Gambar 6. Pohon filogeni Famili Stichopodidae berdasarkan DNA mitokondria modifikasi Byrne et al. 2010.
BAB III METODOLOGI
A. Waktu dan Lokasi Penelitian
Lokasi penelitian dilakukan di Pusat Penelitian Oseanografi – LIPI, Jakarta. Pengamatan dan analisa dilaksanakan pada bulan Januari 2012 sampai April 2012.
Spesimen yang diamati berupa awetan yang terendam alkohol 70 dan tersimpan dalam ruang koleksi P2O-LIPI, Jakarta.
B. Sampel
Sampel yang digunakan untuk penelitian filogeni timun laut anggota Famili Stichopodidae Aspidochirotida, Holothuroidea, Echinodermata adalah spesimen
yang terkumpul dari perairan dangkal Indonesia dalam periode lebih dari 50 tahun yang disimpan di ruang koleksi P2O-LIPI, Jakarta. Beberapa spesimen yang
digunakan telah dideskripsikan oleh Wirawati et al. 2007; Purwati Wirawati 2009; Purwati Wirawati 2011 Tabel 1.
Studi ini menggunakan dua genus anggota Stichopodidae yang terdapat di ruang spesimen koleksi P2O-LIPI Jakarta, serta hidup di daerah tropis dan di
perairan dangkal, yaitu Stichopus Brandt 1835 dan Thelenota HL Clark 1921 sebagai taksa ingroup. Dua genus anggota Holothuriidae, yaitu Holothuria
Linnaeus 1767 dan Actinopyga Bronn 1860 ditetapkan sebagai outgroup yang merupakan kerabat terdekat dari famili Stichopodidae dan dapat digunakan
sebagai akar rooting dalam pohon analisa filogeni yang sesuai dengan analisa filogeni yang dilakukan oleh Samyn et al. 2005 dan Appeltans 2002 Tabel 1.
C. Bahan dan Metode Penelitian
Alat dan Bahan
Alat yang digunakan untuk penelitian kali ini adalah: mikroskop perbesaran kuat dan mikroskop perbesaran lemah, Alat-alat bedah gunting bedah, pisau
bedah, pinset, gelas objek, gelas penutup, pipet, kamera digital, caliper. Bahan yang digunakan adalah alkohol 70, cairan pelarut hidrogen peroksida H
2
O
2
, aquadest, gliserin.
Teknik Pengamatan dan Identifikasi untuk Analisa Filogeni 1.
Pengamatan Morfologi Eksternal
Spesimen yang akan diamati merupakan spesimen awetan yang kondisinya masih bagus, yaitu spesimen yang bentuknya masih dapat diamati dan memiliki
label yang lengkap minimal tercantum tanggal koleksi dan lokasi. Morfologi eksternal yang diamati adalah bentuk penampang tubuh, panjang maksimal tubuh,
susunan papila dan kaki tabung, ada tidaknya tuberkel pada papila, posisi mulut dan anus, ada tidaknya modifikasi anus dan jumlah tentakel.
Tabel 1 Daftar spesimen koleksi Puslit Oseanografi-LIPI, Jakarta untuk analisa filogeni
Famili Genus
Spesies Jml spesimen
Pustaka
Ingroup
Famili Stichopodidae
Hacckel, 1896 Genus
Stichopus Brandt, 1835
Stichopus chloronotus Brandt,
1835 5 EH77, EH80,
EH214, EH239, EH449
[1]
S. herrmanni Semper, 1868
5 EH26, EH92, EH217, EH357,
EH431 [1]
S. horrens Selenka, 1887
3 EH222, EH450, EH451
[1] S. pseudohorrens
Cherbonnier, 1967
1 EH400 [4]
S. quadrifasciatus Massin, 1999 2 EH249,
EH250 [1]
S. vastus Sluiter, 1887
5 EH166, EH248, EH436,
EH468, EH502 [1]
Thelenota HL Clark, 1921
Thelenota ananas Jaeger,
1833 2 EH204,
EH397 [1]
T. anax HL Clark, 1921
2 EH225, EH504
[1] T. rubralienata
Massin Lane 1991
1 EH427 [4]
Outgroup
Famili Holothuriidae
Ludwig, 1894 Genus
Holothuria Linnaeus, 1767
Holothuria Metriatyla scabra Jaeger, 1833
5 EH16, EH72, EH119, EH206,
EH271 [2]
Actinopyga Bronn, 1860
Actinopyga lecanora Jaeger,
1833 5 EH76,
EH371, EH388, EH489, EH513
[3]
Keterangan: [1] = Wirawati, et al. 2007; [2] = Purwati Wirawati 2009; [3] = Purwati Wirawati 2011; [4] = studi ini
2. Pengamatan Morfologi Organ Internal
Untuk melakukan pengamatan morfologi internal dilakukan pembedahan terlebih dahulu. Metode kerja yang digunakan berdasarkan Solis-Marin 2003
dengan modifikasi, yaitu dinding tubuh spesimen bagian dorsal dibedah dari lubang anus sampai ke lubang mulut. Hal tersebut dilakukan agar dapat
mengamati dengan lebih jelas organ-organ yang terdapat di dalam tubuh. Kemudian spesimen diletakkan di atas papan bedah untuk diamati dan difoto
dengan kamera digital. Karakter morfologi internal yang diamati pada studi ini adalah bentuk dan perbandingan ukuran cincin kapur bagian radial dengan
interadial, jumlah gonad, bentuk madreporit, jumlah dan panjang polian vesikel serta ada tidaknya organ cuvier.
3. Isolasi dan Pengamatan Spikula
Isolasi spikula dilakukan untuk mendapatkan sediaan spikula. metode mengisolasi spikula sesuai dengan Wirawati et al. 2007 yang dimodifikasi
dengan cara yang digunakan oleh Samyn et al. 2006. Spikula diambil dari bagian papila dorsal, dinding tubuh dorsal dan ventral, kaki tabung ventral dan
tentakel sebesar kurang lebih 0,5 cm
2
. Selanjutnya potongan tersebut diletakkan diatas gelas objek dan diteteskan dengan cairan pelarut hidrogen peroksida
H
2
O
2
dan dibiarkan selama 5 sampai 10 menit. Setelah jaringan larut dan spikula berupa butiran putih mengendap, maka larutan hidrogen peroksida
tersebut dihisap dengan pipet dan dibilas sebanyak dua kali dengan aquadest. Gliserin diteteskan dengan pipet pada sediaan spikula kemudian ditutup dengan
kaca penutup untuk diamati di bawah mikroskop dan difoto. Spikula yang diamati berasal dari beberapa bagian tubuh, yaitu dinding tubuh dorsal dan ventral, papila
dorsal, kaki tabung ventral dan tentakel.
