 2013. Selain itu penulis juga
pernah lolos dalam PKM Pengabdian yang didanai dikti pada tahun 2011.