xxiv
3.5.1 Pemberian EM4
®
Persiapan hewan coba dengan mengadaptasikan tikus pada kandang percobaan selama 7 hari dan dilanjutkan dengan adaptasi pengenalan sonde dengan diberikan
aquadest selama 7 hari. Effective Microorganism-4 diberikan secara per oral satu kali setiap hari selama 28 hari. Dosis bertingkat yang diberikan sebagai berikut: kelompok
kontrol = tanpa pemberian EM4
®
tetapi diberikan 1 ml aquadest per ekor, kelompok EM4A = diberikan dosis 0,25 ml EM4
®
per ekor, kelompok EM4B = diberikan dosis 0,5 ml EM4
®
per ekor, kelompok EM4C = diberikan dosis 1 ml EM4
®
per ekor, kelompok EM4D = diberikan dosis 2 ml EM4
®
per ekor. Pakan diberikan pagi dan sore hari, 10 gram per ekor tikus setiap pemberian dan air minum diberikan ad libitum.
3.5.2 Pengambilan Sampel
Sebelum dilakukan nekropsi sesuai metode Hussein 2008, tikus terlebih dahulu dieuthanasia dengan menggunakan ether di dalam box plastik. Nekropsi dilakukan
sesuai prosedur nekropsi pada mamalia. Setelah dilakukan nekropsi selanjutnya organ usus, hati dan ginjal diambil dan dimasukkan ke dalam pot plastik yang telah berisi
buffer formalin 10, selanjutnya dibuat preparat histopatologi dengan pewarnaan HE metode Harris Humason, 1972.
3.5.3 Pembuatan preparat histopatologi
Proses pembuatan preparat histopatologi dengan tahap tissue processing sesuai metode Humason 1972. Sampel usus, hati dan ginjal yang telah direndam di dalam
Neutral Buffered Formalin NBF 10 dipindahkan direndam secara bertingkat ke dalam alkohol 70 selama 2 jam, alkohol 80 I selama 1 jam, alkohol 80 II selama
xxv
1 jam, alkohol 90 selama 2 jam dan alkohol 96 selama 2 jam. Kemudian dilanjutkan tahap clearing dengan merendam organ ke dalam alkohol absolute I dan absolute II
masing-masing selama 2 jam. Tahap selanjutnya sampel organ tersebut dimasukkan ke dalam paraffin I dan paraffin II masing-masing selama 2 jam dicetak menggunakan
sepasang plat “L”. Perendaman paraffin digunakan sebagai zat penunjang untuk mempermudah pekerjaan pada saat pemotongan jaringan menggunakan mikrotom
dengan ketebalan 4-5 µm. Prosedur pewarnaan Harris Hematoxylin dan Eosin adalah sebagai berikut :
sampel organ yang telah menjalani Tissue Processing dan dipotong, dimasukkan ke dalam xylol I, II, dan III masing-masing selama 5 menit bertujuan untuk melarutkan
paraffin yang masih ada di dalam jaringan deparafinisasi. Dilanjutkan dengan perendaman secara berurutan ke dalam alkohol 100 sebanyak 2 kali masing-masing
selama 5 menit, aquades selama 1 menit dan zat warna Harris-Hematoxylin selama 15 menit. Proses berikutnya dimasukkan ke dalam aquades selama 1 menit digerakkan
naik turun bertujuan untuk pencucian zat warna, alkohol 1 sebanyak 7-10 celupan untuk melarutkan Hematoxylin yang ada di luar inti sel, aquades I selama 1 menit untuk
menghentikan reaksi acid alcohol, aquades II selama1 menit untuk mengembalikan warna biru pada inti sel. Selanjutnya dimasukkan ke dalam alkohol 96 I, II dan
alkohol 100 I,II masing-masing selama 3 menit untuk menarik air dari dalam sel serta ke dalam xylol IV dan V masing-masing selama 5 menit untuk menarik alkohol
dari dalam sel. Terakhir dilakukan penutupan dengan cover glass mounting yang direkatkan dengan entellan. Preparat histologi yang sudah jadi kemudian diperiksa di
bawah mikroskop Humason, 1972.
xxvi
Pemeriksaan preparat histologi dilakukan masing-masing pada 5 lapang pandang mikroskopik, pada pembesaran 10x40. Perubahan histopatologi usus akibat pemberian
EM4
®
diamati berdasarkan ditemukan adanya degenerasi hidrofik, degenerasi melemak dan nekrosis pada usus. Perubahan ini merupakan tanda adanya keracunan intoksikasi.
3.6 Lokasi dan Waktu Penelitian