Kontruksi dan analisis kualitas pustaka genom kentang (Solanum tuberosum L.) untuk sekuensing genom total
KONSTRUKSI DAN ANALISIS KUALITAS PUSTAKA
GENOM KENTANG (Solanum tuberosum L.) UNTUK
SEKUENSING GENOM TOTAL
YULIANA
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Konstruksi dan
Analisis Kualitas Pustaka Genom Kentang (Solanum tuberosum L.) untuk
Sekuensing Genom Total adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi
pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi
mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan
maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan
dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Oktober 2014
Yuliana
NIM G84100042
ABSTRAK
YULIANA. Konstruksi dan Analisis Kualitas Pustaka Genom Kentang (Solanum
tuberosum L.) untuk Sekuensing Genom Total. Dibimbing oleh I MADE
ARTIKA dan I MADE TASMA.
Salah satu usaha untuk meningkatkan produktivitas kentang yaitu melalui
informasi genetik kentang. Tujuan penelitian yaitu mengkonstruksi pustaka
genom dari empat genotipe kentang di Indonesia (CIP 392781, PT 29, Amudera
dan Margahayu) dan menganalisis kualitas pustaka genom untuk sekuensing
genom total. Konstruksi pustaka genom dilakukan secara in vitro dengan
menempelkan adaptor pada ujung fragmen DNA. Pustaka genom selanjutnya
diklasterisasi dan disekuensing menggunakan cBOT cluster generation dan NGS
HiSeq 2000. Pustaka genom yang berhasil dikonstruksi berukuran 300-600 bp
dengan konsentrasi 13.08-60.14 nM. Pustaka genom yang dikonstruksi telah
memenuhi persyaratan untuk sekuensing genom total. Jumlah basa yang
dihasilkan dari proses sekuensing yaitu sebanyak 287.2 x 109bp. Klaster pustaka
genom dengan nilai Q scores di atas 30 yang dihasilkan lebih besar dari 88.6%.
Tingkat kesalahan pembacaan basa selama proses sekuensing sebesar 0.281.01%%. Secara keseluruhan hasil sekuensing genom termasuk ke dalam kategori
ideal.
Kata kunci : Kentang, Next Generation Sequencing, Pustaka genom, Sekuensing
genom total.
ABSTRACT
YULIANA. Construction and Quality Analysis of Potato (Solanum tuberosum L.)
Genomic Library for Whole Genome Sequencing. Under the direction of I MADE
ARTIKA and I MADE TASMA.
One of the efforts to improve productivity of the potato with the genetic
information. The purpose of this study was to construct genomic libraries of four
potato genotypes of Indonesia (CIP 392781, PT 29, Amudera and Margahayu)
and analyze the quality of genomic library for total genomic sequencing. Genomic
library construction was performed in vitro by attaching the adapter to the ends of
DNA fragments. This was followed by, clustering and sequencing of genomic
library using the cBOT claster Generation and NGS HiSeq2000. Genomic
libraries were successfully constructed with a size of 300-600 bp and
concentration of 13.08 – 60.14 nM. The genomic libraries have met the
requirements for total genome sequencing. The amount of base generated from the
sequencing process was 287.2 x 109 bp. Cluster of genomic library produced with
the value of Q scores above 30 was more than 88.6%. Base reading error rate
during the sequencing process was 0.28-1.01%. Over all result from this genomic
sequencing was belong to the ideal category.
Key words: Potato, Next Generation Sequencing, Genomic library, Whole
genome sequencing.
KONSTRUKSI DAN ANALISIS KUALITAS PUSTAKA
GENOM KENTANG (Solanum tuberosum L.) UNTUK
SEKUENSING GENOM TOTAL
YULIANA
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala yang
telah memberikan rahmat dan karunia-Nya. Shalawat dan salam semoga selalu
tercurah kepada Nabi Muhammad SAW beserta seluruh keluarga, sahabat dan
para pengikutnya sampai akhir zaman sehingga karya ilmiah ini sebagai salah satu
syarat memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biokimia, Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor berhasil
diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan
Desember 2013 hingga Juni 2014 ini ialah biologi molekuler, dengan judul
Konstruksi dan Analisis Kualitas Pustaka Genom Kentang (Solanum tuberosum
L.) untuk Sekuensing Genom Total.
Ucapan terimakasih penulis haturkan kepada kedua pembimbing penelitian
yaitu Dr I Made Artika MApp Sc dan Dr I Made Tasma MSc atas semua ilmu,
saran dan dukungan yang diberikan selama penyusunan karya ilmiah ini. Terima
kasih juga penulis ucapkan kepada Mbak Ida Rosdianti SSi, Bapak Dani
Satyawan MSi, Bapak Habib Rijzaani MSi dan Kak Ihsan yang telah banyak
membantu dalam teknis pelaksanaan penelitian, kepada kedua orang tua dan
seluruh keluarga yang selalu menginspirasi penulis untuk selalu berjuang keras
dan menjadi lebih baik.
Penulis juga menyampaikan terima kasih kepada Syahdan, Asep, Mbak
Titin, rekan-rekan Biokimia 47 dan penghuni 4S kostan atas dukungan, kritik,
bantuan dan sarannya selama penelitian dan penyusunan karya ilmiah ini. Semoga
karya ilmiah ini dapat bermanfaat bagi penulis dan untuk perkembangan ilmu
pengetahuan umumnya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Oktober 2014
Yuliana
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ............................................................................................... x
DAFTAR GAMBAR ........................................................................................... x
DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................................ x
PENDAHULUAN ............................................................................................... 1
METODE ............................................................................................................ 2
Bahan dan Alat ................................................................................................. 2
Prosedur Penelitian ........................................................................................... 3
HASIL ................................................................................................................. 8
PEMBAHASAN ................................................................................................ 15
SIMPULAN DAN SARAN ............................................................................... 26
Simpulan ........................................................................................................ 26
Saran .............................................................................................................. 26
DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................ 26
LAMPIRAN ...................................................................................................... 29
RIWAYAT HIDUP ........................................................................................... 33
DAFTAR TABEL
1 Kuantitas dan kemurnian DNA genom total kentang.
Halaman
8
2 Konsentrasi double stranded DNA hasil isolasi
9
3 Kuantitas dan kemurnian DNA
10
4 Kuantitas dan kemurnian DNA setelah tahapan adenilasi ujung 3’
10
5 Kuantitas dan kemurnian DNA
11
6 Kualitas dan kuantitas pustaka
12
7 Kuantitas pustaka genom kentang diukur menggunakan qPCR
13
8 Jumlah basa dan kualitas klaster pustaka genom
13
9 Densitas dan kualitas pustaka genom hasil sekuensing
14
10Tingkat kesalahan (error rate)
15
DAFTAR GAMBAR
1
Elektroforegram DNA genom hasil isolasi
8
2
Elektroforegram DNA genom kentang hasil fragmentasi
9
3
Elektroforegram DNA hasil purifikasi
10
4 Elektroforegram DNA genom kentang hasil amplifikasi
11
5
Elektroforegram pustaka genom kentang dengan analisis bioanalyzer
12
6
Kualitas pustaka genom kentang menggunakan photocap_MW
12
7
Histogram jumlah klaster
14
DAFTAR LAMPIRAN
1 Strategi penelitian
29
2 Hasil pengukuran kuantitas pustaka genom
30
3 Grafik intensitas persentase hasil sekuensing pustaka genom
31
4 Proses klasterisasi di dalam cBOT
31
5 Proses sekuensing DNA menggunakan NGS Hiseq 2000 (Huson 2010)
32
1
PENDAHULUAN
Kentang (Solanum tuberosum L.) merupakan salah satu komoditas sayuran
penting yang termasuk dalam subsektor hortikultura di Indonesia. Kentang
termasuk sayuran semusim, berumur pendek, dan berbentuk perdu dan merupakan
tanaman semusim karena hanya satu kali berproduksi dan setelah itu mati (Samadi
2007). Kentang merupakan salah satu pangan utama dunia sesudah padi, gandum
dan jagung yang punya asam amino lengkap dibandingkan padi dan gandum yang
kekurangan asam amino lisin dan jagung yang kekurangan asam amino triptofan.
Kentang juga memiliki nutrisi yang tinggi diantaranya karbohidrat, protein,
mineral, asam nukleat, beberapa vitamin C, vitamin B kompleks serta vitamin A.
kJ (Wagih dan Wiersena 1994 ; Wattimena 1996).
Produktivitas kentang di Indonesia masih tergolong rendah karena area
pertanamannya hanya di daerah tertentu saja. Menurut data Badan Pusat Statistik
(2014), produktivitas kentang di Indonesia pada tahun 2012 adalah sebesar 16.58
ton/Ha dengan jumlah produksi sebesar 1.094.240 ton pada luas areal lahan
65.989 Ha dan data sementara BPS untuk tahun 2013 produktivitas kentang
mengalami penurunan menjadi sebesar 16.27 ton/Ha dengan produksi kentang
sebesar 1.023.381 ton pada luas lahan panen 62.900 Ha. Data ini menunjukkan
penurunan terhadap kentang baik dari segi lahan maupun hasil produksi panen
kentang ini sendiri.
Menurut Listanto (2010), rendahnya produktivitas kentang disebabkan oleh
beberapa faktor antara lain : tidak tersedianya varietas super, mutu benih yang
rendah, serangan hama dan penyakit serta teknik budidaya maupun penanganan
pasca panen yang kurang tepat. Usaha-usaha untuk meningkatkan produktivitas
kentang telah banyak dilakukan. Perbaikan tanaman dan peningkatan produksi
lebih lanjut menurut Puspita (2002), dapat dicapai dengan pemanfaatan sumber
plasma nutfah, baik melalui pemuliaan tanaman secara konvensional maupun
rekayasa genetika. Produksi pangan pada masa mendatang akan lebih banyak
bergantung pada penerapan teknologi daripada peningkatan luas lahan pertanian.
Teknik yang banyak berkembang sekarang diantaranya adalah teknik rekayasa
genetika.
Penciptaan bahan unggul pada kentang ini dihubungkan dengan studi
genetik yang melibatkan peranan gen didalamnya. Pemuliaan dengan marka
molekuler nantinya dapat mengetahui gen yang menyandi ketahanan kentang
terhadap penyakit dan hama. Teknik yang berkembang saat sekarang dan juga
sangat banyak membantu dalam penanda molekuler adalah teknik sekuensing
DNA. Sekuensing DNA merupakan teknik kunci untuk berbagai perkembangan
ilmu pengetahuan diantaranya arkeologi, antropologi, ilmu genetika, bioteknologi,
biologi molekular dan ilmu forensik (Franca et al. 2002). Sekuensing DNA terdiri
dari dua jenis yaitu sekuensing fragmen DNA dan sekuensing genom total.
Perbedaan kedua jenis sekuensing tersebut terletak pada metode dan jumlah basa
yang akan disekuens. Sekuens fragmen DNA menggunakan untai DNA pendek
sekitar 100-1000 bp. Metode yang digunakan untuk sekuens fragmen DNA adalah
metode chain termination. Sekuensing genom total (whole genome sequencing)
adalah proses penentuan sekuen genom suatu organisme yang dilakukan pada satu
waktu.
2
Tahapan sekuensing genom total kentang diawali dengan mengkonstruksi
pustaka genom kentang. Konstruksi pustaka genom menggunakan Low
Throughput Protocol dari illumina dan disekuensing menggunakan NGS Illumina
Hiseq 2000. Konstruksi pustaka ini relatif sangat mudah dan singkat karena tidak
membutuhkan vektor untuk menyisipkan fragmen DNA dan juga tidak
membutuhkan ruangan khusus untuk penyimpanan. Konstruksi ini juga tidak
membutuhkan DNA dalam jumlah banyak hanya membutuhkan double stranded
DNA (dsDNA) dengan konsentrasi rendah (20 ng/uL).
Penelitian ini bertujuan mengkonstruksi dan menganalisis kualitas pustaka
genom total untuk mengetahui karakteristik genom kentang empat genotipe
kentang yang diteliti. Hipotesis penelitian ini adalah dapat mengkonstruksi
pustaka genom kentang dan kemudian disekuensing menggunakan NGS Hiseq
2000. Manfaat yang diperoleh dari penelitian ini yaitu diperoleh informasi dan
studi keseluruhan tentang genom kentang. Manfaat lain yaitu urutan DNA yang
dihasilkan diharapkan mampu untuk menunjang program perbaikan genetika
tanaman untuk menunjang program pemuliaan tanaman kentang.
METODE
Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan untuk isolasi DNA adalah daun kentang yang
diambil dari Balai Penelitian Sayuran di Lembang dan yang ditanam di BB
Biogen dengan empat genotipe kentang (CIP 392781, PT 29, Amudra dan
Margahayu), es batu, etanol teknis, bufer ekstraksi CTAB (Cetil Trimetil
Amonium Bromida), NaOAc (natrium asetat), chisam (kloroform : isoamil
alkohol) dengan perbandingan 24 : 1, isopropanol, bufer TE, etanol absolut dan
etanol 70%, natrium bisulfit, dan 2% polivinilpirolidon. Bahan-bahan yang
digunakan untuk fragmentasi DNA adalah DNA hasil isolasi dan resuspension
buffer.
Bahan-bahan yang digunakan untuk modifikasi ujung fragmen DNA adalah
end repair control, end repair mix, AMPure XP Beads, etanol 80%, dan
resuspension buffer. Bahan-bahan yang digunakan untuk adenilasi ujung 3’OH
DNA adalah A-tailing control dan A-tailing mix. Bahan-bahan yang digunakan
untuk ligasi adapter adalah ligase control, DNA ligase mix, DNA adapter index,
stop ligase buffer, AMPure XP Beads, etanol 80%, dan resuspension buffer.
Bahan-bahan yang digunakan untuk pemurnian DNA hasil ligasi adalah serbuk
agarosa, buffer TAE 1X, SyBr Gold, loading dye, DNA ladder, dan nuclease free
water. Bahan-bahan yang digunakan untuk perbanyakan DNA adalah PCR Primer
Cocktail, PCR Master Mix, AMPure XP Beads, etanol 80%, dan Resuspension
Buffer. Bahan-bahan yang digunakan untuk klasterisasi dan sekuensing genom
kentang adalah 2 N NaOH, 1 N NaOH, 0.1 N NaOH, bufer hibridisasi (HT1),
Tris-Cl, 10 nM, PhiX library, akuades, EtOH 70 %, buffer library, TruSeq SR
Cluster Kit v3- HS (cBot), Truseq SBS Kit-HS (200 cycle).
Alat-alat yang digunakan meliputi tabung eppendorf 15 mL, tabung 2 mL,
tabung 1.5 mL, inkubator thermostat, sentrifus 5810R eppendorf, tissue lyser,
3
tungsten bead, batang magnet, vortex, mikropipet, nanodrop thermoscientific
2000 spectrophotometer, instrument Covaris M220, tabung AFA Covaris
snap_cap dan srew_cap, microwave, mikrosentrifus, kotak es, sarung tangan karet,
neraca analitik, sudip, tabung Durant, parafilm, Vortex Maxi Mix II, power supply,
perangkat elektroforesis, instrument Agilent 2100 bionalyzer, High sensitivity
DNA chip Agilent Technologies, Qubit 2.0 Fluorometer invitrogen, realtime PCR
2000 Sequence detection system ABI PRISM, thermocycler Biometra, IKA MS 3
Vortexer, UV transilluminator High Performance 2UV, mesin pendingin, alat
pengering Thermoscientific Savant DNA 120 spedvac evaporator, cBot Cluster
Generation, Illumina Hiseq 2000.
Prosedur Penelitian
Isolasi DNA Genom Kentang (Modifikasi Metode Doyle dan Doyle 1987)
Daun kentang yang masih muda dan segar ditimbang sebanyak 50 mg dan
kemudian ke dalam tabung berisi daun ditambahkan buffer ekstraksi (CTAB 2%,
Na-bisulfid dan PVP 2%) sebanyak 400 µL. Dua butir tungsten bead dimasukkan
ke dalam tabung berisi sampel dan kemudian digerus menggukan tissue lyser
dengan frekuensi 25/5 selama 30 detik dan kemudian diulangi lagi dengan posisi
sebaliknya. Inkubasi sampel pada 650C selama 30 menit dan dibolak-balik secara
berkala (10 menit). Kemudian, ke dalam sampel yang telah dipanaskan tersebut
ditambahkan CHISAM (24:1) sebanyak 750 µL dikocok bolak-balik selama 5
menit. Campuran larutan kemudian disentrifugasi pada kecepatan 12000 rpm
selama 15 menit pada suhu 250C dan supernatan dipindahkan ke dalam tabung
baru (lebih kurang 600µL supernatan). Selanjutnya ke dalam supernatan tersebut
ditambahkan 60µL Na-asetat 3M dan dibolak balik kemudian tambahkan 600 µL
isopropanol dingin dan disimpan di dalam pendingin -20 0C selama 1 jam dan
setelahnya dibolak balik perlahan kemudian didinginkan lagi selama 15 menit.
Setelah dikeluarkan dari pendingin, larutan kemudian disentrifugasi 12000
rpm selama 15 menit pada suhu 40C. Supernatan hasil sentrifugasi dibuang dan
pelet yang dihasilkan kemudian dicuci dengan menambahkan 200 µL etanol 70%
dingin dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan 12000 rpm selama 5 menit
pada suhu 40C. Cairan kemudian dibuang dan pelet dikeringkan menggunakan
vakum evaporator selama 15 menit. Endapan hasil pengeringan kemudian
dilarutkan dengan 50 µL buffer TE pH 8.0 hingga larut atau dengan dipanaskan
pada 650C selama 15 menit. Enzim RNAse kemudian ditambahkan 1/50 kali
volume DNA atau sebanyak 1µL untuk menghilangkan RNA dan kemudian
diinkubasi kembali selama 37oC selama 30 menit. Tahap selanjutnya adalah uji
kualitas dengan menggunakan gel agarose 1%,, uji kuantitas untuk konsentrasi
asam nukleat menggunakan nanodrop spektrofotometer DNA dan uji double
stranded DNA dengan menggunakan fluorometer Qubit ds DNA BR.
Uji Kualitatif DNA Genom Kentang
Uji kualitatif DNA dilakukan dengan menggunakan elektroforesis gel
agarosa 1%. Gel agarosa dibuat dengan menambahkan agarosa sebanyak 1.1 g ke
4
dalam 110 mL larutan TAE 1X. Larutan kemudian dipanaskan hingga larut dan
didinginkan pada suhu kamar hingga hangat dan dituang ke dalam cetakan gel
elektroforesis yang telah dipasangi sisir (cetakan sumur) hingga gel memadat. Gel
yang sudah padat dipindahkan ke dalam bak elektroforesis yang berisi TAE 1X.
Selanjutnya dibuat loading buffer dengan campuran blue juice 6x sebanyak 2 μL,
SyBr Gold 100x 0.5 µL, molecular water 7.5 µL. Sampel yang akan
dielektroforesis pada penelitian ini sebanyak 2 µL sampel DNA pada parafilm.
Setelah tercampur maka campuran sampel diinjeksi ke dalam sumur gel agarosa.
Marker yang digunakan adalah 100 bp plus DNA ladder sebanyak 5.5 μL
ditambah 0.5 µL SyBr Gold 100x. Setelah semua sampel selesai diinjeksi maka
alat elektroforesis dihubungkan pada power supply yang dialiri tegangan listrik
100 volt selama 30 menit. Hasil elektroforesis diamati dengan bantuan lampu UV
dalam trasnsilluminator dan didokumentasikan.
Uji Kuantitatif DNA Genom Kentang (Invitrogen 2010)
Uji kuantitatif untuk konsentrasi dan kemurnian asam nukleat dilakukan
dengan menggunakan spektrofotometer nanodrop thermoscientific, USA dengan
blanko yang digunakan adalah larutan TE pH 8.0. Sebelum digunakan lubang
optik dibersihkan terlebih dahulu dengan menggunakan nuclease free water.
Sebanyak 1 ul Larutan TE dimasukkan ke dalam lubang optik nanodrop
thermoscientific ditutup dan kemudian dipilih menu measure blank pada
komputer. Kemudian, lubang optik dibersihkan kembali dan sampel DNA
sebanyak 1 μL dimasukkan ke dalam lubang optik. Setelah itu, hasil pengukuran
akan muncul dalam konsentrasi ng/μL dan kemurnian DNA dapat dilihat langsung
dalam A280 dan A260. Uji kuantitas DNA dilakukan untuk mengetahui
konsentrasi dan kemurnian DNA dengan perbandingan A260/280 yang baik
sekitar 1.8 hingga 2.0.
Uji double stranded DNA (dsDNA) dilakukan dengan menggunakan
fluorometer Qubit ds DNA BR. Pengenceran larutan Qubit disiapkan dengan
perbandingan reagen 1: 200 dalam buffer Qubit. Beberapa tabung khusus
disiapkan dengan campuran larutan reagen dan buffer Qubit total 198 µL dan ke
dalamnya ditambahkan 2 µL DNA. Semua tabung yang sudah diisi dengan larutan
di vortex selama ± 3 detik dan kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 2
menit. Setelah diinkubasi, tabung kemudian dimasukkan pada alat Qubit 2.0
fluorometer dan konsentrasi dsDNA dapat dilihat pada layar dan dihitung
menggunakan rumus.
Konstruksi Pustaka Genom Kentang (TruSeq DNA low throughput protocol
(Illumina 2010a) )
Fragmentasi DNA. DNA diencerkan dalam resuspension buffer dengan
total keseluruhan volume yang telah dicampur 130 µL (berat DNA 2.6 ug).
Larutan dipipet dan dipindahkan ke dalam tabung Covaris sebanyak 130 µL dan
dimasukkan ke dalam alat instrument Covaris. Program dipilih secara manual
yaitu metode DNA 0300-130 µL_Snap_Cap tabung mikro yaitu program
pemotongan DNA dalam ukuran 300 bp. Tabung covaris dimasukkan ke dalam
alat dan running hingga 75 detik. Proses ini dilakukan dengan hati-hati karena
5
sensor alat ini sangat sensitif. Hasil dari fragmentasi Covaris dipindahkan ke
dalam tabung PCR sebanyak 50 µL (berat DNA 1 ug).
Modifikasi Ujung Fragmen DNA. Modifikasi diawali dengan pembuatan
Insert Modification Plate (IMP). Sebanyak 10 µL End repair control dan 40 µL
End Repair Mix ditambahkan ke dalam tabung yang mengandung 50 µL DNA
hasil fragmentasi. Sampel dicampurkan menggunakan pipet mikro dengan cara
dinaik turunkan sebanyak 10 kali. Tabung yang berisi sampel ditutup dan
diinkubasi dalam thermalcycler selama 30 menit pada suhu 300C.
Langkah selanjutnya yaitu pemurnian IMP yang diawali dengan
penambahan 160 µL AMPure XP Beads yang telah divorteks ke dalam sampel..
Sampel dicampurkan menggunakan pipet mikro dengan cara dinaik turunkan
sebanyak 10 kali. Campuran sampel dan AMPure XP Beads diinkubasi selama 15
menit pada suhu ruang. Tabung yang berisi sampel kemudian dipindahkan keatas
batang magnet pada suhu ruang selama 15 menit. Sebanyak 127.5 µL supernatan
dibuang dengan hati-hati jangan sampai mengenai pelet yang terletak pada
dinding tabung. Tahapan sebelumnya diulangi kembali untuk menghilangkan
supernatan yang masih tersisa. Pada proses pencucian pelet, sebanyak 200 µL
etanol 80% ditambahkan dan diinkubasi selama 30 detik. Selanjutnya, etanol 80%
yang telah ditambahkan dibuang dan dilakukan sebanyak 2 kali ulangan. Pelet
kemudian dikeringkan selama 15 menit pada suhu ruang dan dipindahkan dari
batang magnet. Resuspension buffer sebanyak 17.5 µL ditambahkan ke dalam
tabung yang berisi pelet dan sampel dicampurkan menggunakan pipet mikro
dengan cara dinaik turunkan sebanyak 10 kali. Selanjutnya, tabung berisi sampel
diinkubasi selama 2 menit pada suhu ruang. Tabung yang berisi sampel kemudian
dipindahkan ke atas batang magnet pada suhu ruang selama 5 menit untuk
memisahkan supernatan dengan pelet. Sebanyak 15 µL supernatan dipindahkan ke
dalam tabung yang baru dan disimpan dalam mesin pendingin. Tahapan
selanjutnya yang bisa dilakukan adalah pengukuran kuantitas dan kualitas hasil
modifikasi ujung jika supernatant di dalam tabung masih tersisa. Tahapan
pemurnian menggunakan AMPure XP Beads juga dilakukan pada proses tahapan
penempelan adaptor dan proses perbanyakan fragmen DNA.
Adenilasi Ujung 3’ DNA. A-tailing control 2.5 µL dan A-tailing mix 12.5
µL ditambahkan ke dalam tabung yang berisi sampel. Sampel dicampurkan
menggunakan pipet mikro dengan cara dinaik turunkan sebanyak 10 kali. Tabung
yang berisi sampel ditutup dan diinkubasi dalam thermalcycler selama 30 menit
pada suhu 370C dan setelahnya langsung dilanjutkan dengan tahapan penempelan
adaptor.
Penempelan Adaptor. Sebanyak 2.5 ul Ligase control, 2.5 µL DNA Ligase
Mix dan 2.5 µL dan DNA Adapter Index ditambahkan ke dalam tabung yang berisi
sampel. Sampel dicampurkan menggunakan pipet dengan cara dinaik turunkan
sebanyak 10 kali. Tabung yang berisi sampel ditutup dan diinkubasi dalam
thermalcycler selama 10 menit pada suhu 300C. Sebanyak 5 µL Stop Ligase Mix
ditambahkan ke dalam tabung yang berisi sampel. Kemudian sampel dicampurkan
menggunakan pipet mikro dengan cara dinaik turunkan sebanyak 10 kali.
Langkah selanjutnya yaitu pemurnian sampel yang diawali dengan
penambahan 42.5 µL AMPure XP Beads dengan mengikuti prosedur yang sama
dengan sebelumnya. Selanjutnya resuspension buffer sebanyak 22.5 µL
ditambahkan ke dalam tabung yang berisi pelet. Sampel dicampurkan dan
6
diinkubasi pada suhu ruang. Sebanyak 20 µL supernatan dipindahkan ke dalam
tabung yang baru dan disimpan dalam mesin pendingin. Tahapan selanjutnya yang
dilakukan adalah pengukuran kuantitas dan kualitas hasil adenilasi dan
penempelan adaptor jika supernatan di dalam tabung masih tersisa.
Pemurnian DNA Hasil Ligasi. Pemurnian hasil ligasi terdiri dari dua tahap
yaitu pemisahan ukuran fragmen DNA melalui elektroforesis dan ekstraksi gel.
Pemisahan ukuran fragmen DNA diawali dengan pembuatan gel agarosa 2%.
Sebanyak 1.2 gram bubuk agarosa ditimbang dan ditambahkan larutan TAE 1x
sebanyak 60 mL. Larutan kemudian dipanaskan dalam microwave sampai semua
agarosa larut. Setelah suhu larutan hangat, kemudian tambahkan 6 uL pewarna
SyBr Gold dan kocok hingga homogen. Kemudian larutan dituang ke dalam
cetakan yang telah disiapkan.
Elektroforesis diawali dengan disiapkannya seperangkat bak elektroforesis,
kemudian larutan TAE 1x dituangkan ke dalam bak hingga gel terendam bagian
bawahnya. Selanjutnya, ditempat terpisah sebanyak 4 ul loading dye 6x
ditambahkan ke dalam tabung berisi 20 ul sampel hasil ligasi. Sebanyak 12 ul
penanda DNA ladder 100 bp diinjeksikan pada sumur gel yang tersedia. Sampel
kemudian dimasukkan ke dalam sumur gel yang tersedia. Cetakan agarosa di buat
dengan 2 kolom dimana pada kolom ke dua berisi nuclease free water sebanyak
25 ul. Sampel kemudian di elektroforesis pada kuat arus 100 volt selama 60 menit.
Hasil elektroforesis dilihat di atas lampu UV transiluminator dan
didokumentasikan. Saat telah mendekati ukuran 400 bp, nuclease free water yang
berada pada kolom kedua dipipet dan dimasukkan ke dalam tabung baru (20 ul).
Ukuran fragmen DNA 300 bp, 400 bp dan 500 bp diiris dari gel agarosa dan
disimpan dalam tabung untuk digunakan pada tahapan selanjutnya yaitu ekstraksi
gel jika hasil validasi pustaka tidak mencukupi untuk konsentrasi minimum yang
dibutuhkan untuk proses sekuensing.
Perbanyakan fragmen DNA. Perbanyakan DNA diawali dengan
penambahan 5 µL PCR Primer Cocktail dan 25 µL PCR Master Mix ke dalam
tabung yang berisi sampel. Sampel dicampurkan menggunakan pipet mikro
dengan cara dinaik turunkan sebanyak 10 kali. Tabung kemudian disimpan dalam
mesin PCR untuk proses perbanyakan yang terdiri dari 10 siklus selama 20 menit
dengan rincian reaksi predenaturasi pada suhu 98°C selama 30 detik, denaturasi
pada suhu 98°C selama 10 detik, annealing pada suhu 60°C selama 30 detik,
extension pada suhu 72°C selama 30 detik, dan pasca pemanjangan primer pada
suhu 72°C selama 5 menit.
Tahapan selanjutnya yaitu pemurnian hasil PCR yang diawali dengan
penambahan 50 µL AMPure XP Beads dengan mengikuti prosedur pemurnian
yang sama dengan sebelumnya sebanyak 32.5 µL resuspension buffer
ditambahkan ke dalam tabung yang berisi pelet dan dicampurkan menggunakan.
Sebanyak 30 µL supernatan dipindahkan ke dalam tabung yang baru dan disimpan
dalam mesin pendingin. Tahapan selanjutnya yang bisa dilakukan adalah validasi
terhadap kualitas dan kuantitas pustaka genom yang telah berhasil dikonstruksi.
Validasi kualitas pustaka genom. Uji ini digunakan untuk mengetahui
ukuran fragmen DNA hasil pemotongan yang dilakukan dengan mengikuti
protokol Agilent High Sensitivity DNA Assay. Cip HS DNA diletakkan di atas
priming station chip dan kemudian ke dalam lubang berlabel G ditambahkan 9 ul
dye mix kemudian ditekan menggunakan priming station selama 1 menit. Setelah
7
dibuka kemudian ke dalam lubang lain yang berlabel G ditambahkan 9 ul dye mix
dan marker pada masing-masing lubang kecuali lubang ladder, kemudian ke
dalam lubang ladder ditambahkan 1 ul HS DNA ladder. Sebanyak 1 ul sampel
juga kemudian dimasukkan ke dalam lubang sampel. Cip kemudian di vortex
selama 1 menit dan kemudian di running pada alat agilent 2100 bioanalyser yang
terhubung dengan computer. Kualitas ukuran pustaka juga di ukur dengan
menggunakan software bioinformatika photocap MW.
Validasi kuantitas pustaka genom. Sampel dibuat sebanyak 3 kali ulangan
dan setiap ulangan dibuat pengenceran 1:1000, 1:2000 dan 1:4000 menggunakan
buffer qPCR. Setiap sampel yang telah diencerkan ini kemudian diambil sebanyak
4 ul dan ditambahkan 16 ul reagen qPCR dan dimasukkan ke dalam tabung PCR.
Standar larutan juga dibuat sebanyak 3 ulangan dengan jumlah standar sebanyak 6.
Tabung PCR kemudian di masukkan ke dalam alat qPCR dan di running selama 2
jam. Hasil yang diperoleh akan digunakan untuk perhitungan klasterisasi pustaka
genom. Sebelum klasterisasi pustaka terlebih dahulu dihitung konsentrasi pustaka
genom yang dibutuhkan yaitu sebanyak 2 nM yang diencerkan ke dalam buffer
library (Tris-Cl 10 mM pH 8.5 dan 0.1 % tween 20).
Klasterisasi Pustaka Genom Kentang (cBot cluster generation protocol
(Illumina 2010b)
Klasterisasi DNA diawali dari preparasi sampel yang terdiri dari dua
tahapan, yaitu denaturasi dan pelarutan DNA. Denaturasi diawali dengan
penambahan 0.1 N NaOH ke dalam sampel DNA sehingga diperoleh konsentrasi
DNA pustaka akhir 13 pM. Campuran dinaik turunkan menggunakan pipet hingga
homogen. Sampel diinkubasi selama 5 menit pada suhu ruang untuk
mendenaturasi utas ganda DNA menjadi utas tunggal. DNA yang telah
didenaturasi disimpan dalam mesin pendingin sampai proses pelarutan DNA akan
dilakukan.
Tahapan preparasi sampel selanjutnya yaitu pelarutan DNA dalam buffer
hibridisasi. Sebanyak 987 uL buffer hibridisasi ditambahkan ke dalam template
DNA yang telah didenaturasi sebelumnya sehingga diperoleh konsentrasi akhir 13
pM. Sebanyak 120 µL DNA yang telah dilarutkan ditambahkan ke dalam 1%
PhiX control (1.2 ul) di dalam tabung PCR. Posisi sampel pada tabung dicatat dan
kemudian tabung dimasukkan ke dalam alat cBOT Cluster Generation untuk
dilakukan klasterisasi di dalam suatu flow cell.
Sekuensing Pustaka Genom Kentang (HiSeq 2000 protocol 2011)
Sekuensing pustaka genom menggunakan Illumina HiSeq 2000 terdiri dari
beberapa tahap yaitu persiapan reagen, pemilihan parameter untuk sekuensing,
pemasangan flow cell, sekuensing, dan post-run sequencing (maintenance wash).
Reagen yang digunakan selama sekuensing diantaranya SBS reagen (TruSeq SBS
kit), multiplexing reagen dan paired end reagen. Reagen-reagen tersebut
dimasukkan kedalam rak dan disimpan dalam ruang reagen compartment yang
terdapat dalam Illumina Hiseq 2000. Pemilihan parameter untuk sekuensing
dilakukan melalui Hiseq control software interface. Parameter yang tersedia
diantaranya flow cell ID, experiment, user name, flow cell type, control lane,
8
output folder,confirm first base, keep intensity files, existing recipe, save image
dan align lanes. Tahapan selanjutnya yaitu pemasangan flow cell yang telah
diklasterisasi melalui cBot cluster generation pada flow cell stage. Sekuensing
dilakukan selama sekitar 11 hari dengan panjang pembacaan DNA 2 x 101 siklus.
Tahapan terakhir setelah proses sekuensing selesai dilakukan yaitu dengan
dipindahkannya flow cell dari flow cell stage dan dilakukannya post-run
sequencing yaitu maintenance wash. Tahapan maintenance wash terdiri dari
pembilasan dengan menggunakan air dan NaOH.
HASIL
Hasil DNA Genom Kentang
Isolasi DNA genom kentang dari empat genotipe yaitu CIP 392781, PT 29,
Amudera dan Margahayu dilakukan dengan metode Doyle & Doyle (1987) yang
dimodifikasi. Analisis kualitas pustaka genom kentang dilakukan menggunakan
gel agarosa 1%. DNA genom kentang berhasil diisolasi dengan baik yang
ditunjukkan dengan ukuran pita-pita DNA yang semakin tinggi dari marker dan
semakin mendekati ke sumur gel. Marker DNA yang digunakan adalah 100 bp
(Gambar 1).
Gambar 1 Elektroforegram DNA genom hasil isolasi kentang genotipe 1.
CIP 392781, 2. PT 29, 3. Amudera dan 4. Margahayu
Analisis kuantitatif DNA genom kentang diukur menggunakan nanodrop
spektrofotometer. Pengukuran dilakukan untuk melihat kemurnian DNA genom
kentang dari kontaminasi polisakarida (A260/230) dan protein (A260/280). Tabel 1
menunjukkan masing-masing genotipe kentang menghasilkan DNA dengan
konsentrasi yang tinggi (1039 ng/uL – 3222.5 ng/uL) dan hanya genotipe
Amudera yang memiliki konsentrasi DNA yang rendah yaitu 197.8 ng/uL.
Kemurnian dari masing-masing genotipe kentang sangat murni yang dapat
diketahui dari nilai rasio yang masih berada pada rentang ukuran 1.8-2.0.
Tabel 1 Kuantitas dan kemurnian DNA genom total kentang.
Genotipe
CIP 392781
PT.29
Amudra
Margahayu
[Asam nukleat] (ng/uL)
2787.5
3222.5
197.8
1039
A260/280
1.93
1.95
1.86
1.96
A260/230
2.17
2.1
2.44
2.20
9
Analisis kuantitatif DNA genom kentang selanjutnya yaitu DNA double
stranded (dsDNA) ditunjukkan oleh Tabel 2. Pengukuran dsDNA dilakukan
menggunakan fluorometer. Hasil pengukuran dsDNA menunjukkan konsentrasi
dsDNA yang terdapat pada masing-masing genotipe memenuhi untuk tahapan
fragmentasi. Perhitungan bobot dsDNA untuk konstruksi pustaka genom ini
diperoleh dengan perhitungan :
Tabel 2 Konsentrasi double stranded DNA hasil isolasi
Genotipe
CIP 392781
PT.29
Amudra
Margahayu
[Qubit] (ug/mL)
2.31
1.43
0.482
0.353
Faktor
pengenceran
100
100
200
200
[ds DNA] (ng/uL)
231
143
96.4
70.6
Konstruksi Pustaka Genom DNA Kentang
Fragmentasi DNA Genom Kentang
Pita-pita DNA hasil dari fragmentasi DNA menggunakan prinsip sonikasi
dapat dilihat pada gambar 2. Pita-pita DNA yang smear menunjukkan bahwa
DNA tersebut telah berhasil difragmentasi pada ukuran yang diharapkan (300-400
bp) dengan intensitas yang lebih terang yang berarti bahwa konsentrasi DNA
tinggi terpotong pada ukuran 300-400 bp. Ukuran 300-400 bp dipilih karena
ukuran optimal yang disarankan Illumina untuk proses sekuensing yaitu
GENOM KENTANG (Solanum tuberosum L.) UNTUK
SEKUENSING GENOM TOTAL
YULIANA
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Konstruksi dan
Analisis Kualitas Pustaka Genom Kentang (Solanum tuberosum L.) untuk
Sekuensing Genom Total adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi
pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi
mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan
maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan
dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Oktober 2014
Yuliana
NIM G84100042
ABSTRAK
YULIANA. Konstruksi dan Analisis Kualitas Pustaka Genom Kentang (Solanum
tuberosum L.) untuk Sekuensing Genom Total. Dibimbing oleh I MADE
ARTIKA dan I MADE TASMA.
Salah satu usaha untuk meningkatkan produktivitas kentang yaitu melalui
informasi genetik kentang. Tujuan penelitian yaitu mengkonstruksi pustaka
genom dari empat genotipe kentang di Indonesia (CIP 392781, PT 29, Amudera
dan Margahayu) dan menganalisis kualitas pustaka genom untuk sekuensing
genom total. Konstruksi pustaka genom dilakukan secara in vitro dengan
menempelkan adaptor pada ujung fragmen DNA. Pustaka genom selanjutnya
diklasterisasi dan disekuensing menggunakan cBOT cluster generation dan NGS
HiSeq 2000. Pustaka genom yang berhasil dikonstruksi berukuran 300-600 bp
dengan konsentrasi 13.08-60.14 nM. Pustaka genom yang dikonstruksi telah
memenuhi persyaratan untuk sekuensing genom total. Jumlah basa yang
dihasilkan dari proses sekuensing yaitu sebanyak 287.2 x 109bp. Klaster pustaka
genom dengan nilai Q scores di atas 30 yang dihasilkan lebih besar dari 88.6%.
Tingkat kesalahan pembacaan basa selama proses sekuensing sebesar 0.281.01%%. Secara keseluruhan hasil sekuensing genom termasuk ke dalam kategori
ideal.
Kata kunci : Kentang, Next Generation Sequencing, Pustaka genom, Sekuensing
genom total.
ABSTRACT
YULIANA. Construction and Quality Analysis of Potato (Solanum tuberosum L.)
Genomic Library for Whole Genome Sequencing. Under the direction of I MADE
ARTIKA and I MADE TASMA.
One of the efforts to improve productivity of the potato with the genetic
information. The purpose of this study was to construct genomic libraries of four
potato genotypes of Indonesia (CIP 392781, PT 29, Amudera and Margahayu)
and analyze the quality of genomic library for total genomic sequencing. Genomic
library construction was performed in vitro by attaching the adapter to the ends of
DNA fragments. This was followed by, clustering and sequencing of genomic
library using the cBOT claster Generation and NGS HiSeq2000. Genomic
libraries were successfully constructed with a size of 300-600 bp and
concentration of 13.08 – 60.14 nM. The genomic libraries have met the
requirements for total genome sequencing. The amount of base generated from the
sequencing process was 287.2 x 109 bp. Cluster of genomic library produced with
the value of Q scores above 30 was more than 88.6%. Base reading error rate
during the sequencing process was 0.28-1.01%. Over all result from this genomic
sequencing was belong to the ideal category.
Key words: Potato, Next Generation Sequencing, Genomic library, Whole
genome sequencing.
KONSTRUKSI DAN ANALISIS KUALITAS PUSTAKA
GENOM KENTANG (Solanum tuberosum L.) UNTUK
SEKUENSING GENOM TOTAL
YULIANA
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala yang
telah memberikan rahmat dan karunia-Nya. Shalawat dan salam semoga selalu
tercurah kepada Nabi Muhammad SAW beserta seluruh keluarga, sahabat dan
para pengikutnya sampai akhir zaman sehingga karya ilmiah ini sebagai salah satu
syarat memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biokimia, Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor berhasil
diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan
Desember 2013 hingga Juni 2014 ini ialah biologi molekuler, dengan judul
Konstruksi dan Analisis Kualitas Pustaka Genom Kentang (Solanum tuberosum
L.) untuk Sekuensing Genom Total.
Ucapan terimakasih penulis haturkan kepada kedua pembimbing penelitian
yaitu Dr I Made Artika MApp Sc dan Dr I Made Tasma MSc atas semua ilmu,
saran dan dukungan yang diberikan selama penyusunan karya ilmiah ini. Terima
kasih juga penulis ucapkan kepada Mbak Ida Rosdianti SSi, Bapak Dani
Satyawan MSi, Bapak Habib Rijzaani MSi dan Kak Ihsan yang telah banyak
membantu dalam teknis pelaksanaan penelitian, kepada kedua orang tua dan
seluruh keluarga yang selalu menginspirasi penulis untuk selalu berjuang keras
dan menjadi lebih baik.
Penulis juga menyampaikan terima kasih kepada Syahdan, Asep, Mbak
Titin, rekan-rekan Biokimia 47 dan penghuni 4S kostan atas dukungan, kritik,
bantuan dan sarannya selama penelitian dan penyusunan karya ilmiah ini. Semoga
karya ilmiah ini dapat bermanfaat bagi penulis dan untuk perkembangan ilmu
pengetahuan umumnya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Oktober 2014
Yuliana
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ............................................................................................... x
DAFTAR GAMBAR ........................................................................................... x
DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................................ x
PENDAHULUAN ............................................................................................... 1
METODE ............................................................................................................ 2
Bahan dan Alat ................................................................................................. 2
Prosedur Penelitian ........................................................................................... 3
HASIL ................................................................................................................. 8
PEMBAHASAN ................................................................................................ 15
SIMPULAN DAN SARAN ............................................................................... 26
Simpulan ........................................................................................................ 26
Saran .............................................................................................................. 26
DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................ 26
LAMPIRAN ...................................................................................................... 29
RIWAYAT HIDUP ........................................................................................... 33
DAFTAR TABEL
1 Kuantitas dan kemurnian DNA genom total kentang.
Halaman
8
2 Konsentrasi double stranded DNA hasil isolasi
9
3 Kuantitas dan kemurnian DNA
10
4 Kuantitas dan kemurnian DNA setelah tahapan adenilasi ujung 3’
10
5 Kuantitas dan kemurnian DNA
11
6 Kualitas dan kuantitas pustaka
12
7 Kuantitas pustaka genom kentang diukur menggunakan qPCR
13
8 Jumlah basa dan kualitas klaster pustaka genom
13
9 Densitas dan kualitas pustaka genom hasil sekuensing
14
10Tingkat kesalahan (error rate)
15
DAFTAR GAMBAR
1
Elektroforegram DNA genom hasil isolasi
8
2
Elektroforegram DNA genom kentang hasil fragmentasi
9
3
Elektroforegram DNA hasil purifikasi
10
4 Elektroforegram DNA genom kentang hasil amplifikasi
11
5
Elektroforegram pustaka genom kentang dengan analisis bioanalyzer
12
6
Kualitas pustaka genom kentang menggunakan photocap_MW
12
7
Histogram jumlah klaster
14
DAFTAR LAMPIRAN
1 Strategi penelitian
29
2 Hasil pengukuran kuantitas pustaka genom
30
3 Grafik intensitas persentase hasil sekuensing pustaka genom
31
4 Proses klasterisasi di dalam cBOT
31
5 Proses sekuensing DNA menggunakan NGS Hiseq 2000 (Huson 2010)
32
1
PENDAHULUAN
Kentang (Solanum tuberosum L.) merupakan salah satu komoditas sayuran
penting yang termasuk dalam subsektor hortikultura di Indonesia. Kentang
termasuk sayuran semusim, berumur pendek, dan berbentuk perdu dan merupakan
tanaman semusim karena hanya satu kali berproduksi dan setelah itu mati (Samadi
2007). Kentang merupakan salah satu pangan utama dunia sesudah padi, gandum
dan jagung yang punya asam amino lengkap dibandingkan padi dan gandum yang
kekurangan asam amino lisin dan jagung yang kekurangan asam amino triptofan.
Kentang juga memiliki nutrisi yang tinggi diantaranya karbohidrat, protein,
mineral, asam nukleat, beberapa vitamin C, vitamin B kompleks serta vitamin A.
kJ (Wagih dan Wiersena 1994 ; Wattimena 1996).
Produktivitas kentang di Indonesia masih tergolong rendah karena area
pertanamannya hanya di daerah tertentu saja. Menurut data Badan Pusat Statistik
(2014), produktivitas kentang di Indonesia pada tahun 2012 adalah sebesar 16.58
ton/Ha dengan jumlah produksi sebesar 1.094.240 ton pada luas areal lahan
65.989 Ha dan data sementara BPS untuk tahun 2013 produktivitas kentang
mengalami penurunan menjadi sebesar 16.27 ton/Ha dengan produksi kentang
sebesar 1.023.381 ton pada luas lahan panen 62.900 Ha. Data ini menunjukkan
penurunan terhadap kentang baik dari segi lahan maupun hasil produksi panen
kentang ini sendiri.
Menurut Listanto (2010), rendahnya produktivitas kentang disebabkan oleh
beberapa faktor antara lain : tidak tersedianya varietas super, mutu benih yang
rendah, serangan hama dan penyakit serta teknik budidaya maupun penanganan
pasca panen yang kurang tepat. Usaha-usaha untuk meningkatkan produktivitas
kentang telah banyak dilakukan. Perbaikan tanaman dan peningkatan produksi
lebih lanjut menurut Puspita (2002), dapat dicapai dengan pemanfaatan sumber
plasma nutfah, baik melalui pemuliaan tanaman secara konvensional maupun
rekayasa genetika. Produksi pangan pada masa mendatang akan lebih banyak
bergantung pada penerapan teknologi daripada peningkatan luas lahan pertanian.
Teknik yang banyak berkembang sekarang diantaranya adalah teknik rekayasa
genetika.
Penciptaan bahan unggul pada kentang ini dihubungkan dengan studi
genetik yang melibatkan peranan gen didalamnya. Pemuliaan dengan marka
molekuler nantinya dapat mengetahui gen yang menyandi ketahanan kentang
terhadap penyakit dan hama. Teknik yang berkembang saat sekarang dan juga
sangat banyak membantu dalam penanda molekuler adalah teknik sekuensing
DNA. Sekuensing DNA merupakan teknik kunci untuk berbagai perkembangan
ilmu pengetahuan diantaranya arkeologi, antropologi, ilmu genetika, bioteknologi,
biologi molekular dan ilmu forensik (Franca et al. 2002). Sekuensing DNA terdiri
dari dua jenis yaitu sekuensing fragmen DNA dan sekuensing genom total.
Perbedaan kedua jenis sekuensing tersebut terletak pada metode dan jumlah basa
yang akan disekuens. Sekuens fragmen DNA menggunakan untai DNA pendek
sekitar 100-1000 bp. Metode yang digunakan untuk sekuens fragmen DNA adalah
metode chain termination. Sekuensing genom total (whole genome sequencing)
adalah proses penentuan sekuen genom suatu organisme yang dilakukan pada satu
waktu.
2
Tahapan sekuensing genom total kentang diawali dengan mengkonstruksi
pustaka genom kentang. Konstruksi pustaka genom menggunakan Low
Throughput Protocol dari illumina dan disekuensing menggunakan NGS Illumina
Hiseq 2000. Konstruksi pustaka ini relatif sangat mudah dan singkat karena tidak
membutuhkan vektor untuk menyisipkan fragmen DNA dan juga tidak
membutuhkan ruangan khusus untuk penyimpanan. Konstruksi ini juga tidak
membutuhkan DNA dalam jumlah banyak hanya membutuhkan double stranded
DNA (dsDNA) dengan konsentrasi rendah (20 ng/uL).
Penelitian ini bertujuan mengkonstruksi dan menganalisis kualitas pustaka
genom total untuk mengetahui karakteristik genom kentang empat genotipe
kentang yang diteliti. Hipotesis penelitian ini adalah dapat mengkonstruksi
pustaka genom kentang dan kemudian disekuensing menggunakan NGS Hiseq
2000. Manfaat yang diperoleh dari penelitian ini yaitu diperoleh informasi dan
studi keseluruhan tentang genom kentang. Manfaat lain yaitu urutan DNA yang
dihasilkan diharapkan mampu untuk menunjang program perbaikan genetika
tanaman untuk menunjang program pemuliaan tanaman kentang.
METODE
Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan untuk isolasi DNA adalah daun kentang yang
diambil dari Balai Penelitian Sayuran di Lembang dan yang ditanam di BB
Biogen dengan empat genotipe kentang (CIP 392781, PT 29, Amudra dan
Margahayu), es batu, etanol teknis, bufer ekstraksi CTAB (Cetil Trimetil
Amonium Bromida), NaOAc (natrium asetat), chisam (kloroform : isoamil
alkohol) dengan perbandingan 24 : 1, isopropanol, bufer TE, etanol absolut dan
etanol 70%, natrium bisulfit, dan 2% polivinilpirolidon. Bahan-bahan yang
digunakan untuk fragmentasi DNA adalah DNA hasil isolasi dan resuspension
buffer.
Bahan-bahan yang digunakan untuk modifikasi ujung fragmen DNA adalah
end repair control, end repair mix, AMPure XP Beads, etanol 80%, dan
resuspension buffer. Bahan-bahan yang digunakan untuk adenilasi ujung 3’OH
DNA adalah A-tailing control dan A-tailing mix. Bahan-bahan yang digunakan
untuk ligasi adapter adalah ligase control, DNA ligase mix, DNA adapter index,
stop ligase buffer, AMPure XP Beads, etanol 80%, dan resuspension buffer.
Bahan-bahan yang digunakan untuk pemurnian DNA hasil ligasi adalah serbuk
agarosa, buffer TAE 1X, SyBr Gold, loading dye, DNA ladder, dan nuclease free
water. Bahan-bahan yang digunakan untuk perbanyakan DNA adalah PCR Primer
Cocktail, PCR Master Mix, AMPure XP Beads, etanol 80%, dan Resuspension
Buffer. Bahan-bahan yang digunakan untuk klasterisasi dan sekuensing genom
kentang adalah 2 N NaOH, 1 N NaOH, 0.1 N NaOH, bufer hibridisasi (HT1),
Tris-Cl, 10 nM, PhiX library, akuades, EtOH 70 %, buffer library, TruSeq SR
Cluster Kit v3- HS (cBot), Truseq SBS Kit-HS (200 cycle).
Alat-alat yang digunakan meliputi tabung eppendorf 15 mL, tabung 2 mL,
tabung 1.5 mL, inkubator thermostat, sentrifus 5810R eppendorf, tissue lyser,
3
tungsten bead, batang magnet, vortex, mikropipet, nanodrop thermoscientific
2000 spectrophotometer, instrument Covaris M220, tabung AFA Covaris
snap_cap dan srew_cap, microwave, mikrosentrifus, kotak es, sarung tangan karet,
neraca analitik, sudip, tabung Durant, parafilm, Vortex Maxi Mix II, power supply,
perangkat elektroforesis, instrument Agilent 2100 bionalyzer, High sensitivity
DNA chip Agilent Technologies, Qubit 2.0 Fluorometer invitrogen, realtime PCR
2000 Sequence detection system ABI PRISM, thermocycler Biometra, IKA MS 3
Vortexer, UV transilluminator High Performance 2UV, mesin pendingin, alat
pengering Thermoscientific Savant DNA 120 spedvac evaporator, cBot Cluster
Generation, Illumina Hiseq 2000.
Prosedur Penelitian
Isolasi DNA Genom Kentang (Modifikasi Metode Doyle dan Doyle 1987)
Daun kentang yang masih muda dan segar ditimbang sebanyak 50 mg dan
kemudian ke dalam tabung berisi daun ditambahkan buffer ekstraksi (CTAB 2%,
Na-bisulfid dan PVP 2%) sebanyak 400 µL. Dua butir tungsten bead dimasukkan
ke dalam tabung berisi sampel dan kemudian digerus menggukan tissue lyser
dengan frekuensi 25/5 selama 30 detik dan kemudian diulangi lagi dengan posisi
sebaliknya. Inkubasi sampel pada 650C selama 30 menit dan dibolak-balik secara
berkala (10 menit). Kemudian, ke dalam sampel yang telah dipanaskan tersebut
ditambahkan CHISAM (24:1) sebanyak 750 µL dikocok bolak-balik selama 5
menit. Campuran larutan kemudian disentrifugasi pada kecepatan 12000 rpm
selama 15 menit pada suhu 250C dan supernatan dipindahkan ke dalam tabung
baru (lebih kurang 600µL supernatan). Selanjutnya ke dalam supernatan tersebut
ditambahkan 60µL Na-asetat 3M dan dibolak balik kemudian tambahkan 600 µL
isopropanol dingin dan disimpan di dalam pendingin -20 0C selama 1 jam dan
setelahnya dibolak balik perlahan kemudian didinginkan lagi selama 15 menit.
Setelah dikeluarkan dari pendingin, larutan kemudian disentrifugasi 12000
rpm selama 15 menit pada suhu 40C. Supernatan hasil sentrifugasi dibuang dan
pelet yang dihasilkan kemudian dicuci dengan menambahkan 200 µL etanol 70%
dingin dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan 12000 rpm selama 5 menit
pada suhu 40C. Cairan kemudian dibuang dan pelet dikeringkan menggunakan
vakum evaporator selama 15 menit. Endapan hasil pengeringan kemudian
dilarutkan dengan 50 µL buffer TE pH 8.0 hingga larut atau dengan dipanaskan
pada 650C selama 15 menit. Enzim RNAse kemudian ditambahkan 1/50 kali
volume DNA atau sebanyak 1µL untuk menghilangkan RNA dan kemudian
diinkubasi kembali selama 37oC selama 30 menit. Tahap selanjutnya adalah uji
kualitas dengan menggunakan gel agarose 1%,, uji kuantitas untuk konsentrasi
asam nukleat menggunakan nanodrop spektrofotometer DNA dan uji double
stranded DNA dengan menggunakan fluorometer Qubit ds DNA BR.
Uji Kualitatif DNA Genom Kentang
Uji kualitatif DNA dilakukan dengan menggunakan elektroforesis gel
agarosa 1%. Gel agarosa dibuat dengan menambahkan agarosa sebanyak 1.1 g ke
4
dalam 110 mL larutan TAE 1X. Larutan kemudian dipanaskan hingga larut dan
didinginkan pada suhu kamar hingga hangat dan dituang ke dalam cetakan gel
elektroforesis yang telah dipasangi sisir (cetakan sumur) hingga gel memadat. Gel
yang sudah padat dipindahkan ke dalam bak elektroforesis yang berisi TAE 1X.
Selanjutnya dibuat loading buffer dengan campuran blue juice 6x sebanyak 2 μL,
SyBr Gold 100x 0.5 µL, molecular water 7.5 µL. Sampel yang akan
dielektroforesis pada penelitian ini sebanyak 2 µL sampel DNA pada parafilm.
Setelah tercampur maka campuran sampel diinjeksi ke dalam sumur gel agarosa.
Marker yang digunakan adalah 100 bp plus DNA ladder sebanyak 5.5 μL
ditambah 0.5 µL SyBr Gold 100x. Setelah semua sampel selesai diinjeksi maka
alat elektroforesis dihubungkan pada power supply yang dialiri tegangan listrik
100 volt selama 30 menit. Hasil elektroforesis diamati dengan bantuan lampu UV
dalam trasnsilluminator dan didokumentasikan.
Uji Kuantitatif DNA Genom Kentang (Invitrogen 2010)
Uji kuantitatif untuk konsentrasi dan kemurnian asam nukleat dilakukan
dengan menggunakan spektrofotometer nanodrop thermoscientific, USA dengan
blanko yang digunakan adalah larutan TE pH 8.0. Sebelum digunakan lubang
optik dibersihkan terlebih dahulu dengan menggunakan nuclease free water.
Sebanyak 1 ul Larutan TE dimasukkan ke dalam lubang optik nanodrop
thermoscientific ditutup dan kemudian dipilih menu measure blank pada
komputer. Kemudian, lubang optik dibersihkan kembali dan sampel DNA
sebanyak 1 μL dimasukkan ke dalam lubang optik. Setelah itu, hasil pengukuran
akan muncul dalam konsentrasi ng/μL dan kemurnian DNA dapat dilihat langsung
dalam A280 dan A260. Uji kuantitas DNA dilakukan untuk mengetahui
konsentrasi dan kemurnian DNA dengan perbandingan A260/280 yang baik
sekitar 1.8 hingga 2.0.
Uji double stranded DNA (dsDNA) dilakukan dengan menggunakan
fluorometer Qubit ds DNA BR. Pengenceran larutan Qubit disiapkan dengan
perbandingan reagen 1: 200 dalam buffer Qubit. Beberapa tabung khusus
disiapkan dengan campuran larutan reagen dan buffer Qubit total 198 µL dan ke
dalamnya ditambahkan 2 µL DNA. Semua tabung yang sudah diisi dengan larutan
di vortex selama ± 3 detik dan kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 2
menit. Setelah diinkubasi, tabung kemudian dimasukkan pada alat Qubit 2.0
fluorometer dan konsentrasi dsDNA dapat dilihat pada layar dan dihitung
menggunakan rumus.
Konstruksi Pustaka Genom Kentang (TruSeq DNA low throughput protocol
(Illumina 2010a) )
Fragmentasi DNA. DNA diencerkan dalam resuspension buffer dengan
total keseluruhan volume yang telah dicampur 130 µL (berat DNA 2.6 ug).
Larutan dipipet dan dipindahkan ke dalam tabung Covaris sebanyak 130 µL dan
dimasukkan ke dalam alat instrument Covaris. Program dipilih secara manual
yaitu metode DNA 0300-130 µL_Snap_Cap tabung mikro yaitu program
pemotongan DNA dalam ukuran 300 bp. Tabung covaris dimasukkan ke dalam
alat dan running hingga 75 detik. Proses ini dilakukan dengan hati-hati karena
5
sensor alat ini sangat sensitif. Hasil dari fragmentasi Covaris dipindahkan ke
dalam tabung PCR sebanyak 50 µL (berat DNA 1 ug).
Modifikasi Ujung Fragmen DNA. Modifikasi diawali dengan pembuatan
Insert Modification Plate (IMP). Sebanyak 10 µL End repair control dan 40 µL
End Repair Mix ditambahkan ke dalam tabung yang mengandung 50 µL DNA
hasil fragmentasi. Sampel dicampurkan menggunakan pipet mikro dengan cara
dinaik turunkan sebanyak 10 kali. Tabung yang berisi sampel ditutup dan
diinkubasi dalam thermalcycler selama 30 menit pada suhu 300C.
Langkah selanjutnya yaitu pemurnian IMP yang diawali dengan
penambahan 160 µL AMPure XP Beads yang telah divorteks ke dalam sampel..
Sampel dicampurkan menggunakan pipet mikro dengan cara dinaik turunkan
sebanyak 10 kali. Campuran sampel dan AMPure XP Beads diinkubasi selama 15
menit pada suhu ruang. Tabung yang berisi sampel kemudian dipindahkan keatas
batang magnet pada suhu ruang selama 15 menit. Sebanyak 127.5 µL supernatan
dibuang dengan hati-hati jangan sampai mengenai pelet yang terletak pada
dinding tabung. Tahapan sebelumnya diulangi kembali untuk menghilangkan
supernatan yang masih tersisa. Pada proses pencucian pelet, sebanyak 200 µL
etanol 80% ditambahkan dan diinkubasi selama 30 detik. Selanjutnya, etanol 80%
yang telah ditambahkan dibuang dan dilakukan sebanyak 2 kali ulangan. Pelet
kemudian dikeringkan selama 15 menit pada suhu ruang dan dipindahkan dari
batang magnet. Resuspension buffer sebanyak 17.5 µL ditambahkan ke dalam
tabung yang berisi pelet dan sampel dicampurkan menggunakan pipet mikro
dengan cara dinaik turunkan sebanyak 10 kali. Selanjutnya, tabung berisi sampel
diinkubasi selama 2 menit pada suhu ruang. Tabung yang berisi sampel kemudian
dipindahkan ke atas batang magnet pada suhu ruang selama 5 menit untuk
memisahkan supernatan dengan pelet. Sebanyak 15 µL supernatan dipindahkan ke
dalam tabung yang baru dan disimpan dalam mesin pendingin. Tahapan
selanjutnya yang bisa dilakukan adalah pengukuran kuantitas dan kualitas hasil
modifikasi ujung jika supernatant di dalam tabung masih tersisa. Tahapan
pemurnian menggunakan AMPure XP Beads juga dilakukan pada proses tahapan
penempelan adaptor dan proses perbanyakan fragmen DNA.
Adenilasi Ujung 3’ DNA. A-tailing control 2.5 µL dan A-tailing mix 12.5
µL ditambahkan ke dalam tabung yang berisi sampel. Sampel dicampurkan
menggunakan pipet mikro dengan cara dinaik turunkan sebanyak 10 kali. Tabung
yang berisi sampel ditutup dan diinkubasi dalam thermalcycler selama 30 menit
pada suhu 370C dan setelahnya langsung dilanjutkan dengan tahapan penempelan
adaptor.
Penempelan Adaptor. Sebanyak 2.5 ul Ligase control, 2.5 µL DNA Ligase
Mix dan 2.5 µL dan DNA Adapter Index ditambahkan ke dalam tabung yang berisi
sampel. Sampel dicampurkan menggunakan pipet dengan cara dinaik turunkan
sebanyak 10 kali. Tabung yang berisi sampel ditutup dan diinkubasi dalam
thermalcycler selama 10 menit pada suhu 300C. Sebanyak 5 µL Stop Ligase Mix
ditambahkan ke dalam tabung yang berisi sampel. Kemudian sampel dicampurkan
menggunakan pipet mikro dengan cara dinaik turunkan sebanyak 10 kali.
Langkah selanjutnya yaitu pemurnian sampel yang diawali dengan
penambahan 42.5 µL AMPure XP Beads dengan mengikuti prosedur yang sama
dengan sebelumnya. Selanjutnya resuspension buffer sebanyak 22.5 µL
ditambahkan ke dalam tabung yang berisi pelet. Sampel dicampurkan dan
6
diinkubasi pada suhu ruang. Sebanyak 20 µL supernatan dipindahkan ke dalam
tabung yang baru dan disimpan dalam mesin pendingin. Tahapan selanjutnya yang
dilakukan adalah pengukuran kuantitas dan kualitas hasil adenilasi dan
penempelan adaptor jika supernatan di dalam tabung masih tersisa.
Pemurnian DNA Hasil Ligasi. Pemurnian hasil ligasi terdiri dari dua tahap
yaitu pemisahan ukuran fragmen DNA melalui elektroforesis dan ekstraksi gel.
Pemisahan ukuran fragmen DNA diawali dengan pembuatan gel agarosa 2%.
Sebanyak 1.2 gram bubuk agarosa ditimbang dan ditambahkan larutan TAE 1x
sebanyak 60 mL. Larutan kemudian dipanaskan dalam microwave sampai semua
agarosa larut. Setelah suhu larutan hangat, kemudian tambahkan 6 uL pewarna
SyBr Gold dan kocok hingga homogen. Kemudian larutan dituang ke dalam
cetakan yang telah disiapkan.
Elektroforesis diawali dengan disiapkannya seperangkat bak elektroforesis,
kemudian larutan TAE 1x dituangkan ke dalam bak hingga gel terendam bagian
bawahnya. Selanjutnya, ditempat terpisah sebanyak 4 ul loading dye 6x
ditambahkan ke dalam tabung berisi 20 ul sampel hasil ligasi. Sebanyak 12 ul
penanda DNA ladder 100 bp diinjeksikan pada sumur gel yang tersedia. Sampel
kemudian dimasukkan ke dalam sumur gel yang tersedia. Cetakan agarosa di buat
dengan 2 kolom dimana pada kolom ke dua berisi nuclease free water sebanyak
25 ul. Sampel kemudian di elektroforesis pada kuat arus 100 volt selama 60 menit.
Hasil elektroforesis dilihat di atas lampu UV transiluminator dan
didokumentasikan. Saat telah mendekati ukuran 400 bp, nuclease free water yang
berada pada kolom kedua dipipet dan dimasukkan ke dalam tabung baru (20 ul).
Ukuran fragmen DNA 300 bp, 400 bp dan 500 bp diiris dari gel agarosa dan
disimpan dalam tabung untuk digunakan pada tahapan selanjutnya yaitu ekstraksi
gel jika hasil validasi pustaka tidak mencukupi untuk konsentrasi minimum yang
dibutuhkan untuk proses sekuensing.
Perbanyakan fragmen DNA. Perbanyakan DNA diawali dengan
penambahan 5 µL PCR Primer Cocktail dan 25 µL PCR Master Mix ke dalam
tabung yang berisi sampel. Sampel dicampurkan menggunakan pipet mikro
dengan cara dinaik turunkan sebanyak 10 kali. Tabung kemudian disimpan dalam
mesin PCR untuk proses perbanyakan yang terdiri dari 10 siklus selama 20 menit
dengan rincian reaksi predenaturasi pada suhu 98°C selama 30 detik, denaturasi
pada suhu 98°C selama 10 detik, annealing pada suhu 60°C selama 30 detik,
extension pada suhu 72°C selama 30 detik, dan pasca pemanjangan primer pada
suhu 72°C selama 5 menit.
Tahapan selanjutnya yaitu pemurnian hasil PCR yang diawali dengan
penambahan 50 µL AMPure XP Beads dengan mengikuti prosedur pemurnian
yang sama dengan sebelumnya sebanyak 32.5 µL resuspension buffer
ditambahkan ke dalam tabung yang berisi pelet dan dicampurkan menggunakan.
Sebanyak 30 µL supernatan dipindahkan ke dalam tabung yang baru dan disimpan
dalam mesin pendingin. Tahapan selanjutnya yang bisa dilakukan adalah validasi
terhadap kualitas dan kuantitas pustaka genom yang telah berhasil dikonstruksi.
Validasi kualitas pustaka genom. Uji ini digunakan untuk mengetahui
ukuran fragmen DNA hasil pemotongan yang dilakukan dengan mengikuti
protokol Agilent High Sensitivity DNA Assay. Cip HS DNA diletakkan di atas
priming station chip dan kemudian ke dalam lubang berlabel G ditambahkan 9 ul
dye mix kemudian ditekan menggunakan priming station selama 1 menit. Setelah
7
dibuka kemudian ke dalam lubang lain yang berlabel G ditambahkan 9 ul dye mix
dan marker pada masing-masing lubang kecuali lubang ladder, kemudian ke
dalam lubang ladder ditambahkan 1 ul HS DNA ladder. Sebanyak 1 ul sampel
juga kemudian dimasukkan ke dalam lubang sampel. Cip kemudian di vortex
selama 1 menit dan kemudian di running pada alat agilent 2100 bioanalyser yang
terhubung dengan computer. Kualitas ukuran pustaka juga di ukur dengan
menggunakan software bioinformatika photocap MW.
Validasi kuantitas pustaka genom. Sampel dibuat sebanyak 3 kali ulangan
dan setiap ulangan dibuat pengenceran 1:1000, 1:2000 dan 1:4000 menggunakan
buffer qPCR. Setiap sampel yang telah diencerkan ini kemudian diambil sebanyak
4 ul dan ditambahkan 16 ul reagen qPCR dan dimasukkan ke dalam tabung PCR.
Standar larutan juga dibuat sebanyak 3 ulangan dengan jumlah standar sebanyak 6.
Tabung PCR kemudian di masukkan ke dalam alat qPCR dan di running selama 2
jam. Hasil yang diperoleh akan digunakan untuk perhitungan klasterisasi pustaka
genom. Sebelum klasterisasi pustaka terlebih dahulu dihitung konsentrasi pustaka
genom yang dibutuhkan yaitu sebanyak 2 nM yang diencerkan ke dalam buffer
library (Tris-Cl 10 mM pH 8.5 dan 0.1 % tween 20).
Klasterisasi Pustaka Genom Kentang (cBot cluster generation protocol
(Illumina 2010b)
Klasterisasi DNA diawali dari preparasi sampel yang terdiri dari dua
tahapan, yaitu denaturasi dan pelarutan DNA. Denaturasi diawali dengan
penambahan 0.1 N NaOH ke dalam sampel DNA sehingga diperoleh konsentrasi
DNA pustaka akhir 13 pM. Campuran dinaik turunkan menggunakan pipet hingga
homogen. Sampel diinkubasi selama 5 menit pada suhu ruang untuk
mendenaturasi utas ganda DNA menjadi utas tunggal. DNA yang telah
didenaturasi disimpan dalam mesin pendingin sampai proses pelarutan DNA akan
dilakukan.
Tahapan preparasi sampel selanjutnya yaitu pelarutan DNA dalam buffer
hibridisasi. Sebanyak 987 uL buffer hibridisasi ditambahkan ke dalam template
DNA yang telah didenaturasi sebelumnya sehingga diperoleh konsentrasi akhir 13
pM. Sebanyak 120 µL DNA yang telah dilarutkan ditambahkan ke dalam 1%
PhiX control (1.2 ul) di dalam tabung PCR. Posisi sampel pada tabung dicatat dan
kemudian tabung dimasukkan ke dalam alat cBOT Cluster Generation untuk
dilakukan klasterisasi di dalam suatu flow cell.
Sekuensing Pustaka Genom Kentang (HiSeq 2000 protocol 2011)
Sekuensing pustaka genom menggunakan Illumina HiSeq 2000 terdiri dari
beberapa tahap yaitu persiapan reagen, pemilihan parameter untuk sekuensing,
pemasangan flow cell, sekuensing, dan post-run sequencing (maintenance wash).
Reagen yang digunakan selama sekuensing diantaranya SBS reagen (TruSeq SBS
kit), multiplexing reagen dan paired end reagen. Reagen-reagen tersebut
dimasukkan kedalam rak dan disimpan dalam ruang reagen compartment yang
terdapat dalam Illumina Hiseq 2000. Pemilihan parameter untuk sekuensing
dilakukan melalui Hiseq control software interface. Parameter yang tersedia
diantaranya flow cell ID, experiment, user name, flow cell type, control lane,
8
output folder,confirm first base, keep intensity files, existing recipe, save image
dan align lanes. Tahapan selanjutnya yaitu pemasangan flow cell yang telah
diklasterisasi melalui cBot cluster generation pada flow cell stage. Sekuensing
dilakukan selama sekitar 11 hari dengan panjang pembacaan DNA 2 x 101 siklus.
Tahapan terakhir setelah proses sekuensing selesai dilakukan yaitu dengan
dipindahkannya flow cell dari flow cell stage dan dilakukannya post-run
sequencing yaitu maintenance wash. Tahapan maintenance wash terdiri dari
pembilasan dengan menggunakan air dan NaOH.
HASIL
Hasil DNA Genom Kentang
Isolasi DNA genom kentang dari empat genotipe yaitu CIP 392781, PT 29,
Amudera dan Margahayu dilakukan dengan metode Doyle & Doyle (1987) yang
dimodifikasi. Analisis kualitas pustaka genom kentang dilakukan menggunakan
gel agarosa 1%. DNA genom kentang berhasil diisolasi dengan baik yang
ditunjukkan dengan ukuran pita-pita DNA yang semakin tinggi dari marker dan
semakin mendekati ke sumur gel. Marker DNA yang digunakan adalah 100 bp
(Gambar 1).
Gambar 1 Elektroforegram DNA genom hasil isolasi kentang genotipe 1.
CIP 392781, 2. PT 29, 3. Amudera dan 4. Margahayu
Analisis kuantitatif DNA genom kentang diukur menggunakan nanodrop
spektrofotometer. Pengukuran dilakukan untuk melihat kemurnian DNA genom
kentang dari kontaminasi polisakarida (A260/230) dan protein (A260/280). Tabel 1
menunjukkan masing-masing genotipe kentang menghasilkan DNA dengan
konsentrasi yang tinggi (1039 ng/uL – 3222.5 ng/uL) dan hanya genotipe
Amudera yang memiliki konsentrasi DNA yang rendah yaitu 197.8 ng/uL.
Kemurnian dari masing-masing genotipe kentang sangat murni yang dapat
diketahui dari nilai rasio yang masih berada pada rentang ukuran 1.8-2.0.
Tabel 1 Kuantitas dan kemurnian DNA genom total kentang.
Genotipe
CIP 392781
PT.29
Amudra
Margahayu
[Asam nukleat] (ng/uL)
2787.5
3222.5
197.8
1039
A260/280
1.93
1.95
1.86
1.96
A260/230
2.17
2.1
2.44
2.20
9
Analisis kuantitatif DNA genom kentang selanjutnya yaitu DNA double
stranded (dsDNA) ditunjukkan oleh Tabel 2. Pengukuran dsDNA dilakukan
menggunakan fluorometer. Hasil pengukuran dsDNA menunjukkan konsentrasi
dsDNA yang terdapat pada masing-masing genotipe memenuhi untuk tahapan
fragmentasi. Perhitungan bobot dsDNA untuk konstruksi pustaka genom ini
diperoleh dengan perhitungan :
Tabel 2 Konsentrasi double stranded DNA hasil isolasi
Genotipe
CIP 392781
PT.29
Amudra
Margahayu
[Qubit] (ug/mL)
2.31
1.43
0.482
0.353
Faktor
pengenceran
100
100
200
200
[ds DNA] (ng/uL)
231
143
96.4
70.6
Konstruksi Pustaka Genom DNA Kentang
Fragmentasi DNA Genom Kentang
Pita-pita DNA hasil dari fragmentasi DNA menggunakan prinsip sonikasi
dapat dilihat pada gambar 2. Pita-pita DNA yang smear menunjukkan bahwa
DNA tersebut telah berhasil difragmentasi pada ukuran yang diharapkan (300-400
bp) dengan intensitas yang lebih terang yang berarti bahwa konsentrasi DNA
tinggi terpotong pada ukuran 300-400 bp. Ukuran 300-400 bp dipilih karena
ukuran optimal yang disarankan Illumina untuk proses sekuensing yaitu