Kemudian gelas objek disimpan dalam inkubator selama 2 jam dengan temperatur 56
C agar irisan lebih melekat pada gelas objek dan preparat siap diwarnai.
e. Pewarnaan HE Hematoxylin Eosin
Sebelum dilakukan pewarnaan, terlebih dahulu dilakukan proses deparafinasi penghilangan parafin dan proses rehidrasi penambahan air. Hal ini dilakukan
agar zat warna dapat terserap dengan sempurna. Deparafinasi dilakukan dengan cara : sediaan dimasukkan berturut-turut ke dalam
xylol II dan xylol I masing-masing selama 2 menit. Setiap kali dilakukan pemindahan, daerah sekitar sediaan diusap dengan kertas tissue tanpa menyentuh
jaringan. Rehidrasi dilakukan dengan cara : sediaan dimasukkan berturut-turut ke dalam alkohol absolut II dan alkohol absolut I masing-masing selama 2 menit,
kemudian ke dalam alkohol 95, alkohol 90, dan alkohol 90 masing-masing selama 1 menit.
Setelah proses rehidrasi, sediaan dibilas didalam air mengalir selama 1 menit lalu dimasukkan ke dalam pewarna Mayer
,
s Haematoxylin selama 1 menit. Setelah itu dimasukkan ke dalam Larutan Lithium Carbonate selama 15-13 detik dan
kemudian dibilas di dalam air mengalir. Selanjutnya sediaan dimasukkan ke dalam pewarna Eosin selama 2-3 detik, lalu dibilas kembali dengan air mengalir. Setelah
pewarnaan selesai, dilakukan proses dehidrasi dengan memasukkan sediaan ke dalam alkohol bertingkat yaitu alkohol 80, 90 dan 95 sebanyak 10 celupan, lalu ke
dalam alkohol absolut I sebayak 10 celupan dan alkohol absolut II selama 2 menit. Setelah itu preparat dikeringkan diudara terbuka dan kemudian diteteskan perekat
yaitu permount lalu ditutup dengan cover glass dan diberi label. Setelah preparat kering, dapat dilakukan pengamatan di bawah mikroskop.
Lampiran2 Pengembangan Metoda Analisa Retinol dengan HPLC Thurnham 1988
1. Sampel preparasi Campurkan secara cepat 0.25 mL plasma atau serum dengan 0.25 mL dari 10
mmolL reagent SDS, pencampuran dilanjutkan selama 1 menit setelah ditambahkan 0.5 mL ethanol yang engandung 40
µmol tocopherol acetate per liter, terakhir ditambahkan 1 mL n-heptane yang mengandung 0.5 gram BHT per
liter, campuran di vortex selama 2.5 menit dan centrifuge 2500 x g, 10 menit,20
C untuk memisahkan phase. Pindahkan 0.7 mL supernatant heptane, uapkan pada kondisi nitrogen pada suhu 40
C, dan residu dicampurkan ke dalam 0.25 mL phase mobile. Untuk sampel yang sedikit campurkan 0.1 mL dengan
0.1 mL SDS, 0.2 mL ethanol dan 1 mL heptane. Kemudian pindahkan 0.7 mL heptane, diuapkan dan dicampurkan ke 0.1 mL phase mobile untuk pengukuran.
2. Proteks sampel dan standar dari cahaya Sampel diproteksi dengan cara mengekstraksinya dalam kondisi cahaya alami
tapi tidak terpapar oleh cahaya matahari dan cahaya fluorescent secara terus menerus. Ekstrak akhirnya ditempatkan di dalam vial yang berwarna gelap yang
mengandung 0.3 mL poli ethilene. Standar disimpan pada suhu -20 C, dalam
pengerjaannya standar juga sama dengan sampel. Semua standar diproteksi cahaya langsung matahari dan disimpan pada 4
C bila sedang tidak digunakan. 3. Pengukuran
Siapkan standar seperti pada Tabel 14 dan disimpan pada suhu -20 C. Standar
harus dikalibrasi setiap minggu. Untuk penyesuaian dengan peralatan standar kerja disiapkan di dalam pelarut yang cocok dengan konsentrasi tertentu seperti
pada Tabel 14. Luas area pada chromatographi untuk setiap standar merupakan perbandingan dengan total area seluruhnya. Dalam penggunaan licopene harus
dalam bentu segar, sensitifitas alat dicek setiap hari dengan mencampurkan standar kerja seperti pada Tabel 14, kemudian mengukur luas panasnya di
chromatography. Biasanya 0.5 mL larutan diuapkan dan dicampurkan ke dalam 0.25 mL phase mobile dan diukur standar deviasinya.
4. Pengecekan recovery Recovery diukur dengan memodifikasi cara yang di atas. Ethanol sebanyak 0.5
mL yang mengandung standar internal kira-kira 40 µmolL dipipet ke 18 tabung
