bahwa air bebas dalam bahan berada dalam jumlah yang rendah, sehingga proses pembusukan, hidrolisis komponen aktif dan oksidasi
dalam sampel selama dilakukan maserasi dapat dihindari Winarno, 2008.
Bintang laut yang telah kering kemudian dihaluskan dengan hammer mills, sehingga didapat tekstur yang halus. Ukuran sampel yang lebih
kecil bubuk atau tepung diharapkan dapat memperluas permukaan bahan yang dapat berkontak langsung dengan pelarut, sehingga proses
ekstraksi komponen aktif dapat berjalan dengan maksimal. Bubuk atau tepung bintang laut akan digunakan dalam proses ekstraksi
Nurulita, 2012
1.5.1 Sterilisasi Alat
Seluruh alat yang digunakan pada penelitian ini dicuci bersih, kemudian disterilisasi di dalam autoclave selama 15 menit pada suhu
121
o
C dengan tekanan 1,5 atm.
3.5.2 Pembuatan Ekstrak Bintang Laut
Metode ekstraksi yang digunakan adalah metode ekstraksi bertingkat. Metode ini menggunakan pelarut heksana p.a, etil asetat p.a, dan
metanol p.a. Masing –masing sampel sebanyak 50 g dimaserasi
selama 24 jam dengan pelarut secara bertingkat heksana, etil asetat, metanol dengan perbandingan 1:3 bv atau grml, kemudian disaring
dengan kertas saring Whatman 42. Filtrat ekstrak pelarut masing- masing yang diperoleh kemudian dievaporasi sehingga semua pelarut
terpisah dari ekstrak menggunakan rotary vacuum evaporator pada temperatur 50ºC dan tekanan 500 mmHg. Residu yang tersisa
selanjutnya digunakan untuk proses ekstraksi selanjutnya. Proses ini akan menghasilkan ekstrak metanol yang kental dengan kadar 100
setara dengan larutan konsentrasi 10
6
ppm. Pada penelitian ini digunakan konsentrasi dengan besaran parts per million ppm. Parts
per million merupakan istilah kimia yang digunakan untuk mendeskripsikan konsentrasi yang sangat kecil dari sebuah larutan.
Konsentrasi yang digunakan merujuk pada penelitian Juariah 2014 sebesar 16000 ppm, 8000 ppm, 4000 ppm, 2000 ppm, dan 1000 ppm.
Untuk membuat berbagai konsentrasi yang diperlukan dapat digunakan rumus :
M = 10
6
x
Keterangan: M
= Konsentrasi hasil pengenceran ppm V
ekstrak
= Volume awal ekstrak yang akan di encerkan ml V
ekstrak + pelarut
= Volume akhir hasil pengenceran ml
3.5.3 Identifikasi Bakteri Uji
Identifikasi bakteri dilakukan dengan pewarnaan Gram dan tes-tes biokimiawi, diantaranya adalah sebagai berikut:
1. Pewarnaan Gram
Dari bahan pemeriksaan akan dibuat sediaan dari bahan kaca objek glass, lalu di warnai dengan prinsip pewarnaan Gram, dan diamati
di bawah mikroskop. Bakteri Gram positif akan terlihat dengan
