MEKANISME AKTIVITAS ANTIBAKTERI MINYAK ATSIRI TEMU KUNCI Kaempferia pandurata Roxb

14

3. MEKANISME AKTIVITAS ANTIBAKTERI MINYAK ATSIRI TEMU KUNCI Kaempferia pandurata Roxb

PENDAHULUAN Mekanisme kerja antibakteri minyak atsiri secara tidak langsung dapat dianalisis berdasarkan material-material yang keluar dari membran dinding sel bakteri. Interaksi senyawa antibakteri tersebut dapat menyebabkan sejumlah perubahan atau kerusakan sel bakteri yang akhirnya dapat mempengaruhi fungsi metabolisme sel, bahkan pada kerusakan yang parah dapat menimbulkan kematian sel bakteri. Fenomena kerusakan bakteri uji oleh pengaruh minyak atsiri temu kunci dapat dianalisis melalui kebocoran ion dan material organik dari sel tersebut. Kebocoran ion dari bakteri uji dapat diamati dengan terdeteksinya ion K + dan ion Ca +2 pada supernatan. Kebocoran asam nukleat dapat diamati dari terdeteksinya protein asam amino dan asam nukleat RNA dan DNA Hada et al. 2004; Oladunmoye et al. 2006; Helal et al. 2007. Kerusakan sel oleh senyawa antibakteri maupun pengaruh perlakuan fisik telah diamati oleh beberapa peneliti sebelumnya dengan menggunakan SEM, diantaranya Ritz et al. 2001 oleh pengaruh tekanan hidrostatik, Shi et al. 2003 oleh pengaruh suhu, Mangoni et al. 2004 oleh antibakteri peptida temporin dan Rasooli et al. 2006 oleh minyak atsiri time. Hasil penelitian tersebut umumnya melaporkan bahwa kerusakan sel diawali dengan rusaknya membran sel yang berlanjut dengan keluarnya material isi sel dan akhirnya sel mengalami kematian. Menurut Park et al. 2003, komponen sel yang bocor dapat diukur pada panjang gelombang 260 nm seperti DNA purin, pirimidin ribonukleotida, sedangkan pada panjang gelombang 280 nm dapat mengukur tirosin dan triptofan komponen protein. Potensi aktivitas antibakteri minyak atsiri temu kunci telah dibuktikan sebelumnya. Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis mekanisme aktivitas antibakteri minyak atsiri temu kunci Kaempferia pandurata Roxb terhadap empat bakteri uji yang mewakili bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Pengamatan untuk melihat mekanisme aktivitas antibakteri meliputi pengamatan kebocoran protein dan asam nukleat, kebocoran ion K + dan Ca +2 serta perubahan morfologi sel bakteri uji setelah diinkubasi dengan minyak atsiri temu kunci. BAHAN DAN METODE PENELITIAN Bahan Penelitian Bahan baku yang digunakan adalah rimpang temu kunci Kaempferia pandurata Roxb yang berasal dari Imogiri Yogyakarta yang mendapat pengesahan determinasi jenis tanaman dari LIPI Biologi Bogor. Temu kunci yang digunakan adalah berumur 4 bulan. Kultur mikroba yang digunakan adalah B. cereus FNCC 057, L. monocytogenes FNCC 156 dan P. aeruginosa FNCC 063 dalam bentuk liofilisasinya dari PAU UGM serta EPEC E. coli K1.1 dalam sediaan media agar padat dari PAU IPB koleksi Dr Sribudiarti. 15 Metodologi Penelitian Analisis Kebocoran Protein dan Asam Nukleat Carson et al. 2002 Suspensi bakteri uji yang telah ditumbuhkan selama 24 jam dalam media nutrien broth diambil sebanyak 10 mL, ditambah tween 80 0.15, disentrifus dengan kecepatan 3500 rpm selama 20 menit. Filtrat dibuang lalu pelet dalam tabung dicuci dengan buffer fosfat pH 7.0 sebanyak 2 kali, kemudian disuspensikan kembali didalam 10 mL buffer fosfat pH 7.0 dan divortex. Selanjutnya ditambahkan minyak atsiri temu kunci dengan dosis 1MIC, 2MIC dan kontrol kepada endapan hasil vortex, dan diinkubasi dalam inkubator goyang selama 24 jam suhu 37 o C untuk bakteri B. cereus, E. coli K1.1 dan B. cereus serta suhu 29 o C suhu ruang untuk L. monocytogenes. Suspensi disentrifus dengan kecepatan 3500 rpm selama 15 menit, lalu disaring mengunakan membran filter 0.2 m dengan tujuan untuk memisahkan supernatan dari sel. Cairan supernatan diambil dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 260 nm untuk penentuan asam nukleat dan 280 nm untuk penentuan protein dengan menggunakan spektrofotometer UV. Kebocoran Ion-Ion Logam Cox et al. 2000 Untuk analisis kebocoran ion-ion diukur dalam bentuk ion Ca +2 dan K + yang keluar dari membran sel bakteri akibat perlakuan dengan minyak atsiri temu kunci. Analisis kebocoran ion dilakukan pada pelet bakteri yang dipersiapkan seperti pada pengukuran kebocoran protein dan asam nukleat. Kebocoran dinyatakan dengan terukurnya ion–ion logam yang terdapat pada bakteri uji setelah dikontakkan dengan minyak atsiri temu kunci pada dosis 1MIC dan 2MIC untuk masing-masing bakteri 1 MIC B. cereus 0.12 vv, 1 MIC E. coli K1.1 0.11, 1 MIC P. aeruginosa 0.16 vv, 1 MIC L. monocytogenes 0.009 vv. Kebocoran ion-ion K + dan Ca +2 dideteksi dengan menggunakan AAS Atomic Absorption Spectrophotometer. Larutan sel hasil kontak dengan minyak atsiri temu kunci diambil untuk diukur kandungan logamnya. Analisis Perubahan Morfologi Sel dengan Scanning Electron Microscopy SEM Mangoni et al. 2004 Suspensi sel dimasukkan dalam 0.10 buffer fosfat yang mengandung 0.15 tween 80. Suspensi tersebut diberi perlakuan 1MIC dan 2MIC minyak atsiri dan diinkubasi selama 24 jam pada shaker 150 rpm suhu 37 C untuk semua bakteri, kecuali untuk L. monocytogenes pada suhu kamar 29 o C. Kontrol suspensi sel dalam buffer fosfat yang mengandung tween 80 tidak diberi minyak atsiri. Pelet difiksasi dengan glutaraldehid 2 selama 2 jam, lalu ditambah buffer cocodilate 0.2M pH 7.2 selama 20 menit. Selanjutnya ditambah osmium tetraoksida 1 dalam buffer cocodilate, disimpan dalam lemari es 4 o C selama 1 jam. Selanjutnya dikeringkan berturut-turut dengan alkohol 70 vv, alkohol 80 vv, dan alkohol 96 vv masing-masing selama 10 menit. Pelet sel bakteri ditambah 10 mL butanol, dan dibuat suspensi. Satu ose suspensi diletakkan diatas potongan bujur sangkar penutup kaca cover slip yang telah 16 0 .1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 0M IC 1M IC 2 M IC Ko ns ent r as i M i ny ak A t s i r i T K P.aeruginose L.mo nocyt ogenes E.coli K1.1 B .cereus 0.1 0 .2 0 .3 0 .4 0.5 0 .6 0.7 0 .8 0 .9 0M IC 1M IC 2M IC Ko ns ent r as i M i ny ak A t s i r i T K P.aer uginose L.monoc y t ogenes E.c oli K1.1 B.c er eus direkatkan pada stub alumunium dan dibekukan, kemudian dikeringkan dengan freeze drier selama 4 jam. Suspensi yang telah mengering di atas cover slip dilapisi dengan osmium tetraoksida melalui proses vakum 6-7 Pa selama 20 menit dan diamati dengan scanning electron microscopy SEM JEOL 6300. HASIL DAN PEMBAHASAN Kebocoran Material Organik Bakteri Uji oleh Minyak Atsiri Temu Kunci Hasil analisis kebocoran material organik sel yaitu protein dan asam nukleat dapat dilihat pada gambar 3.1 dan 3.2. Gambar 3.1 Pengaruh minyak atsiri temu kunci terhadap kebocoran protein bakteri uji. Gambar 3.2 Pengaruh minyak atsiri temu kunci terhadap kebocoran asam nukleat bakteri uji. Hasil pengamatan menunjukkan bahwa dengan meningkatnya dosis MIC, nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 maupun pada panjang gelombang 280 nm semakin meningkat pula. Peningkatan nilai absorbansi ini menunjukkan peningkatan jumlah senyawa yang dikeluarkan oleh sel bakteri, yang berarti minyak atsiri temu kunci dapat merusak membran sel dalam aktivitasnya sebagai antibakteri. Senyawa-senyawa yang dapat diserap pada panjang gelombang 260 nm adalah RNA dan turunan RNA yaitu nukleotida, sedangkan yang terdeteksi pada panjang gelombang 280 nm adalah protein menunjukkan bahwa spektrofotometer pada panjang gelombang 260 nm dapat mendeteksi purin, pirimidin dan ribonukleotida sedangkan pada 280 nm dapat mendeteksi tirosin dan triptofan yang terdapat pada protein. Meningkatnya jumlah kandungan sel yang ditemukan pada permukaan luar sel menandakan terjadinya kerusakan membran sel atau perubahan permeabilitas membran sel Burt. 2004. Fenomena yang sama juga dihasilkan oleh penelitian Lin et al. 2000 menggunakan 17 10 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 0 M IC 1M IC 2M IC K o n se n t r a si M i n y a k A t si r i T K B .cereus E.coli K1.1 L.monocyt ogenes P.aeruginosa 10 20 30 40 50 60 70 0M IC 1M IC 2M IC Ko nsent r asi M i nyak A t si r i T K B .cereus E.coli K1.1 L.monocyt ogenes P.aeruginosa senyawa alami alil isotiosianat, yang menyatakan manifestasi kerusakan membran didemonstrasikan dengan kebocoran kandungan intraseluler sel ke lingkungan luar yang dapat diukur dengan lepasnya bahan-bahan yang dapat menyerap pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Baik pada kebocoran asam nukleat maupun protein, peningkatan dosis MIC minyak atsiri temu kunci dapat membocorkan sel L. monocytogenes lebih banyak dari pada sel E. coli, P. aeruginosa dan B. cereus. Pada konsentrasi 2MIC L. monocytogenes telah menunjukkan absorbansi kebocoran sebesar 0.84 sedangkan E. coli 0.77, P. aeruginosa 0.66 dan B. cereus 0.72. Minyak atsiri dari tea tree oil dari daun Melaleuca alternifolia juga dapat menyebabkan kebocoran senyawa-senyawa intraseluler yang dapat diserap dengan sinar UV pada panjang gelombang 260 dan 280 nm dari sel Staphylococcus aureus Carson et al. 2002. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa pola aktivitas minyak atsiri temu kunci dalam merusak nmembran sel serupa dengan pola aktivitas tea tree oil. Komponen molekul minyak atsiri yang sama dengan komponen molekul tea tree oil adalah 1,8 sineol; alfa terpinen, beta terpinen, simen; pinen dan sabinen. Kebocoran Ion Bakteri Uji oleh Minyak Atsiri Temu Kunci Pada Gambar 3.3 dapat dilihat peningkatan ion-ion K + yang dilepaskan oleh sel bakteri E. coli K1.1 dan P. aeruginosa lebih sedikit bila dibandingkan ion K + yang dilepaskan L. monocytogenes. Gambar 3.3 Pengaruh dosis MIC minyak atsiri temu kunci terhadap kebocoran ion K + bakteri uji. Gambar 3.4 Pengaruh dosis MIC minyak atsiri temu kunci terhadap kebocoran ion Ca +2 bakteri uji. Kebocoran ion dari B. cereus hampir sama dengan yang ditunjukkan oleh E. coli K1.1 dan P. aeruginosa pada dosis 1MIC. L. monocytogenes yang 18 diperlakukan dengan dosis 1MIC sudah terjadi peningkatan ion K + sebanyak 16.25 sementara pada B. cereus peningkatan ion K + adalah 10.32 , E. coli K1.1 9.39 dan P. aeruginosa hanya 8.45 . Hal ini menunjukkan bahwa membran sel L. monocytogenes lebih sensitif terhadap minyak atsiri temu kunci dibanding membran E. coli K1.1, B. cereus dan P. aeruginosa. Lipopolisakarida LPS mengandung ion-ion anorganik Na + , K + , dan Ca +2 Nikaido et al. 2003. Ion-ion ini membantu ketegaran senyawa penyusun auto membran sel, dengan cara interaksi elektrostatik. Adanya kation logam dalam LPS, mempermudah kelarutan LPS larut air, fenomena ini dapat dideteksi bila LPS dilarutkan dalam amina sebagai penetralisir. Ion Ca +2 dan Mg +2 pada bakteri gram positif berperan dalam menghubungkan asam teikoat dengan peptidoglikan penyusun sel Madigan. 1992. Pada Gambar 5.5 mekanisme peningkatan ion-ion Ca +2 yang dibebaskan oleh sel E. coli, P. aeruginosa dan B. cereus menunjukkan bahwa dibutuhkan konsentrasi minyak atsiri yang lebih tinggi dari L. monocytogenes p0.05, artinya dinding sel E. coli, P. aeruginosa dan B. cereus lebih tahan terhadap serangan senyawa-senyawa minyak atsiri temu kunci. Fenomena ini sesuai dengan data perubahan morfologi yang menunjukkan sedikitnya perubahan pada sel P. aeruginosa. Kurang sensitifnya E. coli K1.1 dan P. aeruginosa terhadap minyak atsiri temu kunci disebabkan karena sifat hidrofilik yang dimiliki membran sel gram negatif. Sedangkan minyak atsiri temu kunci bersifat hidrofobik tidak larut air. Kontradiksi sifat ini membuat E. coli K1.1 dan P. aeruginosa kurang sensitif terhadap minyak atsiri temu kunci. Dari pola kebocoran ion-ion Ca +2 dan K + menunjukkan bahwa minyak atsiri temu kunci bekerja baik pada membran sel L. monocytogenes yang dapat dilihat pada kebocoran ion K + dan Ca +2 yang lebih besar dibandingkan dari pada sel B. cereus, E. coli dan P. aeruginosa. Pada bakteri L. monocytogenes, jumlah ion Ca +2 meningkat secara tajam, sementara ion K + jauh lebih lambat, hal ini menunjukkan bahwa minyak atsiri temu kunci bekerja pada dinding sel terlebih dahulu, kemudian setelah itu membuat membran bocor. Efek toksik minyak atsiri pada fungsi dan struktur membran sel umumnya disebabkan oleh komponen monoterpennya Andrews et al. 1980; Uribe et al. 1985; Sikkema et al. 1995. Sifat lipopilik monoterpen siklik membuatnya mudah bertransfer dari fasa air ke fasa membran. Hal ini menyebabkan terjadinya ekspansi membran, fluiditas membran meningkat, dan terjadi gangguan terhadap enzim yang terikat pada membran. Minyak tea tree oil yang mengandung alfa pinen, dan beta pinen, juga menyebabkan rusaknya integritas membran, merusak mitokondria, menghambat respirasi sel, menghambat proses transpor ion, dan meningkatkan permeabilitas membran Andrews et al. 1980; Uribe et al. 1985. Helander et al. 1999 juga telah meneliti bahwa berbagai komponen dalam minyak tea tree oil dapat menginduksi kerusakan membran sel, yang mengakibatkan sel mati. Penghambatan respirasi, dan kerusakan membran merupakan faktor utama menyebabkan luasnya spektrum penghambatan dari minyak tea tree oil. Sifat ini dipengaruhi oleh faktor kecepatan senyawa aktif berdifusi melalui dinding sel dan ke daerah fospolifid dari struktur membran, mengubah permeabilitas membran, dan menyebabkan kebocoran material intraseluler. Bakteri gram negatif mempunyai dinding sel yang lebih bersifat hidrofilik karena pada dinding selnya terdapat senyawa lipopolisakarida bersifat polar. 19 E. coli mempunyai ketahanan yang lebih tinggi dibanding B. cereus dan L. monocytogenes. Hal ini disebabkan karena semua protein utama penyusun dinding sel adalah protein asam, dan pada permukaan dinding terdapat polisakarida asam dalam jumlah nyata yang berguna untuk mempertahankan sel dari serangan zat antibakteri Nikaido Vaara 1985. Perbedaan struktur, sifat dan komposisi kimia dinding dan membran sel menyebabkan perbedaan mekanisme inaktivasi sel. Mekanisme inaktivasi sel bakteri oleh senyawa antibakteri dapat dipelajari dari perubahan-perubahan bentuk sel akibat kerja senyawa antibakteri. Perubahan Morfologi Sel Bakteri oleh Minyak Atsiri Temu Kunci Kerusakan sel bakteri merupakan hasil interaksi senyawa antibakteri dengan bagian tertentu pada sel bakteri. Interaksi senyawa antibakteri tersebut dapat menyebabkan sejumlah perubahan atau kerusakan pada sel bakteri yang berpengaruh pada mekanisme inaktivasi bakteri. Pada dosis yang tidak mematikan, bakteri mengalami luka injury, terjadi sejumlah perubahan dan kerusakan struktur sel bakteri yang akhirnya dapat mempengaruhi fungsi metabolisme sel, sedangkan pada kerusakan yang parah dapat menyebabkan kematian sel. Perubahan Morfologi B. cereus Setelah Inkubasi dengan Minyak Atsiri Temu Kunci Pengaruh minyak atsiri temu kunci 1MIC dan 2MIC dapat dilihat pada Gambar 5.5. Ukuran sel pada 0MIC kontrol mempunyai diameter 0.70 – 0.90 µ m dan panjang 2.60 - 2.80 µ m. Pada konsentrasi 1MIC sudah ditemukan perubahan morfologi sel dibanding dengan kontrol. Ukuran sel pada konsentrasi 1MIC mempunyai diamater 0.70–0.80 µ m dan panjang 2.00 - 2.20 µ m. a b c Gambar 3.5 Pengaruh MATK terhadap Perubahan morfologi B. cereus a kontrol b dosis 1 MIC c dosis 2 MIC. 20 Sel B. cereus yang diberi perlakuan minyak atsiri temu kunci 1MIC menunjukkan perubahan bentuk sel seperti membengkak pada bagian tengah sel dan lekukan kerusakan pada bagian ujung sel bakteri. Terlihat sekat septum yang tidak sempurna, dan ini menunjukkan proses pembelahan sel perbanyakan sel akan terganggu. Terganggunya pembelahan sel terjadi karena minyak atsiri mengakibatkan kebocoran inti sel sehingga asan nukleat DNA dan RNA serta protein dari B. cereus yang ditunjukkan dengan pengukuran absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Bocornya material genetik ini menyebabkan terganggunya pembelahan sel Kim et al. 1995. Sel B. cereus yang diberi perlakuan 2MIC menunjukkan fenomena sel yang bocor. Sel terlihat seperti kosong dengan bentuk sel yang tidak teratur, terdapat tonjolan pada bagian ujung sel. Secara umum seluruh bentuk sel telah berubah secara signifikan, dimana terbentuk stuktur seperti ghost cell pada dosis tinggi. Pada perlakuan dengan minyak atsiri temu kunci juga membuat bakteri membelah tidak sempurna Gambar 3.5 b dan pada dosis tertinggi membuat bakteri bocor dan kosong Gambar 3.5 c , fenomena ini hampir sama dengan akibat yang ditimbulkan oleh perlakuan eugenol terhadap bakteri Bacillus subtilis Bennis et al. 2004. Perubahan Morfologi E. coli K1.1 Setelah Inkubasi dengan Minyak Atsiri Temu Kunci E. coli K1.1 adalah bakteri Gram negatif berbentuk batang dan tidak berspora, bersifat motil berukuran 1x 3 µ m. Pengaruh minyak atsiri temu kunci terhadap sel ini dapat dilihat pada Gambar 5.6. Sel normal menunjukkan permukaan yang mulus, agak bulat memanjang dengan ukuran lebar 0.40 - 0.60 µ m dan panjang 4.00 - 4.70 µ m. Pada penambahan minyak atsiri temu kunci dengan konsentrasi 1MIC menyebabkan sel memanjang dengan tidak teratur. Bagian tengah sel seakan membengkak dengan tonjolan pada kedua ujungnya. a b c Gambar 3.6 Pengaruh MATK terhadap Perubahan morfologi E. coli K1.1 a Kontrol b dosis 1 MIC c dosis 2MIC. 21 Perubahan permeabilitas dinding sel mengakibatkan cairan sitoplasma merembes keluar sehingga terbentuk ruang antar membran sitoplasma. Hal ini yang menyebabkan sel kelihatan seperti membengkak Gambar 3.6 b. Pembelahan sel terganggu karena septa terbentuk pada ujung sel yang rusak. Seharusnya sel membelah dan membagi dua sel dengan ukuran dan sifat yang sama dengan sel induk. Perlakuan sel bakteri dengan 2MIC minyak atsiri temu kunci mengakibatkan sel berubah morfologi dengan ukuran lebar berkisar 0.70 - 0.90 µ m dan panjang 1.80 - 2.90 µ m. Pada perlakuan dengan konsentrasi ini menyebabkan dinding sel menjadi bergelombang, terbentuk lekukan, dan tonjolan-tonjolan yang tidak simetris. Terbentuknya tonjolan–tonjolan pada dinding sel tersebut disebabkan oleh porositas membran sel meningkat akibat melemahnya dinding sel oleh pengaruh senyawa-senyawa minyak atsiri. Bentuk sel yang aneh dan beragam dari perlakuan 2MIC ini menunjukkan terbentuknya ghost cell, yang tidak mengandung material intraseluler Fass Prior 1974; Mangoni et al. 2004. Menurut Gilbert 1984, terbentuknya tonjolan-tonjolan pada bakteri tersebut disebabkan terganggunya proses biosintesis dinding sel yang umumnya terjadi pada konsentrasi lebih rendah dari dosis penyebab lisis. Pada keadaan ini enzim-enzim biosintesis dinding sel diduga terganggu oleh senyawa antibakteri yang ada dalam minyak atsiri temu kunci. Kontrol sel E. coli mempunyai lebar 0.38 - 0.63 µ m dan panjang 0.17 - 1.96 µ m. Perlakuan dengan 1MIC minyak atsiri temu kunci sel yang teramati rata-rata mempunyai panjang 0.54 - 1.36 m dan lebar 0.71 - 2.07 m. Bakteri yang diberi perlakuan dosis 2MIC rata-rata memiliki panjang 1.82 - 2.96 µ m dengan lebar 0.68 - 0.91 µ m. Terjadinya permukaan yang kasar pada dinding sel pada E. coli K1.1 dan B. cereus disebabkan karena minyak atsiri temu kunci mengganggu sintesis protein tapi tidak mengganggu sintesis peptidoglikan. Pada beberapa bakteri mengalami perubahan dinding sel menjadi kasar bila sintesis protein dihambat dan sintesis dinding sel tetap berlanjut Perubahan Morfologi L. monocytogenes Setelah Inkubasi dengan Minyak Atsiri Temu Kunci Sel L. monocytogenes normal berbentuk batang pendek dengan ukuran diamater berkisar 0.40 - 0.50 µ m dan panjang 0.50 – 2.00 µ m Doyle et al. 2001. Pengamatan morfologi sel dilakukan dengan SEM perbesaran 30.000-60.000 kali. Pengaruh penambahan minyak atsiri temu kunci dengan konsentrasi 1MIC dan 2MIC terhadap sel L. monocytogenes dapat dilihat pada Gambar 3.7. Sel normal berbentuk panjang agak bulat, dengan permukaan yang licin dengan ukuran diameter 0.10 - 0.40 µ m, dan panjang 1.00 - 1.20 µ m. Pada konsentrasi 1MIC ditemukan tonjolan kecil blebs pada permukaan sel. Ukuran diameter sel agak membesar yaitu 0.50 - 0.60 µ m dan memanjang menjadi 1.60 - 2.60 µ m. Ukuran diameter sel lebih besar dari dari sel normal, kemungkinan karena adanya tonjolan pada dinding sel. 22 a b c Gambar 3.7 Pengaruh minyak atsiri TK terhadap Perubahan morfologi L. monocytogenes a kontrol b dosis 1MIC c dosis 2MIC. Bakteri yang tidak diperlakukan dengan minyak atsiri menunjukan permukaan yang terang dan kokoh yang merupakan ciri khas dari bakteri kontrol tanpa adanya kerusakan pada dinding sel. Sebaliknya pada bakteri yang diberi minyak atsiri menunjukkan bentuk yang secara signifikan berubah dari bentuk yang normal menjadi sangat kasar pada permukaan sel bakteri, karena struktur sel menjadi rusak dan munculnya ghost cell dimana sel terlihat transparan, tipis dan kelihatan kosong. Walaupun terjadinya kerusakan berat tetapi lisis bakteri hanya teramati pada L. monocytogenes. Sel L. monocytogenes merupakan bakteri Gram positif, yang memiliki lapisan peptidoglikan yang tebal. Tonjolan dan kerutan ini merupakan tanda terganggunya proses biosintesis dinding sel akibat aktivitas antibakteri minyak atsiri temu kunci. Sel juga menunjukkan pembelahan yang tidak sempurna. Pada konsentrasi 2MIC, sel mengalami perubahan morfologi yang cukup signifikan. Pada perlakuan ini sel juga menunjukkan perubahan menjadi ghost cell. Sel menjadi transparan menyerupai sferoplast. Rasooli et al. 2006 melaporkan bahwa permukaan sel L. monocytogenes yang diinkubasi dengan minyak atsiri time menjadi kasar yang menunjukkan kerusakan pada dinding sel bakteri tersebut dan pada dosis tinggi menyebabkan kebocoran sel. Bennis et al. 2004 juga melaporkan bahwa E. coli yang diinkubasi dengan eugenol juga menyebabkan bakteri tersebut mengalami kerusakan dinding sel. Dalam penelitian ini minyak atsiri temu kunci juga menyebabkan kerusakan pada dinding sel, dimana permukaan sel berubah menjadi kasar, morfologi sel berubah dan sel menjadi kosong pada dosis tinggi ghost cell. Penelitian Shi dan Xia 2003 serta Mangoni et al. 2004 juga menunjukkan fenomena yang sama. Minyak atsiri temu kunci yang digunakan dalam penelitian ini cenderung memberikan efek yang hampir sama dengan sel L. monocytogenes yang diperlakukan dengan nisin. L. monocytogenes kontrol mempunyai lebar sel 0.16 - 0.44 m dan panjang 1.00 - 1.22 m. L. monocytogenes yang diberi perlakuan 1MIC memiliki lebar 0.47 - 0.60 m dan panjang 1.57 - 2.57 m. Sedangkan 23 L. monocytogenes yang diberi perlakuan 2MIC mempunyai panjang 1.57 - 1.67 m dan lebar 0.44 - 0.74 m. Menurut Gemme dan Lorin 1996 pada konsentrasi antibiotik mendekati MIC, menyebabkan lisis terjadi pada bagian sel yang terdapat tonjolan di mana cairan sitoplasma akan keluar dan pada konsentrasi diatas 1MIC, filamen berhenti tumbuh dan terjadi lisis. Hal yang serupa juga ditemukan oleh Ultee et al. 2002 dan Sikkema 1994 yang mengamati efek senyawa-senyawa penyusun minyak atsiri terhadap sel bakteri. Senyawa hidrofilik dan hidrofobik dalam minyak atsiri dapat menyebabkan pembengkakan sel karena adanya akumulasi dari senyawa antibakteri dan diikuti kobocoran dan kematian sel. Perubahan Morfologi P. aeruginosa Setelah Inkubasi dengan Minyak Atsiri Temu Kunci Sel P. aeruginosa berbentuk batang dengan ukuran berkisar 0.50-0.70 x 1.00- 3.00 µ m Robinson 2000. Pengaruh penambahan minyak atsiri temu kunci 1MIC dan 2MIC terhadap sel P. aeruginosa dapat dilihat pada Gambar 3.8. Pada konsentrasi 1MIC, morfologi sel berubah menjadi tidak simetris. Sel memanjang dan membesar pada salah satu ujung dan permukaan sel menjadi kasar dan tidak rata. Hal ini mungkin disebabkan karena terganggunya enzim- enzim pembentuk dinding sel. Perpanjangan dan menjadi kasarnya permukaan sel oleh senyawa antibakteri seperti ini banyak ditemukan pada perlakuan senyawa antibakteri pada dosis MIC Rasooli 2006; Gilbert 1984; Gammel Lorin 1996. a b c Gambar 3.8 Pengaruh minyak atsiriTK terhadap Perubahan morfologi P.aeruginosa a kontrol b dosis 1 MIC c dosis 2 MIC. 24 Semakin tinggi dosis MIC minyak atsiri yang diinkubasikan dengan sel bakteri, sel menjadi semakin mengecil dengan tidak simetris. Pada perlakuan 2 MIC panjang sel menjadi 1.2 m dengan lebar 0.33 m dibanding dengan hasil perlakuan 1MIC yang mempunyai panjang 2 m dan lebar 0.72 m. Hal ini kemungkinan disebabkan rusaknya aktivitas enzim-enzim, serta proses pembentukan ATP yang berperan dalam pertumbuhan sel Rasooli et al. 2006. Pada kontrol tanpa perlakuan dengan minyak atsiri tidak menunjukkan adanya lekukan-lekukan seperti pada perlakuan dengan dosis 1MIC dan 2MIC, hal ini kemungkinan menunjukkan bahwa proses pembelahan telah selesai terjadi. Semakin banyak lekukan menunjukkan bahwa pertahanan sel menurun oleh peningkatan dosis minyak atsiri temu kunci. Secara umum seluruh bentuk sel telah berubah secara signifikan, dimana terbentuk stuktur seperti ghost cell pada dosis tinggi. Pada perlakuan dengan minyak atsiri temu kunci juga membuat bakteri membelah tidak sempurna Gambar 3.5 b, 3.6 b dan 3.7 b dan pada dosis tertingi membuat bakteri kosong Gambar 3.5 c dan 3.7 c. Fenomena ini hampir sama dengan akibat yang ditimbulkan oleh perlakuan bakteri Bacillus subtilis dengan eugenol Bennis et al. 2004 serta perlakuan Escherichia coli dengan peptida temporin L 2004. SIMPULAN Mekanisme aktivitas antibakteri minyak atsiri temu kunci dapat ditentukan berdasarkan kebocoran ion, asam nukleat dan protein dari sel bakteri, dimana tingkat kebocoran akan dipengaruhi oleh dosis MIC. Nilai absorbansi kebocoran asam nukleat dan protein berkisar antara 0.38 - 0.83, dan kebocoran ion K + dan ion Ca +2 berkisar antara 8.46 - 52.63. Kerusakan yang terjadi pada bakteri B. cereus, E. coli K1.1, L. monocytogenes umumnya mengalami perubahan dinding sel dan morfologi sel yang sangat signifikan. Kerusakan pada P. aeruginosa teramati hanya pada ukuran sel. Semakin tinggi dosis MIC, maka kebocoran dan kerusakan yang terjadi juga semakin besar. Pusat aksi minyak atsiri temu kunci adalah pada dinding sel bakteri, baik pada membran luar maupun membran dalam bakteri. Terganggunya permeabilitas dinding sel serta terganggunya komponen dan reaksi-reaksi penting di dinding sel merupakan kunci sifat toksik minyak atsiri temu kunci terhadap bakteri patogen dan pembusuk makanan yang diujikan dalam penelitian ini. 25

4. AKTIVITAS ANTIBAKTERI DAN SIFAT FISIK FILM PATI SAGU YANG MENGANDUNG MINYAK ATSIRI TEMU