Intensitas Penyakit Penting, Deteksi Huanglongbing Dan Pengaruh Aplikasi Pgpr Pada Tanaman Jeruk Di Kabupaten Bogor
INTENSITAS PENYAKIT PENTING, DETEKSI
HUANGLONGBING DAN PENGARUH APLIKASI PGPR
PADA TANAMAN JERUK DI KABUPATEN BOGOR
ROIS ZAYYINUL FUADI
DEPARTEMEN PROTEKSI TANAMAN
FAKULTAS PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Intensitas Penyakit
Penting, Deteksi Huanglongbing dan Pengaruh Aplikasi PGPR pada Tanaman
Jeruk di Kabupaten Bogor adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi
pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi
mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan
maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan
dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Juni 2015
Rois Zayyinul Fuadi
NIM A34090067
ABSTRAK
ROIS ZAYYINUL FUADI. Intensitas Penyakit Penting, Deteksi Huanglongbing
dan Pengaruh Aplikasi PGPR pada Tanaman Jeruk di Kabupaten Bogor.
Dibimbing oleh KIKIN HAMZAH MUTAQIN dan EFI TODING TONDOK.
Jeruk adalah salah satu tanaman holtikultura penting dan mempunyai nilai
ekonomi tinggi di Indonesia. Salah satu permasalahan penting yang dihadapi
dalam budidaya jeruk adalah adanya penyakit tanaman yang mengakibatkan
penurunan kualitas dan kuantitas hasil. Tujuan penelitian ini adalah mengamati
penyakit-penyakit umum tanaman jeruk di Kabupaten Bogor, Provinsi Jawa Barat,
deteksi penyakit huanglongbing dan melihat pengaruh aplikasi plant growth
promoting rhizobacteria (PGPR) pada fase vegetatifnya. Tahapan penelitian
meliputi pengamatan intensitas dan identifikasi penyakit yang ditemui di lapang,
aplikasi PGPR pada tanaman jeruk fase vegetatif untuk mengetahi pengaruhnya
terhadap intensitas penyakit jeruk. Selanjutnya, pengamatan berdasarkan peubah
agronomi tanaman yang dilakukan setiap minggu selama 10 minggu pengamatan.
Khusus untuk penyakit huanglongbing, yang juga dikenal sebagai CVPD,
dilakukan pengamatan gejala eksternal serta gejala internal melalui uji akumulasi
pati pada jaringan floem yang diambil dari tulang daun tanaman jeruk dan deteksi
secara molekuler dengan teknik polymerase chain reaction (PCR). Berdasarkan
pengukuran Area
ABSTRACT
ROIS ZAYYINUL FUADI. Intensity of Important Diseases, Detection of
Huanglongbing and the Effect of Plant Growth Promoting Rhizobacteria
Application on Citrus in Bogor. Supervised by KIKIN HAMZAH MUTAQIN and
EFI TODING TONDOK.
Citrus is one of the important holticultural crops and plays a significant
economic role in Indonesia. Diseases are serious constraint to cause reduction of
yield quality and quantity. The objectives of this study were to observe important
diseases, which affect citrus plants grown in Bogor district of West Java province
and to look the effect of application of plant growth promoting rhizobacteria
(PGPR) to its vegetative phase. The studies involved field observation and
subsequent identification of encountered diseases, application of PGPR on citrus
plants at vegetative phase to find its effect on citrus disease incidences and
severities. Furthermore, observations based on agronomic growth parameter of
the plants were made once a week during 10 weeks. For huanglongbing disease,
external symptom observation and starch accumulation tests to show internal
symptom were carried out on sample of leaf petioles and midribs. Huanglongbing
detection was done through molecular methods with polymerase chain reaction
(PCR). Total DNA was extracted from leaf petioles and midrib from each sample
plant. The extracted DNA was used as template for PCR amplification. Based on
Area Under the Diseases Progress Curve (AUDPC), it showed that the most
predominant disease of citrus at vegetative and generative phase at area I were
sooty mold (Meliola sp.) and scab disease (Elsinoe fawcetti), meanwhile in area II
were scab disease in generative phase. PGPR application resulted in insignificant
disease intensity change in the plant compare to that untreated citrus. Therefore,
PGPR treatment did not give effect on decreasing the disease incidence and
severity, but it could affect citrus growth and development. Huanglongbing
diasease incidence was low at both orchards. Diagnosing huanglongbing from
internal symptom expressed as starch accumulation in phloem tissue does not
always show positive result with that of PCR assay.
Keyword: CVPD, huanglongbing, citrus diseases, PGPR, polymerase chain
reaction.
©Hak Cipta milik IPB, tahun 2015
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau
menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang
wajar IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam
bentuk apa pun tanpa izin IPB
INTENSITAS PENYAKIT PENTING, DETEKSI
HUANGLONGBING DAN PENGARUH APLIKASI PGPR
PADA TANAMAN JERUK DI KABUPATEN BOGOR
ROIS ZAYYINUL FUADI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Pertanian
pada
Departemen Proteksi Tanaman
DEPARTEMEN PROTEKSI TANAMAN
FAKULTAS PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga skripsi ini dapat diselesaikan. Skripsi ini berjudul
Intensitas Penyakit Penting, Deteksi Huanglongbing dan Pengaruh Aplikasi
PGPR pada Tanaman Jeruk di Kabupaten Bogor.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Dr. Ir. Kikin Hamzah Mutaqin
MSi. dan Ibu Dr. Efi Toding Tondok SP. MSc. selaku dosen pembimbing skripsi
yang telah memberikan pengarahan, saran dan motivasi selama penelitian dan
penulisan skripsi. Ucapan terimakasih juga disampaikan kepada Bapak Dr. Ir.
Abdul Muin Adnan, MS. selaku dosen pembimbing akademik yang telah
memberikan bimbingan dan saran selama penulis menuntut ilmu di Departemen
Proteksi Tanaman. Penulis juga menyampaikan terima kasih kepada Dr. Endang
Sri Ratna selaku dosen penguji tamu yang telah memberikan saran dan masukan
terhadap penyempurnaan skripsi. Di samping itu, penghargaan penulis sampaikan
kepada Bapak H. Iming, Bapak Yunus dan Bapak Amir pemilik pertanaman jeruk
di Desa Situ Gede tempat penelitian dilaksanakan. Ucapan terima kasih juga
penulis ucapkan kepada rekan-rekan mahasiswa S1/S2/S3 di Laboratorium
Bakteriologi Tumbuhan dan Laboratorium Mikologi Tumbuhan yaitu Ariny
Prasetya SP. MSi., Indriati Husain SP. MSi., Mahardika Gama SP., Nadzirum
Mubin SP. MSi., Tatit Sastrini SP., Syaiful Khoiry SP., Muhammad Rizal SP.,
Suci AK, Antoni Sulthan SP. dan Teguh Pratama SP. yang telah memberikan
bantuan dan saran selama pelaksanaan penelitian dan penulisan skripsi. Kakakkakak tingkat yaitu Zakarias Pikindu SP., Busyairi SP., Rado Puji Santoso SP. dan
Mochamad Yadi Nurjayadi SSi. atas nasehat dan motivasinya. Ungkapan
terimakasih juga disampaikan kepada Devi Indriana Sari Amd.Keb yang telah
menemani dan memberikan semangat selama proses penyelesaian penulisan
skripsi. Teman-teman di Wisma Galih yaitu Hera Tri Utomo SPt., Ilham
Abiwijaya SHut., Muhammad Doni Rahman STp., Bayu Gagat P SHut., dan
Nasrudin SSi. atas kebersamaannya. Terimakasih juga ditujukan kepada temanteman Departemen Proteksi Tanaman angkatan 47 atas dukungan dan bantuan
yang telah diberikan.
Kepada ibu, bapak, adik Rahma, serta seluruh keluarga yang telah
mencurahkan kasih sayang, doa dan dukungan tiada henti selama ini, karya ini
semoga menjadi persembahan kecil dari ananda.
Semoga penelitian ini bermanfaat.
Bogor, Juni 2015
Rois Zayyinul Fuadi
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL
viii
DAFTAR GAMBAR
ix
DAFTAR LAMPIRAN
PENDAHULUAN
x
1
Latar Belakang
1
Tujuan Penelitian
2
Manfaat Penelitian
2
BAHAN DAN METODE
3
Tempat dan Waktu Penelitian
3
Alat dan Bahan
3
Metode Penelitian
3
Penentuan Lokasi dan Pengamatan Tanaman Contoh
3
Identifikasi Penyakit
4
Deteksi Penyakit Huanglongbing
4
Pengamatan Pengaruh Aplikasi PGPR terhadap Nilai Agronomis
Tanaman
5
HASIL DAN PEMBAHASAN
6
Keadaan Umum Lahan Peranaman Jeruk
6
Penyakit yang Ditemukan pada Tanaman Jeruk
6
Busuk Buah
7
Busuk Pangkal Batang
7
Penyakit Kulit Diplodia
8
Mati Pucuk
9
Kudis
10
Jamur Upas
11
Embun Hitam
12
Bercak Alternaria
14
Bercak Cercospora
15
Kanker
16
Area Under the Disease Progress Curve (AUDPC)
17
Deteksi Penyakit Huanglongbing
18
Penyebab dan Vektor Penyakit Huanglongbing
18
Pengamatan Gejala Eksternal Penyakit Huanglongning
19
Pengamatan Gejala Internal Penyakit Huanglongbing
20
Deteksi Huanglongbing pada Jeruk dengan PCR melalui Ekstraksi
DNA
20
Pengaruh Aplikasi PGPR terhadap Faktor Agronomis pada Tanaman
Jeruk
Fase Vegetatif
22
SIMPULAN DAN SARAN
25
Simpulan
Saran
DAFTAR PUSTAKA
LAMPIRAN
25
25
26
29
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Penyakit tanaman jeruk di Situ Gede, Dramaga, Bogor, Jawa Barat
2 Nilai AUDPC intensitas penyakit selama 10 minggu pada tanaman
jeruk di Situ Gede
3 Identifikasi gejala penyakit huanglongbing secara eksternal, internal
dan secara molekuler menggunakan PCR
4 Hasil pengamatan pengaruh aplikasi PGPR terhadap faktor agronomis
pada tanaman jeruk fase vegetatif
7
18
19
23
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
Bagan warna daun dengan nilai numerik 2-5
Pertanaman jeruk di Desa Situ Gede Kecamatan Dramaga
Persentase insidensi dan severitas penyakit busuk pangkal batang pada
tanaman jeruk lahan 2
Gejala dan penyebab penyakit: (a) busuk buah, (b) busuk pangkal
batang, (c) sporangium (Phytophthora spp.)
Persentase insidensi dan severitas penyakit kulit Diplodia pada tanaman
jeruk lahan 1 dan 2
Persentase insidensi dan severitas penyakit mati pucuk pada tanaman
jeruk lahan 1 dan 2
Gejala dan penyebab penyakit : (a) penyakit kulit Diplodia, (b) mati
pucuk, (c) konidia Botryodiplodia theobromae
Gejala penyakit kudis (Elsinoe fawcetti)
Persentase insidensi dan severitas penyakit kudis pada tanaman jeruk
lahan 1 dan 2
Penyakit jamur upas (Upasia salmonicolor)
Persentase insidensi dan severitas penyakit jamur upas pada tanaman
jeruk lahan 1 dan 2
Gejala dan tanda penyakit embun hitam (Meliola citricola)
Persentase insidensi dan severitas penyakit embun hitam pada tanaman
jeruk lahan 1 dan 2
Gejala dan penyebab penyakit bercak Alternaria (Alternaria alternate)
Persentase insidensi dan severitas penyakit bercak Alternaria pada
tanaman jeruk lahan 1 dan 2
Gejala dan penyebab penyakit bercak Cercospora (Cercospora sp.)
Persentase insidensi dan severitas penyakit bercak Cercospora pada
tanaman jeruk lahan 1 dan 2
Gejala penyakit Kanker (Xanthomonas axonopodis)
Persentase insidensi dan severitas penyakit kanker pada tanaman jeruk
lahan 1 dan 2
Serangga vektor Diaphorina citri
Pengamatan gejala eksternal : (21a) tanaman bergejala huanglongbing,
(21b) tanaman tidak bergejala
Pengamatan gejala internal : (22a) tanaman tidak bergejala, tidak
terdapat akumulasi pati, (22b) tanaman bergejala, tidak terdapat
akumulasi pati, (22c) tanaman bergejala dan terdapat akumulasi pati
Hasil amplifikasi PCR terhadap DNA contoh daun jeruk sakit
huanglongbing
5
6
8
8
9
10
10
11
11
12
12
13
13
14
14
15
16
17
17
20
21
21
22
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Data curah hujan bulanan pada bulan Mei sampai Oktober 2014
30
2 Insidensi dan severitas penyakit pada lahan I pertanaman jeruk di Desa
Situgede pada bulan Agustus sampai Oktober 2014
31
3 Insidensi dan severitas penyakit pada lahan II pertanaman jeruk di Desa
Situgede pada bulan Agustus sampai Oktober 2014
33
4 Identifikasi penyakit huanglongbing berdasarkan gejala eksternal pada daun
jeruk
34
5 Identifikasi penyakit huanglongbing berdasarkan gejala internal berupa
akumulasi pati pada petiol daun
6 Larutan Iodin - Kalium Iodida yang digunakan dalam uji akumulasi pati 41
7 Larutan Penyangga CTAB (CTAB buffer) yang digunakan dalam ekstraksi
DNA
41
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Jeruk (Citrus spp.) merupakan tanaman hortikultura penting dari famili
Rutaceae. Tanaman jeruk diduga berasal dari Asia, tepatnya Cina. Daerah yang
terkenal sebagai daerah pertanaman jeruk di Indonesia adalah Medan dan Brastagi
(Sumatra Utara), Palembang (Sumatra Selatan), Bogor, Garut, Sukabumi,
Sumedang, Tasikmalaya (Jawa Barat), Karanganyar, Purworjo, dan Sragen (Jawa
Tengah), Banyuwangi, Madura Malang dan Tulungagung (Jawa Timur), Bangli
(Bali), Pontianak, Sambas (Kalimantan Barat), Jeneponto dan Pangkep (Sulawesi
Selatan) (Sarwono 1986). Buah jeruk mempunyai kandungan vitamin C yang
tinggi, rasa yang enak dan dimanfaatkan sebagai makanan buah segar, makanan
olahan, minuman, obat-obatan dan kosmetik. Tanaman jeruk merupakan
komoditas bernilai tinggi dan banyak dibudidayakan di Indonesia. Produksi jeruk
sebesar 1.6 juta ton menempatkan Indonesia sebagai negara penghasil jeruk ke-13
di dunia pada tahun 2004 (Balitbangtan 2007). Produktivitas jeruk pernah
mencapai 2.625.884 ton pada tahun 2007, namun terus mengalami penurunan
hingga tahun 2014 dengan hasil produksi sebesar 1.411.229 ton (BPS 2014).
Hama dan penyakit tanaman menjadi salah satu faktor penyebab rendahnya
produktivitas jeruk tersebut.
Beberapa penyakit penting pada tanaman jeruk dapat mengakibatkan
kerugian ekonomi di antaranya, penyakit busuk pangkal batang, kudis, blendok,
kanker, tristeza, dan penyakit Citrus Vein Phloem Degeneration (CVPD).
Beberapa sentra penghasil jeruk Indonesia pernah mengalami kemunduran pada
tahun 1982-1985 akibat penyakit CVPD (Balitjestro 2008). Menurut Ditlin (1994)
daerah tersebut meliputi Garut (Jawa Barat), Tawangmangu (Jawa Tengah),
Punten (Jawa Timur), Tejakula (Bali). Penyakit CVPD yang disepakati secara
internasional namanya menjadi huanglongbing, disebabkan oleh bakteri
Liberobacter asiaticus yang ditularkan oleh serangga vektor Diaphorina citri
(Balitjestro 2008). Diagnosis penyakit sebagai langkah awal untuk taktik
pengendalian selanjutnya seharusnya didasarkan atas deteksi dan identifikasi yang
tepat. Deteksi dan identifikasi penyakit seringkali merupakan rangkaian dari
tahap-tahap pengamatan gejala di lapangan sampai dengan teknik-teknik di
laboratorium.
Salah satu teknik pengendalian yang potensial adalah penggunaan agens
hayati, seperti plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) yang dapat
meningkatkan kesehatan dan ketahanan tanaman. PGPR merupakan bakteribakteri yang hidup dan berkoloni di sekitar perakaran. Terdapat beberapa
mekanisme PGPR dalam meningkatkan dan memicu kesehatan tanaman,
diantaranya adalah mekanisme induksi resistensi sistemik, mekanisme
pembentukan siderophores atau antibiotik dan mekanisme penyerapan nutrisi
yang berperan sebagai pupuk hayati. PGPR juga dapat berperan sebagai
biostimulus dengan membentuk phytohormone dan sebagai bioprotektan yang
mampu menekan penyakit pada tanaman (Tenuta 2003).
2
Tujuan Penelitian
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengamati intensitas dan identifikasi
penyakit yang umum pada tanaman jeruk, deteksi penyakit huanglongbing
berdasarkan gejala dan teknik molekuler serta mengetahui peranan PGPR
terhadap penekanan penyakit dan pertumbuhan tanaman.
Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai jenis
penyakit pada tanaman jeruk saat ini, cara deteksi penyakit huanglongbing secara
tepat sebagai dasar upaya pencegahan dan penaganan penyakit tersebut dan
manfaat plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) sebagai salah satu upaya
pengendalian penyakit tanaman dengan memicu dan meningkatkan kesehatan
tanaman.
3
BAHAN DAN METODE
Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium Bakteriologi Tumbuhan, Departemen
Proteksi Tanaman. Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor dan lahan
pertanaman jeruk milik petani di Desa Situ Gede, Bogor. Penelitian ini
dilaksanakan dari bulan Mei hingga Oktober 2014.
Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam penelitian adalah kantong plastik, gunting, kuas,
mikroskop, cawan petri, kaca preparat, cover glass, kamera digital, stiker label,
mortar, pipet mikro, tip pipet, mikrosentrifus Mikro 200R Hettich Zentrifugen, ice
box, water bath, vortex mixer, freezer, Gene AMP PCR System 9700, perangkat
elektroforesis dan transilluminator UV.
Bahan yang digunakan dalam penelitian adalah tanaman jeruk, pupuk hayati
berupa PGPR, contoh daun jeruk dari semua tanaman dari pertanaman jeruk milik
petani di Desa Situ Gede, tabung ependorf ukuran 1.5 ml dan 2 ml, nitrogen cair,
asam laktat, iodin, kalium iodida, gelas preparat, bufer ekstraksi, bufer CTAB 2%,
bufer NaCl 5 M, bufer CTAB 10% dalam 0.7 M NaCl, kloroform/isoamil alkohol
(24:1 v/v), isopropanol, alkohol 70%, akuades, Primer forward A2, Primer
reverse J5, ddH2O, gel agarosa, bufer TAE 2X, etidium bromida, bufer TAE 1X,
marker 1 kbp, loading dye dan parafilm.
Metode Penelitian
Penentuan Lokasi dan Pengamatan Tanaman Contoh
Penelitian dilakukan di dua lahan pertanaman jeruk milik petani di Desa
Situ Gede. Pengamatan penyakit dilakukan pada kedua lahan secara langsung.
Pada lahan I dilakukan pengamatan pada 20 tanaman contoh, masing-masing
terdiri atas 10 tanaman jeruk fase generatif umur 5 tahun dan fase vegetatif umur
1 tahun, sedangkan pada lahan II dilakukan pengamatan terhadap 20 tanaman
contoh fase generatif umur 7 tahun. Insidensi dan severitas penyakit dihitung
dengan menggunakan rumus :
n = jumlah tanaman yang terserang
N= jumlah tanaman yang diamati
n = jumlah tanaman yang tergolong ke dalam suatu kategori serangan
v = nilai numerik pada masing-masing kategori
N= jumlah tanaman yang diamati
V= nilai kategori serangan terberat
Pengamatan meliputi gejala pada keseluruhan tanaman dan bagian-bagian
tanaman, penilaian penyakit (insidensi dan severitas penyakit). PGPR
4
diaplikasikan pada tanaman jeruk fase vegetatif, kemudian diamati perubahan
pertumbuhan, insidensi dan severitas penyakit setiap minggu selama 10 minggu.
Tanaman yang bergejala diambil contoh untuk identifikasi lebih lanjut. Skor
penentuan kategori penyakit adalah sebagai berikut: 0 (tidak ada serangan), 1 (0 ≤
x ≤ 25 %), 2 (25 < x ≤ 50%), 3 (50 < x ≤ 75%), 4 (> 75%). Suatu penyakit yang
teramati dihitung sebagai Area Under the Disease Progress Curve (AUDPC)
menggunakan rumus sebagai berikut:
yi = data pengamatan ke-i
ti = waktu pengamatan ke-I
∑(
)
yi+1 = data pengamatan ke-i+1
ti+1 = waktu pengamatan ke i+1
Identifikasi Penyakit
Identifikasi penyakit dilakukan dengan berbagai cara tergantung jenis
patogen penyebabnya, diantaranya didasarkan atas gejala khas yang ditimbulkan
suatu patogen pada tanaman jeruk dan pembuatan preparat patogen. Tanaman
yang bergejala patogen dibuat preparat dengan cara dikorek dan ditetesi dengan
laktofenol biru. Penyakit yang disebabkan cendawan Deuteromycetes
diidentifikasi secara mikroskopis berdasarkan kunci identifikasi berdasarkan
Barnett dan Hunter (1999).
Deteksi Penyakit Huanglongbing
Deteksi penyakit huanglongbing, selain dilakukan pengamatan gejala
eksternal, juga dilakukan pengamatan gejala internal melalui uji akumulasi pati
menggunakan metode Noordam (1973) dan teknik PCR. Teknik PCR dilakukan
dengan pengambilan 3 sampai 5 contoh daun secara acak pada setiap tanaman
contoh dan tanaman kontrol. Tahapan bekerja dengan teknik PCR meliputi tahap
ekstraksi DNA total menggunakan metode Su & Hung (2001), amplifikasi DNA
dengan PCR, dan elektroforesis gel agarose.
Ekstraksi DNA total dari jaringan tulang daun tanaman yang terinfeksi
huanglongbing menggunakan metode Su & Hung (2001). Tulang daun dari dua
helai daun segar yang tidak mengalami nekrosis dipotong-potong halus dengan
silet, kemudian digerus pada mortar beku. Hasil gerusan dipindah ke dalam
tabung eppendorf 1,5 ml dan disuspensikan denga 800 μl bufer CTAB pada suhu
60 oC yang mengandung 0,2% CTAB; 1,4 M NaCl; 100 mM Tris-HCl pH 8,0; 20
mM EDTA; dan 1% β-Mercaptoethanol. Suspensi diinkubasi selama 10 menit
pada suhu 65 oC. Selama inkubasi, tabung dibolak-balik beberapa kali.
Selanjutnya dilakukan sentrifugasi pada 5000 rpm selama 5 menit, supernatan
yang dihasilkan dipindah ke dalam tabung eppendorf baru. Ke dalam supernatan
ditambahkan kloroform/isoamil alkohol (24:1 v/v) dengan volume setara,
kemudian divortex dan disentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm selama 5
menit. Lapisan epifase sebanyak 100 μl dipindahkan ke tabung eppendorf baru
dan dipresipitasi dengan menambahkan 10 μl NaOAc (pH 5,2) serta 275 μl
ethanol 70% dingin (-20 oC), kemudian diinkubasi pada suhu -20 oC selama 30
menit. Suspensi disentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm selama 15 menit pada
suhu 4 oC. Supernatan dibuang, endapan DNA dicuci dua kali dengan etanol 70%
dingin (-20 oC) dan disentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm selama 2 menit.
5
Endapan DNA dikeringanginkan, DNA diresuspensikan dengan bufer TE
sebanyak 30 μl.
Contoh DNA hasil ekstraksi kemudian diamplifikasi dengan teknik PCR
menggunakan primer spesifik untuk mendeteksi patogen Liberobacter asiaticus
penyebab penyakit Huanglongbing, yaitu primer forward A2 (5’TATAAAGGTTGACCTTTCGAGTTT3’) dan primer reverse J5 (5’ACAAAAGCAGAAATAGCACGAACAA-3’) dengan target DNA patogen
berukuran 680 bp (Garnier et al. 2000). Bahan PCR terdiri atas Dream Taq Green
PCR Master Mix 2X. Kondisi PCR yang digunakan adalah denaturasi pada suhu
94 oC selama 3 menit, annealing pada suhu 62 oC selama 45 detik, ekstensi pada
suhu 72 oC selama 90 detik, terdiri dari 35 siklus yang didahului dengan
denaturasi awal pada suhu 94 oC selama 3 menit dan diakhiri dengan ekstensi
akhir pada suhu 72 oC selama 5 menit. DNA hasil ekstraksi dan PCR
dielektroforesis pada gel agarose 1% dalam bufer TAE 1X dan divisualisasi pada
trasilluminator UV untuk mengamati ukuran fragmen DNA bakteri dari contoh
yang dianalisis.
Pengamatan Pengaruh Aplikasi PGPR terhadap Nilai Agronomis Tanaman
Pengamatan agronomis tanaman meliputi pengukuran indeks warna daun,
pencatatan jumlah tunas, bunga dan buah pada tanaman fase vegetatif. Indeks
warna daun diukur berdasarkan tingkat warna berdasarkan bagan warna daun
pada skala 2-5. Bagan warna daun berfungsi sebagai alat untuk mengukur warna
daun dan biasanya digunakan untuk menentukan waktu pemupukan N pada
tanaman padi (BBPTP 2014). Penggunaan bagan warna daun pada penelitian ini
bertujuan untuk mengetahui perbedaan warna pada daun jeruk selama periode
pengamatan. Daun yang dipilih adalah daun bagian atas yang telah membuka
sempurna. Daun diambil dan diletakkan di atas bagan warna daun untuk
dibandingkan warnanya dengan skala 2-5. Apabila warna daun berada di antara
dua skala yang terdapat pada bagan warna daun maka digunakan nilai rata- rata
skala. Penilaian nilai indeks warna daun disajikan pada Gambar 1.
Gambar 1 Bagan warna daun dengan nilai numerik 2-5
BWD-1: 2 ≤ X < 3, BWD-2: 3 ≤ X < 4, BWD-3: 4≤ X
HUANGLONGBING DAN PENGARUH APLIKASI PGPR
PADA TANAMAN JERUK DI KABUPATEN BOGOR
ROIS ZAYYINUL FUADI
DEPARTEMEN PROTEKSI TANAMAN
FAKULTAS PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Intensitas Penyakit
Penting, Deteksi Huanglongbing dan Pengaruh Aplikasi PGPR pada Tanaman
Jeruk di Kabupaten Bogor adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi
pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi
mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan
maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan
dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Juni 2015
Rois Zayyinul Fuadi
NIM A34090067
ABSTRAK
ROIS ZAYYINUL FUADI. Intensitas Penyakit Penting, Deteksi Huanglongbing
dan Pengaruh Aplikasi PGPR pada Tanaman Jeruk di Kabupaten Bogor.
Dibimbing oleh KIKIN HAMZAH MUTAQIN dan EFI TODING TONDOK.
Jeruk adalah salah satu tanaman holtikultura penting dan mempunyai nilai
ekonomi tinggi di Indonesia. Salah satu permasalahan penting yang dihadapi
dalam budidaya jeruk adalah adanya penyakit tanaman yang mengakibatkan
penurunan kualitas dan kuantitas hasil. Tujuan penelitian ini adalah mengamati
penyakit-penyakit umum tanaman jeruk di Kabupaten Bogor, Provinsi Jawa Barat,
deteksi penyakit huanglongbing dan melihat pengaruh aplikasi plant growth
promoting rhizobacteria (PGPR) pada fase vegetatifnya. Tahapan penelitian
meliputi pengamatan intensitas dan identifikasi penyakit yang ditemui di lapang,
aplikasi PGPR pada tanaman jeruk fase vegetatif untuk mengetahi pengaruhnya
terhadap intensitas penyakit jeruk. Selanjutnya, pengamatan berdasarkan peubah
agronomi tanaman yang dilakukan setiap minggu selama 10 minggu pengamatan.
Khusus untuk penyakit huanglongbing, yang juga dikenal sebagai CVPD,
dilakukan pengamatan gejala eksternal serta gejala internal melalui uji akumulasi
pati pada jaringan floem yang diambil dari tulang daun tanaman jeruk dan deteksi
secara molekuler dengan teknik polymerase chain reaction (PCR). Berdasarkan
pengukuran Area
ABSTRACT
ROIS ZAYYINUL FUADI. Intensity of Important Diseases, Detection of
Huanglongbing and the Effect of Plant Growth Promoting Rhizobacteria
Application on Citrus in Bogor. Supervised by KIKIN HAMZAH MUTAQIN and
EFI TODING TONDOK.
Citrus is one of the important holticultural crops and plays a significant
economic role in Indonesia. Diseases are serious constraint to cause reduction of
yield quality and quantity. The objectives of this study were to observe important
diseases, which affect citrus plants grown in Bogor district of West Java province
and to look the effect of application of plant growth promoting rhizobacteria
(PGPR) to its vegetative phase. The studies involved field observation and
subsequent identification of encountered diseases, application of PGPR on citrus
plants at vegetative phase to find its effect on citrus disease incidences and
severities. Furthermore, observations based on agronomic growth parameter of
the plants were made once a week during 10 weeks. For huanglongbing disease,
external symptom observation and starch accumulation tests to show internal
symptom were carried out on sample of leaf petioles and midribs. Huanglongbing
detection was done through molecular methods with polymerase chain reaction
(PCR). Total DNA was extracted from leaf petioles and midrib from each sample
plant. The extracted DNA was used as template for PCR amplification. Based on
Area Under the Diseases Progress Curve (AUDPC), it showed that the most
predominant disease of citrus at vegetative and generative phase at area I were
sooty mold (Meliola sp.) and scab disease (Elsinoe fawcetti), meanwhile in area II
were scab disease in generative phase. PGPR application resulted in insignificant
disease intensity change in the plant compare to that untreated citrus. Therefore,
PGPR treatment did not give effect on decreasing the disease incidence and
severity, but it could affect citrus growth and development. Huanglongbing
diasease incidence was low at both orchards. Diagnosing huanglongbing from
internal symptom expressed as starch accumulation in phloem tissue does not
always show positive result with that of PCR assay.
Keyword: CVPD, huanglongbing, citrus diseases, PGPR, polymerase chain
reaction.
©Hak Cipta milik IPB, tahun 2015
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau
menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang
wajar IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam
bentuk apa pun tanpa izin IPB
INTENSITAS PENYAKIT PENTING, DETEKSI
HUANGLONGBING DAN PENGARUH APLIKASI PGPR
PADA TANAMAN JERUK DI KABUPATEN BOGOR
ROIS ZAYYINUL FUADI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Pertanian
pada
Departemen Proteksi Tanaman
DEPARTEMEN PROTEKSI TANAMAN
FAKULTAS PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga skripsi ini dapat diselesaikan. Skripsi ini berjudul
Intensitas Penyakit Penting, Deteksi Huanglongbing dan Pengaruh Aplikasi
PGPR pada Tanaman Jeruk di Kabupaten Bogor.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Dr. Ir. Kikin Hamzah Mutaqin
MSi. dan Ibu Dr. Efi Toding Tondok SP. MSc. selaku dosen pembimbing skripsi
yang telah memberikan pengarahan, saran dan motivasi selama penelitian dan
penulisan skripsi. Ucapan terimakasih juga disampaikan kepada Bapak Dr. Ir.
Abdul Muin Adnan, MS. selaku dosen pembimbing akademik yang telah
memberikan bimbingan dan saran selama penulis menuntut ilmu di Departemen
Proteksi Tanaman. Penulis juga menyampaikan terima kasih kepada Dr. Endang
Sri Ratna selaku dosen penguji tamu yang telah memberikan saran dan masukan
terhadap penyempurnaan skripsi. Di samping itu, penghargaan penulis sampaikan
kepada Bapak H. Iming, Bapak Yunus dan Bapak Amir pemilik pertanaman jeruk
di Desa Situ Gede tempat penelitian dilaksanakan. Ucapan terima kasih juga
penulis ucapkan kepada rekan-rekan mahasiswa S1/S2/S3 di Laboratorium
Bakteriologi Tumbuhan dan Laboratorium Mikologi Tumbuhan yaitu Ariny
Prasetya SP. MSi., Indriati Husain SP. MSi., Mahardika Gama SP., Nadzirum
Mubin SP. MSi., Tatit Sastrini SP., Syaiful Khoiry SP., Muhammad Rizal SP.,
Suci AK, Antoni Sulthan SP. dan Teguh Pratama SP. yang telah memberikan
bantuan dan saran selama pelaksanaan penelitian dan penulisan skripsi. Kakakkakak tingkat yaitu Zakarias Pikindu SP., Busyairi SP., Rado Puji Santoso SP. dan
Mochamad Yadi Nurjayadi SSi. atas nasehat dan motivasinya. Ungkapan
terimakasih juga disampaikan kepada Devi Indriana Sari Amd.Keb yang telah
menemani dan memberikan semangat selama proses penyelesaian penulisan
skripsi. Teman-teman di Wisma Galih yaitu Hera Tri Utomo SPt., Ilham
Abiwijaya SHut., Muhammad Doni Rahman STp., Bayu Gagat P SHut., dan
Nasrudin SSi. atas kebersamaannya. Terimakasih juga ditujukan kepada temanteman Departemen Proteksi Tanaman angkatan 47 atas dukungan dan bantuan
yang telah diberikan.
Kepada ibu, bapak, adik Rahma, serta seluruh keluarga yang telah
mencurahkan kasih sayang, doa dan dukungan tiada henti selama ini, karya ini
semoga menjadi persembahan kecil dari ananda.
Semoga penelitian ini bermanfaat.
Bogor, Juni 2015
Rois Zayyinul Fuadi
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL
viii
DAFTAR GAMBAR
ix
DAFTAR LAMPIRAN
PENDAHULUAN
x
1
Latar Belakang
1
Tujuan Penelitian
2
Manfaat Penelitian
2
BAHAN DAN METODE
3
Tempat dan Waktu Penelitian
3
Alat dan Bahan
3
Metode Penelitian
3
Penentuan Lokasi dan Pengamatan Tanaman Contoh
3
Identifikasi Penyakit
4
Deteksi Penyakit Huanglongbing
4
Pengamatan Pengaruh Aplikasi PGPR terhadap Nilai Agronomis
Tanaman
5
HASIL DAN PEMBAHASAN
6
Keadaan Umum Lahan Peranaman Jeruk
6
Penyakit yang Ditemukan pada Tanaman Jeruk
6
Busuk Buah
7
Busuk Pangkal Batang
7
Penyakit Kulit Diplodia
8
Mati Pucuk
9
Kudis
10
Jamur Upas
11
Embun Hitam
12
Bercak Alternaria
14
Bercak Cercospora
15
Kanker
16
Area Under the Disease Progress Curve (AUDPC)
17
Deteksi Penyakit Huanglongbing
18
Penyebab dan Vektor Penyakit Huanglongbing
18
Pengamatan Gejala Eksternal Penyakit Huanglongning
19
Pengamatan Gejala Internal Penyakit Huanglongbing
20
Deteksi Huanglongbing pada Jeruk dengan PCR melalui Ekstraksi
DNA
20
Pengaruh Aplikasi PGPR terhadap Faktor Agronomis pada Tanaman
Jeruk
Fase Vegetatif
22
SIMPULAN DAN SARAN
25
Simpulan
Saran
DAFTAR PUSTAKA
LAMPIRAN
25
25
26
29
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Penyakit tanaman jeruk di Situ Gede, Dramaga, Bogor, Jawa Barat
2 Nilai AUDPC intensitas penyakit selama 10 minggu pada tanaman
jeruk di Situ Gede
3 Identifikasi gejala penyakit huanglongbing secara eksternal, internal
dan secara molekuler menggunakan PCR
4 Hasil pengamatan pengaruh aplikasi PGPR terhadap faktor agronomis
pada tanaman jeruk fase vegetatif
7
18
19
23
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
Bagan warna daun dengan nilai numerik 2-5
Pertanaman jeruk di Desa Situ Gede Kecamatan Dramaga
Persentase insidensi dan severitas penyakit busuk pangkal batang pada
tanaman jeruk lahan 2
Gejala dan penyebab penyakit: (a) busuk buah, (b) busuk pangkal
batang, (c) sporangium (Phytophthora spp.)
Persentase insidensi dan severitas penyakit kulit Diplodia pada tanaman
jeruk lahan 1 dan 2
Persentase insidensi dan severitas penyakit mati pucuk pada tanaman
jeruk lahan 1 dan 2
Gejala dan penyebab penyakit : (a) penyakit kulit Diplodia, (b) mati
pucuk, (c) konidia Botryodiplodia theobromae
Gejala penyakit kudis (Elsinoe fawcetti)
Persentase insidensi dan severitas penyakit kudis pada tanaman jeruk
lahan 1 dan 2
Penyakit jamur upas (Upasia salmonicolor)
Persentase insidensi dan severitas penyakit jamur upas pada tanaman
jeruk lahan 1 dan 2
Gejala dan tanda penyakit embun hitam (Meliola citricola)
Persentase insidensi dan severitas penyakit embun hitam pada tanaman
jeruk lahan 1 dan 2
Gejala dan penyebab penyakit bercak Alternaria (Alternaria alternate)
Persentase insidensi dan severitas penyakit bercak Alternaria pada
tanaman jeruk lahan 1 dan 2
Gejala dan penyebab penyakit bercak Cercospora (Cercospora sp.)
Persentase insidensi dan severitas penyakit bercak Cercospora pada
tanaman jeruk lahan 1 dan 2
Gejala penyakit Kanker (Xanthomonas axonopodis)
Persentase insidensi dan severitas penyakit kanker pada tanaman jeruk
lahan 1 dan 2
Serangga vektor Diaphorina citri
Pengamatan gejala eksternal : (21a) tanaman bergejala huanglongbing,
(21b) tanaman tidak bergejala
Pengamatan gejala internal : (22a) tanaman tidak bergejala, tidak
terdapat akumulasi pati, (22b) tanaman bergejala, tidak terdapat
akumulasi pati, (22c) tanaman bergejala dan terdapat akumulasi pati
Hasil amplifikasi PCR terhadap DNA contoh daun jeruk sakit
huanglongbing
5
6
8
8
9
10
10
11
11
12
12
13
13
14
14
15
16
17
17
20
21
21
22
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Data curah hujan bulanan pada bulan Mei sampai Oktober 2014
30
2 Insidensi dan severitas penyakit pada lahan I pertanaman jeruk di Desa
Situgede pada bulan Agustus sampai Oktober 2014
31
3 Insidensi dan severitas penyakit pada lahan II pertanaman jeruk di Desa
Situgede pada bulan Agustus sampai Oktober 2014
33
4 Identifikasi penyakit huanglongbing berdasarkan gejala eksternal pada daun
jeruk
34
5 Identifikasi penyakit huanglongbing berdasarkan gejala internal berupa
akumulasi pati pada petiol daun
6 Larutan Iodin - Kalium Iodida yang digunakan dalam uji akumulasi pati 41
7 Larutan Penyangga CTAB (CTAB buffer) yang digunakan dalam ekstraksi
DNA
41
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Jeruk (Citrus spp.) merupakan tanaman hortikultura penting dari famili
Rutaceae. Tanaman jeruk diduga berasal dari Asia, tepatnya Cina. Daerah yang
terkenal sebagai daerah pertanaman jeruk di Indonesia adalah Medan dan Brastagi
(Sumatra Utara), Palembang (Sumatra Selatan), Bogor, Garut, Sukabumi,
Sumedang, Tasikmalaya (Jawa Barat), Karanganyar, Purworjo, dan Sragen (Jawa
Tengah), Banyuwangi, Madura Malang dan Tulungagung (Jawa Timur), Bangli
(Bali), Pontianak, Sambas (Kalimantan Barat), Jeneponto dan Pangkep (Sulawesi
Selatan) (Sarwono 1986). Buah jeruk mempunyai kandungan vitamin C yang
tinggi, rasa yang enak dan dimanfaatkan sebagai makanan buah segar, makanan
olahan, minuman, obat-obatan dan kosmetik. Tanaman jeruk merupakan
komoditas bernilai tinggi dan banyak dibudidayakan di Indonesia. Produksi jeruk
sebesar 1.6 juta ton menempatkan Indonesia sebagai negara penghasil jeruk ke-13
di dunia pada tahun 2004 (Balitbangtan 2007). Produktivitas jeruk pernah
mencapai 2.625.884 ton pada tahun 2007, namun terus mengalami penurunan
hingga tahun 2014 dengan hasil produksi sebesar 1.411.229 ton (BPS 2014).
Hama dan penyakit tanaman menjadi salah satu faktor penyebab rendahnya
produktivitas jeruk tersebut.
Beberapa penyakit penting pada tanaman jeruk dapat mengakibatkan
kerugian ekonomi di antaranya, penyakit busuk pangkal batang, kudis, blendok,
kanker, tristeza, dan penyakit Citrus Vein Phloem Degeneration (CVPD).
Beberapa sentra penghasil jeruk Indonesia pernah mengalami kemunduran pada
tahun 1982-1985 akibat penyakit CVPD (Balitjestro 2008). Menurut Ditlin (1994)
daerah tersebut meliputi Garut (Jawa Barat), Tawangmangu (Jawa Tengah),
Punten (Jawa Timur), Tejakula (Bali). Penyakit CVPD yang disepakati secara
internasional namanya menjadi huanglongbing, disebabkan oleh bakteri
Liberobacter asiaticus yang ditularkan oleh serangga vektor Diaphorina citri
(Balitjestro 2008). Diagnosis penyakit sebagai langkah awal untuk taktik
pengendalian selanjutnya seharusnya didasarkan atas deteksi dan identifikasi yang
tepat. Deteksi dan identifikasi penyakit seringkali merupakan rangkaian dari
tahap-tahap pengamatan gejala di lapangan sampai dengan teknik-teknik di
laboratorium.
Salah satu teknik pengendalian yang potensial adalah penggunaan agens
hayati, seperti plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) yang dapat
meningkatkan kesehatan dan ketahanan tanaman. PGPR merupakan bakteribakteri yang hidup dan berkoloni di sekitar perakaran. Terdapat beberapa
mekanisme PGPR dalam meningkatkan dan memicu kesehatan tanaman,
diantaranya adalah mekanisme induksi resistensi sistemik, mekanisme
pembentukan siderophores atau antibiotik dan mekanisme penyerapan nutrisi
yang berperan sebagai pupuk hayati. PGPR juga dapat berperan sebagai
biostimulus dengan membentuk phytohormone dan sebagai bioprotektan yang
mampu menekan penyakit pada tanaman (Tenuta 2003).
2
Tujuan Penelitian
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengamati intensitas dan identifikasi
penyakit yang umum pada tanaman jeruk, deteksi penyakit huanglongbing
berdasarkan gejala dan teknik molekuler serta mengetahui peranan PGPR
terhadap penekanan penyakit dan pertumbuhan tanaman.
Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai jenis
penyakit pada tanaman jeruk saat ini, cara deteksi penyakit huanglongbing secara
tepat sebagai dasar upaya pencegahan dan penaganan penyakit tersebut dan
manfaat plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) sebagai salah satu upaya
pengendalian penyakit tanaman dengan memicu dan meningkatkan kesehatan
tanaman.
3
BAHAN DAN METODE
Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium Bakteriologi Tumbuhan, Departemen
Proteksi Tanaman. Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor dan lahan
pertanaman jeruk milik petani di Desa Situ Gede, Bogor. Penelitian ini
dilaksanakan dari bulan Mei hingga Oktober 2014.
Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam penelitian adalah kantong plastik, gunting, kuas,
mikroskop, cawan petri, kaca preparat, cover glass, kamera digital, stiker label,
mortar, pipet mikro, tip pipet, mikrosentrifus Mikro 200R Hettich Zentrifugen, ice
box, water bath, vortex mixer, freezer, Gene AMP PCR System 9700, perangkat
elektroforesis dan transilluminator UV.
Bahan yang digunakan dalam penelitian adalah tanaman jeruk, pupuk hayati
berupa PGPR, contoh daun jeruk dari semua tanaman dari pertanaman jeruk milik
petani di Desa Situ Gede, tabung ependorf ukuran 1.5 ml dan 2 ml, nitrogen cair,
asam laktat, iodin, kalium iodida, gelas preparat, bufer ekstraksi, bufer CTAB 2%,
bufer NaCl 5 M, bufer CTAB 10% dalam 0.7 M NaCl, kloroform/isoamil alkohol
(24:1 v/v), isopropanol, alkohol 70%, akuades, Primer forward A2, Primer
reverse J5, ddH2O, gel agarosa, bufer TAE 2X, etidium bromida, bufer TAE 1X,
marker 1 kbp, loading dye dan parafilm.
Metode Penelitian
Penentuan Lokasi dan Pengamatan Tanaman Contoh
Penelitian dilakukan di dua lahan pertanaman jeruk milik petani di Desa
Situ Gede. Pengamatan penyakit dilakukan pada kedua lahan secara langsung.
Pada lahan I dilakukan pengamatan pada 20 tanaman contoh, masing-masing
terdiri atas 10 tanaman jeruk fase generatif umur 5 tahun dan fase vegetatif umur
1 tahun, sedangkan pada lahan II dilakukan pengamatan terhadap 20 tanaman
contoh fase generatif umur 7 tahun. Insidensi dan severitas penyakit dihitung
dengan menggunakan rumus :
n = jumlah tanaman yang terserang
N= jumlah tanaman yang diamati
n = jumlah tanaman yang tergolong ke dalam suatu kategori serangan
v = nilai numerik pada masing-masing kategori
N= jumlah tanaman yang diamati
V= nilai kategori serangan terberat
Pengamatan meliputi gejala pada keseluruhan tanaman dan bagian-bagian
tanaman, penilaian penyakit (insidensi dan severitas penyakit). PGPR
4
diaplikasikan pada tanaman jeruk fase vegetatif, kemudian diamati perubahan
pertumbuhan, insidensi dan severitas penyakit setiap minggu selama 10 minggu.
Tanaman yang bergejala diambil contoh untuk identifikasi lebih lanjut. Skor
penentuan kategori penyakit adalah sebagai berikut: 0 (tidak ada serangan), 1 (0 ≤
x ≤ 25 %), 2 (25 < x ≤ 50%), 3 (50 < x ≤ 75%), 4 (> 75%). Suatu penyakit yang
teramati dihitung sebagai Area Under the Disease Progress Curve (AUDPC)
menggunakan rumus sebagai berikut:
yi = data pengamatan ke-i
ti = waktu pengamatan ke-I
∑(
)
yi+1 = data pengamatan ke-i+1
ti+1 = waktu pengamatan ke i+1
Identifikasi Penyakit
Identifikasi penyakit dilakukan dengan berbagai cara tergantung jenis
patogen penyebabnya, diantaranya didasarkan atas gejala khas yang ditimbulkan
suatu patogen pada tanaman jeruk dan pembuatan preparat patogen. Tanaman
yang bergejala patogen dibuat preparat dengan cara dikorek dan ditetesi dengan
laktofenol biru. Penyakit yang disebabkan cendawan Deuteromycetes
diidentifikasi secara mikroskopis berdasarkan kunci identifikasi berdasarkan
Barnett dan Hunter (1999).
Deteksi Penyakit Huanglongbing
Deteksi penyakit huanglongbing, selain dilakukan pengamatan gejala
eksternal, juga dilakukan pengamatan gejala internal melalui uji akumulasi pati
menggunakan metode Noordam (1973) dan teknik PCR. Teknik PCR dilakukan
dengan pengambilan 3 sampai 5 contoh daun secara acak pada setiap tanaman
contoh dan tanaman kontrol. Tahapan bekerja dengan teknik PCR meliputi tahap
ekstraksi DNA total menggunakan metode Su & Hung (2001), amplifikasi DNA
dengan PCR, dan elektroforesis gel agarose.
Ekstraksi DNA total dari jaringan tulang daun tanaman yang terinfeksi
huanglongbing menggunakan metode Su & Hung (2001). Tulang daun dari dua
helai daun segar yang tidak mengalami nekrosis dipotong-potong halus dengan
silet, kemudian digerus pada mortar beku. Hasil gerusan dipindah ke dalam
tabung eppendorf 1,5 ml dan disuspensikan denga 800 μl bufer CTAB pada suhu
60 oC yang mengandung 0,2% CTAB; 1,4 M NaCl; 100 mM Tris-HCl pH 8,0; 20
mM EDTA; dan 1% β-Mercaptoethanol. Suspensi diinkubasi selama 10 menit
pada suhu 65 oC. Selama inkubasi, tabung dibolak-balik beberapa kali.
Selanjutnya dilakukan sentrifugasi pada 5000 rpm selama 5 menit, supernatan
yang dihasilkan dipindah ke dalam tabung eppendorf baru. Ke dalam supernatan
ditambahkan kloroform/isoamil alkohol (24:1 v/v) dengan volume setara,
kemudian divortex dan disentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm selama 5
menit. Lapisan epifase sebanyak 100 μl dipindahkan ke tabung eppendorf baru
dan dipresipitasi dengan menambahkan 10 μl NaOAc (pH 5,2) serta 275 μl
ethanol 70% dingin (-20 oC), kemudian diinkubasi pada suhu -20 oC selama 30
menit. Suspensi disentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm selama 15 menit pada
suhu 4 oC. Supernatan dibuang, endapan DNA dicuci dua kali dengan etanol 70%
dingin (-20 oC) dan disentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm selama 2 menit.
5
Endapan DNA dikeringanginkan, DNA diresuspensikan dengan bufer TE
sebanyak 30 μl.
Contoh DNA hasil ekstraksi kemudian diamplifikasi dengan teknik PCR
menggunakan primer spesifik untuk mendeteksi patogen Liberobacter asiaticus
penyebab penyakit Huanglongbing, yaitu primer forward A2 (5’TATAAAGGTTGACCTTTCGAGTTT3’) dan primer reverse J5 (5’ACAAAAGCAGAAATAGCACGAACAA-3’) dengan target DNA patogen
berukuran 680 bp (Garnier et al. 2000). Bahan PCR terdiri atas Dream Taq Green
PCR Master Mix 2X. Kondisi PCR yang digunakan adalah denaturasi pada suhu
94 oC selama 3 menit, annealing pada suhu 62 oC selama 45 detik, ekstensi pada
suhu 72 oC selama 90 detik, terdiri dari 35 siklus yang didahului dengan
denaturasi awal pada suhu 94 oC selama 3 menit dan diakhiri dengan ekstensi
akhir pada suhu 72 oC selama 5 menit. DNA hasil ekstraksi dan PCR
dielektroforesis pada gel agarose 1% dalam bufer TAE 1X dan divisualisasi pada
trasilluminator UV untuk mengamati ukuran fragmen DNA bakteri dari contoh
yang dianalisis.
Pengamatan Pengaruh Aplikasi PGPR terhadap Nilai Agronomis Tanaman
Pengamatan agronomis tanaman meliputi pengukuran indeks warna daun,
pencatatan jumlah tunas, bunga dan buah pada tanaman fase vegetatif. Indeks
warna daun diukur berdasarkan tingkat warna berdasarkan bagan warna daun
pada skala 2-5. Bagan warna daun berfungsi sebagai alat untuk mengukur warna
daun dan biasanya digunakan untuk menentukan waktu pemupukan N pada
tanaman padi (BBPTP 2014). Penggunaan bagan warna daun pada penelitian ini
bertujuan untuk mengetahui perbedaan warna pada daun jeruk selama periode
pengamatan. Daun yang dipilih adalah daun bagian atas yang telah membuka
sempurna. Daun diambil dan diletakkan di atas bagan warna daun untuk
dibandingkan warnanya dengan skala 2-5. Apabila warna daun berada di antara
dua skala yang terdapat pada bagan warna daun maka digunakan nilai rata- rata
skala. Penilaian nilai indeks warna daun disajikan pada Gambar 1.
Gambar 1 Bagan warna daun dengan nilai numerik 2-5
BWD-1: 2 ≤ X < 3, BWD-2: 3 ≤ X < 4, BWD-3: 4≤ X