Karakteristik Gen Cytochrome Oxidase Subunit I (COI) pada Ulat Sutera Liar (Attacus atlas L.) asal Jawa Barat

KARAKTERISTIK GEN CYTOCHROME OXIDASE SUBUNIT I (COI)
PADA ULAT SUTERA LIAR (Attacus atlas L.) ASAL JAWA BARAT

DEWI MURNI PUSPITO SARI

DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKAN DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012

ABSTRAK
DEWI MURNI PUSPITO SARI. Karakteristik Gen Cytochrome Oxidase Subunit I (COI) pada
Ulat Sutera Liar (Attacus atlas L.) Asal Jawa Barat. Di bawah bimbingan DEDY DURYADI
SOLIHIN dan SURIANA.
Attacus atlas merupakan ulat sutera liar Indonesia yang tersebar luas, mulai dari Nangroe
Aceh Darusalam (NAD) hingga Papua. Berdasarkan basis data genetik di GenBank, belum ada
data lengkap genom spesies tersebut, terutama asal Indonesia. Penelitian ini bertujuan mengetahui
karakteristik gen COI A. atlas asal Provinsi Jawa Barat. DNA genomik diekstraksi dari otot larva
A. atlas asal Bogor dan Purwakarta. DNA total hasil ekstraksi dilanjutkan pada proses amplifikasi
dan sekuensing DNA pada gen COI. Gen COI A. atlas disejajarkan dengan gen COI spesies lain

untuk membandingkan sekuen nukleotida gen COI. Data sekuen gen COI spesies lain diperoleh
dari GenBank. Cricula trifenestrata, Antheraea pernyi, Bombyx mori, dan Bombyx mandarina
merupakan spesies yang termasuk dalam pensejajaran. Enam sampel berhasil diamplifikasi dan
menghasilkan produk amplifikasi sebesar 595 nt, yang kemudian dianalisis dengan software
MEGA 4.0. Penelitian ini telah mampu mengkarakterisasi gen COI A. atlas dan produk sepanjang
508 nt. Runutan nukleotida gen COI pada spesies A. atlas bersifat monomorfik. Nukleotida
tersebut bersifat lestari pada level spesies. Ada 31 situs nukleotida diagnostik yang merupakan
penciri bagi spesies A. atlas. Pengelompokkan terpisah jelas antara sesama anggota famili
Saturniidae (A. atlas, C. trifenestrata, dan A. pernyi) dengan anggota famili Bombycidae (B. mori
dan B. mandarina). Analisis hubungan kekerabatan pada A. atlas menunjukkan bahwa A. atlas
menempati nodus sendiri, sedangkan C. trifenestrata lebih dekat dengan A. pernyi.
Kata Kunci: Attacus atlas, COI, karakteristik

ABSTRACT
DEWI MURNI PUSPITO SARI. Characteristic of Cytochrome Oxidase Subunit I (COI) Gene in
Wild Silkworm (Attacus atlas. L) from West Java Province. Supervised by DEDY DURYADI
SOLIHIN and SURIANA.
Attacus atlas is a silkworm of Indonesia, distributing from Nangroe Aceh Darusalam
(NAD) to West Papua. Based on genetic databases from GenBank, there is no genome complete
data of this species, especially Indonesian origin. This study was aimed to characterize A. atlas

COI gene originated from West Java Province. Genomic DNA was extracted from the tissue of A.
atlas larvae from Bogor and Purwakarta. DNA extraction were then followed with DNA
amplification and sequencing of COI gene. A. atlas COI gene were aligned along with other
spesies COI gene to compare nucleotide sequences of COI gene. COI gene sequence data of the
others were acquired from GenBank. Cricula trifenestrata, Antheraea pernyi, Bombyx mori, and
Bombyx mandarina were among species included in the alignment. Six samples were amplified
and the amplification product was 595 nt, which was then analyzed with MEGA 4.0 software. This
study was able to characterize A. atlas COI gene and product was 508 nt. Nucleotide sequences of
the gene was monomorfic and conserved in the species level. There are 31 diagnostic nucleotide
sites characterizing A. atlas. Group separation was distinct between the member of Saturniidae
family (A. atlas, C. trifenestrata, and A. pernyi) with the member of Bombycidae family (B. mori
and B. mandarina). Phylogenetic analysis of A. atlas showed that A. atlas possesses separate
nodes, while the position of C. trifenestrata closes to A. pernyi.
Key words: Attacus atlas, COI, characteristic

KARAKTERISTIK GEN CYTOCHROME OXIDASE SUBUNIT I (COI)
PADA ULAT SUTERA LIAR (Attacus atlas L.) ASAL JAWA BARAT

DEWI MURNI PUSPITO SARI

Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Biologi

DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKAN DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012

Judul Skripsi : Karakteristik Gen Cytochrome Oxidase Subunit I (COI) pada
Ulat Sutera Liar (Attacus atlas L.) asal Jawa Barat
Nama
: Dewi Murni Puspito Sari
NIM
: G34070104

Disetujui,
Pembimbing I

Dr. Ir. Dedy Duryadi Solihin, DEA
NIP 195611021984031003

Pembimbing II

Dr. Suriana, M.Si
NIP 196805221992032001

Diketahui,
Ketua Departemen Biologi
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.Sc
NIP 196410021989031002

Tanggal Lulus:

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas segala rahmat dan berkatNya

sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah yang berjudul Karakteristik Gen Cytochrome
Oxidase Subunit 1 (COI) pada Ulat Sutera Liar (Attacus atlas L.) asal Jawa Barat. Penelitian
dilaksanakan mulai bulan Februari 2011 hingga Mei 2012 di Laboratorium Biologi Molekuler,
Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB) dan Laboratorium Terpadu
Departemen Biologi, Institut Pertanian Bogor (IPB).
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Bapak Dr. Ir. Dedy Duryadi Solihin, DEA dan
Ibu Dr. Suriana, M.Si selaku pembimbing atas segala dukungan, saran dan bimbingan selama
proses penelitian dan penyusunan skripsi. Terima kasih penulis sampaikan kepada Ibu N.A. Butet,
Bapak Heri, dan Ibu Harini N, atas segala bantuan dan doa, terima kasih kepada seluruh staf
Laboratorium Biologi Molekuler PPSHB IPB dan seluruh staf Departemen Biologi. Penulis
haturkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada kedua orang tua, Bapak dan Ibu, serta adik
Aprilia Sulistyowati atas segala doa, dukungan, dan kasih sayangnya selama ini. Salam hangat
penuh cinta penulis sampaikan kepada teman-teman Biologi 44 (khususnya temen seperjuangan:
Dini, Ratna, Lydia, Gita, Fery, Danis, Aryo), para sahabat (Anin, Tya, Tiara, Vero, Yosh, Icil, Ana,
Anggi, Lia, Wendi, Uchi, Rani, Yusi, Fitri, Sita), M. Adrian Pratama, Aditya R. Syahreza,
Keluarga Besar Saman Bungong Puteh, Rumah Muslimah Aisyah dan Pondok Cantik, atas segala
kebersamaan dan kenangan indah yang takkan pernah terlupakan.
Penulis menyadari bahwa karya ilmiah ini masih jauh dari sempurna. Oleh karena itu,
kritik dan saran yang membangun sangat diharapkan. Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat
bagi yang membutuhkan.

Bogor, September 2012
Dewi Murni Puspito Sari

2

RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Wonogiri pada tanggal 13 Maret 1989 dari ayahanda Partino dan
ibunda Suyati. Penulis merupakan anak pertama dari dua bersaudara.
Pada tahun 2007, penulis diterima sebagai mahasiswa Departemen Biologi, Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA), Institut Pertanian Bogor (IPB) melalui jalur
Seleksi Penerimaan Mahasiswa Baru (SPMB).
Selama menjadi mahasiswi, penulis aktif dalam kegiatan mahasiswa Saman Bungong
Puteh sejak tahun 2008-2011. Selain itu, penulis juga sempat mengikuti kegiatan Studi Lapang di
Cangkuang, Sukabumi, Jawa Barat dengan judul laporan “Tinjauan Ekofisiologi dari Struktur
Lanskap dan Vegetasi di Wana Wisata Cangkuang”. Penulis juga mengikuti kegiatan Praktek
Lapang di PT. Ultrajaya Milk Industry and Trading Company, Tbk. pada bulan Juli 2010 dengan
judul “Proses Pembuatan Jus Jambu Biji di PT Ultrajaya Milk Industry and Trading Company,
Tbk”. Penulis menjadi asisten praktikum mata kuliah Perkembangan Hewan (2011/2012) dan
sempat menjadi tentor di salah satu bimbingan belajar di Bogor.

3

DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR GAMBAR ................................................................................................................. vii
DAFTAR LAMPIRAN.............................................................................................................. vii
PENDAHULUAN ....................................................................................................................... 1
Latar Belakang ........................................................................................................................ 1
Tujuan..................................................................................................................................... 2
Waktu dan Tempat .................................................................................................................. 2
BAHAN DAN METODE ............................................................................................................ 2
Bahan...................................................................................................................................... 2
Metode .................................................................................................................................... 2
Isolasi DNA ........................................................................................................................ 2
Amplifikasi dan Visualisasi Fragmen DNA ......................................................................... 2
Perunutan Produk PCR (Sekuensing) DNA A. atlas Gen COI .............................................. 3
Pensejajaran Runutan Nukleotida (Alignment) Gen COI A. atlas .......................................... 3
Analisis Filogeni ................................................................................................................. 3
HASIL DAN PEMBAHASAN .................................................................................................... 3

Hasil ....................................................................................................................................... 3
Isolasi DNA Total ............................................................................................................... 3
Amplifikasi Gen COI .......................................................................................................... 3
Sekuens dan Alignment DNA A. atlas Gen COI ................................................................... 4
Analisis Filogeni A. atlas Gen COI ...................................................................................... 5
Pembahasan ............................................................................................................................ 6
Variabilitas gen COI............................................................................................................ 6
SIMPULAN ................................................................................................................................ 7
SARAN ....................................................................................................................................... 7
DAFTAR PUSTAKA .................................................................................................................. 7

4

DAFTAR GAMBAR
Halaman
1
2
3
4

Hasil isolasi DNA total otot A. atlas pada gel agarosa 1.2%..............................................4
Hasil amplifikasi daerah COI pada gel agarosa 1.5%..........................................................4
Elektroforesis DNA hasil pre-test produk PCR pada gel agarosa 1%.................................4
Konstruksi pohon filogeni berdasarkan runutan 508 nukleotida COI dengan metode
Neighboor-Joining, bootstrapped 1000x, model p-distance………………………………….5

DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1
2
3
4
5
6

Lokasi pengambilan sampel A. atlas Bogor dan Purwakarta…………………………….10
Pensejajaran berganda nukleotida (508 nt) pada gen COI A. atlas dengan C. trifenestrata,
B. mori, B. mandarina, dan A. pernyi (GenBank)………………………………………..11
Situs nukleotida diagnostik gen COI A. atlas....................................................................19
Perbandingan situs nukleotida diagnostik gen COI antara famili Saturniidae dengan

Bombycidae………………………………………………………………………………20
Situs nukleotida diagnostik gen COI B. mandarina Japanese dalam fami li
Bombycidae…………………………………………………………………………........21
Matriks perbedaan rata-rata nukleotida p-distance berdasarkan metode pairwise distance
daerah COI pada ulat sutera A. atlas, C. trifenestrata, A. pernyi, B. mori, dan B.
mandarina………………………......................................................................................22

1

PENDAHULUAN
Latar Belakang
Sebagai negara yang terkenal dengan
kekayaan alam dan biodiversitasnya,
Indonesia memiliki berbagai jenis hewan dan
satwa yang sangat potensial untuk
dikembangkan. Ulat sutera alam asli
Indonesia merupakan salah satu contohnya.
Empat jenis ulat sutera alam Indonesia (ordo
Lepidoptera, famili Saturniidae), yakni
Attacus

atlas,
Cricula
trifenestrata,
Antheraea pernyi, dan Philosamia ricini
berpotensi untuk dikembangkan. Permintaan
pasar terhadap benang sutera domestik yang
berasal dari ulat sutera alam sampai saat ini
sangat tinggi dan belum tercukupi.
Masyarakat di daerah Yogyakarta, Gunung
Kidul dan Bali telah memanfaatkan sutera
alam dari jenis A. atlas dan C. trifenestrata
(Solihin & Fuah 2010). A. atlas merupakan
salah
satu
hewan
Indonesia
yang
penyebarannya cukup luas (Solihin & Fuah
2010). Menurut Peigler (1989), peta
penyebaran A. atlas tersebar di beberapa
daerah di Indonesia, mulai dari Nangro Aceh
Darusalam (NAD) hingga Papua.
Attacus
atlas
termasuk
serangga
holometabola yaitu serangga yang mengalami
metamorfosis sempurna. Siklus hidupnya
terbagi menjadi empat tahap yaitu telur, larva
atau ulat, pupa atau kepompong dan imago
atau ngengat dewasa (Gullan & Cranston
2000). Lamanya siklus hidup spesies tersebut
dari telur hingga imago rata-rata 64-88 hari
bagi A. atlas (Solihin & Fuah 2010).
Keunggulan dari A. atlas ini antara lain
memiliki sifat polifagus (makan dan hidup
pada berbagai pohon inang) dan polivoltin
(beberapa generasi dalam satu tahun) (Solihin
& Fuah 2010).
Ulat sutera liar A. atlas (Lepidoptera:
Saturniidae) adalah salah satu jenis serangga
yang mempunyai nilai ekonomi tinggi karena
warna benang sutera yang menarik yaitu
coklat keemasan, lebih mengkilat dan harga
jual kokon yang tinggi (Rianto 2009).
Banyak komoditi olahan yang dapat
diproduksi dari bahan ulat sutera liar ini,
yaitu industri tekstil (industri tenun dan
pakaian), makanan, obat-obatan, kosmetik,
seni dan kerajinan tangan (Awan 2007).
Gen cytochrome oxidase subunit I (COI)
merupakan salah satu gen yang terdapat
dalam genom mitokondria. Dalam studi
molekuler, gen COI digunakan sebagai
penanda
genetik
untuk
mempelajari
karakteristik genetik antar spesies maupun

antar individu. COI juga dapat digunakan
sebagai DNA barcoding karena sedikit sekali
delesi dan insersi dalam sekuennya, serta
variasi juga sedikit (Hebert et al. 2003),
merekonstruksi filogenetik pada cabang
evolusi tingkat spesies (Palumbi 1996) dan
telah berhasil
mengidentifikasi maupun
membedakan spesies berbagai Invertebrata
dan Vertebrata, dari Lepidoptera sampai
burung dan dalam geografi yang berbeda
(Hajibabaei et al. 2007). Ketepatan pemilihan
gen sebagai penanda genetik berdasarkan
beberapa kriteria, diantaranya gen ada di
semua organisme, memiliki cara kerja yang
sama, serta mampu membedakan dengan
spesies lain. Karakteristik utama yang perlu
diperhatikan sebagai penanda genetik adalah
laju substitusi nukleotida ataupun asam
amino pada daerah-daerah tertentu. Salah
satu kelebihan gen COI sebagai penanda
analisis filogeni adalah asam amino pada
fragmen COI jarang mengalami substitusi.
Namun, basa-basa pada triple kodonnya
masih berubah dan bersifat silent (Lynch &
Jarrell 1993).
Filogeni molekuler sudah banyak dikaji
pada ulat sutera domestikasi (Bombyx mori)
dengan penanda genetik cytochrome b (Li et
al. 2005), 12S rRNA, 16S rRNA (Arunkumar
et al. 2006) dan COI (Arunkumar et al. 2006;
Li et al. 2009). Pada ulat sutera liar (Famili
Saturniidae), khususnya pada beberapa
spesies Antheraea juga sudah dilakukan
pengkajian molekuler dengan penanda
genetik 12S rRNA, 16S rRNA (Arunkumar et
al. 2006), dan COI (Arunkumar et al. 2006;
Mahendran et al. 2006). Selain itu, kajian
molekuler juga telah dilakukan pada ulat
sutera liar C. trifenestrata asal Indonesia
dengan penanda genetik gen fibroin (Suriana
2011). Di Indonesia, kajian mengenai ulat
sutera liar A. atlas masih terbatas, sehingga
perlu dilakukan eksplorasi mengenai gen
cytochrome oxidase subunit I (COI) pada
spesies tersebut.
Berdasarkan basis data genetik di
GenBank, belum ada data lengkap genom
spesies A. atlas, terutama asal Indonesia. Hal
inilah yang mendasari penulis untuk
melakukan penelitian mengenai karakteristik
gen cytochrome oxidase subunit I (COI) pada
ulat sutera liar Attacus atlas asal Jawa Barat.
Hasil penelitian ini diharapkan dapat
digunakan sebagai informasi dasar mengenai
keragaman genetik dengan penanda COI
sebagai pembeda antar spesies A. atlas.

2

Tujuan
Penelitian
bertujuan
mengetahui
karakteristik gen cytochrome oxidase subunit
I (COI) pada ulat sutera liar Attacus atlas asal
Jawa Barat.
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan
Februari 2011 hingga bulan Mei 2012 di
laboratorium Biologi Molekuler, Pusat
Penelitian
Sumberdaya
Hayati
dan
Bioteknologi (PPSHB) dan laboratorium
terpadu Departemen Biologi.

BAHAN DAN METODE
Bahan
Sampel yang digunakan adalah sampel
otot A. atlas asal Bogor (AB) dan Purwakarta
(AP). Lokasi pengambilan sampel disajikan
pada Lampiran 1. Bahan ekstraksi dan
purifikasi DNA yang digunakan yaitu larutan
CTAB, proteinase K, larutan fenol, larutan
CIAA, larutan NaCl, etanol absolut, etanol
70%, dan larutan TE-RNAse.
Metode
Isolasi DNA
DNA genomik dari A. atlas masingmasing daerah yang berbeda individu (n= 3)
diisolasi dari sampel otot melalui modifikasi
metode Solihin (1997). Sampel otot yang
telah dihaluskan, ditambahkan 600 l larutan
CTAB, dimasukkan ke dalam ependorf dan
ditambahkan 10 l proteinase K 20 mg/ ml.
Sampel diinkubasi pada suhu 55o C selama
semalam.
Suspensi yang telah diinkubasi pada suhu
55o C selama semalam ditambahkan 400 l
fenol, 400 l CIAA, dan 40 l NaCl.
Kemudian dikocok pelan pada suhu ruang
selama 30 menit dan disentrifugasi pada
kecepatan 13000 rpm selama 3 menit.
Supernatan dipindahkan ke ependorf baru,
ditambahkan 400 l CIAA, dikocok pelan
pada suhu ruang selama 20 menit, dan
disentrifugasi pada kecepatan 13000 rpm
selama 3 menit. Supernatan dipindahkan ke
ependorf baru, ditambahkan 800 l etanol
absolut, dan disimpan di freezer selama
semalam. Sampel disentrifugasi pada
kecepatan 12000 rpm selama 5 menit.
Supernatan dibuang, ditambah dengan 800 µl
etanol 70%, disentrifugasi pada kecepatan
12000 rpm selama 5 menit dan bagian
supernatan dibuang. Sampel (endapan DNA)
dikeringudarakan selama 15-30 menit.
Endapan ditambahkan 35-50 µl larutan TERNAse 40 mg/ ml. Inkubasi pada suhu 37o C
selama 15 menit. Sampel DNA disimpan

dalam freezer sampai
akan
digunakan
pada tahap selanjutnya.
Kualitas
DNA
dilihat
dengan
dimigrasikan pada gel agarosa 1,2%
menggunakan buffer 1xTAE (Tris-asetat 40
mM, EDTA 1 mM). Pewarnaan gel agarosa
dengan ethidium bromide (0,8% g/ml)
diamati dan difoto di bawah sinar ultra violet
(200-400nm). Kuantitas DNA dapat diukur
melalui uji spektrofotometri dengan rasio
serapan pada panjang gelombang ( ) 260/280
lebih besar 1.8 dianggap murni (Sambrook et
al. 1989).
Amplifikasi dan Visualisasi Fragmen DNA
DNA total hasil purifikasi digunakan
sebagai DNA cetakan untuk proses
amplifikasi gen COI. Amplifikasi dilakukan
melalui teknik Polymerase Chain Reaction
(PCR)
dengan
menggunakan
mesin
thermocycler (ESCO). Fragmen DNA yang
diamplifikasi yaitu gen COI pada A. atlas.
Amplifikasi fragmen DNA daerah COI
dilakukan dengan menggunakan pasangan
primer yang didisain dari genom lengkap
mitokondria Antheraea pernyi. Primer yang
digunakan didesain khusus untuk gen COI
famili Saturniidae berdasarkan Mahendran et
al. (2006) dan Suriana (2011), yaitu primer
forward dengan urutan nukleotida 5'TGATCAAATTTATAATAC-3' dan primer
reverse dengan urutan nukleotida 5'GTAAAATTAAAATATAAAC-3'.
Komposisi perekasi PCR terdiri atas 2 µl
sampel DNA, masing-masing 1 µl primer
forward dan primer reverse dengan
konsentrasi 20 ρmol, 1 µl MgCl2 50 mM, 5.5
µl ddH2O, 2 µl Enhancer, dan 12.5 µl Green
Taq Polymerase Master Mix 2x dengan
volume total reaksi adalah 25 µl. Kondisi
reaksi PCR diawali dengan pre-denaturasi
94o C selama 5 menit. Siklus PCR dilakukan
sebanyak 35 kali dengan kondisi denaturasi
94o C selama 45 detik, penempelan primer
(annealing) 38o C selama 1 menit 30 detik,
ekstensi atau elongasi 72o C selama 2 menit,
dan diakhiri oleh post-elongasi 72o C selama
5 menit. Produk PCR yang nantinya
dihasilkan sebesar 595 pasang basa (pb).
Kualitas produk PCR dilihat dengan
dimigrasikan pada gel agarosa 1,5%
menggunakan buffer 1xTAE (Tris-asetat 40
mM, EDTA 1 mM). Pewarnaan gel agarosa
dengan ethidium bromide (0,8% g/ml)
diamati dan difoto di bawah sinar ultra violet
(300-400nm). Kuantitas DNA dapat diukur
melalui uji spektrofotometri dengan rasio
serapan pada panjang gelombang ( ) 260/280

3

lebih besar 1.8 dianggap murni (Sambrook et
al. 1989).
Perunutan Produk PCR (Sekuensing)
DNA A. atlas Gen COI
Pembacaan sekuen DNA sebagai produk
PCR menjadi alat penting dan utama dalam
biologi molekular karena dapat mengetahui
komposisi nukleotida dan asam amino suatu
gen, juga menganalisis kekerabatan dan jalur
evolusinya (Albert et al. 1994). Prinsip
analisa sekuensing DNA berbasis pada
metode Sanger (1977) dan Maxam-Gilbert
(Applied
Biosystems
2012).
DNA
sequencing menggunakan metode PCR
(Polymerase Chain Reaction) sebagai
pijakannya. DNA yang akan ditentukan
urutan basanya (A,C,G,T) dijadikan sebagai
cetakan (template). Kemudian diamplifikasi
menggunakan enzim dan bahan-bahan yang
hampir sama dengan reaksi PCR, namun ada
penambahan beberapa pereaksi tertentu.
Proses ini dinamakan cycle sequencing. Saat
proses ekstensi, enzim polimerase akan
membuat rantai baru DNA salinan dari
template dengan menambahkan dNTP-dNTP
sesuai dengan urutan pada DNA cetakannya.
Jika yang menempel adalah ddNTP, maka
otomatis proses polimerisasi akan terhenti
karena ddNTP tidak memiliki gugus 3′-OH
yang seharusnya bereaksi dengan gugus 5′-P
dNTP
berikutnya
membentuk ikatan
fosfodiester. Pada akhir cycle sequencing,
yang dihasilkan adalah fragmen-fragmen
DNA dengan panjang bervariasi. Jika
fragmen-fragmen tersebut dipisahkan dengan
elektroforesis, maka akan terpisah-pisah
dengan jarak antar fragmennya satu basa-satu
basa. Urutan basa DNA dapat ditentukan
dengan proses pemisahan fragmen pada gel
elektroforesis dalam satu lajur, menggunakan
label fluorescent dengan empat warna yang
berbeda untuk setiap reaksi cycle sequencing
(Applied Biosystems 2012).
Perbedaan cycle sequencing dengan PCR
biasa diantaranya primer yang digunakan
hanya satu untuk satu arah pembacaan, dan
adanya penambahan ddNTPs (dideoxyNucleotide Triphosphate) sebagai modifikasi
dari dNTPs dengan menghilangkan gugus 3′OH pada ribosa (Applied Biosystems 2012).
Produk PCR gen COI penelitian ini
berupa pita tunggal yang berukuran 595 pb.
Produk PCR dilakukan sekuensing di PT
Genetika Science secara lengkap, baik
dengan primer forward maupun reverse,
untuk memperoleh urutan DNA.

Pensejajaran
Runutan
Nukleotida
(Alignment) Gen COI A. atlas
Runutan nukleotida gen COI A. atlas
dengan primer forward dan reverse diedit dan
dianalisis untuk mendapatkan sekuens DNA
dari gen COI. Pensejajaran runutan
nukleotida dilakukan dengan menggunakan
program Clustal W yang terdapat pada
software MEGA 4.0 (Tamura et al. 2007).
Runutan nukleotida gen COI A. atlas
disejajarkan
dengan
ingroup
(Famili
Saturniidae) yaitu Cricula trifenestrata
(Suriana 2011, GenBank: JF264728.1) dan
Antheraea pernyi (GenBank: HQ264055.1),
serta outgroup (Famili Bombycidae) yaitu
Bombyx mori (GenBank: AF027953.1,
AF167260.1, AB083339.1, AB649185.1),
dan
Bombyx
mandarina
(GenBank:
NC_003395, AY301620.2). Pensejajaran
berganda dilakukan hanya pada nukleotida,
sehingga dapat diketahui apakah ada
perbedaan nukleotida pada ulat sutera liar
yang diuji.
Analisis Filogeni
Analisis filogeni A. atlas dikonstruksi
antara gen COI hasil penelitian ini dengan
basis data gen COI C. trifenestrata, A. pernyi,
B. mori, dan B. mandarina. Analisis filogeni
menggunakan program MEGA 4 (Tamura et
al. 2007) berdasarkan metode substitusi
nukleotida dengan jarak genetik p-distance
dan konstruksi pohon filogeni berdasarkan
bootstrapped
Neighbour-Joinning
(NJ)
dengan 1000 kali pengulangan.

HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Isolasi DNA Total
Enam sampel DNA A. atlas yang
digunakan dalam penelitian ini terdiri atas 3
sampel asal Bogor dan 3 sampel asal
Purwakarta. Gambar 1 menunjukkan hasil
isolasi DNA total setelah dimigrasikan pada
gel agarose 1.2% dan dilihat dengan UV
transilluminator.
DNA total tersebut selanjutnya digunakan
sebagai cetakan DNA untuk mengamplifikasi
gen COI dengan menggunakan teknik PCR.
Amplifikasi Gen COI
Amplifikasi daerah COI mtDNA pada
enam sampel A. atlas (Bogor dan
Purwakarta) menghasilkan pita tunggal
berukuran 595 pb. Produk PCR tersebut
selanjutnya
digunakan
dalam
proses
sekuensing. Gambar 2 menunjukkan hasil
amplifikasi gen COI setelah dimigrasikan

4

pada gel agarosa 1.5% dan dilihat dengan UV
transilluminator (300 nm).
1

2

3

4

5

6

Gambar 1 Hasil isolasi DNA total otot A.
atlas pada gel agarosa 1.2%.
keterangan: dari kolom 1 sampai
kolom 6= AP 4, AP 6, AP 23, AB
52, AB 53, AB 54
1

600 pb

2 3 4 5 6 7

595 pb

500 pb

Gambar 2 Hasil amplifikasi daerah COI pada
gel agarosa 1.5%. Keterangan:
dari kolom 1 sampai kolom 7=
marker 100 bp, AP 4, AP 6, AP
23, AB 52, AB 53, AB 54
Sekuens dan Alignment DNA A. atlas Gen
COI
PT Genetika Science melakukan pre-test
semua sampel produk PCR untuk cek kualitas
sampel sebelum dilakukan proses cycle
sequencing (Gambar 3). Perunutan DNA
(sekuensing) dilakukan dari dua arah, yaitu
forward dan reverse. Berdasarkan hasil
sekuensing yang diperoleh, semua sampel
memiliki panjang nukleotida kurang dari 595

nt. Dua sampel yaitu AP 4 dan AP 6
menunjukkan hasil sekuensing yang lebih
baik dari empat sampel lainnya, yaitu AP 23,
AB 52, AB 53 dan AB 54. Sampel AP 23
menghasilkan pita tunggal yang lebih tipis
(Gambar 3) sehingga hasil sekuensing yang
diperoleh memiliki beberapa basa nukleotida
yang tidak terdeteksi.
Panjang DNA hasil sekuensing setelah
dilakukan pensejajaran berganda, diperoleh
hasil sekuen sepanjang 508 nukleotida (nt)
dari yang seharusnya sepanjang 595 nt
(Lampiran 2). Hasil pensejajaran 508 nt gen
COI antar populasi A. atlas menunjukkan
bahwa gen tersebut sangat conserve pada
level spesies (tidak ada satupun nukleotida
yang berbeda). Sekuens intra spesies A. atlas
pada gen COI menunjukkan komposisi
nukleotida yang terdiri dari 37.6% basa timin
(T), 28.3% basa adenin (A), 18.9% basa
sitosin (C), dan 15.2% basa guanin (G). Basa
yang mendominasi yaitu T dan A.
Keenam sekuens A. atlas disejajarkan
dengan C. trifenestrata (Suriana 2011,
GenBank:
JF264728.1),
A.
pernyi
(HQ264055.1),
B.
mori
(GenBank:
AF027953.1, AF167260.1, AB083339.1,
AB649185.1),
dan
B.
mandarina
(NC_003395, AY301620.2), diperoleh nilai
conserved dan variabel sebesar 74.2%
(377/508) dan 25.8% (131/508). Berdasarkan
pensejajaran inter spesies A. atlas dengan
spesies lain, terdapat 31 situs nukleotida COI
A. atlas yang berbeda dengan spesies lain dan
bersifat
diagnostik,
sehingga
dapat
dipergunakan sebagai penciri bagi spesies
tersebut (Lampiran 3). Ada 15 situs
nukleotida COI diagnostik yang merupakan
perbandingan antara famili Saturniidae
dengan Bombycidae (Lampiran 4), dan 11
situs nukleotida COI diagnostik untuk B.
mandarina Japanese (famili Bombycidae)
(Lampiran 5).

750 pb
500 pb

595 pb

Gambar 3 Elektroforesis DNA hasil pre-test
produk PCR pada gel agarosa 1%.
Keterangan: dari kolom 1 sampai

5

trifenestrata, A. pernyi, B. mori, dan B.
mandarina, dapat dilihat pada Lampiran 6.
Analisis
filogeni
menunjukkan
kekerabatan yang dekat dan tidak ada
perbedaan komposisi nukleotida antara data
sampel A. atlas gen COI dari Bogor dan
Purwakarta. Konstruksi pohon filogeni A.
atlas, C. trifenestrata, A. pernyi, B. mori, dan
B. mandarina berdasarkan jarak genetik pdistance dari basa-basa nukleotida COI dapat
dilihat pada Gambar 4. Pada Gambar 4
tersebut menunjukkan bahwa enam sampel A.
atlas berada pada nodus yang sama dengan
nilai boostrap 100%.
Ulat sutera liar famili Saturniidae berbeda
kelompok dengan ulat sutera domestik origin
maupun hasil
persilangannya
(famili
Bombycidae).
Sampel A. atlas (Bogor dan Purwakarta)
dengan C. trifenestrata (Bogor, Purwakarta,
dan Bantul) dan A. pernyi terletak pada nodus
A. Sedangkan A. atlas dengan B. mori dan B.
mandarina terletak pada nodus terpisah, yaitu
nodus B. Hal ini menunjukkan bahwa A.
atlas memiliki hubungan kekerabatan
terdekat dengan C. trifenestrata dan A. pernyi
karena berada dalam satu famili, yaitu
Saturniidae.

kolom 7= marker 1 kb, AP 4, AP
6, AP 23, AB 52, AB 53, AB 54
Analisis Filogeni A. atlas Gen COI
Hubungan kekerabatan famili Saturniidae
(A. atlas, C. trifenestrata, dan A. pernyi)
maupun famili Bombycidae (B. mori, dan B.
mandarina) dapat dibandingkan berdasarkan
jarak genetik p-distance dari basa-basa
nukleotidanya. Nilai jarak genetik A. atlas, C.
trifenestrata, A. pernyi, B. mori, dan B.
mandarina,
berkisar
antara
0-0.183
(Lampiran 6). Spesies A. atlas dengan C.
trifenestrata dan A. pernyi, masing-masing,
memiliki jarak genetik sebesar 0.154 (15.4%)
dengan 78 nt berbeda dan 0.140 (14%)
dengan 71 nt berbeda. Sedangkan spesies A.
atlas dengan B. mori dan B. mandarina,
masing-masing, memiliki jarak genetik
sebesar 0.152-0.157 (15.2-15.7%) dengan 7779 nt berbeda dan 0.154-0.156 (15.4-15.6%)
dengan 78-79 nt berbeda. Persentase jarak
genetik antara A. atlas dengan A. pernyi lebih
kecil dibandingkan dengan persentase jarak
genetik antara A. atlas dengan C.
trifenestrata, B. mori, dan B. mandarina.
Perbedaan susunan basa nukleotida hasil
pensejajaran pada gen COI dapat dilihat pada
Lampiran 2. Matriks perbedaan rata-rata pdistance pada spesies ulat sutera A. atlas, C.

AB52 A. atlas
AB53 A. atlas
100 AP4 A. atlas

AP6 A. atlas

A

AP23 A. atlas
AB54 A. atlas
A. pernyi
CP1 C. trifenestrata

50
100

CBG1 C. trifenestrata
CBAJ1 C. trifenestrata

B. mandarina (Japanese)

B

B. mandarina (Chinese)

100

B. mori Backokjam (Korea)

99
93
88

B. mori Daizo (Chinese)
B. mori Aojuku (Japanese)
B. mori BmoHap2A (European)

0.02

Gambar 4 Konstruksi pohon filogeni berdasarkan runutan 508 nukleotida COI dengan metode
Neighboor-Joining, bootstrapped 1000x, model p-distance (AA= Attacus atlas; CT=
Cricula trifenestrata).

6

Pada nodus B, B. mandarina (Japanese)
berbeda cluster dengan B. mandarina
(Chinese) dan B. mori lain.
Pembahasan
Semua
sampel
(enam
sampel)
menghasilkan pita tunggal yang cukup tebal
dengan ukuran 595 pb. Pita DNA yang tebal
mengindikasikan bahwa konsentrasi DNA
tersebut tinggi. Namun dalam penelitian tidak
dilakukan pengukuran kuantitas DNA
melalui uji spektrofotometri. Keberhasilan
amplifikasi gen COI dipengaruhi oleh
beberapa faktor, yaitu kemurnian DNA hasil
purifikasi (Sentausa 2003), komposisi bahan
pereaksi, dan kondisi reaksi PCR yang tepat,
terutama pada proses penempelan primer
(annealing). Suhu optimum penempelan
primer pada saat amplifikasi sampel yaitu 38o
C. Penggunaan suhu penempelan primer
tersebut penting dalam proses amplifikasi,
karena pada tahap ini memungkinkan primer
forward dan reverse akan menempel secara
spesifik pada kedua ujung DNA cetakan.
Menurut Newton dan Graham (1997), jika
suhu penempelan primer terlalu tinggi dari
suhu optimum, menyebabkan primer tidak
menempel dengan DNA cetakan. Jika suhu
penempelan primer terlalu rendah dari suhu
penempelan
optimum
menyebabkan
mispriming, yaitu penempelan primer pada
tempat yang salah pada DNA cetakan
sehingga dihasilkan produk non spesifik.
Oleh karena itu, dilakukan optimasi terhadap
suhu penempelan primer.
Hambatan yang sering terjadi dalam
proses amplifikasi pada penelitian ini, yaitu
pita yang dihasilkan multistrand atau banyak
pita yang bukan target. Untuk mengatasi hal
tersebut dilakukan beberapa modifikasi pada
komposisi dan kondisi PCR. Modifikasi yang
dilakukan pada komposisi antara lain dengan
menurunkan volume MgCl2, menambah
volume taq polymerase dan volume DNA
cetakan (apabila pita yang dihasilkan tipis).
Modifikasi pada kondisi PCR dilakukan
dengan menaikkan suhu penempelan primer
sehingga lebih spesifik (Febriana 2011).
Variabilitas gen COI
Pendekatan filogenetik dengan jarak
genetik antar sekuens dapat digunakan untuk
menunjukkan
kedekatan
kekerabatan.
Persentase jarak genetik spesies A. atlas
dengan ingroup (A. atlas, C. trifenestrata dan
A. pernyi) sebesar 14%-15.4%. Sedangkan
persentase jarak genetik A. atlas dengan
outgroup (B. mori dan B. mandarina) sebesar
15.2%-15.7%. Hal ini menunjukkan bahwa

semakin besar nilai atau persentase jarak
genetik maka semakin besar perbedaan
jumlah basa nukleotidanya. Sehingga
semakin jauh hubungan kekerabatannya.
Sebaliknya, semakin kecil nilai atau
persentase jarak genetiknya, maka semakin
sedikit perbedaan jumlah basa nukleotidanya.
Semakin
kecil
perbedaan
susunan
nukleotidanya,
maka
semakin
dekat
hubungan kekerabatannya (Febriana 2011).
Meskipun nilai perbedaannya tampak tidak
signifikan, namun tetap menunjukkan bahwa
A. atlas, C. trifenestrata, dan A. pernyi
berada dalam satu famili Saturniidae,
sedangkan B. mori dan B. mandarina berada
dalam satu famili Bombycidae.
Rendahnya keragaman sekuen nukleotida
intra spesies berdasarkan COI juga
ditemukan pada B. mori (Li et al. 2009), ordo
Hymenoptera pada spesies Diadegma
(Weagner et al. 2006), dan pada nyamuk
(Cywinska 2006). Namun demikian, gen COI
ternyata berhasil memisahkan spesies
kumbang pada genus Ophraella dengan
keragaman antar spesies sebesar 24% (Funk
et al. 1995). Gen COI juga mampu
memisahkan famili dengan jelas antara famili
Saturniidae dengan famili Bombycidae
(Mahendran et al. 2006).
Sampel AP 4, AP 6, AP 23, AB 52, AB
53, dan AB 54 terletak pada satu nodus
dengan C. trifenestrata (CBAJ1, CBG1, dan
CP1) dan A. pernyi. Filogeni berdasarkan
runutan nukleotida menunjukkan bahwa A.
atlas menempati nodus sendiri dan lebih
dekat dengan C. trifenestrata dan A. pernyi
dibandingkan dengan B. mori dan B.
mandarina.
Konstruksi
filogenetik
menggunakan C. trifenestrata dan A. pernyi
sebagai
kerabat
pada
level
famili
(Saturniidae) dan kerabat jauhnya yaitu B.
mori dan B. mandarina (Bombycidae). DNA
mitokondria gen COI pada B. mori dan B.
mandarina digunakan sebagai outgroup pada
analisis filogeni. Penggunaan outgroup
berfungsi sebagai faktor koreksi dalam
penentuan karakter diantara ingroup yang ada
(Maddison 1984).
Hasil eksplorasi gen COI A. atlas
menunjukkan konsistensinya sebagai gen
penanda spesies (Suriana 2011). Namun
demikian
diperlukan
adanya
usaha
mengeksplorasi
keragaman
genetik
menggunakan gen mitokondria lainnya,
seperti gen cytochrome b, d-loop mitokondria
ataupun gen lainnya. Runutan nukleotida gen
COI pada spesies A. atlas bersifat
monomorfik, menunjukkan tidak ada variasi

7

pada semua individu baik di dalam maupun
antar populasi. Hal ini dapat dikatakan bahwa
nukleotida tersebut bersifat conserve pada
level spesies. Keberadaan 31 situs nukleotida
diagnostik yang merupakan penciri bagi
spesies A. atlas menunjukkan proses evolusi
spesifik pada A. atlas. Substitusi nukleotida
yang terjadi pada A. atlas memiliki pola
sebagai berikut: basa nukleotida C akan
digantikan dengan T atau A pada spesies lain;
basa nukleotida G digantikan dengan A atau
T; basa nukleotida A digantikan dengan T
atau C; sedangkan basa nukleotida T
digantikan dengan C atau A (Lampiran 3).
Berdasarkan konstruksi pohon filogeni,
semua sampel A. atlas, C. trifenestrata dan B.
mandarina (Japanese) memiliki
nilai
boostrap
100%
yang
menunjukkan
konstruksi pohon tidak akan berubah. Antar
individu di dalam spesies yang sama
memiliki gen COI yang sama, karena tidak
ada variasi genetik pada intra dan inter
populasinya, yang berarti tidak adanya
perubahan nukleotida pada gen tersebut, baik
sesama individu maupun antar populasi.

SIMPULAN
Penelitian
ini
telah
mampu
mengkarakterisasi gen COI A. atlas
sepanjang 508 nt yang dapat dijadikan
barcoding untuk spesies tersebut. COI tidak
mampu membedakan individu, baik pada
populasi yang sama maupun berbeda asal
usul. Filogeni menunjukkan bahwa famili
Saturniidae bersifat monophyletic. Spesies C.
trifenestrata dan A. pernyi menunjukkan
kekerabatan dekat dengan A. atlas. Ada 31
situs nukleotida diagnostik untuk A. atlas
sebagai penciri spesies.

SARAN
Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut
pada level molekuler mengenai kajian
penggunaan gen cytochrome b sebagai
penanda genetik dengan menggunakan
sampel yang berasal dari lokasi lain di
Indonesia. Selain itu perlu adanya usaha
mengeksplorasi
keragaman
genetik
menggunakan gen yang lain.

DAFTAR PUSTAKA
Albert J, Wahlberg J, Leitner T, Escamilla
D, Uhlen M. 1994. Analysis of a rape
case by direct sequencing of the human
immunodeficiency virus type 1 pol and
gag genes. J. Virol 68: 5018-24.

Applied
Biosystems.
2012.
DNA
sequencing and fragment analysis by
capillary
electrophoresis.
http://www.appliedbiosystems.com. [13
September 2012].
Arunkumar KP, Muralidhar M, Nagaraju J.
2006. Molecular phylogeny of silkmoths
reveals the origin of domesticated
silkmoth, Bombyx mori from Chinese
Bombyx mandarina and paternal
inheritance of Antheraea proylei
mitochondrial DNA. Mol Phylogenet
and Evol 40:419–427.
Awan A. 2007. Domestikasi ulat sutera liar
Attacus atlas (Lepidoptera: Saturniidae)
dalam usaha meningkatkan persuteraan
nasional [disertasi]. Bogor: Program
Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
Cywinska AC, Hunter FF, Hebert PDN.
2006. Identifying Canadian mosquito
species through DNA barcodes. Med and
Veter Ent 20: 413-424.
Febriana A. 2011. Filogeni Berdasarkan
Sekuens DNA Mitokondria Gen
Cytochrome Oxidase I (Gen COI) pada
Beberapa Bangsa Sapi Lokal Indonesia
[skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika
dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut
Pertanian Bogor.
Funk DJ, Futuyama DJ, Orti G, Meyer A.
1995. Mitochondrial DNA sequence and
multiple data sets: A phylogenetic study
of
phyotophagus
beetles
(Chrysomelidae: Ophraella). Mol Biol
Evol 12: 627-640.
Gullan PJ, Cranston PS. 2000. The Insects
An Outline of Entomology. Second
Edition. London: Blackwell Science Ltd.
Hajibabaei M G, Singer AC, Clare EL and
Hebert PDN. 2007. Design and
Applicability of DNA Arrays and DNA
Barcodes in Biodiversity Bionitoring.
Bio Med Centre Biol 5:24-30.
Hebert PDN, Ratnasingham S, dan De
Waard JR. 2003. Barcoding animal life:
cytochrome c oxidase subunit 1
divergences among closely related
species. Proc R Soc 270: 96–99.
Li AL, Zhao Q, Hang Z. 2005. Molecular
phylogeny
of
the
domesticated
silkworm, Bombyx mori, based on the
sequences of mitochondrial cytochrome
b genes. J Genet 84:137-142.
Li YP et al. 2009. Mitochondrial DNA
analysis reveals a low nucleotide
diversity of Caligula japonica in China.
Afr J of Biotec 8:2707-2712.

8

Lynch M, Jarrel PE. 1993. A method for
calibrating molecular clocks and its
application to animal mitochondrial
DNA. Genetics 135: 1197-1208.
Maddison WP, Donoghue MJ, Maddison
DR. 1984. Outgroup analysis and
parsimony. Syst Zool 33: 83-103.
Mahendran B, Ghosh SK, Kundu, SC. 2006.
Molecular phylogeny of silk-producing
based on 16S ribosomal RNA and
cytochrome oxidase subunit I genes. J
Genet 85:31-38.
Newton CR, Graham A. 1997. PCR
Introduction to Biotechnique. Second
Edition.
Oxford:
Bios Scientific
Publisher Ltd.
Palumbi SR. 1996. Nucleic acids II: the
polymerase chain reaction. Dalam
Molecular systematic. Ed ke-2. Edited
by Hillis DM, Moritz C, Mable BK.
Massachusetts: Sinauer.
Peigler RS. 1989. A revision of the IndoAustralian genus Attacus. California:
The Lepidoptera Research Foundation,
Inc.
Rianto F. 2009. Performa Reproduksi Imago
Attacus atlas L. yang Berasal dari
Perkebunan Teh Purwakarta [skripsi].
Bogor: Fakultas Peternakan, Institut
Pertanian Bogor.
Sambrook J, Fristsch EF, Maniatis T. 1989.
Molecular Cloning: A Laboratory
Manual. New York: Cold Spring
Harbour Laboratory Press.
Sanger F, Nicklen S, Coulson AR. 1977.
DNA sequencing with chain-terminating
inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA 74:
5463-5467.
Sentausa E. 2003. Studi DNA Prasejarah
dari Tulang Manusia Situs Arkeologi
Tadulako, Sulawesi Tengah [skripsi].
Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Institut Pertanian
Bogor.
Solihin DD. 1997. Isolasi dan Purifikasi
Mitochondrian (mtDNA). Laboratorium
Biologi Molekuler Pusat Penelitian
Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi
IPB. Bogor.
Solihin DD, Fuah AM. 2010. Budidaya Ulat
Sutera Alam Attacus atlas. Jakarta:
Penebar Swadaya.
Suriana. 2011. Karakteristik Genetik
Cricula trifenestrata dari Jawa Barat dan
DIY [disertasi]. Bogor: Program
Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
Tamura K, Dudley J, Nei M, Kumar S.
2007. MEGA 4: Molecular evolutionary

genetics analysis software version 4. J
Mol Biol Evol 24: 1596-1599.
Weagner B, Reineke A, Lohr B, Zebit PW.
2006. Phylogenetic study of Diadegma
species (Hymenoptera: Ichneumonidae)
inferred from analysis of mitochondrial
and nuclear DNA sequence. Biol Control
37: 131-140.

9

LAMPIRAN

10

Lampiran 1 Lokasi pengambilan sampel A. atlas Bogor dan Purwakarta

11

Lampiran 2 Pensejajaran berganda nukleotida (508 nt) pada gen COI A. atlas dengan C. trifenestrata, A. pernyi, B. mori, dan B. mandarina (GenBank)
#MEGA
!Title COI A. atlas vs C. trifenestrata vs A. pernyi vs B. mori vs B. mandarina;
!Format
DataType=Nucleotide
NSeqs=16 NSites=508
Identical=. Missing=? Indel=-;

!Domain=Data;
[
[
#AP4_A._atlas
#AP6_A._atlas
#AP23_A._atlas
#AB52_A._atlas
#AB53_A._atlas
#AB54_A._atlas
#CBG1_C._trifenestrata
#CP1_C._trifenestrata
#CBAJ1_C._trifenestrata
#A._pernyi
#B._mori_Backokjam_(Korea)
#B._mori_Aojuku_(Japanese)
#B._mori_Daizo_(Chinese)
#B._mori_BmoHap2A_(European)
#B._mandarina_(Japanese)
#B._mandarina_(Chinese)

1
1234567890
TATAGTAATA
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
......C...
......T...
......T...
......T...
......T...
......T...
......T...

1111111112
1234567890
CCCATTATAA
..........
..........
..........
..........
..........
..T.......
..T.......
..T.......
..T.......
..T.......
..T.......
..T.......
..T.......
..T.......
..T.......

2222222223
1234567890
TCGGAGGATT
..........
..........
..........
..........
..........
.T........
.T........
.T........
.T........
.T........
.T........
.T........
.T........
.T........
.T........

3333333334
1234567890
TGGAAATTGG
..........
..........
..........
..........
..........
...T.....A
...T.....A
...T.....A
.........A
.........A
.........A
.........A
.........A
.........A
.........A

4444444445
1234567890
TTAGTACCTT
..........
..........
..........
..........
..........
...A.C..C.
...A.C..C.
...A.C..C.
...A.T..A.
.....T...C
.....T...C
.....T...C
.....T...C
.....T..CC
.....T...C

5555555556
1234567890
TAATATTAGG
..........
..........
..........
..........
..........
.....C.T..
.....C.T..
.....C.T..
..........
.T...C....
.T...C....
.T...C....
.T...C....
.T...C....
.T...C....

6666666667 ]
1234567890 ]
AGCACCTGAT
..........
..........
..........
..........
..........
...T......
...T......
...T......
...T......
......A...
......A...
......A...
......A...
......A...
......A...

12

Lampiran 2 Lanjutan
[
[
[
#AP4_A._atlas
#AP6_A._atlas
#AP23_A._atlas
#AB52_A._atlas
#AB53_A._atlas
#AB54_A._atlas
#CBG1_C._trifenestrata
#CP1_C._trifenestrata
#CBAJ1_C._trifenestrata
#A._pernyi
#B._mori_Backokjam_(Korea)
#B._mori_Aojuku_(Japanese)
#B._mori_Daizo_(Chinese)
#B._mori_BmoHap2A_(European)
#B._mandarina_(Japanese)
#B._mandarina_(Chinese)

7777777778
1234567890
ATAGCTTTCC
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
.....A....
.....A....
.....A....
.....A....
.....A....
.....A....

8888888889
1234567890
CTCGAATAAA
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
.A........
.A........
.A........
.A........
.A........
.A........
.A........

1
9999999990
1234567890
TAATATAAGT
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
.........A
.........A
.........A
.........A
.........A
.........A

1111111111
0000000001
1234567890
TTTTGACTTC
..........
..........
..........
..........
..........
........AT
........AT
........AT
........AT
........C.
........C.
........C.
........C.
........C.
........C.

1111111111
1111111112
1234567890
TTCCCCCTTC
..........
..........
..........
..........
..........
.A........
.A........
.A........
.A.....C..
.A.....C..
.A.....C..
.A.....C..
.A.....C..
.A.....C..
.A.....C..

1111111111
2222222223
1234567890
CTTAACATTA
..........
..........
..........
..........
..........
A...GT.C.T
A...GT.C.T
A...GT.C.T
T.....CC..
.C.T.T....
.C.T.T....
.C.T.T....
.C.T.T....
.C.T.T....
.C.T.T....

1111111111 ]
3333333334 ]
1234567890 ]
TTAATCTCTA
..........
..........
..........
..........
..........
.....T..C.
.....T..C.
.....T..C.
........C.
.....T..A.
.....T..A.
.....T..A.
.....T..A.
.....T..A.
.....T..A.

13

Lampiran 2 Lanjutan
[
[
[
#AP4_A._atlas
#AP6_A._atlas
#AP23_A._atlas
#AB52_A._atlas
#AB53_A._atlas
#AB54_A._atlas
#CBG1_C._trifenestrata
#CP1_C._trifenestrata
#CBAJ1_C._trifenestrata
#A._pernyi
#B._mori_Backokjam_(Korea)
#B._mori_Aojuku_(Japanese)
#B._mori_Daizo_(Chinese)
#B._mori_BmoHap2A_(European)
#B._mandarina_(Japanese)
#B._mandarina_(Chinese)

1111111111
4444444445
1234567890
GAAGAATTGT
..........
..........
..........
..........
..........
....T.....
....T.....
....T.....
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........

1111111111
5555555556
1234567890
CGAAAATGGA
..........
..........
..........
..........
..........
T.........
T.........
T.........
A.........
A........T
A........T
A........T
A........T
A........T
A........T

1111111111
6666666667
1234567890
GCAGGAACAG
..........
..........
..........
..........
..........
..T.......
..T.......
..T.......
..T.....T.
..........
..........
..........
..........
..........
..........

1111111111
7777777778
1234567890
GATGAACAGT
..........
..........
..........
..........
..........
.T.....G..
.T.....G..
.T.....G..
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........

1111111111
8888888889
1234567890
TTACCCCCCT
..........
..........
..........
..........
..........
.........C
.........C
.........C
.........C
.........A
.........A
.........A
.........A
.........A
.........A

1111111112
9999999990
1234567890
CTCTCCTCTA
..........
..........
..........
..........
..........
..T..T..C.
..T..T..C.
..T..T..C.
........A.
..T..A....
..T..A....
..T..A....
..T..A....
..T..A....
..T..A....

2222222222 ]
0000000001 ]
1234567890 ]
ATATTGCCCA
..........
..........
..........
..........
..........
.......T..
.......T..
.......T..
.......T..
....C..A..
....C..A..
....C..A..
....C..A..
.......A..
.......A..

14

Lampiran 2 Lanjutan
[
[
[
#AP4_A._atlas
#AP6_A._atlas
#AP23_A._atlas
#AB52_A._atlas
#AB53_A._atlas
#AB54_A._atlas
#CBG1_C._trifenestrata
#CP1_C._trifenestrata
#CBAJ1_C._trifenestrata
#A._pernyi
#B._mori_Backokjam_(Korea)
#B._mori_Aojuku_(Japanese)
#B._mori_Daizo_(Chinese)
#B._mori_BmoHap2A_(European)
#B._mandarina_(Japanese)
#B._mandarina_(Chinese)

2222222222
1111111112
1234567890
CGGGGGAAGC
..........
..........
..........
..........
..........
.A.T....CT
.A.T....CT
.A.T....CT
T..A...TCT
TA.A.....A
TA.A.....A
TA.A.....A
TA.A.....A
.A.A.....A
TA.A.....A

2222222222
2222222223
1234567890
TCAGTAGATT
..........
..........
..........
..........
..........
..T..T....
..T..T....
..T..T....
.........C
..C......C
..C......C
..C......C
..C......C
..T.....CC
..C......C

2222222222
3333333334
1234567890
TAGCTATTTT
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
.T........
.T........
.T........
.T........
.T........
.T........
.T........

2222222222
4444444445
1234567890
TTCTCTTCAT
..........
..........
..........
..........
..........
C..C......
C..C......
C..C......
...C......
...A..A...
...A..A...
...A..A...
...A..A...
...AT.A...
...A..A...

2222222222
5555555556
1234567890
TTAGCTGGAA
..........
..........
..........
..........
..........
C.T..A....
C.T..A....
C.T..A....
C.T..A..T.
.....A..T.
.....A..T.
.....A..T.
.....A..T.
.....A..T.
.....A..T.

2222222222
6666666667
1234567890
TTTCTTCAAT
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
....A.....
....A.....
....A.....
....A.....
....A.....
....A.....
....A.....

2222222222 ]
7777777778 ]
1234567890 ]
TTTAGGGGCT
..........
..........
..........
..........
..........
.C....C..A
.C....C..A
.C....C..A
......A..A
.A....A..A
.A....A..A
.A....A..A
.A....A..A
.A....A..A
.A....A..A

15

Lampiran 2 Lanjutan
[
[
[
#AP4_A._atlas
#AP6_A._atlas
#AP23_A._atlas
#AB52_A._atlas
#AB53_A._atlas
#AB54_A._atlas
#CBG1_C._trifenestrata
#CP1_C._trifenestrata
#CBAJ1_C._trifenestrata
#A._pernyi
#B._mori_Backokjam_(Korea)
#B._mori_Aojuku_(Japanese)
#B._mori_Daizo_(Chinese)
#B._mori_BmoHap2A_(European)
#B._mandarina_(Japanese)
#B._mandarina_(Chinese)

2222222222
8888888889
1234567890
ATTAATTTTA
..........
..........
..........
..........
..........
....T.....
....T.....
....T.....
..........
..........
..........
..........
..........
........C.
..........

2222222223
9999999990
1234567890
TTACAACAAT
..........
..........
..........
..........
..........
.......T..
.......T..
.......T..
....T.....
..........
..........
..........
..........
..........
..........

3333333333
0000000001
1234567890
TATTAATATA
..........
..........
..........
..........
..........
......C...
......C...
......C...
..........
A.........
A.........
A.........
A.........
A.........
A........G

3333333333
1111111112
1234567890
CGAATAAATA
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
...T......
...T......
...T......
...T......
...T......
...T......

3333333333
2222222223
123456789