REGENERASI KELAPA KOPYOR DENGAN METODE PEMBELAHAN

1 Bagian bab ini dalam proses pengajuan paten ke Direktorat Jenderal Hak Kekayaan Intelektual, Departemen Hukum dan Hak Asasi Manusia R.I. dengan judul invensi: Pembelahan Eksplan Embrio Sigotik untuk Peningkatan Jumlah Planlet dan Bibit Kelapa Kopyor

BAB IV REGENERASI KELAPA KOPYOR DENGAN METODE PEMBELAHAN

EKSPLAN EMBRIO SIGOTIK PADA DAERAH MERISTEM APIKAL Abstrak Kultur embrio hanya menghasilkan satu planlet per embrio sigotik yang ditanam. Pembelahan embrio sigotik secara longitudinal akan meningkatkan eksplan menjadi dua kali. Belahan eksplan embriogenik diambil dari embrio segar yang diisolasi dari buah dan embrio yang berkecambah dengan plumula dan radikel setelah dikultur selama satu bulan. Setelah ditanam pada media padat Eeuwens yang mengandung sukrosa 60gl, arang aktif 2.5 gl, dan BAP 2.5-7.5 mgl, kedua macam eksplan tumbuh menjadi planlet lengkap, tunas, atau akar saja. Eksplan belahan embrio yang tumbuh menjadi planlet dan tunas mencapai 83, sedangkan eksplan belahan kecambah mencapai 100. BAP meningkatkan pertumbuhan tunas namun tidak berpengaruh pada pertumbuhan akar dan konsentrasi yang terbaik adalah 5 mgl. Kata kunci: induksi tunas, BAP, kultur embrio REGENERATION OF KOPYOR COCONUT BY EXCISING OF ZYGOTIC EMBRYO EXPLANT IN THE APICAL MERISTEM 1 Abstract Embryo rescue produces only one plantlet per zygotic embryo cultured. Longitudinally excision the zygotic embryos would increase the explants 2-fold. The half embryonic explants were excised from freshly isolated embryo of the fruit or from the germinating embryo that has grown plumule and radicle one month after cultured. Upon transferred to Eeuwens solid medium containing 60 gl sucrose, 2.5 gl activated charcoal, and 2.5-7.5 mgl BAP, both kinds of explants regenerated into a complete plantlet, shoot without root, or root only. The halved embryo explants regenerated plantlet and shoot up to 83, while the halved germinating embryo regenerated plantlet up to 100. BAP improved shoot growth but not root growth and the best was 5 mgl. Key words: shoot induction, BAP, embryo culture 1 Part of this chapter is in the process of patent application to the Directorate General of Intellectual Property, Ministry of Law and Human Rights Republic of Indonesia, with tittle of invention: Splitting of Zygotic Embryo Explant to Increase Number of Kopyor Coconut Plantlet and Seedling. Pendahuluan Pohon kelapa maupun pohon kelapa berbuah kopyor mempunyai batang lurus, tidak bercabang dan berbentuk silinder yang berasal dari satu titik tumbuh meristem apikal. Bagian meristematik tanaman hanya terdapat pada tunas apikal dan ujung akar. Pohon kelapa juga tidak mempunyai sucker atau anakan sehingga sifat-sifat tersebut menyebabkan tanaman kelapa tidak bisa diperbanyak secara klonal. Metode perbanyakan yang umum digunakan adalah dengan perbanyakan generatif melalui buah kelapa yang dikecambahkan. Khusus untuk kelapa kopyor, teknik perbanyakan yang dipakai adalah dengan mengecambahkan buah kelapa dari pohon kelapa normal yang berbuah kopyor. Bibit yang didapat dari teknik perbanyakan tersebut akan menghasilkan buah kelapa normal dan buah kelapa kopyor. Perkembangan di bidang kultur jaringan memungkinkan memperbanyak tanaman kelapa kopyor yang dapat menghasilkan buah kelapa yang semuanya kopyor, yaitu melalui teknik kultur embrio. Teknik ini telah dikembangkan dengan intensif oleh beberapa laboratorium kultur jaringan untuk memproduksi bibit kelapa kopyor. Meskipun demikian, banyak kendala yang ditemukan dengan teknik kultur embrio sehingga persentase bibit kelapa kopyor yang diperoleh masih cukup rendah. Dengan sistem kultur embrio yang ada saat ini, jumlah maksimal bibit kelapa kopyor yang dapat diperoleh hanya sebanyak embrio yang ditanam pada saat awal. Jumlah bibit kelapa kopyor yang diperoleh dapat diperbesar jika tingkat multiplikasi planlet ditingkatkan. Pada sebagian besar tanaman multiplikasi planlet dilakukan melalui multiplikasi tunas-tunas lateral lateral buds. Problem dengan kelapa dan juga kelapa kopyor adalah tunas lateral sulit diinduksi menjadi tunas-tunas baru yang tumbuh dari daerah meristem pucuk. Kemungkinan dominasi apikal pada daerah meristem pucuk sangat kuat. Oleh sebab itu fokus sekarang dialihkan pada embrio kelapa kopyor sebagai satu-satunya sumber eksplan untuk memperbanyak bibit kelapa kopyor secara in vitro. Pada penelitian ini, daerah meristem pucuk yang mengandung bakal tunas dan bakal akar dibelah secara longitudinal. Tujuannya adalah memecah titik tumbuh tunas dan akar sehingga dapat berkembang menjadi individu-individu tunas dan akar yang baru. Tergantung pada jumlah pembelahan, jika embrio dibelah menjadi dua dengan tepat maka masing-masing belahan diharapkan menjadi planlet baru. Dengan demikian, multiplikasi planlet bisa ditingkatkan dua kali atau dari satu embrio dapat diperoleh dua planlet baru. Tujuan Penelitian Tujuan penelitian adalah mencari metode memperbanyak planlet kelapa kopyor melalui pembelahan eksplan embrio sigotik dan dengan pembelahan eksplan kecambah. Metodologi Penelitian Bahan Tanam dan Media Kultur Bahan penelitian embrio kelapa kopyor berasal dari buah kelapa kopyor yang diambil pada bulan September 2007 dari sentra kebun kelapa berbuah kopyor di Sumenep, Jawa Timur. Embrio diambil dari buah kelapa kopyor umur 11-12 bulan dengan menggunakan spatula dalam bentuk silinder endosperma yang didalamnya mengandung embrio. Silinder endosperma selanjutnya dibawah ke laboratorium untuk disterilisasi. Sterilisasi silinder endosperma menggunakan Natrium hipoklorit NaClO 1 selama 20 menit dan dibilas dengan akuades steril sebanyak 3 kali. Di dalam Laminair Air Flow Cabinet embrio dikeluarkan dari silinder endosperma dan dimasukkan ke dalam gelas erlenmeyer 250 ml. Setiap gelas erlemenyer berisi 50 embrio. Embrio kemudian disterilisasi dengan NaClO 0.5 selama 5 menit dan sterilisasi ini diulang sekali lagi dengan waktu yang sama. Setelah itu embrio dicuci dengan akuades steril sebanyak tiga kali. Media dasar yang dipakai adalah media cair dan padat yang mengandung senyawa makro dan mikro Eeuwens 1976 dan vitamin dari Morel Wetmore 1951. Media juga mengandung arang aktif 2.5 gl, sukrosa 60 gl, agar 7 gl dengan pH media 5.8. sebelum disterilisasi. Media disterilisasi selama 20 menit dengan tekanan 15 psi dan suhu 121°C. Induksi Tunas dari Eksplan Embrio Kelapa Kopyor yang Dibelah Embrio kelapa kopyor dibuang bagian haustorium dan dibelah menjadi dua bagian secara longitudinal. Masing-masing potongan embrio ini kemudian ditanam pada media Eeuwens padat. Media berisi arang aktif 2.5 gl, sukrosa 60 gl, 2,4-D 2.5 mgl dan berbagai konsentrasi BAP 0, 2.5; 5.0; 7.5 mgl. Setiap botol kultur yang mewakili satu unit percobaan diisi dengan 2 potongan embrio yang berasal dari satu embrio yang sama. Setiap perlakuan ada 15 botol kultur. Kultur diletakkan dalam rak kultur dengan susunan sesuai dengan Rancangan Acak Lengkap RAL di bawah kondisi yang gelap selama dua bulan atau sampai keluar tunas. Suhu ruangan dipertahankan sekitar 25 C. Setelah tunasdan akar muncul, planlet disubkultur ke media Eeuwens padat yang mengandung arang aktif 2.5 gl, sukrosa 60 gl dan BAP 2.5; 5.0; 7.5 mgl . Selanjutnya kultur dipindah ke ruang yang terang dengan penyinaran 16 jam terang dan 8 jam gelap. Eksplan yang tumbuh tunas atau tumbuh tunas dengan akar disubkultur dua bulan sekali, sedangkan eksplan yang hanya tumbuh akar dibuang. Planlet-planlet yang hanya tumbuh tunas tanpa akar dari media tanpa BAP diinduksi perakarannya pada media yang mengandung ZPT auksin IBA. Pengamatan dilakukan terhadap jumlah eksplan yang berhasil tumbuh, jumlah eksplan yang tumbuh tunas dan akar, jumlah eksplan yang hanya membentuk tunas, jumlah eksplan yang hanya tumbuh akar, panjang tunas, dan panjang akar. Data hasil pengamatan dianalisis dengan sidik ragam ANOVA untuk menentukan pengaruh perlakuan SAS Institute, 1992. Rata-rata nilai tengah dibedakan dengan menggunakan Duncan Multiple Range Test DMRT pada taraf nyata 5. Induksi Tunas Kelapa Kopyor dari Eksplan Kecambah yang Dibelah Embrio kelapa kopyor dikulturkan pada media Eeuwens cair 10 mltabung reaksi yang mengandung arang aktif 2.5 gl, sukrosa 60 gl dan pH media 5.8 sebelum sterilisasi. Embrio yang telah keluar bakal tunas dan akar dijadikan sumber eksplan untuk dibelah secara longitudinal menjadi dua bagian. Bagian haustorium dipotong dan dibuang. Masing-masing potongan kecambah ini ditanam pada media Eeuwens padat 20 mllbotol kultur yang mengandung arang aktif 2.5 gl, sukrosa 45 gl, 2,4-D 2.5 mgl. Pada media ditambahkan perlakuan ZPT BAP dengan berbagai konsentrasi, yaitu 2.5; 5.0; dan 7.5 mgl. Setiap perlakuan diulang 15 kali. Kultur disusun sesuai dengan Rancangan Acak Lengkap RAL dan dipelihara dalam kondisi gelap dengan suhu 25 C sampai ada pertumbuhan tunas. Planlet selanjutnya disubkultur ke media Eeuwens padat 40 mll yang mengandung arang aktif 2.5 gl, sukrosa 45 gl dan BAP 2.5; 5.0; 7.5 mgl. Kultur kemudian dipindah ke ruang yang terang dengan penyinaran 16 jam terang dan 8 jam gelap. Evaluasi perlakuan dilakukan dengan cara mengamati jumlah eksplan yang berhasil tumbuh, jumlah eksplan yang tumbuh tunas dan akar, jumlah eksplan yang hanya membentuk tunas, jumlah eksplan yang hanya tumbuh akar, panjang tunas, dan panjang akar. Data-data dianalisis dengan ANOVA menggunakan program SAS versi 6.12. Jika ada pengaruh perlakuan, analisis dilanjutkan dengan menggunakan uji Duncan Multiple Range Test DMRT pada taraf nyata 5 untuk membedakan rata-rata nilai tengah. Hasil Penelitian Induksi Tunas dari Eksplan Embrio yang Dibelah Kelapa kopyor seperti tanaman kelapa pada umumnya hampir tak pernah mempunyai cabang yang berasal dari perkembangan tunas lateral. Namun dengan teknik pembelahan meristem apikal pada tahap embrio dan kecambah, ternyata masing-masing belahan embrio atau kecambah masih bisa tumbuh. Lebih dari 80 eksplan belahan embrio tumbuh pada media dengan BAP 2.5 mgl Tabel 4.1. Hal yang menarik adalah eksplan belahan embrio yang tumbuh semakin menurun dengan meningkatnya konsentrasi BAP, pada konsentrasi 7.5 mgl hanya sekitar 58 yang berhasil tumbuh Tabel 4.1. Tanpa pemberian BAP, belahan embrio masih bisa tumbuh tetapi eksplan yang berhasil tumbuh hanya 37.5 yang terdiri dari 25 tumbuh tunas dan Tabel 4.1 Persentase eksplan belahan embrio yang tumbuh menjadi tunas dan akar planlet lengkap atau tunas atau akar saja pada berbagai konsentrasi BAP Konsentrasi BAP mgl Tumbuh tunas akar Tumbuh tunas Tumbuh akar Total 0.00 2.50 5.00 7.50 0.00 8.33 0.00 8.33 25.00 62.50 50.00 37.50 12.50 12.50 20.83 12.50 37.5 83.33 70.83 58.33 sisanya 12.5 tumbuh akar Tabel 4.1. Planlet tanpa akar ini disubkultur ke media perakaran dengan menambahkan IBA 2 mgl. Sementara itu, perlakuan BAP meningkatkan jumlah planlet yang terbentuk lebih dari dua kali dibanding perlakuan tanpa BAP. Walaupun demikian penambahan BAP ke dalam media tidak bisa diberikan secara sendiri. BAP masih membutuhkan zat pengatur tumbuh lain dari jenis auksin yaitu 2,4-D untuk meningkatkan persentase eksplan belahan embrio tumbuh. Jika BAP diberikan tanpa 2,4-D, eksplan sulit tumbuh dan bahkan tidak memberi respon apapun. Hal ini hampir sama dengan embrio asam jawa tamarin yang juga dibelah secara longitudinal dan ditumbuhkan pada media MS. Tunas adventif yang dibentuk dari belahan embrio tersebut terbaik pada media yang mengandung BAP 44.39 uM dan dikombinasikan dengan NAA 2.69 uM Mehta 2000. Pertumbuhan eksplan belahan embrio sebagian besar menjadi tunas atau menjadi akar, sedangkan eksplan yang tumbuh menjadi tunas+akar sedikit jumlahnya Tabel 4.1. Bahkan media yang tanpa BAP dan media dengan BAP 5.0 mgl menunjukkan tidak ada belahan eksplan yang tumbuh menjadi tunas+ akar. Persentase belahan eksplan yang tumbuh menjadi tunas tertinggi pada BAP 2.5 mgl. Konsentrasi di atas 2.5 mgl, persentase belahan eksplan yang menjadi tunas semakin menurun Tabel 4.1. Produksi tunas lateral secara in vitro pada tanaman bambu justru dapat ditingkatkan dengan BAP sampai konsentrasi 5 mgl Jimenez et al. 2006. Gambar 4.1 Proses regenerasi kelapa kopyor dari embrio sigotik yang dibelah sampai menjadi planlet sempurna pada media yang mengandung BAP. a. Eksplan embrio sigotik, b. Eksplan setelah dikultur selama 1 bulan di media Eeuwens cair, c. Belahan eksplan yang ditanam pada media padat, d. Belahan eksplan yang mulai tumbuh, e. Belahan eksplan mulai menampakkan warna hijau daun, f. Belahan eksplan tumbuh membentuk daun baru, g. Belahan eksplan menjadi planlet normal. b c A f e g c d a Tabel 4.2 Pertumbuhan tunas dan akar planlet kelapa kopyor dari eksplan belah embrio pada media Eeuwens yang mengandung berbagai konsentrasi BAP Konsentrasi BAP mgl Panjang tunas cm Jumlah daun Panjang akar cm 2.50 5.00 7.50 0.95 1.35 1.50 1.50 2.00 2.50 1.25 0.95 1.10 Pemecahan titik tumbuh pada meristem apikal embrio kelapa kopyor tidak selamanya menghasilkan belahan embrio yang mampu tumbuh menjadi planlet. Ada sekitar 20-40 belahan embrio tidak tumbuh. Kemungkinan bagian ini tidak mengandung meristem tunas atau akar. Proses regenerasi planlet kelapa kopyor dari pembelahan embrio sigotik tahap demi tahap adalah belahan embrio mulai membesar 5-7 hari setelah penanaman di media padat Gambar 4.1c dan muncul tunas dan akar setelah 3-4 minggu. Belahan eksplan embrio mulai tumbuh tunas tak berklorofil Gambar 4.1d sekitar 5-6 minggu setelah penanaman dan tunas mulai membentuk klorofil Gambar 4.1e setelah dipindah ke tempat yang terang dengan pencahayaan dari lampu TL. Planlet mulai membentuk daun baru setelah 2-3 bulan Gambar 4.1f dan menjadi planlet yang sempurna. Pertumbuhan tunas dan akar dari eksplan embrio yang dibelah menunjukkan tidak ada perbedaan pada pertumbuhan panjang tunas, panjang akar dan jumlah daun yang muncul antara konsentrasi BAP yang dicoba Tabel 4.2. Namun ada kecenderungan bahwa pertumbuhan tunas yang ditunjukkan oleh panjang tunas dan jumlah daun meningkat dengan meningkatnya konsentrasi BAP. Induksi Tunas dari Eksplan Kecambah yang Dibelah Hampir semua eksplan belah kecambah yang ditanam pada media BAP tumbuh, bahkan konsentrasi BAP 5.0-7.5 mgl tumbuh dengan persentase mencapai 100 Tabel 4.3. Hasil ini jauh lebih baik daripada eksplan belahan embrio. Di samping itu eksplan yang tumbuh sebagian besar adalah eksplan yang menjadi tunas dan akar Gambar 4.2c dan hampir tidak ada yang tumbuh menjadi akar Tabel 4.3. Berdasarkan persentase belahan eksplan yang tumbuh dan Gambar 4.2 Respon eksplan belahan kecambah kelapa kopyor yang ditanam pada media Eeuwens dengan penambahan BAP. a. Eksplan belahan kecambah yang tumbuh tunas, b. Eksplan yang tumbuh menjadi akar, c. Eksplan yang tumbuh menjadi tunas dan akar. Tabel 4.3 Persentase eksplan belahan kecambah kelapa kopyor yang tumbuh menjadi tunas dan akar planlet lengkap, tunas, atau akar saja pada media yang mengandung berbagai konsentrasi BAP Konsentrasi BAP mgl Tumbuh tunas akar Tumbuh tunas Tumbuh akar Total 2.50 5.00 7.50 87.50 87.50 50.00 0.00 12.50 33.33 0.00 0.00 16.67 87.50 100.00 100.00 Tabel 4.4 Pertumbuhan tunas dan akar planlet kelapa kopyor dari eksplan belahan kecambah pada media Eeuwens yang mengandung berbagai konsentrasi BAP Konsentrasi BAP mgl Panjang tunas cm Jumlah daun Panjang akar cm 2.50 5.00 7.50 0.63b 2.33a 1.73ab 3.00 2.33 2.00 1.37 1.33 1.30 Angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada kolom yang sama tidak berbeda nyata menurut uji Duncan Multiple Range Test DMRT 5 persentase eksplan yang tumbuh menjadi tunas akar planlet lengkap, maka perlakuan yang terbaik adalah konsentrasi BAP 5.0 mgl. Pada konsentrasi ini semua belahan eksplan tumbuh semua, dengan persentase eksplan tumbuh a b c tunas+akar sebesar 87.50. Jika sisa persentase eksplan yang tumbuh menjadi tunas 12.50 dapat diinduksi perakarannya, maka jumlah planlet pada perlakuan belah kecambah dengan BAP 5.0 mgl bisa meningkat 100 atau dua kali dari embrio yang ditanam awal. Pertumbuhan panjang tunas eksplan belahan kecambah pada media BAP 5.0 mgl nyata berbeda dengan BAP 2.5 mgl. Walaupun demikian konsentrasi BAP yang lebih tinggi dari 5.0 mgl tidak meningkatkan panjang tunas. Sementara itu pertumbuhan akar dan jumlah daun tidak berbeda antara BAP 2.5, 5.0 dan 7.5 mgl Tabel 4.4. Pembahasan Usaha untuk menginduksi tunas atau akar kelapa kopyor dari belahan eksplan embrio sigotik maupun dari eksplan kecambah embrio sigotik yang keluar plumula dan radikel telah berhasil dilakukan dengan pemberian ZPT BAP pada media yang mengandung 2,4-D. Dengan teknik pembelahan eksplan tersebut, jaringan meristematik dan titik tumbuh pada bagian-bagian belahan embrio sigotik yang didapat terbukti berpotensi untuk berkembang menjadi tunas dan plantlet sehingga dapat diregenerasikan menjadi bibit kelapa kopyor. Dengan satu kali pembelahan satu embrio sigotik menjadi dua belahan eksplan, perolehan planlet dan bibit kelapa kopyor ditingkatkan menjadi dua kali jika dibandingkan dengan tanpa pembelahan. Selain itu, berdasarkan hasil penelitian ini memberi potensi untuk melakukan pembelahan embrio sigotik yang lebih banyak sehingga akan lebih meningkatkan jumlah plantlet dan bibit kelapa kopyor yang didapatkan. Persentase belahan eksplan embrio sigotik yang tumbuh dan pembentukan planlet lengkap planlet dengan tunas akar meningkat pada media yang mengandung BAP. BAP banyak digunakan untuk induksi tunas dan untuk multiplikasi tunas pada berbagai tanaman. Tunas planlet kelapa kopyor dapat diinduksi dari eksplan embrio atau kecambah yang dibelah dengan pemberian BAP 2.5-7.5 mgl. Pada tanaman jambu mete pemberian BAP 1 mgl menghasilkan tunas lebih banyak yang diinduksi dari eksplan nodel dan perkembangan tunas yang lebih baik daripada zeatin 1 mgl Osterac et al. 2005. Pada tanaman manggis BAP dapat menginduksi tunas aksilar pada konsentrasi terbaik 5 mgl, sedangkan untuk multiplikasi tunas konsentrasi 3 mgl yang terbaik Roostika et al. 2005. Induksi tunas dan akar dari belahan eksplan embrio sigotik kelapa kopyor selain membutuhkan BAP juga 2,4-D dengan konsentrasi 2.5 mgl. Pada beberapa tanaman, induksi tunas dan proliferasi tunas dilakukan dengan pemberian kombinasi antara auksin dan sitokinin. Untuk proliferasi tunas Gloriosa superba digunakan BAP 1.5 mgl yang dikombinasikan dengan NAA 0.5 mgl Hassan Roy 2005. Pada tanaman bambu, tunas-tunas adventif diinduksi oleh pemberian BAP yang dikombinasikan dengan NAA Mehta 2000. Penggunaan eksplan belahan kecambah lebih baik dari pada eksplan belahan embrio dalam menginduksi tunas kelapa kopyor. Pada tahap embrio titik tumbuh yang ada dalam meristem apikal sulit untuk dibelah dengan tepat. Belahan embrio yang tidak tumbuh kemungkinan tidak mengandung titik tumbuh tunas atau akar. Eksplan kecambah lebih mudah untuk diamati bagian titik tumbuh tunas dan akar, sehingga dapat dibelah dengan tepat. Kesimpulan Titik-titik tumbuh di daerah meristem apikal pada eksplan embrio dan kecambah kelapa kopyor yang dibelah dapat diinduksi menjadi individu tanaman baru. Eksplan embrio yang dibelah lebih banyak tumbuh menjadi tunas atau akar, sedangkan eksplan kecambah yang dibelah hampir semua eksplan tumbuh menjadi planlet utuh. Penambahan BAP meningkatkan jumlah planlet yang diperoleh, dengan persentase eksplan tumbuh di atas 58. Pada eksplan embrio, persentase eksplan tumbuh semakin menurun dengan meningkatnya konsentrasi BAP, sebaliknya pada eksplan kecambah persentase eksplan tumbuh semakin meningkat 100 dengan meningkatnya konsentrasi BAP. BAP berpengaruh pada pertumbuhan tunas, namun tidak berpengaruh pada pertumbuhan akar. Berdasarkan persentase eksplan tumbuh dan persentase jumlah planlet lengkap, maka perlakuan yang terbaik adalah BAP 5 mgl pada eksplan kecambah yang dibelah. 1 Bagian bab ini telah didaftarkan untuk memperoleh hak paten pada Direktorat Jenderal Hak Kekayaan Intelektual, Departemen Hukum dan Hak Asasi Manusia R.I. dengan judul invensi: Metode Pembiakan Klonal Kelapa Kopyor Melalui Embriogenesis Somatik dan No. Registrasi: P00 200800263 15 Mei 2008

BAB V REGENERASI TANAMAN KELAPA KOPYOR MELALUI