Metode Lowry (Apriyantono, 1989)

C. Metode Lowry (Apriyantono, 1989)

Pendahuluan Metode Lowry merupakan metode pengukuran protein yang

mempunyai keuntungan 100 kali lebih sensitive dari metode biuret karena selain reaksi antara ion Cu 2+ dengan ikatan peptida juga reduksi asam fosfomolibdat dan asam fosfotungstat oleh tirosin dan triftofan yang merupakan residu protein.

Prinsip Reaksi antara ion Cu 2+ dengan ikatan peptide dan reduksi asam

fosfomolibdat dan asam fosfotungstat oleh tirosin dan triftofan yang merupakan residu protein yang akan menghasilkan warna biru. Warna yang terbentuk terutama dari hasil reduksi fosfomolibdat dan fosfotungstat sehingga warna yang terbentuk tergantung pada

Metode Analisis Bahan Pangan dan Komponen Bioaktif

kadar tirosin dan triftofan dalam protein. Senyawa fenolik yang juga membentuk warna biru dalam metode Lowry ini dapat mengganggu hasil penetapan protein. Gangguan ini dapat dihilangkan dengan cara mengendapkan protein dengan TCA, hilangkan supernatannya lalu melarutkan kembali endapan protein yang diendapkan oleh TCA tadi, baru dianalisa selanjutnya.

Pereaksi

1. Natrium karbonat 2% dalam larutan NaOH 0.1N

2. Tembaga Sulfat 0.5% dalam larutan Na K tartarat 1% (dibuat jika hanya pada waktu akan digunakan).

3. Campuran 50 ml pereaksi (1) dengan 1 ml pereaksi (2), dibuat jika hanya pada waktu akan digunakan, hanya stabil selama 1 hari.

4. Pereaksi Folin Ciocalteau (pereaksi fenol). Biasanya tersedia secara komersial, larutkan dengaN air 1 :1 sebelum digunakan. Peraksi ini dapat dibuat sendiri dengan cara sebagai berikut :

Masukkan 100 gram natrium tungstat, 25 gram natrium molibdat, 500 ml aquades, 50 ml asam fosfat 85% dan 100 ml HCl pekat ke dalam labu 2 liter. Campuran ini kemudian

direfluks dengan hati-hati selama 10 jam dengan menggunakan kondensor. Sesudah didinginkan, tambahkan ke dalam labu

150 gram litium sulfat, 50 ml aquades dan beberapa tetes Br 2 (brom), pendidihan dilanjutkan lagi selam 10 menit dengan tanpa kondensor. Sesudah pendinginan volume larutan dijadikan 100 ml dan saring jika perlu. Filtrat tidak boleh ada warna kehijauan, jika ada pendidihan harus dilakukan sekali lagi. Ini merupakan “stock reagent”, larutkan dengan air 1 : 1 sebelum digunakan.

5. Larutan Protein Standar 0.25 mg/ml (larutan bovine serum albumin)

3. Waring blender

4. Tabung reaksi bertutup

Metode Analisis Bahan Pangan dan Komponen Bioaktif

Prosedur Kerja Pembuatan Kurva Standar

1. Masukkan ke dalan tabung reaksi : 0 (blanko), 0.1, 0.2, 0.4, 0.6,

0.8 dan 1.0 ml protein standar.

2. Tambahkan aquades sampai volume total masing-masing 4 ml.

3. Tambahkan 5.5 ml pereaksi (3) ke dalam masing-masing tabung reaksi, campur merata dan biarkan selama 10 – 15 menit pada suhu kamar.

4. Tambahkan 0.5 pereaksi (4) ke dalam masing-masing tabung reaksi, kocok merata dengan cepat setelah penambahan.

5. Biarkan selama kurang lebih 30 menit sampai warna biru terbentuk

6. Ukur absorbansinya pada panjang gelombang 650 nm.

7. Buat kurva standar. Persiapan sampel

1. Sampel harus berupa cairan, jika berbentuk padatan maka harus dihancurkan dulu dengan menggunakan waring blender dan penambahan air. Hancuran yang diperoleh disaring lalu disentrifuse. Supernatan didekantansi untuk dipergunakan selanjutnya. Protein yang terukur pada supernatan adalah “soluble protein” (perhatikan faktor pengenceran).

2. Jika cairan berupa larutan protein seperti protein konsentrat, isolate yang tidak keruh maka persiapan sampel cukup dengan pengenceran secukupnya saja. Jika cairannya keruh atau mengandung bahan- bahan yang mengganggu seperti glukosa maka harus dilakukan perlakuan sebagai berikut.

1. Alikuot atau ekstrak didistribusikan ke dalam tabung reaksi seperti pada waktu penetapan standar, kemudian ditambahkan air sampai volume total masing-masing 1 ml.

2. Kedalam masing-masing tabung reaksi tambahkan 1 ml Trichloro Acetic Acid (TCA) 10% sehingga protein akan terdenaturasi.

3. Sentrifuse pada 3000 rpm selama 10 menit sampai protein yang terdenaturasi mengendap, supernatant dibuang dengan cara dekantansi.

Metode Analisis Bahan Pangan dan Komponen Bioaktif

4. Ke dalam endapan tambahkan 2 ml etil eter, campur merata, kemudian sentrifuse kembali. Ini akan menolong menghilangkan residu TCA. Biarkan mengering pada suhu kamar.

5. Ke dalam endapan kering ditambahkan 4 ml air, campur merata.

6. Tambahkan 6 ml pereaksi Biuret, alkali dalam pereaksi ini akan melarutkan endapan yang tersisa.

Penetapan sampel. Pipet dengan tepat 0.1 s.d 1.0 ml sampel dimasukkan ke dalam tabung

reaksi, kemudian diperlakukan seperti menetapkan standar. Tentukan kadar protein dengan memanfaatkan kurva standar.