In vitro propagation and molecular analysis of kopyor coconut

PEMBIAKAN IN VITRO DAN ANALISIS

MOLEKULER KELAPA KOPYOR

SUKENDAH

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2009

ABSTRACT

SUKENDAH. In Vitro Propagation and Molecular Analysis of Kopyor Coconut. Supervised by SUDARSONO, WITJAKSONO, and NURUL KHUMAIDA

Kopyor coconut is a mutant that cannot be propagated by conventional technique. Morphologically kopyor coconut cannot be differentiated from normal coconut. The aims of these studies were to improve efficiency of coconut zygotic embryo culture and to develop a protocol for clonal propagation through somatic embryogenesis. Moreover, the study was to design a molecular marker to differentiate kopyor coconut from normal one. A series of experiments such as: additions of organic addenda, subculture period, increasing of plantlet rooting by IBA on the zygotic embryo culture technique and embryo splitting technique were carried out to increase the production of plantlets and seedling of kopyor coconut. To develop a protocol of somatic embryogenesis, some experiments were conducted such as: factors that affected callus induction (2,4-D concentration, mode of excision embryo, explant age, and organic addenda), effect of gelled gum concentration, BAP and 2,4-D on the formation of somatic embryos, and effect of ABA on the development of somatic embryos. Designing molecular marker was done to analyze genes related to kopyor trait such as -D galactosidase, sucrose synthase (SUS), abscicic acid insensitive (ABI), and stearoyl acyl carrier protein desaturase (SACPD). Some of those markers were used to analyze the genetic diversity of kopyor fruited and normal coconut. For plantlet production, efficiency of coconut zygotic embryo culture increased to 80% by addition liquid coconut endosperm 150 ml/l in the germination phase, excising the embryo explants into two pieces, subculturing of plantlet every 2-3 months, addition of IBA 1-2 mg/l to induce root of plantlet. For clonal propagation, a protocol of coconut somatic embryogenesis has been established and consisted of callus initiation, callus proliferation, somatic embryo and plantlet formation. Growth regulator 2,4-D at concentration of 50-125 uM induced coconut embryogenic callus. Amino acid was the best organic addendum to increase callus formation, while BAP 10 mg/l+2,4-D 2-5 mg/l was the best concentration on the somatic embryo and plantlet formation. A specific molecular marker for -D galactosidase was designed to analyze kopyor, kopyor fruited and normal coconut. Based on some specific markers of CnSUS1A, CnSUS1B, CnABI3, CnSACPD, and EgFAD3, kopyor fruited coconut from East Java could be separated from Central Java. Some progenies of hybrid kopyor fruited coconuts in the Central Java are suggested to be originated from tall and dwarf kopyor fruited coconut of the Central Java.

Key words: zygotic embryo culture, somatic embryo, -D galactosidase, molecular marker.

RINGKASAN

SUKENDAH. Pembiakan In Vitro dan Analisis Molekuler Kelapa Kopyor. Dibimbing oleh SUDARSONO, WITJAKSONO, dan NURUL KHUMAIDA.

Kelapa kopyor bernilai komersial tinggi, tersedia terbatas dengan harga mahal. Endosperma mempunyai nilai gizi yang lebih sehat dari pada endosperma kelapa normal. Keterbatasan dalam penyediaan disebabkan oleh alasan genetik (mutan) yang terjadi pada bagian endosperma, sehingga endosperma tidak fungsional dan embrio tidak dapat berkecambah secara alami.

Satu-satunya cara memperbanyak kelapa kopyor adalah dengan teknik in vitro melalui metode kultur embrio yang telah dikembangkan selama 35 tahun. Walaupun demikian, teknik-teknik yang ada belum mampu menghasilkan bibit secara efisien. Oleh sebab itu perlu modifikasi teknik kultur in vitro untuk meningkatkan efisiensinya. Ada dua pendekatan yang dilakukan, yaitu; (1) memperbaiki kultur embrio sigotik pada tahap perkecambahan, pertumbuhan planlet, dan tahap sebelum aklimatisasi, serta mengembangkan teknik pembelahan eksplan embrio, (2) mengembangkan teknik pembiakan klonal dengan embriogenesis somatik melalui tahap kalus.

Perbaikan kultur embrio sigotik dilakukan dengan menambahkan berbagai macam bahan aditif (air kelapa 150 ml/l, air santan 150 ml/l, thio-urea 50 mg/l, dan thio-urea 100 mg/l) di media Eeuwens pada fase perkecambahan. Pada fase pertumbuhan planlet, menambahkan air kelapa konsentrasi 100, 150, 200 ml/l dan mengatur periode subkultur, yaitu 1, 2, 3, dan 4 bulan. Pada fase sebelum aklimatisasi, memberi perlakuan IBA 1, 2, 3 mg/l ke dalam media kultur untuk meningkatkan perakaran planlet. Teknik pembelahan eksplan embrio dilakukan dengan cara membelah embrio sigotik dan kecambah pada titik tumbuh di daerah meristem apikal menjadi dua belahan. Ke dalam media kultur ditambahkan BAP konsentrasi 2.5-7.5 mg/l untuk menginduksi proliferasi tunas samping.

Pengembangan teknik embriogenesis somatik dilakukan dengan melalui beberapa tahap, yaitu: inisiasi kalus, proliferasi kalus, pembentukan dan pematangan embrio somatik, dan perkembangan/pembentukan planlet. Kalus embriogenik diinduksi dengan 2,4-D pada konsentrasi 50, 75, 100 dan 125 uM dan model pembelahan embrio secara longitudinal & horizontal. Untuk meningkatkan pembentukan kalus ke dalam media ditambahkan bahan aditif seperti asam amino, casein hydrolisate, dan air kelapa. Pada tahap pembentukan embrio somatik, ZPT BAP 10 mg/l yang dikombinasikan dengan 2,4-D 2.5 dan 5.0 mg/l digunakan menginduksi pembentukan embrio somatik, sedangkan untuk perkembangan embrio somatik digunakan perlakuan konsentrasi phytagel dan ZPT ABA 25 dan 50 uM. Analisis morfologi dan histologi juga dilakukan untuk mengamati perkembangan kalus, embrio somatik dan kecambah asal embrio somatik.

Berdasarkan pangamatan yang telah dilakukan diperoleh hasil, yaitu: persentase perkecambahan embrio ditingkatkan mencapai 95% pada perlakuan air kelapa 150 ml/l. Pada fase planlet, penambahan air kelapa meningkatkan jumlah planlet yang lengkap, yaitu planlet dengan perkembangan tunas dan akar primer dan lateral. Lama periode yang paling tepat untuk melakukan subkultur adalah setiap 2-3 bulan sekali. Pemberian IBA 1 mg/l mampu menghasilkan planlet

dengan akar primer sebesar 85.7%, sedangkan untuk menginduksi keluarnya akar lateral diperlukan IBA 2 mg/l. Pada penelitian ini, untuk pertama kalinya telah berhasil menginduksi tunas dan akar dari eksplan embrio sigotik yang dibelah. Pengamatan yang telah dilakukan menunjukkan 58% belahan embrio dapat tumbuh menjadi planlet, tunas, atau akar saja. Perlakuan BAP 5.0-7.5 mg/l pada eksplan belah kecambah meningkatkan perolehan planlet sampai 100%. Konsentrasi BAP yang paling baik untuk menghasilkan planlet lebih banyak adalah 5 mg/l. ZPT BAP juga berpengaruh pada pertumbuhan tunas planlet meskipun tidak berpengaruh pada pertumbuhan akar.

Protokol teknik embriogenesis somatik telah berhasil dikembangkan untuk pertama kalinya pada kelapa kopyor dalam penelitian ini. Pembentukan kalus embriogenik kelapa kopyor memerlukan zat pengatur tumbuh 2,4- D dengan konsentrasi antara 50-125 uM. Bahan aditif asam amino dapat meningkatkan produksi kalus embriogenik. Struktur embrio somatik mulai terbentuk ketika kultur dipindah dari media yang mengandung 2,4-D tinggi ke media dengan 2.4-D lebih rendah dan dikombinasikan dengan BAP. BAP 10 mg/l+2,4-D 5 mg/l menghasilkan embrio somatik lebih banyak daripada BAP 10 mg/l+2,4-D 2.5 mg/l. Sebaliknya, BAP 10 mg/l+2,4-D 2.5 mg/l lebih baik dalam meningkatkan jumlah planlet. Penambahan ABA dan phytagel tidak banyak berpengaruh pada perkembangan embrio somatik. Analisis morfologi memperlihatkan bahwa embrio somatik kelapa kopyor mirip dengan embrio sigotiknya. Planlet asal embrio sigotik mempunyai batang ramping tegar dengan daun lurus. Planlet asal embrio sigotik mempunyai satu akar primer dan akar-akar lateral yang keluar dari akar primer. Sementara itu, planlet asal embrio somatik mempunyai daun sedikit tidak beraturan dan akar primer lebih dari satu dan tidak bisa dibedakan antara akar primer dan akar lateral. Perkembangan embrio somatik juga menghasilkan bentuk-bentuk yang abnormal seperti bentuk akar tanpa tunas, kecambah dengan banyak tunas, atau kecambah dengan tunas dan akar berasal dari embrio yang berbeda.

Morfologi bibit kelapa kopyor yang dihasilkan dari kultur in vitro, dan bibit kelapa berbuah kopyor yang dihasilkan oleh petani, serta bibit kelapa normal tidak bisa dibedakan. Untuk membedakan ketiga jenis bibit ini sedini mungkin hanya bisa dilakukan dengan penanda (marker) molekuler. Fenomena kopyor pada tanaman kelapa ada kaitannya dengan gen -D Galaktosidase yang ditemukan tidak aktif pada endosperma kelapa kopyor. Untuk itu dalam penelitian ini dikembangkan penanda molekuler gen -D Galaktosidase yang dirancang dari runutan nukleotida DNA kelapa berbuah kopyor.

Hasil analisis runutan nukleotida DNA kelapa berbuah kopyor menunjukkan runutan nukleotida DNA -D Galaktosidase kelapa tersebut berbeda dengan runutan nukleotida DNA -D Galaktosidase normal dari berbagai spesies tanaman. Diduga kuat bahwa DNA -D Galaktosidase kelapa berbuah kopyor telah mengalami mutasi. Dengan demikian runutan nukleotida DNA -D Galaktosidase kelapa berbuah kopyor dapat dijadikan penanda molekuler untuk membedakan tanaman kelapa yang berpotensi menghasilkan buah kelapa kopyor dengan kelapa yang hanya berpotensi menghasilkan buah normal. Dalam penelitian ini, maka untuk pertama kalinya dihasilkan 4 (empat) pasangan primer spesifik, GAL22 (GAL22-F2 & GAL22-R2); GAL23 (Gal22-F2 & Gal33-R3); GAL33 (GAL33-F3 & GAL33-R3), dan GAL13 (GAL11-F1 & GAL33-R3) yang

dapat digunakan untuk membedakan tanaman kelapa yang berpotensi menghasilkan buah kelapa kopyor dengan kelapa yang hanya berpotensi menghasilkan buah normal.

Komposisi senyawa endosperma buah kelapa kopyor ditemukan berbeda dengan endosperma buah kelapa normal. Endosperma kelapa kopyor mengandung sukrosa dan karbohidrat lebih tinggi daripada kelapa normal. Sebaliknya, kandungan lemak lebih rendah. Asam lemak pada endosperma kelapa kopyor lebih banyak terdiri dari asam oleat (C18:1) dan asam linoleat (C18:2). Berdasarkan perbedaan tersebut dirancang sejumlah primer spesifik untuk gen Sucrose synthase (SUS), Stearoyl acyl carrier protein desaturase (SACPD), dan Absicid acid insensitive (ABI). Enam (6) pasang primer telah berhasil dirancang, yaitu 4 pasang primer spesifik untuk gen SUS (CnSUS1A, CnSUS1B, CnSUS2A, CnSUS2B), sepasang primer gen SACPD (CnSACPD), dan dua pasang gen ABI (CnABI3A dan CnABI3B).

Enam primer spesifik tersebut di atas ditambah dengan primer spesifik gen FAD (EgFAD), gen LTP (EgLTP), gen FATB (EgFATB), dan gen ARF1 (EgARF1) digunakan untuk menganalisis keragaman genetik menggunakan metode SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) pada populasi kelapa berbuah kopyor di P. Jawa. Hasil analisis menunjukkan bahwa populasi kelapa berbuah kopyor asal Jawa Timur membentuk subgroup tersendiri yang terpisah dari subgroup populasi asal Jawa Tengah. Meskipun demikian belum bisa dibedakan antara populasi kelapa berbuah kopyor dengan populasi kelapa normal. Kelapa berbuah kopyor jenis dalam, genjah dan hibrida juga belum bisa dipisahkan secara tegas dengan primer-primer tersebut.

Kata kunci: kultur embrio, embriogenesis somatik, penanda molekuler, keragaman genetik

PEMBIAKAN IN VITRO DAN ANALISIS

MOLEKULER KELAPA KOPYOR

SUKENDAH

Disertasi

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Doktor pada

Program Studi Agronomi

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2009

Judul Disertasi : Pembiakan In Vitro dan Analisis Molekuler Kelapa Kopyor

Nama : Sukendah

NIM : A. 361050161

Disetujui Komisi Pembimbing

Prof. Dr. Ir. Sudarsono, M.Sc. Ketua

Dr. Ir. Witjaksono, M.Sc. Dr. Ir. Nurul Khumaida, M.S. Anggota Anggota

Diketahui

Ketua Program Studi Dekan Sekolah Pascasarjana Agronomi

Dr. Ir. Munif Ghulamahdi, M.S. Prof. Dr. Ir. Khairil A. Notodiputro, M.S.

Penguji pada Ujian Tertutup: Dr. Ir. Agus Purwito, M.S. Dr. Ir. Darda Effendi, M.Si.

Penguji pada Ujian Terbuka: Prof. Dr. Ir. Sudirman Yahya, M.Sc. Dr. Ir. Bambang Heliyanto, M.Sc.

PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI

DAN SUMBER INFORMASI

Saya menyatakan dengan sebenar-benarnya bahwa segala pernyataan dalam disertasi yang berjudul: Pembiakan In Vitro dan Analisis Molekuler Kelapa Kopyor adalah karya sendiri dan belum pernah penulis ajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal dan dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan oleh penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini.

Bogor, 18 Agustus 2009

Sukendah A.361050161

© Hak cipta milik IPB, tahun 2009

Hak cipta dilindungi

1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumber

a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tujuan suatu masalah

b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB

2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB

KATA PENGANTAR

Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT yang dengan segala rahmatNya penulis dapat menyelesaikan penelitian dengan judul: PEMBIAKAN IN VITRO DAN ANALISIS MOLEKULER KELAPA KOPYOR. Penelitian ini memuat beberapa topik seperti: (1) Perbaikan Teknik Kultur Embrio Sigotik Kelapa Kopyor, (2) Regenerasi Kelapa Kopyor dengan Metode Pembelahan Eksplan Embrio Sigotik, (3) Regenerasi Kelapa Kopyor Melalui Embriogenesis Somatik, (4) Pengembangan Penanda Molekuler Gen -D Galaktosidase, (5) Isolasi dan Analisis Fragmen DNA Gen-Gen yang Diduga Berhubungan dengan Sifat Kopyor, (6) Keragaman Genetik Kelapa Berbuah Kopyor di P. Jawa. Sebagian penelitian ini dibiayai oleh UPN ”Veteran” Jatim dan Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi Departemen Pendidikan Nasional melalui proyek Hibah Bersaing, Program Sandwich, dan Program Hibah Doktor.

Sebagian disertasi telah dipublikasikan ke jurnal Bulletin Agronomi (36)(1):16-23 (2008) dengan judul: Perbaikan Teknik Kultur Embrio Kelapa Kopyor (Cocos nucifera L.) Asal Sumenep Jawa Timur Melalui Penambahan Bahan Aditif dan Pengujian Periode Subkultur. Sebagian disertasi juga telah didaftarkan untuk memperoleh hak paten pada Direktorat Jenderal Hak Kekayaan Intelektual, Departemen Hukum dan Hak Asasi Manusia R.I. dengan judul invensi (1): Metode Pembiakan Klonal Kelapa Kopyor Melalui Embriogenesis Somatik dengan No. Registrasi: P00200800263 (15 Mei 2008), dan (2): Deteksi Dini Kelapa Kopyor Menggunakan Penanda Molekuler Spesifik Gen -D Galaktosidase dengan No. Registrasi: P00200900431 (12 Agustus 2009).

Pada kesempatan ini penulis menyampaikan rasa terima kasih dan penghargaan pada berbagai pihak yang telah membantu dengan caranya masing-masing dalam studi, penelitian maupun penyempurnaan tulisan disertasi:

(1) Kepada keluarga: suami dan anak-anak yang saya cintai, rasa hormat dan terima kasih yang tidak pernah habis kepada keluarga besar W. Sanoesi (mas Mustadi dan mbak Erna, mas Ayup Soepeno (almarhum) dan mbak Emmy, adik Pri dan Wahyu, mas Yanto sekeluarga) dan keluarga besar Stephan (mas Wayan dan mbak Poppy, mas George Eddy sekeluarga, mas Theodore sekeluarga, dik Iswanyudi dan Lely, dik Didik dan Tetty).

(2) Kepada komisi pembimbing, Prof. Dr. Ir. Sudarsono, MSc. yang telah banyak memberikan pengetahuan dalam bidang molekuler, ketajaman dalam menganalisis, mengelola penelitian dengan baik, dan saran-saran dalam tulisan disertasi. Dr. Ir. Witjaksono, MSc. yang ahli di bidang kultur jaringan telah banyak memberikan arahan dan ketajaman dalam detail-detail penelitian in vitro, serta saran-saran dalam tulisan disertasi. Dr. Ir. Nurul Khumaida, MS. yang selalu memotivasi dan memberi masukan pada tulisan disertasi. (3) Kepada Rektor, Ketua LPPM, dan Dekan Fak. Pertanian UPN ”Veteran”

Jatim yang selalu membantu dalam kelancaran studi dan penelitian sampai terbentuknya kerja sama antara UPN ”Veteran” Jatim dengan IPB dalam bentuk MOU untuk pengelolaan penelitian kelapa kopyor.

(4) Kepada Dekan Sekolah Pascasarjana IPB beserta staf yang telah membantu memperoleh kesempatan dalam program Sandwich di Thailand dan program Hibah Doktor untuk menyelesaikan studi S3.

(5) Kepada Dr.Hugo Volkaert yang telah membimbing dalam teknik molekuler, dan selalu mencurahkan waktunya dalam mengarahkan dan memberi saran selama penelitian di Lab. CAB Kasetsart University, Thailand. Dr. Pongthep Aktratanakul Direktur CAB, Kasetsart University, Thailand yang telah memberikan kesempatan untuk penelitian dan menggunakan segala fasilitas laboratorium di CAB. Teman-teman di CAB: Poom Preedakoon, Songkran Thongthawee, Meow, Uug, dan Eik yang selalu siap membantu dalam penelitian dan yang telah memperkenalkan kebudayaan dan kehidupan orang Thailand.

(6) Kepada Direktur Kantor HKI-IPB dan staf: bu Ade, pak Romli, mas Andre dan mas Hendri yang telah membantu dalam proses dan pendaftaran paten kelapa kopyor ke Direktorat Jenderal Hak Kekayaan Intelektual, Departemen Hukum dan Hak Asasi Manusia R.I.

(7) Kepada sahabat dan teman Lab. Biologi Molekuler: Nenny, Bu Renny, Bu Surti, Bu Loly, Pak Syamsudin, Pak Darmawan, Pak Zhulhermana, Susilowati, mbak Narti, dan mas Agus. Terima kasih atas kebersamaan, kerja sama dan semangat yang diberikan selama penelitian.

(8) Kepada sahabat-sahabat kost: Lisnawita kebersamaan kita selama masa-masa sulit selalu memberiku semangat untuk menyelesaikan studi ini, Niken, Ria, Nenni, Annisa, Bu Hesti yang selalu memberi motivasi meskipun sudah berada di institusi masing-masing.

(9) Kepada sahabat-sahabat kuliah: Sigit, Awang, Nanas, Rai, Edi, Joko, bersama kalian kuliah di IPB terasa sangat menyenangkan seberat apapun tugas dan materi yang diberikan oleh dosen.

(10)Kepada sahabat-sahabat kantor: Jonny, Ziah, Ida, Hadi, Guntoro, Bu Widi, Bu Pongky, Bu Guniarti dan Pak Agus yang selalu menyampaikan berita-berita penting dari UPN dan membantu dalam penyiapan bahan tanam dari Jawa Timur.

(11)Kepada Bapak Ir. Hartoyo yang membantu menelusuri kelapa kopyor di Jember dan dalam pengambilan sampel, serta perhatian yang besar atas pengembangan bibit kelapa kopyor di Jawa Timur.

(12)Akhirnya kepada sahabat, teman dan pihak-pihak yang tidak bisa penulis sebutkan satu per satu, terima kasih atas bantuan yang diberikan selama penulis studi S3 dan penulis berharap semoga tulisan ini bermanfaat bagi pihak yang berkepentingan.

Bogor, 18 Agustus 2009

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Surabaya pada 31 Oktober 1963. Penulis putri keempat dari pasangan Bapak W. SANOESI dan Ibu NASIKAH. Penulis mempunyai satu saudara laki-laki (Nadiyanto) dan tiga saudara perempuan (Emmy, Herna, dan Wahyuningsih). Penulis menikah dengan Willy Richard Stephan pada tahun 1991 sampai sekarang dan dikaruniai satu anak laki-laki, Atthur K. Willyanda dan satu anak perempuan, Arrum Y. Willyanda.

Penulis menyelesaikan 6 tahun sekolah dasar di SDN Margorejo II di Surabaya dan melanjutkan ke sekolah menengah pertama di SMPN VI pada kota yang sama. Pada tahun 1983 lulus dari sekolah menengah atas di SMAN V Surabaya dan melalui Proyek Perintis II diterima di Institut Pertanian Bogor dan lulus pada tahun 1987. Setelah lulus sarjana, penulis bergabung dengan Universitas Pembangunan Nasional ”Veteran” Jawa Timur pada tahun 1988. Pada tahun 1999 penulis menerima beasiswa dari IPGRI (International Plant Genetic Resources Institute) di bawah pengelolaan SEARCA untuk studi program master di bidang Plant Genetic Resources and Management di Departemen Hortikultura UPLB (University of the Philippines Los Banos) Filipina. Penulis mengambil topik: Coconut In Vitro Conservation sebagai master thesis dibawah bimbingan Dr. Maria Lourdes O. Cedo. Sambil menyelesaikan studi masternya, penulis diberi kesempatan menjadi presiden pertama PSSN (the Philippine Society for the Study of Nature) Inc. Los Baños Chapter periode 2000-2001 dan menjadi anggota sampai sekarang. Organisasi ini banyak memberikan pelajaran, inspirasi dan tantangan dalam membangun hubungan sosial antar warganegara dari berbagai bangsa dan dari berbagai disiplin ilmu. Tahun 2001 penulis diundang untuk bergabung dengan the Gamma Sigma Delta Honor Society of Agriculture (GSD-HAS) Philippine.

Setelah kembali ke institusi penulis mengembangkan Laboratorium Bioteknologi di Jurusan Agronomi dan menjadi Kepala Laboratorium Bioteknologi periode tahun 2002-2006 serta mulai mengembangkan bibit kelapa kopyor di Jawa Timur. Pada tahun 2005 penulis menerima Dana Pendidikan dari UPN “Veteran” Jatim untuk melanjutkan studi S3 di Pasca Sarjana IPB dengan mengambil bidang bioteknologi di Departemen Agronomi dan Hortikultura Fak. Pertanian. Penulis diberi kesempatan penelitian di CAB (Center for Agricultural Biotechnology) Kasetsart University, Thailand pada September 2008-Januari 2009 oleh Pascasarjana IPB melalui program Sandwich yang diselenggarakan oleh Dikti.

xii

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR TABEL………. xv

DAFTAR GAMBAR....……… DAFTAR LAMPIRAN………. xviii xxii I. PENDAHULUAN Latar Belakang……….. 1

Tujuan Penelitian……… 5

Manfaat Penelitian………. 5

II TINJAUAN PUSTAKA Kelapa Kopyor……… 7

Kultur Embrio Sigotik Kelapa……… 9

Kultur Embrio Somatik... 12

Perkembangan Kultur Embrio Somatik pada Tanaman Kelapa... 14

Penanda Molekular... 20

Penggunaan Penanda Molekuler pada Tanaman Kelapa………… 21

Gen-gen Penting pada Endosperma dan Perkecambahan Kelapa.. 22

III. PERBAIKAN TEKNIK KULTUR EMBRIO SIGOTIK KELAPA KOPYOR Abstrak... 24

Abstract... 25

Pendahuluan... 26

Tujuan Penelitian... 28

Metode penelitian... 28

Hasil Penelitian ... 32

Pembahasan... 41

Kesimpulan... 43

IV. REGENERASI KELAPA KOPYOR DENGAN METODE PEMBELAHAN EKSPLAN EMBRIO SIGOTIK PADA DAERAH MERISTEM APIKAL Abstrak... 45

Abstract... 46

Pendahuluan... 47

Tujuan Penelitian... 48

Metode penelitian... 48

Hasil Penelitian ... 50

Pembahasan... 55

xiii

V. REGENERASI TANAMAN KELAPA KOPYOR MELALUI

EMBRIOGENESIS SOMATIK

Abstrak... 57

Abstract... 58

Pendahuluan... 59

Tujuan Penelitian... 60

Metode penelitian... 60

Hasil Penelitian ... 64

Pembahasan... 78

Kesimpulan... 80

VI. PENGEMBANGAN PENANDA MOLEKULER SPESIFIK UNTUK GEN -D GALAKTOSIDASE KELAPA KOPYOR Abstrak... 81

Abstract... 82

Pendahuluan... 83

Tujuan Penelitian... 84

Metode penelitian... 85

Hasil Penelitian ... 88

Pembahasan... 99

Kesimpulan... 102

VII. ISOLASI DAN ANALISIS FRAGMEN DNA TERHADAP GEN- GEN YANG DIDUGA BERHUBUNGAN DENGAN SIFAT KOPYOR PADA TANAMAN KELAPA Abstrak... 104

Abstract... 105

Pendahuluan... 106

Tujuan Penelitian... 108

Metode penelitian... 108

Hasil Penelitian ... 111

Pembahasan... 121

Kesimpulan... 124

VIII. KERAGAMAN GENETIK POPULASI KELAPA BERBUAH KOPYOR DI PULAU JAWA BERDASARKAN PCR-SINGLE STRAND CONFORMATION POLYMORPHISM (SSCP) Abstrak... 125

Abstract... 126

Pendahuluan... 127

Tujuan Penelitian... 129

Metode penelitian... 129

Hasil Penelitian ... 133

Pembahasan... 142

Kesimpulan... 144

xiv KESIMPULAN DAN SARAN

Kesimpulan... Saran...

153 154

DAFTAR PUSTAKA……… 155

xv

DAFTAR TABEL

Halaman 2.1 Kandungan komposisi senyawa kimia air kelapa dan

endosperma kelapa kopyor dengan kelapa normal yang

dihitung berdasarkan persentase bahan kering………... 9 2.2 Protokol komposisi media kultur embrio kelapa yang

dikembangkan oleh berbagai negara... 11 2.3 Mikropropagasi secara klonal pada tanaman kelapa melalui

proses embriogenesis somatik………... 15

3.1 Persentase daya kecambah dan waktu yang dibutuhkan embrio

kelapa kopyor untuk berkecambah... 34 3.2 Persentase embrio kelapa kopyor yang mengalami browning,

stagnasi, dan embrio tidak viabel pada fase perkecambahan di

berbagai media tanpa bahan aditif dan dengan bahan aditif …. 34 3.3 Pertumbuhan planlet kelapa kopyor setelah umur 5 bulan pada

berbagai periode subkultur dan pada media Eeuwens yang

mengandung berbagai konsentrasi air kelapa... 35 3.4 Persentase planlet kelapa kopyor yang diperoleh pada

berbagai periode subkultur dan pada media Eeuwens yang mengandung berbagai konsentrasi air kelapa setelah 8 bulan

dalam proses pengkulturan... 36 3.5 Persentase planlet kelapa kopyor yang berhasil diinduksi

akarnya pada media padat Eeuwens dengan penambahan ZPT

IBA... 38 3.6 Pertumbuhan tunas dan akar planlet kelapa kopyor asal kultur

embrio sigotik pada media Eeuwens dengan penambahan

berbagai konsentrasi IBA setelah 2 dan 4 bulan perlakuan... 38 4.1 Persentase eksplan belahan embrio yang tumbuh menjadi

tunas dan akar (planlet lengkap) atau tunas atau akar saja pada

berbagai konsentrasi BAP... 51 4.2 Pertumbuhan tunas dan akar planlet kelapa kopyor dari

eksplan belah embrio pada media Eeuwens yang mengandung

xvi

4.3 Persentase eksplan belahan kecambah kelapa kopyor yang tumbuh menjadi tunas dan akar (planlet lengkap), tunas, atau akar saja pada media yang mengandung berbagai konsentrasi

BAP... 54 4.4 Pertumbuhan tunas dan akar planlet kelapa kopyor dari

eksplan belahan kecambah pada media Eeuwens yang

mengandung berbagai konsentrasi BAP... 54 5.1 Pengaruh model pembelahan longitudinal pada induksi dan

pertumbuhan kalus kelapa kopyor di media Eeuwens dengan

penambahan berbagai konsentrasi 2,4-D... 67 5.2 Pengaruh model pembelahan embrio secara horizontal pada

pembentukan kalus dan embrio somatik kelapa kopyor di

media Eeuwens padat dengan berbagai konsentrasi 2,4-D…… 69 5.3 Persentase pembentukan kalus, diameter dan berat kalus

kelapa kopyor pada eksplan embrio muda (10 bulan) dan tua

(12 bulan) dengan penambahan berbagai konsentrasi 2,4-D…. 70 5.4 Pengaruh penambahan bahan aditif pada induksi dan

pertumbuhan kalus kelapa kopyor di media Eeuwens padat... 71 5.5 Persentase embrio somatik kelapa kopyor yang berkembang

menjadi planlet, tunas, atau akar pada media yang

mengandung 2,4-D dan BAP………. 72

5.6 Persentase embrio somatik kelapa kopyor yang berkembang menjadi planlet, tunas, atau akar pada media dengan berbagai

konsentrasi phytagel………. 73

5.7 Persentase embrio somatik kelapa kopyor yang berkembang menjadi planlet, tunas, atau akar pada media dengan berbagai

konsentrasi ABA ... 74 6.1 Hasil rancangan pasangan primer degenerate yang

dikembangkan berdasarkan runutan DNA gen -D

Galaktosidase normal yang ada di DNA data base ... 89 6.2 Hasil amplifikasi PCR dengan cetakan DNA kelapa berbuah

kopyor dan primer degenerate yang dirancang berdasarkan

gen -D Galaktosidase normal yang ada di DNA data base... 91 7.1 Pasangan primer dan suhu penempelan yang digunakan untuk

amplifikasi PCR gen SUS, SACPD, dan ABI dengan cetakan DNA kelapa berbuah kopyor jenis dalam dan perkiraan

xvii

7.2 Hasil analisis runutan nukleotida fragmen DNA gen SUS, SACPD, dan ABI3 pada tanaman kelapa berbuah kopyor hasil amplifikasi pasangan primer SUS1, SUS2, SACPD, dan

ABI3... 114 8.1 Deskripsi sampel tanaman yang digunakan untuk analisis

keragaman genetik populasi pohon kelapa berbuah kopyor di

Jawa Tengah dan Jawa Timur……… 130

8.2 Pasangan primer spesifik dan suhu penempelan yang digunakan untuk amplifikasi PCR berbagai gen yang berhubungan dengan sifat kopyor pada genom populasi kelapa berbuah kopyor di Jawa Tengah dan Jawa Timur serta panjang

fragmen yang dihasilkan……… 133

8.3 Pola pita SSCP alel polimorfik dan keragaman gen antara populasi kelapa berbuah kopyor dengan kelapa berbuah normal untuk masing-masing lokus gen SUS, SACPD, ABI3,

dan FAD……….. 137

8.4 Kemungkinan asal tetua kelapa berbuah kopyor hibrida di

xviii

DAFTAR GAMBAR

Halaman 1.1 Bagan alur kerangka penelitian teknik pembiakan in vitro

dan analisis molekuler pada tanaman kelapa kopyor... 6 2.1 Fenotipe endosperma buah kelapa normal dan kelapa

kopyor... 7 3.1 Endosperma kelapa kopyor yang berisi embrio setelah diambil

dari buah kelapa kopyor (a) dan embrio kelapa kopyor yang telah dikeluarkan dari endosperma dan dimasukkan dalam

erlenmeyer untuk proses sterilisasi (b)……….. 29

3.2 Berbagai respon embrio kelapa kopyor pada media

perkecambahan………... 33

3.3 Persentase planlet kelapa kopyor yang mengalami browning pada fase pertumbuhan di berbagai media tanpa air kelapa dan dengan air kelapa konsentrasi 100 ml/l, 150 ml/l, dan 200

ml/l………. 37

3.4 Proses pertumbuhan planlet kelapa kopyor asal kultur embrio

sebelum dan sesudah aklimatisasi... 40 4.1 Proses regenerasi kelapa kopyor dari embrio sigotik yang

dibelah sampai menjadi planlet sempurna pada media yang

mengandung BAP………. 52

4.2 Respon eksplan belahan kecambah kelapa kopyor yang

ditanam pada media Eeuwens dengan penambahan BAP……. 54

5.1 Berbagai struktur kalus dan embrio somatik kelapa kopyor...

65 5.2 Produktivitas per 100 embrio yang dibelah secara longitudinal

menjadi 2, 4, dan 8 dalam pembentukan kalus embriogenik

kelapa kopyor... 67 5.3 Morfologi eksplan embrio sigotik yang diiduksi menjadi kalus

dan planlet kelapa kopyor pada setiap tahap embriogenesis

somatik... 75 5.4 Morfologi kalus non-embriogenik (a) dan bentuk abnormalitas

xix

5.5 Struktur kecambah embrio sigotik dan somatik kelapa

kopyor... 77 6.1 Diagram struktur parsial gen -D Galaktosidase normal dari

tanaman Vitis vinifera (No.AM423271) dan posisi primer

degenerate yang dirancang... 89 6.2 Representasi hasil amplifikasi PCR dengan menggunakan

DNA genom tiga jenis kelapa berbuah kopyor dengan pasangan primer degenerate GAL22 -F2 dan GAL22-R2 atau

pasangan primer GAL11-F1 dan GAL33-R3... 91 6.3 Identifikasi plasmid rekombinan yang membawa potongan

DNA hasil PCR dengan cetakan DNA kelapa berbuah kopyor dan pasangan primer degenerate GAL22-F2 dan GAL22-R2 (a), GAL11-F1 dan GAL33-R3 (b), dan GAL22-F2 dan

GAL33-R3 (c)... 93 6.4 Potongan DNA 6 plasmid rekombinan kelapa berbuah kopyor

di dalam diagram struktur parsial gen -D Galaktosidase dari tanaman Vitis vinifera (No.AM423271) dan posisi primer

degenerate yang dirancang... 95 6.5 Analisis 6 runutan nukleotida dari potongan gen -D

Galaktosidase kelapa berbuah kopyor di program GeneDoc versi 2.6.002. Pensejajaran dimulai dari sekuen potongan gen -D Galaktosidase yang diamplifikasi primer forward2 GAL

22 dan reverse3 GAL33... 96 6.6 Pensejajaran runutan -D Galaktosidase pada ekson 10 dan

ekson 12 antar plasmid rekombinan kelapa berbuah kopyor untuk analisis primer spesifik (forward dan reverse)

berdasarkan ClustalW dan program GeneDoc... 98 7.1 Hasil amplifikasi PCR genom kelapa berbuah kopyor dalam

dari Kecamatan Tayu dan Margoyoso dengan 3 macam pasangan primer yang digunakan dalam penelitian

ini... 112 7.2 Posisi masing-masing pasangan primer (F & R) dan fragmen

DNA kelapa berbuah kopyor di dalam diagram struktur parsial gen Sucrose synthase (SUS), Stearoyl Acyl Carrier Protein Desaturase (SACPD), dan Absicic Acid Insensitive

xx

7.3 Pensejajaran runutan asam amino yang diturunkan dari fragmen DNA kelapa berbuah kopyor CnSus1A+B dan CnSus2A+B dengan tanaman monokotil lainnya seperti Oncidium AF530567, Tulipa gesneriana X96938, Triticum aestivum AJ000153, Sacharrum officinarum AF263384, Oryza sativa Z15028, Hordeum vulgare X69931, Zea mays

L22296, dan Bambusa oldhamii AF412037………. 117

7.4 Pensejajaran runutan asam amino yang diturunkan dari fragmen DNA gen SACPD dan ABI kelapa berbuah kopyor hasil amplifikasi pasangan primer SACPD dan ABI3 dengan tanaman monokotil dan dikotil lainnya dan variasi asam

amino yang ditimbulkan antar runutan nukleotida... 118 7.5 Dendrogram runutan asam amino Sucrose synthase (SUS)

kelapa berbuah kopyor CnSus1A+B dan CnSus2A+B dengan spesies Tulipa gesneriana X96938, Triticum aestivum AJ000153, Saccharum officinarum AF263384, Oryza sativa Z15028, Hordeum vulgare X69931, Zea mays L22296, Bambusa oldhamii AF412037, Oncidium AF530567, Vigna radiata D10266, Glycine max AF030231, Hordeum vulgare X69931, Citrus lanatus AB018561, Vicus faba M97551, Pisum sativum AJ012080, Medicago truncale AJ131943, Gossypium hirsutum U73587, Citrus unshiu, Lycopersicon esculentum L19762, dan Daucus carota X75332, yang

runutan asam aminonya tersedia di data base... 119 7.6 Dendrogram asam amino gen SACPD dan ABI dengan

tanaman monokotil dan dikotil yang runutan asam aminonya tersedia di data base………...

120 8.1 Representasi hasil amplifikasi PCR yang menggunakan DNA

genom kelapa berbuah kopyor jenis kelapa dalam dengan primer spesifik yang digunakan dalam penelitian ini dan

ukuran fragmen DNA yang dievaluasi pada agarose gel 1%... 135 8.2 Keragaman pola pita SSCP (Single Strand Conformation

Polimorphism) pada sebagian aksesi kelapa berbuah kopyor di

gel poliakrilamid 11.5 %... 135 8.3 Fenogram populasi kelapa berbuah kopyor (dalam, genjah,

dan hibrida) dan normal (dalam dan genjah) asal Dukuh Seti, Tayu, Margoyoso, dan Jember berdasarkan Jaccard’s similarity coefficients menggunakan SIMQUAL (Similarity

for Qualitative Data) melalui NJ-WNJ-Hierarchical………… 138 8.4 Fenogram populasi kelapa berbuah kopyor (dalam, genjah,

dan hibrida) asal Dukuh Seti, Margoyosos, Tayu (Jawa Tengah), dan Jember (Jawa Timur) yang dikontruksi berdasarkan Jaccard’s similarity coefficients menggunakan SIMQUAL (Similarity for Qualitative Data) melalui

xxi

8.5 Fenogram populasi kelapa berbuah normal (dalam dan genjah) asal Dukuh Seti, Tayu, Margoyoso, dan Jember berdasarkan Jaccard’s similarity coefficients menggunakan SIMQUAL (Similarity for Qualitative Data) melalui

NJ-WNJ-Hierarchical……… 141

9.1 Diagram skema pembiakan kelapa kopyor melalui kultur in vitro yang dikembangkan dari eksplan embrio sigotik buah

xxii

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman 1 Komposisi media Eeuwens yang digunakan sebagai media dasar

pada pembiakan in vitro kelapa kopyor………... 168

2 Nama dan kode asam amino serta urutan kodon yang digunakan untuk menterjemahkan runutan nukleotida DNA kelapa berbuah

kopyor……….. 169

3 Kode untuk nukleotida degenerate yang digunakan untuk merancang primer degenerate pada gen-gen yang berkaitan

dengan sifat kopyor pada tanaman kelapa………... 170

4 Registrasi dan No. Pendaftaran Hak Paten Kelapa Kopyor dengan Invensi: Metode Pembiakan Klonal Kelapa Kopyor Melalui

Embriogenesis Somatik... 171 5 Registrasi dan No. Pendaftaran Hak Paten Kelapa Kopyor dengan

Invensi: Deteksi Dini Kelapa Kopyor Menggunakan Penanda

xxiii

GLOSSARY

alel : salah satu bentuk alternatif dari gen yang dapat muncul sebagai lokus tunggal

akar dari embrio : akar yang berkembang dari embrio somatik atau embrio somatik yang tumbuh menjadi akar

data biner : data pola pita yang distandarisasi menjadi suatu nilai yaitu satu (1) bila ada pita atu nol (0) bila tidak ada pita sehingga data bisa dianalis secara statistik

BLAST : program yang terkenal untuk membandingkan sebuah runutan nukleotida DNA (sequence) dengan semua runutan nukleotida DNA yang ada di data base

ClustalW : program yang terkenal untuk mensejajarkan banyak runutan nukleotida DNA (sequence alignments)

dendrogram : nama lain dari pohon filogenetik yaitu pohon yang menggambarkan sejarah kekerabatan dari sekelompok runutan nukleotida DNA yang mempunyai nenek moyang yang sama

endosperma : jaringan nutrisi pada biji (albumen)

ekson : coding region, bagian gen yang ditranslasikan atau yang mengkode protein (dibaca dan ditranslasi menjadi protein)

eksplan : jaringan yang diambil dari tempat asalnya dan ditransfer ke media buatan untuk pertumbuhan atau pemeliharaan embrio sigotik : embrio hasil fertilisasi antara gamet jantan dengan betina embrio somatik : embrio yang berkembang dari sel somatik atau bukan

berasal dari hasil fertilisasi

embriogenesis : proses pembentukan embrio dari sigot

filogenetik : rekonstruksi dari sejarah evolusi dari kerabat gen berdasarkan perbandingan gen

gap : representasi dari insersi atau delesi di dalam pensejajaran runutan nukleotida DNA

xxiv

haustorium : struktur pada bagian embrio yang berfungsi melakukan penetrasi pada jaringan endosperma untuk mengambil makanan (sebutan di beberapa daerah: kentos, abung) homolog : dua gen homolog jika mereka berbagi nenek moyang

yang sama

intron : bagian dari open reading frame (ORF) sebuah gen yang tidak ditranslasikan

kalus

embriogenik

: kalus yang mempunyai kemampuan untuk membentuk embrio

kecambah normal : kecambah yang mempunyai bagian tunas dan akar kecambah

abnormal

: bentuk-bentuk penyimpangan dari embrio menjadi tanaman (kecambah dengan tunas majemuk, kecambah dengan tunas dan akar dari embrio yang berbeda)

kelapa berbuah kopyor

: pohon kelapa yang menghasilkan buah kelapa kopyor dan normal dalam satu tandanya

kelapa kopyor : pohon kelapa yang menghasilkan buah kelapa kopyor 100% (total semua buah yang dihasilkan adalah kopyor) kelapa berbuah

normal

: pohon kelapa yang menghasilkan buah kelapa normal 100%

konversi tanaman : perkembangan embrio somatik ke bentuk planlet (tunas dan akar) atau tunas saja

penanda molekuler

: lokasi fisik pada kromosom yang teridentifikasi dan pewarisannya dapat dimonitor

perkecambahan : munculnya tunas dan akar dari benih/biji setelah melewati masa dormansi

planlet : tanaman yang dipelihara dalam botol kultur atau secara in vitro

planlet tunas : planlet yang hanya dilengkapi dengan tunas daun tanpa adanya akar (akar dapat diinduksi kemudian)

planlet lengkap : planlet yang mempunyai daun dan akar planlet sempurna : planlet dengan daun dan akar proporsional

xxv

plumula : kotiledon pada tanaman rumput-rumputan dan tanaman monokotil lainnya yaitu daun yang sangat termodifikasi terdiri dari skutelum dan koleoptil

polimorfik : bentuk lain atau bentuk yang berbeda dari gen dan runutan nukleotida lainnya

primer degenerate

: sebuah primer yang di sejumlah posisi nukelotidanya mempunyai kemungkinan basa nitrogen lebih dari satu runutan

nukleotida

: susunan/ urutan basa nitrogen (A, T, C, G) dalam rantai DNA

xxvi

DAFTAR SINGKATAN

a.a ABA

: :

Asam amino Abscisic Acid

ABI : Abscisic Acid Insensitive ANOVA : Analisis Varian

ARF1 : Auxin Response Factor1

BAP : 6-Benzyl amino purine

BLAST : Basic Local Alignment Search Tool

bp : base pair

CAB : Central for Agricultural Biotechnology

cds : coding segment

EBI : European Bioinformatics Institute dNTP : 2’-deoxy any base 5’-triphosphate

DNA : Deoxyribonucleic acid

DN : Dalam Normal

DK : Dalam Kopyor

2,4-D : 2,4-dichiorophenoxyacetic acid DMRT : Duncan Multiple Range Test FAD : ER-linoleate desaturase FATB : Palmitoyl-ACP thioesterase

GK : Genjah Kopyor

GN HE

: :

Genjah Normal Hemakktosilin-eosin

HY : Hibrida

IBA : Indolyl-3-butyric acid LTP : Lipid transfer protein

NCBI : National Center for Biotechnology Information NJ-WNJ : Neighbor Joining-Weighted Neighbor Joining

NTSYS : Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System PCA : Philippine Coconut Authority

SACPD : Stearoyl acyl carrier protein desaturase SIMQUAL : Similarity for Qualitative Data

SSCP : Single Strand Conformation Polymorphism

SUS : Sucrose synthase

Taq TBA

: :

Thermus aquaticus Tertiary Butyl Alcohol

BAB I

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Kelapa kopyor adalah kelapa mutan yang mempunyai endosperma bergumpal-gumpal yang lepas dari tempurungnya. Endosperma yang tidak normal tersebut justru sangat disukai oleh konsumen. Di lain pihak buah kelapa kopyor tidak selalu tersedia di pasar. Akibatnya, buah kelapa kopyor dijual dengan harga yang lebih mahal dibandingkan dengan buah kelapa biasa. Buah kelapa kopyor menjadi salah satu komoditi pertanian dengan nilai komersial tinggi.

Abnormalitas endosperma buah kelapa kopyor menyebabkan embrio dalam buah kelapa kopyor gagal berkecambah. Endospermanya tidak dapat dimanfaatkan oleh embrio sebagai sumber energi dalam proses perkecambahan. Buah kelapa kopyor sebagai biji jika ditanam akan segera membusuk sehingga embrio tidak dapat tumbuh. Selama ini buah kelapa kopyor diperoleh dari pohon kelapa normal yang menghasilkan buah kelapa normal dan buah kelapa kopyor dalam satu tandannya. Pohon kelapa berbuah kopyor ini menghasilkan buah kopyor hanya 1-2 (1-2%) buah per pohon. Pohon kelapa jenis ini ditumbuhkan dari benih kelapa yang fenotipenya normal, tetapi membawa gen untuk sifat kopyor pada salah satu alel dalam lokus yang mengatur sifat kopyor. Di samping itu, meskipun pohon kelapa tersebar luas di seluruh Indonesia namun pohon kelapa berbuah kopyor hanya bisa ditemukan pada daerah-daerah tertentu seperti di daerah Pati, Sumenep, Jember dan Banyuwangi. Tegakan pohon kelapa berbuah kopyor masih terbatas jumlahnya dan ada di kebun-kebun rakyat yang berskala kecil. Kedua hal tersebut secara simultan menyebabkan buah kelapa kopyor tersedia dalam jumlah terbatas dan mahal.

Mengingat cara reproduksi dan penyediaan bibit kelapa berbuah kopyor yang sulit serta keterbatasan jumlah tegakan pohon kelapa berbuah kopyor yang ada, ada kekhawatiran bahwa genotipe kelapa yang bernilai komersial tinggi tersebut secara bertahap menjadi hilang dan secara sengaja atau tidak sengaja

2

menjadi tergantikan dengan tegakan kelapa biasa pada proses peremajaan perkebunan kelapa rakyat (proses replanting). Tegakan kelapa berbuah kopyor yang saat ini dikonservasi secara in situ oleh sejumlah petani di berbagai sentra produksi kelapa telah berumur ratusan tahun karena biasanya sebagai tanaman warisan yang diturunkan dari satu generasi ke generasi berikutnya.

Oleh sebab itu perlu dilakukan upaya mengembangkan budidaya pohon kelapa yang dapat menghasilkan buah kopyor dalam persentase tinggi untuk meningkatkan kuantitas dan kualitasnya sehingga layak menjadi komoditi ekspor sekaligus menjadi buah unggulan lokal. Hal ini terbukti sangat sulit dilakukan dengan menggunakan pendekatan konvensional.

Seiring dengan perkembangan ilmu bioteknologi, embrio sigotik kelapa kopyor dapat dikecambahkan dengan menanamnya dalam media agar secara aseptik yang disebut dengan teknik kultur embrio (embryo rescue). Melalui teknik ini diperoleh bibit kelapa kopyor yang pada saat berproduksi dapat menghasilkan buah kelapa kopyor 100% per pohon. Penggunaan teknologi kultur embrio untuk memperbanyak bibit kelapa kopyor telah dirintis oleh de Guzman pada tahun 1971 (de Guzman 1971; Del Rosario & de Guzman 1976) dan bahkan telah dikomersialkan (Tahardi 1997; Del Rosario 1997). Meskipun demikian efisiensi teknik kultur embrio sigotik dalam menghasilkan planlet dan bibit kelapa kopyor masih rendah, yaitu kurang dari 30% (Mashud 1999).

Sedikitnya persentase bibit kelapa kopyor yang diperoleh bersumber dari dua hal, yaitu pertama kehilangan materi tanaman selama proses pengkulturan baik pada fase perkecambahan maupun fase pendewasaan planlet yang disebabkan oleh embrio tidak viabel, kontaminasi, browning, dan stagnasi. Ke dua, kehilangan materi tanaman pada saat periode aklimatisasi planlet dari kondisi in vitro ke kondisi in vivo (Engelmann 1998). Perbaikan-perbaikan proses kultur embrio untuk kelapa kopyor masih perlu dilakukan untuk meningkatkan perkecambahan embrio dan mempertahankan planlet yang dihasilkan.

Planlet kelapa kopyor tergolong tanaman yang sulit untuk diaklimatisasi. Persentase keberhasilan sejauh ini rata-rata 50% atau kurang (Mashud 1999; Sukendah 2005). Ada beberapa pertimbangan yang harus diperhatikan untuk meningkatkan daya bertahan hidup planlet kelapa kopyor pada proses

3

aklimatisasi, misalnya: kondisi planlet sebelum aklimatisasi, media aklimatisasi dan lingkungan aklimatisasi (suhu, kelembaban dan cahaya). Oleh sebab itu masih perlu dikaji faktor-faktor yang mempengaruhi keberhasilan aklimatisasi baik faktor-faktor sebelum dan pada saat proses aklimatisasi. Dalam penelitian ini dilakukan perbaikan perakaran planlet sebelum diaklimatisasi untuk meningkatkan daya tahan planlet pada kondisi luar.

Pembiakan kelapa kopyor dengan metode kultur embrio sigotik hanya menghasilkan sedikit bibit karena satu embrio maksimal hanya menghasilkan satu tanaman. Perolehan bibit kelapa kopyor asal kultur embrio sigotik yang tidak banyak mengakibatkan harga bibit kelapa kopyor sangat mahal yang sulit terjangkau oleh keuangan petani. Oleh sebab itu dibutuhkan alternatif metode kultur jaringan selain kultur embrio untuk meningkatkan jumlah planlet dan bibit kelapa kopyor. Metode yang dapat digunakan untuk mencapai tujuan tersebut adalah teknologi pembelahan meristem apikal dan embriogenesis somatik.

Metode embriogenesis somatik banyak digunakan untuk menghasilkan bibit tanaman secara masal dan dapat digunakan untuk kepentingan manipulasi genetik pada program pemuliaan tanaman. Pada kelapa kopyor sejauh ini belum banyak publikasi yang melaporkan keberhasilan perakitan bibit kelapa kopyor melalui proses embriogenesis somatik. Walaupun demikian teknologi embrio somatik telah digunakan secara intensif oleh beberapa peneliti untuk tanaman kelapa normal yang tidak berbuah kopyor (Blake 1990; Verdeil et al. 1992; Hornung 1995; Chan et al. 1998; Samosir et al. 1998; Hocher et al. 1998). Sementara itu perbanyakan kelapa kopyor melalui teknik pembelahan embrio pada daerah meristem tunas dan akar apikal belum ada publikasi ilmiahnya.

Hasil observasi menunjukkan bahwa secara morfologi tidak ada perbedaan antara bibit atau pohon kelapa kopyor, kelapa berbuah kopyor dengan kelapa normal. Perbedaan ketiga macam kelapa tersebut hanya terletak pada bagian endosperma dan baru terlihat setelah memasuki fase generatif. Satu-satunya cara untuk membedakan ketiga macam kelapa ini sedini mungkin adalah pada level DNA dengan menggunakan analisis molekuler.

Karakteristik abnormal endosperma kelapa kopyor diduga berhubungan dengan aktivitas enzim -D Galaktosidase. Aktivitas enzim -D Galaktosidase

4

diketahui meningkat sejalan dengan proses pematangan dan perkecambahan buah kelapa (Mujer et al. 1984). Pada dua spesies buah kopi yaitu Coffea arabica dan Coffea canephora var. Robusta, aktivitas enzim -D Galaktosidase meningkat secara gradual selama pembentukan endosperma dan mencapai puncaknya 30 minggu setelah pembungaan, yang mana diiringi oleh mengerasnya endosperma (Marraccini et al. 2005). Pada kelapa kopyor aktivitas enzim -D Galaktosidase sangat rendah, bahkan tak terdeteksi (Mujer et al. 1984).

Penelitian tentang analisis molekular gen -D Galaktosidase pada kelapa atau kelapa kopyor belum pernah dilaporkan. Penelitian yang ada adalah tentang pemanfaatan penanda molekular untuk menganalisis keragaman genetik kelapa kopyor dengan menggunakan marker molekuler RAPD yang dihasilkan oleh random primer OPC09, OPH03, OPH05, dan OPH09 (Toruan & Ginting 1998) dan marker molekuler SSRs dari pasangan primer CNZ 21, CNZ 51, CNZ 09, CNZ 18, dan CnCr4 (Maskromo 2005). Namun demikian, marker molekuler yang ada belum dapat dijadikan sebagai marker untuk secara spesifik mendeteksi bibit kelapa kopyor atau menandai gen penentu sifat kopyor pada kelapa. Hal ini diduga karena marker-marker yang ada tidak terpaut (tidak ada dalam kromosom yang sama) dengan gen mutan penyebab sifat kopyor pada kelapa. Primer spesifik yang digunakan untuk menghasilkan marker SSR pada kelapa oleh Rivera et al. (1999) belum dapat digunakan untuk membedakan pohon kelapa berbuah kopyor dengan kelapa berbuah normal. Untuk itu perlu dikembangkan penanda molekuler spesifik untuk gen -D Galaktosidase yang dapat digunakan untuk mengidentifikasi keberadaan gen mutan yang menyebabkan sifat kopyor pada endosperma kelapa.

Komposisi beberapa senyawa seperti sukrosa, lemak dan protein dalam endosperma kelapa kopyor dan kelapa normal sangat berbeda. Oleh sebab itu di samping gen -D Galaktosidase juga akan dieksplorasi dan dianalisis gen-gen lainnya yang berkaitan erat dengan sintesis sukrosa dan lemak. Berdasarkan runutan DNA gen-gen tersebut, maka akan dikembangkan penanda molekuler spesifik untuk menganalisis perbedaan genetik pohon kelapa yang berpotensi menghasilkan buah kopyor dengan kelapa yang berpotensi menghasilkan buah normal.

5

Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan: (1) memperbaiki teknologi kultur embrio sigotik kelapa kopyor untuk meningkatkan perkecambahan embrio dan meningkatkan jumlah planlet serta mempelajari teknik aklimatisasi bibit kelapa kopyor, (2) mengkaji teknologi pembiakan in vitro dengan teknik pembelahan embrio pada daerah meristem tunas dan akar embrio kelapa kopyor, (3) mengkaji teknologi embrio somatik untuk pembiakan klonal kelapa kopyor, (4) mengembangkan penanda molekuler gen -D Galaktosidase pada kelapa berbuah kopyor, (5) menganalisis fragmen DNA sejumlah gen yang diduga berkaitan erat dengan sifat kopyor, dan (6) menganalisis keragaman genetik populasi kelapa berbuah kopyor di Pulau Jawa. Kerangka pendekatan penelitian untuk mencapai tujuan penelitian tersebut disajikan pada Gambar 1.1.

Manfaat Penelitian

Hasil penelitian ini diharapkan dapat: (1) memberikan masukan kepada peneliti dan laboratorium yang akan mengembangkan bibit kelapa kopyor melalui teknik kultur embrio sigotik dan somatik, (2) membantu meningkatkan penyediaan bibit kelapa kopyor, (3) membantu mendeteksi bibit kelapa yang berpotensi menghasilkan buah kopyor dari bibit kelapa yang berpotensi menghasilkan buah normal, dan (4) menambah informasi dalam memahami fenomena kopyor pada tanaman kelapa, terutama untuk gen-gen yang berkaitan erat dengan sifat kopyor.

6

Gambar 1.1 Bagan alur kerangka penelitian teknik pembiakan in vitro dan analisis molekuler pada tanaman kelapa kopyor.

Pembiakan in vitro Pohon Kelapa Berbuah Kopyor

Analisis Molekuler

Kalus Embriogen Embriogenesis

Somatik

Embrio Somatik Pembelahan

Embrio

Proliferasi tunas/planlet

1.Bibit Kelapa Kopyor Kultur Embrio

Sigotik

Perkecambahan Embrio

Aklimatisasi Embrio

Planlet Isolasi DNA

Genom

Analisis Keragaman Genetik Kopyor Disain Primer

Degenerate

Primer Spesifik Ligasi dan

Kloning PCR dan Purifikasi

Penentuan runutan nukleotida

Disain Primer Spesifik

Data base

GeneBank

DNA Genom

PCR-SSCP

Gen terpaut sifat kopyor

2.Penanda molekuler sifat kopyor

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Kelapa Kopyor

Kelapa kopyor (Cocos nucifera L.) (2n=2x=32) sama dengan tanaman kelapa lainnya merupakan anggota dari famili monokotiledon Aracaceae (Palmaceae). Cocos nucifera adalah satu-satunya spesies dalam genus Cocos subfamili Cocoideae (Harris 1990). Buah kelapa kopyor adalah buah kelapa yang endospermanya tidak normal (remah) (Gambar 2.1). Buah dengan karakteristik tersebut dihasilkan dari pohon kelapa tertentu yang sebagian besarnya buahnya normal dan sebagian kecil tidak normal (kopyor) (Wahyuni 2000). Biasanya pohon jenis ini hanya mempunyai buah kelapa kopyor dengan frekuensi antara 1-2 buah kopyor per tandan.

Abnormalitas endosperma kelapa kopyor bersifat genetik dan ditimbulkan oleh beberapa faktor resesif (Zuniga dalam Tahardi & Warga-Dalem 1982). Sifat kopyor dibawa oleh pasangan gen resesif, yaitu 50% dari induk betina dan 50%

Gambar 2.1 Fenotipe endosperma buah kelapa normal dan kelapa kopyor. a. Buah kelapa normal dengan endosperma padat dan masif, b. Buah kelapa kopyor dengan endosperma bergumpal-gumpal dan mengelupas dari tempurung.

8

dari induk jantan. Buah kopyor akan terbentuk jika terjadi persilangan antara polen dan stigma yang masing-masing memiliki sifat kopyor (Tahardi 1997). Sifat kopyor secara genetik dikendalikan oleh genotipe endosperma (betina) dan genotipe polen (jantan). Bila satu pohon kelapa kopyor bunga betinanya konsisten diserbuki oleh polen dari pohon kelapa kopyor, maka dapat dipastikan pohon tersebut akan menghasilkan 100% buah kopyor.

Morfologi pohon kelapa kopyor dan kelapa berbuah kopyor tidak bisa dibedakan dari kelapa normal. Hasil observasi menunjukkan tidak ada penanda morfologi yang bisa digunakan untuk membedakan ketiga jenis pohon kelapa tersebut (Maskromo 2005). Kepastian tanaman berbuah kopyor diketahui setelah buahnya dipanen. Salah satu cara sederhana untuk mengetahui buah kelapa kopyor adalah dengan mengguncang buah tersebut. Pada saat diguncang buah kopyor akan berbunyi gemericik, yang menandakan endosperma telah hancur dan telah terlepas dari tempurung sehingga bercampur dengan air kelapa.

Fenotipe endosperma abnormal pada kelapa kopyor terkait dengan tidak aktifnya gen penyandi enzim -D Galaktosidase. Pada kelapa normal, aktivitas enzim -D Galaktosidase diketahui meningkat sejalan dengan proses pematangan dan perkecambahan buah kelapa. Pada kebanyakan tanaman, misalnya pada tanaman kopi proses mengerasnya endosperma dikontrol secara langsung oleh aktivitas gen -Gal, melalui pelepasan residu galactosyl dari rantai mannan (Marraccini et al. 2005).

Pada kelapa kopyor, aktivitas enzim -D Galaktosidase sangat rendah dan bahkan tak terdeteksi menyebabkan endospermanya menjadi abnormal (remah). Mutasi genetik yang terjadi pada kelapa kopyor dan terekspresi secara khusus pada endosperma dalam bentuk berkurangnya aktivitas enzim -D Galaktosidase atau tidak aktif sama sekali menjadi penyebab fenotipe endosperma buah kelapa yang tidak normal tersebut (Mujer et al. 1984).

Perbedaan fenotipe endosperma antara kelapa kopyor dengan kelapa normal ternyata tidak hanya dalam teksturnya tetapi juga senyawa-senyawa kimia yang dikandungnya (Tabel 2.1). Pada kelapa normal endosperma merupakan sumber lemak utama, tetapi pada kelapa kopyor kandungan utama adalah karbohidrat, diikuti oleh lemak (Santoso et al. 1996). Rosario & Gabuya (1980)

9

Tabel 2.1 Kandungan komposisi senyawa kimia air kelapa dan endosperma kelapa kopyor dengan kelapa normal yang dihitung berdasarkan persentase bahan kering

Jenis kelapa

Protein Lemak

Karbo-hidrat

Sukrosa Glukosa Fruk-

tosa

Vit.C

-tocopherol

AKN* 9.36 2.67 79.5 9.24 26.7 25.7 7.08 ND**

AKK 10.4 4.79 72.8 60.8 6.29 5.24 2.42 0.01

EKN 7.10 62.64 29.1 4.77 0.24 0.46 5.27 0.94

EKK 4.93 30.71 62.3 10.70 2.42 2.08 12.3 2.34

*Sampel buah diambil pada umur 12 bulan setelah penyerbukan, AKN=Air kelapa normal, AKK=air kelapa kopyor, EKN=Endosperma kelapa normal, EKN=endosperma kelapa kopyor ** ND = tidak terdeteksi

Sumber: Santoso et al. (1996)

melaporkan bahwa bahan dasar utama dinding sel pada kelapa “Makapuno” (sebutan kelapa kopyor di Filipina) adalah pektin sedangkan pada kelapa normal adalah hemisellulosa. Kandungan vitamin C dan -tocopherol pada endosperma kelapa kopyor jauh lebih tinggi daripada kelapa normal. Begitu juga kandungan sukrosa, galaktosa dan fruktosa lebih tinggi pada endosperma kelapa kopyor. Menurut Santoso et al. (1996) kombinasi antara kandungan gula yang tinggi, asam sitrat dan asam malat menimbulkan rasa lezat pada endosperma kelapa kopyor. Sementara itu kandungan senyawa protein seperti lisina sangat rendah dibandingkan kelapa normal. Protein pada endosperma kelapa kopyor didominasi oleh asam glutamina, arginina dan asam aspartat.

Kultur Embrio Sigotik Kelapa

Produktivitas buah kelapa kopyor per pohon yang dihasilkan dari pohon asal buah kelapa normal namun membawa sifat kopyor pada salah satu alelnya sangat rendah yaitu antara 2.1-17.5% dari seluruh jumlah kelapa yang dihasilkan, sedangkan pohon kelapa kopyor yang ditanam dari kultur embrio sigotik buah kelapa kopyor secara potensial dapat menghasilkan buah kopyor antara 75-100% (Novarianto 1999). Kultur embrio adalah isolasi steril dan pertumbuhan suatu embrio muda atau embrio masak secara in vitro dengan tujuan mendapatkan sebuah tanaman normal (Mariska & Hobir 1998; Gunawan 1995).

10

Metode kultur embrio telah dikembangkan secara intensif oleh COGENT (International Coconut Genetic Resources Network) sejak tahun 1997 untuk pertukaran plasma nutfah dan konservasi ex situ kelapa (Engelmann 1998). Metode ini juga digunakan oleh UPLB (University of Philippines at Los Banos) untuk mengembangkan kelapa “Makapuno” (kopyor). Hasilnya saat ini terdapat beberapa macam protokol media kultur untuk tanaman kelapa yang dikembangkan oleh PCA (Philippine Coconut Authority), CPCRI (Central Plantation Crops Research Institute) India, ORSTOM/CIRAD Perancis, dan UPLB (Tabel 2.2). Berdasarkan hasil penelitian yang dilakukan terhadap keempat macam protokol tersebut menunjukkan bahwa meskipun protokol yang terbaikpun seperti UPLB persentase embrio yang berhasil mencapai tahap aklimatisasi di screen house masih di bawah 50%. Selanjutnya plantlet-planlet yang berhasil mencapai tahap aklimatisasi dan berhasil bertahan hidup dibawah 30% (Mashud 1999). International Coconut Embryo Culture Workshop, 2000, di Mexico meyimpulkan perlunya upgrading teknik kultur embrio untuk tanaman kelapa dan meningkatkan efisiensinya.

Keragaman respon yang tinggi embrio kelapa kopyor ketika dikulturkan menyebabkan kesenjangan waktu yang lama untuk proses aklimatisasi antara embrio satu dengan embrio lainnya untuk periode inokulasi yang sama. Hal ini karena pertumbuhan planlet satu dengan lainnya tidak seragam. Ada planlet kelapa kopyor yang tumbuh sangat cepat sehingga hanya dibutuhkan waktu 5-6 bulan untuk diaklimatisasi (Sukendah 2003). Di lain pihak ada planlet yang membutuhkan waktu hampir satu tahun baru bisa diaklimatisasi. Vigor (ketegaran) planlet kelapa kopyor juga sangat beragam. Hal ini berkaitan dengan perkembangan tunas dan sisten perakaran yang kurang baik. Untuk planlet-planlet yang kondisinya tidak siap untuk proses aklimatisasi perlu dilakukan peningkatan vigor planlet, salah satunya dengan cara memperbaiki sistem perakarannya.

Perakaran seringkali merupakan kendala yang serius pada kultur embrio sigotik kelapa (Verdeil et al. 1997). Pada tahun-tahun yang lalu hampir semua embrio sigotik yang berkecambah tidak berkembang akarnya atau mempunyai sistem perakaran yang tidak bagus. Perlakuan yang terbaik untuk menginduksi

11

perakaran adalah dengan menambahkan ZPT NAA 20 mg/l. Untuk meningkatkan pertumbuhan tunas dan akar planlet kelapa, Magdalita et al. (2004) menambahkan GA3 20 uM. GA3 pada konsentrasi ini berpengaruh pada panjang tunas, jumlah akar, dan berat segar dan berat kering planlet, namun tidak mempengaruhi panjang akar.

Tabel 2.2 Protokol komposisi media kultur embrio kelapa yang dikembangkan oleh berbagai negara

Senyawa kimia (mg/l)

PCA (Y3)

UPLB (Y3)

CPCRI (Y3)

ORSTOM (MS)

NH4NO3 - - - 1650

NH4Cl 535 535 535 -

KNO3 2020 2020 2020 1900

MgSO4.7H2O 247 247 247 370

CaCl2.2H2O 294 294 294 440

KCl 1492 1492 1492 -

KH2PO4 - - - 170

NaH2PO4.2H2O 312 312 312 -

KI 8.3 8.3 8.3 0.83

H3BO3 3.1 3.1 3.1 6.2

MnSO4.4H2O 11.2 11.2 11.2 22.3

ZnSO4.7H2O 7.2 7.2 7.2 8.6

CuSO4.5H2O 0.25 0.25 0.25 0.025

CoCl2.6H2O 0.24 0.24 0.24 0.025

NaMoO4.H2O 0.24 0.24 0.24 0.025

NiCl.6H2O 0.024 0.024 0.024 -

Fe2SO4.7H2O 13.9 41.7 13.9 24.9

Na2EDTA 37.3 55.8 37.3 26.1

Myo-inositol 100 - 100 -

Pyridoxine HCl 0.05 0.05 0.05 1.0

Thiame HCl 0.05 0.05 0.5 1.0

Nicotinic Acid 0.05 0.05 - 1.0

Ca-D-pantothenate _{0.05 - - 1.0}

Biotin 0.05 0.05 0.05 0.01

Folic acid - 0.05 - -

Glycine - 1.0 - -

Na Ascorbate - - - 100

BAP* - - 0.5 -

NAA* - - 0.5 -

NAA** - - 1.0 -

IBA** - - 5.0 -

*Media perkecambahan , **Media perakaran, Y3= media dasar Eeuwens, MS= media dasar Murashage & Skoog

12

Kultur Embrio Somatik

Embriogenesis somatik adalah serangkaian proses pada struktur bipolar (mirip embrio sigotik) yang berkembang dari sel non-sigotik tanpa ada hubungan vaskular dengan jaringan sel induknya (Arnold et al. 2002). Sel-sel yang ditumbuhkan secara in vitro ini membentuk embrio somatik. Embrio somatik dapat berkembang dari satu sel dalam suatu eksplan (embriogenesis somatik langsung), atau didahului oleh proses proliferasi sel kalus (embriogenesis somatik tidak langsung) (Witjaksono 2003).

Pada embriogenesis somatik tidak langsung, ekplan seperti daun, bunga, tunas, hipokotil, atau bagian organ lainnya dikulturkan di dalam media yang mengandung auksin (2,4-D) untuk memperoleh kultur embriogenik. Dengan adanya auksin, sel yang sedang mengalami pembelahan dengan cepat distimulasi untuk membelah dengan tidak equal. Hal ini menghasilkan dua bentuk sel, yaitu sel yang besar dengan banyak vakuola, dan sel kecil yang sitoplasmik yang kompeten untuk embriogenesis (Litz & Gray 1995). Embriogenesis somatik tidak langsung terjadi pada sel-sel induced embriogenic determined cell (IEDC) yaitu sel-sel yang mengalami dediferensiasi, pembelahan sel dan transformasi menjadi sel embriogenik. Embriogenesis somatik langsung dapat terjadi pada tanaman tahunan seperti mangga yang dikulturkan dari nuselus (Litz 1984) dan apukat (Witjaksono & Litz 1999).

Embriogenesis somatik langsung, embrio somatik dapat ditumbuhkan dari eksplan (embrio sigotik muda, nuselus, hipokotil) tanpa melalui fase kalus. Embrio somatik dapat diinisiasi dari sel embrionik yang sudah ada di dalam eksplan, yaitu pada sel-sel preembriogenic determined cell (PEDC). Sel-sel PEDC tersebut membutuhkan zat pengatur tumbuh untuk pembentukan embrio somatik. Induksi embriogenesis somatik langsung pada tanaman tahunan terjadi pada nucelus mangga poliembrioni (Litz et al. 1995) dan kotiledon pear tipe liar (de March et al. 1993).

Faktor yang sangat mempengaruhi terbentuknya kultur embriogenik adalah hormon terutama auksin. Jenis tanaman palma (kelapa sawit, kurma, sagu) umumnya menggunakan auksin 2,4-D untuk menginduksi kultur embriogenik (de

13

Touchet et al. 1991; Esraghi et al. 2005; Riyadi et al. 2005). Walupun demikian, auksin juga mempunyai kemampuan untuk menghambat pertumbuhan embrio (Litz & Gray 1992). Karena sifat inilah auksin tidak ditambahkan ke dalam media pada proses perkembangan lebih lanjut dari embrio. Auksin dapat mengacaukan polarisasi pembelahan sel yang dibutuhkan dalam pertumbuhan proembrio menjadi embrio somatik (Kawahara & Komamine 1995). Pada kurma proliferasi suspensi kalus dipelihara tanpa auksin (2,4-D), namun ditambahkan glutamina untuk meningkatkan proliferasi embrio somatik (Zouine & Hadrami 2007). Pada mangga proliferasi proembrioni dan apukat dipengaruhi oleh genotipe tanaman (Witjaksono & Litz 1999). Pada wortel tipe liar, proliferasi dipengaruhi oleh pH media. pH rendah sangat ideal untuk terjadinya proliferasi dilain pihak pH tinggi dibutuhkan untuk perkembangan embrio somatik (Smith & Krikorian 1990).

Tahap perkembangan embrio somatik hampir sama dengan jalur yang ditempuh oleh biji/embrio sigotik pada proses perkecambahan, yaitu: tahap globular, hati, torpedo dan kotiledon untuk spesies dikotil (Arnold et al. 2002). Pada spesies tanaman monokotil tahap yang ditempuh adalah globular, skutelar, dan koleoptil (Gray 2005). Perkembangan embrio somatik diinisiasi setelah embrio ditransfer ke media tanpa atau dengan auksin rendah. Walaupun demikian hormon seperti ABA mengontrol pendewasaan embrio somatik sebelum dikonversi menjadi tanaman utuh. Nickel & Yeung (1993) berpendapat bahwa ABA mungkin menginduksi diferensiasi jaringan tunas meristem dan mencegah perkecambahan dini.

Periode kritikal terakhir adalah konversi tanaman yaitu proses penumbuhan tunas dan akar dari embrio somatik. Masalah utama dalam embriogenesis somatik pada tanaman tahunan seperti kurma, mangga dan apukat, yaitu rendahnya frekuensi konversi tanaman (0-5%). Huong et al. (1999) menambahkan BAP 0.2 mg/l untuk meningkatkan konversi tanaman kurma mencapai 76%. Mathews & Wetzstein (1993) menggunakan hormon BA 100 uM dan 3 mg/l anti etilen perak nitrat pada embrio somatik pecan dan meningkatkan perkecambahan dari 3 menjadi 47% serta konversi tanaman dari 2 menjadi 13%. Beberapa peneliti menggunakan GA3 dikombinasi dengan IAA untuk meningkatkan konversi tanaman.

14

Perkembangan Kultur Embrio Somatik pada Tanaman Kelapa

Sejauh ini propagasi klonal melalui embriogenesis somatik pada kelapa kopyor belum banyak dilaporkan. Sifat pertumbuhan kelapa (normal atau kopyor) yang monopodial (tidak bercabang) dan tak ada sucker, rimpang atau anakan yang tumbuh menyebabkan kelapa secara genetik sulit diperbanyak secara vegetatif. Walaupun demikian dengan berpedoman pada teori totipotensi bahwa setiap sel tanaman mempunyai otonomi dan kemampuan untuk berkembang menjadi tanaman utuh, beberapa peneliti mencoba memperbanyak kelapa secara vegetatif dari sel somatiknya (2n). Perbanyakan klonal melalui embriogenesis somatik pada kelapa dimulai pada era 80-an oleh Blake dengan koleganya. Penelitian embriogenesis somatik pada kelapa mulai intensif dikerjakan setelah CIRAD bekerja sama dengan IRD pada tahun 1991 untuk mengembangkan metode propagasi klonal kelapa dari eksplan seperti infloresens muda (Verdeil et al. 1994; Magnaval et al. 1997), dan plumula (Hornung 1995).

Kloning in vitro tanaman kelapa melalui embriogenesis somatik menjajikan prospek yang baik di masa mendatang. Studi untuk mendapatkan embrio somatik telah dilaksanakan menggunakan berbagai jenis eksplan, termasuk daun muda, akar, embrio muda dan infloresens dengan berbagai tingkat keberhasilan (Oropeza et al. 2003.). Pada awal tahun 1990-an kalus dapat diperoleh dari berbagai sumber eksplan tersebut, tetapi embrio somatik dan regenerannya hanya dapat diperoleh dari daun muda (Buffard-Morel et al. 1992; Karunaratne et al. 1991) dan infloresens (Branton & Blake 1986; Verdeil et al. 1994). Studi pendahuluan yang dilakukan oleh Hornung (1995) dan Chan et al. (1998) menunjukkan bahwa pembentukan embrio somatik dan regenerannya lebih tinggi diperoleh dari eksplan plumula daripada jenis eksplan lainnya.

Perkembangan penelitian embrio somatik kelapa dirangkum pada Tabel 2.2, yang menunjukkan macam eksplan yang digunakan, formulasi media, dan berbagai respon kultur terhadap perlakuan yang diberikan. Hasil-hasil yang diperoleh pada penelitian kelapa tersebut telah dijadikan sebagai sumber acuan untuk melakukan regenerasi kelapa kopyor melalui embriogenesis somatik.

15

Tabel 2.3 Mikropropagasi secara klonal pada tanaman kelapa melalui proses embriogenesis somatik

No. Eksplan Media Kultur Respon/Hasil Autor

1. -Potongan jaringan batang -Infloresens muda

-Media dasar: Makro MS (1962)

+MikroY3(1976)+Vitamin Blake (1970)

-Hormon: 2,4D 10-4 – 10

-7

M dan BAP 5x10-6M -Arang aktif: 2.5 g/l

-Terbentuk kalus nodular yang bersifat meristematik setelah 16 minggu sejak dari penanaman

Branton & Blake (1983)

2. -Daun muda non-klorofil -Infloresens (rachis) Tidak disebutkan (kemungkinan untuk kepentingan paten) -Kalus dengan struktur memanjang (elongated calli) dari eksplan infloresens setelah 3-5 bulan

-Kalus berbentuk nodular dengan daerah meristematik dari eksplan daun non klorofil (4-5 bulan)

Verdeil

et al.

(1989)

3. -Daun muda non-klorofil -Infloresens (spikelet)

Media: Buffard-Morel et

al. (1992) + 2,4D 80 mg/l

+ arang aktif 2/3 g/l

-Kalus terbentuk setelah 4-9 bulan

-Embriogenesis tampak setelah 12 bulan dan ada pembentukan proembrio seperti pada tahap awal embriogenesis embrio sigotik

-Tunas terbentuk pada media yang bebas hormon

Verdeil

et al.

(1992)

4. - Daun

muda non-klorofil -Infloresens

Media Eeuwens (Y3) + Vitamin (Morel &

Wetmore) + sukrosa 40 g/l + agar 7.5 g/l +arang aktif 2/3 g/l

Hormon: 30-80 g/l

-Dua tipe embriogenesis somatik pada kelapa: * tipe organogenetik yang berasal dari struktur meristematik komplek epidermal,

Verdeil

et al.

16

Lanjutan Tabel 2.3

No. Eksplan Media Kultur Respon/Hasil Autor

membentuk embriogenesis multicellular origin *tipe unicellular origin, dengan individu sel embriogenik yang akan mengarah pada pembentukan pro-embrio (karakteristik pada pembentukan embrio sigotik)

5. - Daun muda non-klorofil -Infloresens muda

Media Eeuwens + Vitamin Morel & Wetmore + sukrosa 30 g/l + agar 7.5 g/l + arang aktif 2 g/l Hormon: 2,4-D 40-70 mg/l

-Proses embriogenesis kelapa membutuhkan NH4+, Ca2+, Mg2+ dan sukrosa lebih besar per gram berat kering

- Terbentuk embrio somatik dengan jaringan haustorium dan embriogenesis tidak lengkap

(terbentuk haustorium dengan atau tanpa daerah akar)

Buffard-Morel et

al. (1995)

6. Embrio sigotik muda

Media Branton & Blake (1983), semi-solid gelrite 0.3%, gula 30 g/l, arang aktif 2.5 g/l Hormon:

• Induksi dan multiplikasi kalus: Media dasar+ 2,4-D 2x10-4M

• Pembentukan & pematangan ES: Media dasar+2,4-D 1x10-4-5x10-5M

• Perkecambahan: Media dasar+2,4-D1x10-5M +2iP 2x10-6M

-Terbentuk nodular kalus setelah 3 minggu pada bagian pusat kotiledon

-Sebagian besar embrio somatik tidak berkecambah tetapi tumbuh menjadi bentuk yang tidak beraturan dengan struktur akar yang banyak sekali

-Didapatkan 2 planlet dari perkecambahan embrio somatik

Cueto et

17

Lanjutan Tabel 2.3

No. Eksplan Media Kultur Respon/Hasil Autor

7. Plumula dari embrio sigotik

Media Eeuwens + gelrite 3 g/l + arang aktif 2.5 g/l Hormon:

• Induksi kalus: Media dasar + 2,4-D 0.1 mM

• Pembentukan embrio & Perkecambahan: Media dasar + 2,4-D 1 uM + 50 uM BAP

-40% kalus meristematik terbentuk setelah 3 bulan. Embrio somatik terbentuk setelah 7-9 bulan

-Embrio somatik dapat berkecambah membentuk tunas yang berkembang menjadi planlet setelah disubkultur 3 bulan sekali (planlet membutuhkan waktu 1-1.5 tahun)

Chan et

al. (1997)

8. Belahan embrio secara longitudinal

• Induksi kalus: media Eeuwens+Morel &Wetmore vitamin+sukrosa 30g/l+arang aktif 2.5g/l+agar 7 g/l+2,4-D 125 uM+BA 5 uM+ 2iP 5 uM

• Pembentukan & Pematangan ES: Media Y3+sukrosa 40 g/l+ arang aktif 2.5 g/l+agar 7 g/l+2,4-D 10 uM+ BA 5 uM+ 2iP 5 uM

• Perkecambahan: Media Y3+sukrosa 60 g/l+ arang aktif 2.5 g/l+ agar 7 g/l tanpa hormon -Belahan embrio pada daerah kotiledon yang paling responsif untuk induksi kalus -Kalus nodular secara gradual berubah menjadi tunas dan berkembang menjadi kecambah dengan tunas yang menggulung - Banyak ditemukan perkembangan yang dominan pada awal pembentukan planlet Samosir et al. (1998)

18

Lanjutan Tabel 2.3

No. Eksplan Media Kultur Respon/Hasil Autor

9. Embrio yang dibelah

-Induksi kalus: Media Y3+ 7 g/l agar+ sukrosa 90 mM+ arang aktif 2.5 g/l + 2,4-D 125 uM

Ditambah bahan aditif: AVG (1.5 uM), STS (3 uM), putrescine (7.5 mM), dan spermine (1 uM)

-Proliferasi: Media Y3+agar 7 g/l+sukrosa 90 mM+arang aktif 2.5 g/l+2,4-D 125 uM -Pematangan dan Regenerasi: Media Y3+agar 7 g/l+sukrosa 175 mM

-Penambahan bahan aditif untuk kontrol produksi etilen (AVG & STS) dan

penggunaan poliamina pada induksi kalus akan meningkatkan embriogenesis somatik

Adkins et al. (1998)

10. Embrio sigotik muda

-Induksi kalus: Basal Medium 72 (Sri Langka) + 2,4-D 24 uM + 2.5 g/l

-Regenerasi tanaman: 1. 2,4-D 8 uM+ BAP 2-10 uM

2. * Diferensiasi kalus : BM 72+agar 8 g/l+sukrosa 60 g/l+arang aktif 2.5 g/l+ABA 2.5-5 uM * Perkecambahan:

Media Y3+2,4-D 0.1 uM+BAP 5 uM+agar 8 g/l+ arang aktif 2.5 g/l

-Penambahan 2.5-5 uM ABA meningkatkan produksi embrio somatik -Penambahan ABA menunjukkan pembentukan tunas yang normal dan planlet yang lengkap

Fernando & Gamage (2000)

Embriogenesis somatik adalah proses regenerasi yang melalui beberapa tahap. Pada tanaman kelapa sedikitnya ada empat tahap, yaitu:

Inisiasi kalus embriogenik. Ada dua faktor yang sangat berpengaruh pada pembentukan kalus embriogenik pada tanaman kelapa. Pertama adalah sel yang berkompeten menjadi kalus embriogenik pada tanaman kelapa sangat

19

terbatas. Tiga macam eksplan yang biasa digunakan untuk induksi kalus, yaitu: infloresens muda, embrio sigotik, dan plumula (Cueto et al. 1994; Buffard-Morel et al. 1995; Samosir et al. 1998; Chan et al. 1998). Faktor ke dua adalah auksin mutlak dibutuhkan untuk induksi kalus embriogenik tanaman kelapa. Umumnya dari golongan auksin sintetik yang kuat seperti 2,4-D. Konsentrasi 2,4-D sebanyak 250 uM dibutuhkan untuk menginduksi kalus dari eksplan meristem bunga yang muda (infloresens muda) (Verdeil et al. 2001). Eksplan plumula membutuhkan 2,4-D 100 uM untuk membentuk kalus (Chan et al. 1998), sedangkan eksplan embrio sigotik konsentrasi yang dibutuhkan sebesar 125 uM (Samosir et al. 1998).

Proliferasi kalus embriogenik. Untuk multiplikasi kalus embriogenik, kalus disubkultur 3- 4 kali pada media yang mengandung 2,4-D dengan konsentrasi sama seperti pada saat inisiasi kalus (Cueto et al. 1994), atau kalus dipelihara dengan mengurangi konsentrasi 2,4-D pada setiap subkultur yang dilakukan 4 minggu sekali (Buffard-Morel et al. 1995).

Induksi dan pematangan embrio somatik. Sejumlah peneliti berpendapat bahwa faktor yang menentukan untuk menginduksi embriogenesis somatik kelapa adalah mengurangi level konsentrasi 2,4-D pada saat yang tepat (Buffard-Morel et al. 1995), karena ada kalanya proembrio sudah terbentuk pada waktu kalus dipelihara pada media dengan 2,4-D tinggi dan pematangan embrio dicapai saat level 2,4-D dikurangi secara gradual pada media yang ditambah BAP (Verdeil et al. 1994). Pengurangan 2,4-D yang terlalu cepat mengakibatkan proses pematangan embrio yang tidak sempurna dan menimbulkan bentuk-bentuk yang menyimpang. Untuk meningkatkan produksi embrio somatik, Adkins et al. (1998) menambahkan poliamina (putrescine 7.5 mM dan spermine 1 uM). Sementara Fernando & Gamage (2000) menambahkan ABA 2.5-5.0 uM untuk meningkatkan jumlah embrio somatik dan planlet lengkap. Samosir et al. (1998) menemukan bahwa cahaya menghambat produksi embrio somatik kelapa dan sedikit berpengaruh pada pematangan embrio, namun dibutuhkan pada saat regenerasi planlet dari embrio somatik.

Konversi tanaman. Konversi embrio kelapa menjadi tunas atau planlet umumnya dilakukan pada media tanpa auksin. Walaupun demikian, beberapa

20

peneliti melakukan konversi embrio menjadi planlet pada media mengandung 2,4-D sangat rendah yang dikombinasikan dengan BAP (50 uM) di bawah kondisi yang bercahaya (Chan et al. 1998).

Penanda Molekuler

Penanda molekuler belakangan ini telah digunakan secara luas untuk menganalisis variasi sekuen DNA di dalam dan antar spesies tanaman. Penanda molekuler diidentifikasi sebagai fragmen DNA yang pendek yang berada pada posisi tertentu di dalam kromosom dan dapat mendeteksi perbedaan sekuen pada posisi fragmen tersebut antara berbagai spesies atau galur tanaman. Penanda molekuler didasarkan pada keragaman yang terjadi pada sekuen DNA hasil dari mutasi titik, delesi atau insersi, atau adanya variasi pada jumlah copy dari fragmen DNA berulang. Keragaman genetik di dalam atau antar spesies atau organisme dideteksi sebagai polimorfisme (Patwary 2004).

Pada saat ini telah dikembangkan sistem pendeteksi marker untuk mengidentifikasi penanda yang terkait dengan sifat tertentu, baik melalui genome wide marker maupun dengan gene specific marker. Genome wide marker dikembangkan menggunakan teknik seperti RAPD, AFLP, RFLP, SSR. Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) banyak digunakan karena kesederhanaan, mudah dan cepat dalam penerapannya (Tingey et al. 1992). Marker AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) juga tidak sulit untuk dilakukan dan bisa mendeteksi ratusan lokus dalam genom tanaman untuk satu kali analisis. Walaupun demikian belakangan ini banyak digunakan penanda molekuler SSR (Simple Sequence Repeats) atau microsatellite untuk studi keragaman genetik, filogeni, pemetaan genom, dan evolusi. SSR dapat menghasilkan lebih banyak pita polimorfik dan membutuhkan pengetahuan tentang informasi sekuen DNA tentang keberadaan Simple Sequence Repeats dalam genom tanaman (Godwin et al. 1997).

Gene specific marker atau Penanda Molekuler Spesifik merupakan penanda molekuler yang dapat mendeteksi secara spesifik keberadaan gen target yang merupakan penentu sifat terkait pada genom tanaman. Pendekatan dilakukan

PA, Engelmann F, editor. Current State of The Art and Problems with In vitro Culture of Coconut Embryos. Proceedings in Symposium of the First Workshop on Embryo Culture; Albay, 27-31 October 1997. Serdang: IPGRI. hlm 17-28.

Verdeil JL, Hocher V, Huet C, Grosdemange F, Escoute J, Ferriere N, Nicole M. 2001. Ultrastructural changes in coconut calli associated with the acquisition of embryogenic competence. Ann. Bot. 88:9-18.

Wahyuni M. 2000. Bertanam Kelapa Kopyor. Jakarta: Penebar Swadaya.

Warokka JS, Jones P, Dickinson MJ. 2006. Detection of phytoplasmas associated with Kalimantan wilt disease of coconut by the Polymerase Chain Reaction. J. Littri. 12:154-160.

Witjaksono, Litz RE. 1999. Induction and growth characteristics of embryonic avocado cultures. Plant Cell, Tiss. Org. Cult. 58: 19-29.

Witjaksono. 2003. Organogenesis and Somatic Embryogenesis: Recent Advances. Chapter 2, Agricultural Biotechnology: Principle and Practice. hlm 15-31. Zhu A, Goldstein J. 1994. Cloning and functional expression of a cDNA

encoding Coffee bean -Galactosidase. Gene. 140:227-231.

Zouine J, El Hadrami I. 2007. Effect of 2,4-D, Glutamine and BAP on embriogenesis suspension culture of date palm (Phoenix dactylifera L.). Scientia Hort. 112:221-226.

Lampiran 1. Komposisi media Eeuwens yang digunakan sebagai media dasar pada pembiakan in vitro kelapa kopyor

Komponen Kimia Dosis (mg/l)

Macronutrients:

NH4Cl

KNO3

MgSO4.7H2O

CaCl2.2H2O

KCl

NaH2PO4.2H2O

535 2020 247 294 1492 312 Micronutrients: KI H3BO3

MnSO4.7H2O

ZnSO4.7H2O

CuSO4.5H2O

CoCl2.6H2O

NaMoO4. H2O

NiCl.6H2O

8.3 3.1 11.2 7.2 0.25 0.24 0.24 0.024 Iron Source:

Fe2SO4.7H2O

Na2EDTA

41.7 55.8 Vitamin Source: Pryridoxine HCl Thiamine HCl Nicotinic Acid Biotin Folic Acid Glycine 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 1.00 Agar Activated charcoal Sucrose pH 7000 2500 60000 5.6

Lampiran 2. Nama dan kode asam amino serta urutan kodon yang digunakan untuk menterjemahkan runutan nukleotida DNA kelapa berbuah kopyor

Stop Kodon TAA, TAG, TGA Sumber: Henry (1997)

Nama Asam Amino Singkatan Kode Kodon

Alanine Ala A GCT, GCC, GCA, GCG

Arginine Arg R CGT, CGC, CGA, CGG,

AGA, AGG

Asparagine Asn N AAT, AAC

Aspartic acid Asp D GAT, GAC

Cysteine Cys C TGT, TGC

Glutamine Gln Q CAA, CAG

Glutamic acid Glu E GAA, GAG

Glycine Gly G GGT, GGC, GGA, GGG

Histidine His H CAT, CAC

Isoleucine Ile I ATT, ATC, ATA

Leucine Leu L TTA, TTG, CTT, CTC,

CTA, CTG

Lysine Lys K AAA, AAG

Methionine Met M ATG

Phenylalanine Phe F TTT

Proline Pro P CCT, CCC, CCA, CCG

Serine Ser S TTC, TCT, TCC, TCA,

TCG, AGT, AGC

Threonine Thr T ACT, ACC, ACA, ACG

Tryptophan Trp T TGG

Tyrosine Tyr Y TAT, TAC

Lampiran 3. Kode untuk nukleotida degenerate yang digunakan untuk merancang primer degenerate pada gen-gen yang berkaitan dengan sifat kopyor pada tanaman kelapa

Sumber: Henry (1997)

No. Kode Nukleotida

1. R A,G

2. Y C,T

3. M A,C

4. K G,T

5. S G,C

6. W A,T

7. H A,T,C

8. B G,T,C

9. V G,A,C

10. D G,A,T

Lampiran 4 Registrasi dan No. Pendaftaran Hak Paten Kelapa Kopyor dengan Invensi: Metode Pembiakan Klonal Kelapa Kopyor Melalui Embriogenesis Somatik

Lampiran 5. Registrasi dan No. Pendaftaran Hak Paten Kelapa Kopyor dengan Invensi: Deteksi Dini Kelapa Berbuah Kopyor Menggunakan Penanda Molekuler Spesifik Gen -D Galaktosidase