Konstruksi promotor gen leafy kakao pada vektor ekspresi dengan sistem gateway dan transformasi ke Agrobacterium sp.

vi

KONSTRUKSI PROMOTOR GEN LEAFY KAKAO PADA
VEKTOR EKSPRESI DENGAN SISTEM GATEWAY
DAN TRANSFORMASI KE Agrobacterium sp.

ENDAH RATNA PURI

DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011

vii

ABSTRAK
ENDAH RATNA PURI. Konstruksi Promotor Gen LEAFY Kakao pada Vektor
Ekspresi dengan Sistem Gateway dan Transformasi ke Agrobacterium sp.
Dibimbing oleh LAKSMI AMBARSARI dan TETTY CHAIDAMSARI.
Kakao (Theobroma cacao L.) merupakan salah satu tanaman perkebunan

yang memiliki prospek cerah karena diperkirakan kebutuhan kakao dunia akan
terus meningkat. Peningkatan permintaan kakao tersebut ternyata disertai
permasalahan besar dalam pembudidayaannya, yaitu layu pentil (cherelle wilt)
yang merupakan penyakit fisiologis karena ketidaknormalan gen yang
bertanggung jawab pada proses pembungaan. Salah satu gen yang berperan utama
dalam pembentukan bunga adalah gen LEAFY dan promotor gen LEAFY
diharapkan mengaktifkan kerja gen LEAFY. Penelitian ini bertujuan menyisipkan
tiga ukuran promotor gen LEAFY (1041 pb, 702 pb, dan 349 pb) ke dalam vektor
ekspresi dengan sistem gateway untuk mengetahui ukuran promotor yang efektif
mengekspresikan gen. Promotor gen LEAFY yang berukuran 1041 pb, 702 pb, dan
349 pb terlebih dahulu disisipkan ke dalam vektor donor (pDONRTM221) yang
selanjutnya ke dalam vektor destinasi khusus promotor. Pengujian plasmid
rekombinan setelah transformasi ke dalam Agrobacterium tumefaciens galur
AGL-O menghasilkan pita berukuran sekitar 8002 pb, 7663 pb, dan 7310 pb.
Simpulan dari penelitian ini tiga ukuran promotor gen LEAFY, yaitu 349 pb, 702
pb, dan 1041 pb telah berhasil disisipkan pada vektor ekspresi dengan sistem
gateway dan ditransformasikan ke dalam Agrobacterium tumefaciens galur AGLO sehingga siap ditransfer ke dalam tanaman.

viii

ABSTRACT
ENDAH RATNA PURI. Construction of Cacao LEAFY Gene Promoter in
Expression Vector with Gateway System and Transformation to Agrobacterium
sp. Under the direction of LAKSMI AMBARSARI and TETTY
CHAIDAMSARI.
Cacao (Theobroma cacao L.) is one of the plantations with a good prospect
because the world demand of cocoa is expected to be growing. The increased
demand of cacao is contributed with a major problems related to the cultivation is
cherelle wilt. Cherelle wilt in cocoa is a physiological disease that cause by the
abnormalities of the genes who is responsible to the flowering process. One of the
genes that play a major role in the flower formation is the LEAFY gene and
LEAFY gene promoter is expected to activate LEAFY genes. The objective of this
research is to construct three size of LEAFY gene promoter (1041 bp, 702 bp, and
349 bp) into the expression vector with gateway system by knowing the size of an
effective related to the gene expressed. LEAFY gene promoter in size 1041 bp,
702 bp, and 349 bp to be inserted into a donor vector (pDONRTM221) and then
into the specific destination vector for promoter. The recombinant plasmid has
been analyzed after transformation into the Agrobacterium tumefaciens strain
AGL-O give a result in a DNA band about 8002 bp, 7663 bp, and 7310 bp. The
conclusion of this research by the three measures of LEAFY gene promoter, which

is 1041 bp, 702 bp, and 349 bp have been successfully inserted into the expression
vector with the gateway system and transformed into Agrobacterium tumefaciens
strain AGL-O then ready to be transferred into the plant.

ix

KONSTRUKSI PROMOTOR GEN LEAFY KAKAO PADA
VEKTOR EKSPRESI DENGAN SISTEM GATEWAY
DAN TRANSFORMASI KE Agrobacterium sp.

ENDAH RATNA PURI

Skripsi
sebagai salah satu syarat memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Biokimia

DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR
2011

x

Judul
Nama
NIM

: Konstruksi Promotor Gen LEAFY Kakao pada Vektor Ekspresi
dengan Sistem Gateway dan Transformasi ke Agrobacterium sp.
: Endah Ratna Puri
: G84070026

Disetujui
Komisi Pembimbing

Dr. Laksmi Ambarsari, M.S
Ketua

Dr. Tetty Chaidamsari, M.Si.
Anggota

Diketahui

Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc
Ketua Departemen Biokimia

Tanggal Lulus:

xi

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala keruniaNya, shalawat serta salam semoga selalu tercurah kepada Nabi Muhammad SAW,
keluarga, sahabat, dan para pengikutnya sampai akhir zaman sehingga penulis
dapat menyelesaikan penelitian ini. Penelitian ini berjudul Konstruksi Promotor
Gen LEAFY Kakao pada Vektor Ekspresi dengan Sistem Gateway dan
Transformasi ke Agrobacterium sp. Kegiatan penelitian ini dilakukan dari bulan
Desember hingga April 2011, bertempat di Laboratorium Balai Penelitian
Bioteknologi Perkebunan Indonesia, jalan Taman Kencana, Bogor.

Penulis mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang telah
membantu dalam penyelesaian penelitian ini, antara lain kepada Dr. Laksmi
Ambarsari, MS. selaku pembimbing utama dan Dr. Tetty Chaidamsari, M.Si
selaku pembimbing lapangan yang telah memberikan saran, kritik, dan
bimbingannya serta Mba Nina, Mba Herti, serta segenap staf di Laboratorium
Biologi Molekuler dan Rekayasa Genetika, Balai Penelitian Bioteknologi
Perkebunan Indonesia atas peran dan kerjasamanya yang telah banyak membantu
dalam menyelesaikan penelitian ini.
Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada orang tua, kakak, adik,
Andes Dinova, dan Biokimia 44 untuk semua doa, dukungan, dan bimbingan yang
sangat berarti bagi penulis. Serta kepada rekan selama penelitian Yoshita, Riska,
Ismi, Ibrahim, Dewi, Mas Rendi, Rika, dan M. Iqbal Akbar Muttaqin atas saran
dan motivasi yang diberikan. Penulis berharap semoga karya ilmiah ini dapat
memberikan manfaat bagi semua orang yang memerlukannya.

Bogor, April 2011

Endah Ratna Puri

xii

RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Bandung pada tanggal 18 Mei 1989 dari ayah Endang
Achyar dan ibu Wiwin Wintarsih. Penulis merupakan anak ketiga dari empat
bersaudara.
Pendidikan penulis dimulai dari TK Bayangkari 18 dan SDN Garuda 5
Bandung, kemudian melanjutkan pendidikan ke SMPN 1 Bandung. Tahun 2007
penulis lulus dari SMAN 7 Bandung dan pada tahun yang sama lulus seleksi
masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Penulis memilih
mayor Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
Selama mengikuti perkuliahan penulis aktif dalam kegiatan organisasi
kemahasiswaan, diantaranya penulis aktif di Himpunan Profesi Biokimia
(CREBs), Himpunan Profesi Komunikasi dan Pengembangan Masyarakat
(HIMASIERA), AGRIFARMA, dan Paguyuban Mahasiswa Bandung
(PAMAUNG). Penulis juga aktif sebagai penyiar radio komunitas IPB (AGRI
FM) dan master ceremony beberapa acara besar di IPB. Selain itu, penulis juga
aktif mengikuti beberapa acara kepanitiaan seperti masa pengenalan departemen
Biokimia 2008/2009 dan 2009/2010, IPB Art Contest, Lomba Karya Ilmiah
Populer, dan beberapa seminar di IPB. Penulis melakukan Praktik Lapang di Balai
Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia, Taman Kencana, Bogor. Penulis

juga aktif mengikuti kegiatan kompetisi karya tulis dan kompetisi wirausaha.
Prestrasi yang pernah diraih, yaitu menjadi juara 3 KKTM tingkat nasional Index
2010, juara 2 LKTI Al-Quran 2010, Finalis Wirauasaha Muda Mandiri, Finalis
call paper ICBFS Bali-Indonesia, Finalis call paper AMSTEC Tokyo-Jepang, dan
Finalis call paper ICMM18 Pulau Jeju-Korea.

xiii

DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR GAMBAR ........................................................................................

vi

DAFTAR LAMPIRAN ..................................................................................... vii
PENDAHULUAN ……………………………………………………… ........

1

TINJAUAN PUSTAKA

Kakao (Theobroma cacao L.) ..................................................................
Promotor Gen ...........................................................................................
Pengklonan dengan Sistem Gateway ........................................................
Polymerase Chain Reaction (PCR) ..........................................................
Agrobacterium tumefaciens ......................................................................

1
3
3
4
5

BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat .........................................................................................
Metode.......................................................................................................

6
6

HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil Amplifikasi Promotor Gen LEAFY dengan Tiga Primer
Spesifik Gateway ......................................................................................
Hasil Ekstraksi dan Pemurnian Promotor Gen LEAFY
dari Gel Agarosa .......................................................................................
Hasil Reaksi Rekombinasi BP dan LR Promotor Gen LEAFY
dengan Sistem Gateway............................................................................
Hasil Konfirmasi Koloni Transforman setelah Reaksi BP
dengan Teknik PCR Koloni ......................................................................
Hasil Konfirmasi Koloni Transforman setelah Reaksi BP
dengan Isolasi DNA Plasmid Rekombinan (Fermentas) ..........................
Hasil Konfirmasi Koloni Transforman setelah Reaksi LR
dengan Teknik PCR Koloni ......................................................................
Hasil Konfirmasi Koloni Transforman setelah Reaksi LR
dengan Isolasi DNA Plasmid Rekombinan (Fermentas) ..........................
Hasil Transformasi Klon Ekspresi ke dalam
Agrobacterium tumefaciens Galur AGL-O ..............................................

9
10
10

11
12
13
14
15

SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan ................................................................................................. 16
Saran ......................................................................................................... 16
DAFTAR PUSTAKA ....................................................................................... 16
LAMPIRAN ... ................................................................................................... 17

vi

DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Pohon kakao .................................................................................................

2

2 Promotor gen prokariot .................................................................................

3

3 Promotor gen eukariot ...................................................................................

3

4 Bagian struktur promotor eukariot ................................................................

3

5 Proses Polymerase Chain Reaction (PCR) ...................................................

5

6 Koloni Agrobacterium tumefaciens ..............................................................

6

7 Elektroforegram amplikon promotor gen LEAFY........................................... 9
8 Elektroforegram ekstraksi dan pemurnian promotor gen LEAFY ................. 10
9 Koloni setelah reaksi BP ............................................................................... 11
10 Koloni setelah reaksi LR ............................................................................... 11
11 Elektroforegram PCR koloni promotor gen LEAFY 349 pb (pDONR) ........ 12
12 Elektroforegram PCR koloni promotor gen LEAFY 702 pb (pDONR) ........ 12
13 Elektroforegram PCR koloni promotor gen LEAFY 1041 pb (pDONR) ...... 12
14 Elektroforegram hasil isolasi plasmid setelah reaksi BP .............................. 13
15 Elektroforegram PCR koloni promotor gen LEAFY 349 pb (pDEST) ......... 14
16 Elektroforegram PCR koloni promotor gen LEAFY 702 pb (pDEST) ......... 14
17 Elektroforegram PCR koloni promotor gen LEAFY 1041 pb (pDEST) ....... 14
18 Elektroforegram hasil isolasi plasmid setelah reaksi LR .............................. 15
19 Koloni Agrobacterium tumefaciens setelah reaksi LR.................................. 15
20 Elektroforegram hasil isolasi plasmid setelah transformasi AGL-O ............ 16

vii

DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Tahapan konstruksi promotor gen LEAFY ke vektor pengklonan ................ 19
2 Tahapan konstruksi promotor gen LEAFY ke vektor destinasi ..................... 20
3 Peta marka seleksi pDONRTM221................................................................. 21
4 Reaksi BP Gateway ....................................................................................... 22
5 Reaksi LR Gateway....................................................................................... 23
6 Multisite Gateway ......................................................................................... 24

1

PENDAHULUAN
Kakao (Theobroma cacao L.) merupakan
salah satu tanaman perkebunan yang
mempunyai nilai ekonomi tinggi sebagai
komoditas ekspor. Kakao sebagai komoditas
andalan perkebunan berperan penting bagi
perekonomian nasional, khususnya sebagai
penyedia
lapangan
kerja,
sumber
pendapatan, dan devisa negara (Depperin
2007). Indonesia termasuk ke dalam tiga
besar produsen kakao dunia bersama Ghana
dan Pantai Gading (International Cocoa
Organization 2003). Sumbangan devisa
terbesar ketiga pada sub sektor perkebunan
setelah karet dan minyak sawit yaitu dari
kakao sebesar US$ 546 juta. Peranan kakao
yang penting di Indonesia menjadi alasan
pemerintah untuk menetapkan kakao sebagai
salah satu komoditas dalam revitalisasi
perkebunan (Deptan 2007).
Tanaman kakao memiliki prospek yang
cerah karena diperkirakan kebutuhan kakao
dunia akan terus meningkat. Peningkatan
permintaan kakao tersebut disertai beberapa
masalah besar dalam pembudidayaannya.
Masalah besar yang dapat menurunkan
produksi kakao tersebut di antaranya
serangan penggerek buah kakao (PBK) dan
rendahnya persen bunga menjadi buah yang
disebabkan oleh layu pentil (cherelle wilt)
(Deptan 2007).
Masalah layu pentil dan sedikitnya
jumlah bunga yang akan menjadi buah
terjadi karena ketidaknormalan gen yang
bertanggung
jawab
pada
proses
pembungaan. Layu pentil pada kakao
merupakan penyakit fisiologis yang diduga
karena beberapa faktor, salah satunya yaitu
persaingan untuk memperoleh nutrisi yang
ketersediaannya terbatas antara buah muda,
buah tua, dan berbagai tunas muda. Layu
pentil pada kakao juga diduga karena adanya
persaingan untuk memperoleh asimilat,
terutama karbohidrat. Persaingan ini terjadi
antara buah dengan buah dan antara buah
dengan pertumbuhan pucuk yang aktif
(Alvim 1974). Buah menjadi layu karena
rendahnya kandungan fitohormon di dalam
biji atau buah sehingga penyerapan asimilat
juga menjadi rendah.
Usaha untuk meningkatkan produktivitas
tanaman kakao mendorong studi molekuler
dan rekayasa genetika dengan mempelajari
mekanisme molekuler dari pembungaan
kakao. Salah satu gen yang berperan utama
dalam pembentukan bunga adalah gen
LEAFY. Promotor gen LEAFY diharapkan

dapat mengaktifkan kerja gen LEAFY
sehingga mencegah penyakit layu pentil,
mengatur pembungaan, dan akhirnya
meningkatkan produktivitas kakao. Pada
penelitian sebelumnya telah berhasil
diisolasi promotor gen LEAFY dari daun
kakao yang berukuran 1650 pb dengan
teknik Genome WalkingTM (Santoso 2010).
Hasil menunjukkan bahwa bagian dari
promotor gen LEAFY yang efektif untuk
mengekspresikan gen masih harus diteliti
melalui
konstruksi
beberapa
ukuran
promotor gen LEAFY. Pada penelitian ini
dilakukan konstruksi promotor gen LEAFY
dengan tiga ukuran berbeda, yaitu 1041 pb,
702 pb, dan 349 pb. Ketiga ukuran tersebut
diperoleh dari hasil amplifikasi dengan
primer gateway yang spesifik.
Penelitian ini bertujuan menyisipkan tiga
ukuran promotor gen LEAFY (1041 pb, 702
pb, dan 349 pb) ke dalam vektor ekspresi
dengan sistem gateway untuk mengetahui
ukuran
promotor
yang
efektif
mengekspresikan gen dan ukuran yang
efisien untuk menggabungkannya dengan
gen LEAFY atau gen lain. Hipotesis
penelitian ini adalah tiga ukuran berbeda
dari promotor gen LEAFY, yaitu 1041 pb,
702 pb, dan 349 pb dapat dikonstruksi pada
vektor ekspresi dengan sistem gateway.
Konstruksi pada beberapa ukuran ini
dilakukan karena tidak semua bagian dari
promotor
gen
LEAFY
dapat
mengekspresikan gen dan mengaktifkan gen
LEAFY.
Keberhasilan konstruksi promotor gen
LEAFY pada vektor ekspresi merupakan
fokus penelitian ini yang diharapkan dapat
digunakan untuk mempelajari sifat, fungsi,
dan ukuran efektif promotor gen yang
terekspresi. Penyisipan tiga ukuran promotor
gen LEAFY yang berbeda (1041 pb, 702 pb,
dan 349 pb) pada vektor ekspresi dengan
sistem
gateway
selanjutnya
akan
ditransformasikan ke dalam tanaman melalui
penyisipan ke Agrobacterium tumefaciens
galur AGL-O.

TINJAUAN PUSTAKA
Kakao (Theobroma cacao L.)
Kakao (Theobroma cacao L.) merupakan
salah satu tanaman perkebunan yang dapat
tumbuh baik di Indonesia, terutama di
dataran rendah atau di lereng gunung yang
ketinggiannya tidak lebih 500 m dari muka

2

air laut. Klasifikasi lengkap tanaman kakao
termasuk ke dalam divisi Spermatophyta,
subdivisi
Angiospermae,
kelas
Dicotyledone, ordo Malvales, famili
Sterculiaceae, genus Theobroma, dan
spesies Theobroma cacao L (Tjitrosoepomo
1988). Tanaman kakao bukan tanaman asli
Indonesia, melainkan tanaman yang berasal
dari lembah hulu sungai Amazon, Amerika
Selatan yang dibawa masuk ke Indonesia
melalui Sulawesi Utara oleh bangsa Spanyol
sekitar tahun 1560. Tanaman kakao ditanam
hampir di seluruh pelosok tanah air dengan
sentra produksi utama di Sulawesi Selatan,
Sulawesi Tenggara, Sulawesi Tengah,
Sumatera Utara, Nusa Tenggara Timur,
Jawa Timur, Kalimantan Timur, Maluku
Utara, dan Irian Jaya (Deptan 2007).
Keberhasilan
perluasan
areal
dan
peningkatan
produksi
tersebut
telah
memberikan hasil nyata bagi peningkatan
komoditas kakao Indonesia di dunia.
Indonesia berhasil menempatkan diri
sebagai produsen kakao terbesar kedua
dunia setelah Pantai Gading (Cote d’Ivoire)
pada tahun 2002, walaupun kembali tergeser
ke posisi ketiga oleh Ghana pada tahun 2003
(International Cocoa Organization 2003).
Kakao bagi Indonesia merupakan salah
satu komoditas andalan perkebunan yang
peranannya
cukup
penting
bagi
perekonomian nasional, khususnya sebagai
penyedia
lapangan
kerja,
sumber
pendapatan, dan devisa negara (Depperin
2007). Kakao juga berperan dalam
mendorong pengembangan wilayah dan
pengembangan agroindustri. Pada tahun
2004, perkebunan kakao telah menyediakan
lapangan kerja dan sumber pendapatan bagi
sekitar 1.1 juta kepala keluarga petani yang
sebagian besar berada di Kawasan Timur
Indonesia (KTI). Perkebunan kakao juga
memberikan sumbangan devisa terbesar
ketiga pada sub sektor perkebunan setelah
karet dan minyak sawit dengan nilai sebesar
US$ 546 juta. Atas dasar pentingnya peran
kakao di Indonesia, maka pemerintah
menetapkan kakao sebagai salah satu
komoditas dalam revitalisasi perkebunan
(Deptan 2007).
Tanaman kakao di Indonesia memiliki
prospek yang cerah karena diperkirakan
kebutuhan kakao dunia akan terus
meningkat. Peningkatan permintaan kakao
tersebut disertai permasalahan besar dalam
pembudidayaannya. Masalah besar yang
dapat menurunkan produksi kakao adalah
serangan penggerek buah kakao (PBK) dan

pembungaan yang tidak konsisten dengan
layu pentil (Deptan 2007). Salah satu aspek
fisiologis yang penting dalam peningkatan
produksi buah kakao adalah tingginya
tingkat layu pentil, terutama yang terjadi
saat awal pembentukan buah.
Layu pentil merupakan penyakit
fisiologis yang disebabkan oleh persaingan
nutrisi antara pentil dengan organ lain yang
sedang tumbuh aktif yang mengakibatkan
kegagalan proses embriogenesis dan
perkembangan buah. Hasil penelitian
Tjasadihardja (1987), menunjukkan bahwa
pertunasan sangat erat hubungannya dengan
tingkat layu pentil. Tunas
baru yang
terbentuk merupakan pesaing yang sangat
kuat bagi buah muda dalam menggunakan
asimilat.
Kakao merupakan tumbuhan tahunan
(perennial) berbentuk pohon, di alam dapat
mencapai ketinggian 10 m. Walaupun dalam
pembudidayaan tingginya dibuat tidak lebih
dari 5 m tetapi dengan tajuk menyamping
yang meluas. Hal ini dilakukan untuk
memperbanyak cabang produktif (Putri
2004). Pohon kakao menghasilkan buah
berbentuk bulat memanjang yang tumbuh
dari bunga yang diserbuki. Buah terdiri dari
5 daun buah dan memiliki ruang yang di
dalamnya terdapat biji (Gambar 1).

Gambar 1 Pohon kakao.
Bunga pada tanaman kakao terbentuk
sepanjang
tahun
tetapi
intensitas
pembentukannya beragam dari waktu ke
waktu. Pembentukkan bunga ditentukan oleh
beberapa faktor, yaitu genetis, umur, dan
lingkungan
tumbuh.
Faktor
genetis
berpengaruh hingga pada tingkat klon
(progeni) yang menyebabkan terbentuknya
keragaman jumlah bunga pada masingmasing klon. Pembentukan bunga karena
faktor umur, biasanya pada tanaman yang
semakin tua, akan semakin banyak bunga

3

yang terbentuk dan keragaman bunganya
lebih tinggi dari pada tanaman yang lebih
muda. Kontrol lingkungan (lamanya hari
dan suhu) mendorong transisi dari sel yang
sedang aktif membelah menjadi sel bunga.
Pembentukan bunga dimulai dengan
mekanisme
yang
kompleks
dari
pembentukan kelopak bunga, daun bunga,
benang sari, dan putik. Gen penanda
meristem mengubah sel yang sedang aktif
membelah dengan cepat menjadi sel bunga
(Brian 2003).
Gambar 3 Promotor gen eukariot.
Promotor Gen
Gen prokariot secara umum tersusun atas
promotor, bagian struktural, dan terminator.
Promotor gen adalah urutan DNA spesifik
yang berperan mengendalikan transkripsi
gen struktural dan terletak di sebelah hulu
(upsteam) dari bagian struktural suatu gen.
Bagian promotor menjadi tempat awal
pelekatan enzim RNA polimerase yang
melakukan transkripsi bagian struktural
(Yuwono 2005). Bagian penting promotor
pada prokariot disebut sebagai Pribnow Box
pada urutan nukleotida -10 pb dan -35 pb,
biasanya berupa TATA-Box. TATA-Box
merupakan bagian DNA yang banyak
mengandung basa timin dan adenin (Gambar
2) (Murray et al. 2003).

Promotor gen eukariot tertentu, ada yang
memiliki beberapa exon, yaitu bagian yang
akan mengkode protein atau biasa disebut
open reading frame (ORF) dan ada yang
tidak ditranslasi menjadi protein tetapi
berperan
dalam
proses
transkripsi
(untranslated region). Hasil transkripsi
seringkali juga membawa sekuen yang
disebut sebagai intron, yang terdapat pada
bagian ORF atau pada bagian untranslated
region. Secara bertahap intron akan dibuang
dari hasil transkripsi yang terbentuk dan
exon yang ada akan digabungkan
membentuk mRNA yang siap untuk
ditranslasi menjadi protein (Gambar 4).

Gambar 4 Bagian struktur promotor
eukariot.

Gambar 2 Promotor gen prokariot.
Promotor pada eukariot lebih kompleks
dibandingkan dengan promotor pada
prokariot.
Pada
eukariot,
promotor
digunakan untuk menguraikan semua urutan
penting di dalam inisiasi transkripsi suatu
gen. Berbagai gen yang ada dalam genom
inti ditranskripsi oleh salah satu dari tiga
jenis enzim RNA polimerase. RNA
polimerase I dan III bertanggung jawab
untuk mensintesis
rRNA dan tRNA,
sedangkan RNA polimerase II bertanggung
jawab untuk mentranskripsi gen yang
mengkode suatu protein tertentu (Gambar 3)
(Brown 2002).

Pengklonan dengan Sistem Gateway
Sistem pengklonan dengan sistem
Gateway pada dasarnya bergantung pada
dua reaksi yaitu, rekombinasi BP dan LR.
Sistem pengklonan Gateway Site-Specific
Recombination (SSR) dikomersialisasikan
oleh Invitrogen. Metode ini mengkonstruksi
gen sisipan yang terlebih dahulu diklon ke
dalam vektor donor (pDONR) dan kemudian
ditransfer ke dalam vektor destinasi
(pDEST) dengan rekombinasi situs spesifik.
Teknologi ini merupakan penerapan reaksi
rekombinasi situs spesifik yang dapat balik
(reversible). Penamaan reaksi BP dan LR
didasarkan pada singkatan B dari bakteri dan
P (phage) sedangkan L (left) dan R (right).
Reaksi
BP
terjadi
pada
saat
penggabungan situs attP yang berukuran 242

4

pb dari faga lamda dan situs attB yang
berukuran 25 pb dari rekombinasi
Escherichia coli dan genom faga lamda
yang disambungkan ke genom E. coli.
Hasilnya genom faga diikat oleh attL yang
berukuran 100 pb dan attR yang berukuran
168 pb (Lampiran 4). Kebalikannya faga
lamda dipotong dari genom E. coli dengan
rekombinasi di antara situs attL dan attR
dalam
reaksi
LR.
Reaksi
ini
merekombinasikan gen sisipan yang diikat
oleh situs attL dengan vektor destinasi yang
membawa situs attR. Hasilnya gen sisipan
diikat oleh dua situs yakni situs attB1 dan
attB2 yang selanjutnya disebut klon ekspresi
(Lampiran 5) (Hartley et al. 2000).
Reaksi BP dikatalisis oleh enzim BP
klonase yang terdiri atas integrase faga (Int)
dan IHF (Integration Host Factor).
Campuran BP klonase memindahkan DNA
sisipan ke dalam vektor donor yang
menghasilkan suatu klon entri (pENTR) dan
diikat oleh dua situs attL. Entri klon
merupakan substrat kunci dalam reaksi LR
yang dikatalisis oleh campuran LR klonase
yang terdiri atas integrase faga (Int), IHF
(Integration Host Factor), dan eksisionase
(Xis). Campuran LR klonase mentransfer
DNA sisipan yang diikat oleh situs attL ke
dalam vektor destinasi (pDEST) yang
membawa situs attR (Karimi et al. 2007).
Setelah pencocokan rekombinasi situs attL
dan attR, DNA sisipan dimasukkan ke dalam
klon ekspresi (pEXPR) dan diikat kembali
oleh situs attB1 dan attB2. Vektor donor
(pDONR), klon entri (pENTR), vektor
destinasi (pDEST), dan klon ekspresi
(pEXPR) merupakan bagian yang diadopsi
oleh pengguna gateway untuk memasukkan
dan mengeluarkan plasmid di dalam reaksi
klonase (Karimi et al. 2007).
Hasil rekombinasi dengan sistem
gateway dapat dengan mudah diseleksi
dengan seleksi positif (resisten terhadap
antibiotik) dan seleksi negatif (gen sitotoksik
ccdB) yang akan menghambat pertumbuhan
E. coli yang telah disisipi salah satu vektor
(Magnani et al. 2006). Gen sitotoksik ccdB
terdapat pada vektor donor dan vektor
destinasi. Pada saat reaksi rekombinasi BP,
ccdB akan tertukar dengan gen sisipan
sehingga vektor yang tidak tersisipi gen
akan mati karena adanya ccdB. Pada reaksi
rekombinasi LR, gen sisipan yang telah
diikat oleh situs attL akan tertukar dengan
gen ccdB yang telah diikat oleh situs attR
pada vektor destinasi (Bernard & Couturier
1992).

Sistem gateway memiliki banyak
keuntungan diantaranya kloning berlangsung
cepat dengan efisiensi yang tinggi dalam
mentransfer sekuen DNA ke dalam berbagai
sistem vektor untuk ekspresi protein dan
analisis
protein.
Multisite
gateway
memungkinkan penggunaan dan ekspresi
berbagai tipe DNA sekuen (misalnya hasil
PCR, klon cDNA, dan fragmen restriksi)
(Lampiran 6). Keuntungan lain sistem
gateway, yaitu memudahkan akomodasi
transfer sejumlah besar sekuen DNA ke
dalam berbagai vektor destinasi (Invitrogen
2008). Modifikasi pengklonan gateway juga
sering
dilakukan
untuk
tujuan
memperkirakan Open Reading Frame
(ORF) yang menyandi protein dalam vektor
entri untuk mencegah keberadaan atau
penambahan muatan sekuen. Penambahan
muatan sekuen yang sering kali tinggi
setelah rekombinasi dapat mempengaruhi
fungsi protein (Dubin et al. 2008).
Polymerase Chain Reaction (PCR)
Polymerase Chain Reaction (PCR)
adalah suatu metode enzimatis untuk
melipatgandakan secara eksponensial suatu
sekuen nukleotida tertentu dengan cara in
vitro.
Metode
ini
pertama
kali
dikembangkan pada tahun 1985 oleh Kary
B. Mullis dan sekarang telah banyak
digunakan
untuk
berbagai
macam
manipulasi dan analisis genetik (Yuwono
2006). Metode yang dikembangkan oleh
Kary B. Mullis ini akhirnya mendapatkan
hadiah nobel di bidang kimia pada tahun
1993. Metode PCR sangat sensitif,
sensitivitas tersebut dapat digunakan untuk
melipatgandakan satu molekul DNA (Jonas
2003). Instrumen PCR digunakan untuk
menggandakan jumlah molekul DNA pada
target tertentu dengan mensintesis molekul
DNA baru yang berkomplemen dengan
molekul DNA target dengan bantuan enzim
dan oligonukleotida sebagai primer dalam
suatu thermocycler. Primer yang berada
sebelum daerah target disebut sebagai
primer forward dan primer yang berada
setelah daerah target disebut primer reverse.
Enzim yang digunakan sebagai pencetak
rangkaian
molekul DNA baru dikenal
sebagai enzim polimerase (Muladno 2002).
Komponen yang dibutuhkan dalam
reaksi PCR adalah (1) DNA target
(template), yaitu fragmen DNA yang akan
dilipatgandakan, (2) oligonukleotida primer,
yaitu suatu sekuen oligonukleotida pendek
(15-25 basa nukleotida) yang digunakan

5

untuk mengawali sintesis rantai DNA, (3)
deoksiribonukleotida
trifosfat
(dNTP),
terdiri atas dATP, dCTP, dGTP, dTTP, dan
(4) enzim DNA polimerase, yaitu enzim
yang melakukan katalis reaksi sintesis rantai
DNA. Komponen lain yang juga penting
adalah senyawa bufer (Yuwono 2006).
Bufer berfungsi menjaga kestabilan pH
selama proses PCR berlangsung, menjaga
kekuatan ionik, dan suhu penempelan primer
(annealing) pada DNA target. Bufer yang
umum digunakan terdiri dari KCL dengan
konsentrasi 50 mM dan Tris-HCL 10 mM.
Bufer memiliki pH 8.3 pada suhu 25oC
(Kolmodin & Williams 1997).
Reaksi PCR pada dasarnya adalah tiruan
dari proses replikasi DNA, yaitu adanya
pembukaan rantai DNA utas ganda,
penempelan primer, dan pemanjangan rantai
DNA baru oleh DNA polimerase dari arah
5’ ke 3’. Satu siklus pada teknik PCR terdiri
atas tiga tahap (Gambar 5), yaitu denaturasi,
annealing,
dan
ekstensi.
Denaturasi
dilakukan pada suhu 90o-95oC sehingga
terjadi pemisahan utas ganda DNA menjadi
dua utas tunggal DNA yang menjadi cetakan
(template) tempat penempelan primer dan
tempat kerja DNA polimerase. Selanjutnya
tahap annealing, suhu diturunkan untuk
penempelan primer oligonukleotida pada
sekuens yang komplementer pada molekul
DNA cetakan. Suhu annealing tiap sekuens
DNA bersifat spesifik dan merupakan faktor
penentu keberhasilan suatu reaksi PCR,
sedangkan tahap terakhir adalah ekstensi.
Tahap ekstensi dilakukan pada suhu 72oC.
Suhu ini merupakan suhu optimum untuk
kerja enzim Taq DNA polimerase (Yuwono
2006). Pada tahap ini terjadi sintesis DNA
komplemen dengan DNA cetakan.
Ketiga tahapan tersebut dilakukan
berulang kali dalam mesin PCR, pada
umumnya antara 25-30 kali (siklus)
bergantung dari jumlah DNA yang
diinginkan sehingga pada akhir siklus akan
diperoleh molekul-molekul DNA rantai
ganda yang baru hasil polimerisasi dalam
jumlah yang jauh lebih banyak dibandingkan
dengan jumlah DNA cetakan yang
digunakan (Yuwono 2006). Banyaknya
siklus
amplifikasi
tergantung
pada
konsentrasi DNA target di dalam campuran
reaksi. Sedikitnya diperlukan 25 siklus
untuk melipatgandakan satu kopi sekuen
DNA target di dalam genom mamalia agar
hasilnya dapat dilihat secara langsung,
misalnya dengan elektroforesis gel agarosa
(Sambrook et al. 1989).

Gambar 5 Proses Polymerase Chain
Reaction (PCR).
Agrobacterium tumefaciens
Bakteri Agrobacterium tumefaciens
merupakan bakteri tanah Gram negatif yang
termasuk famili Rhizobiaceae dan anggota
dari genus Agrobacterium. Agrobacterium
memiliki tiga komponen genetik yang
digunakan untuk menginfeksi tanaman.
Komponen yang pertama adalah komponen
T-DNA yaitu fragmen yang ditransfer ke sel
tanaman. T-DNA terletak di plasmid Ti
(tumour-inducing) dari Agrobacterium.
Komponen kedua adalah virulance (vir)
region yang mensintesis protein vir dan
komponen ketiga adalah gen chomosomal
virulance (chv) yang berfungsi dalam
pelekatan bakteri ke dalam sel tanaman
(Tzafira & Citovsky 2002). Langkah awal
dalam induksi tumor adalah ketika A.
tumefaciens menempel pada permukaan sel
tanaman yang disebut kolonisasi bakteri
(Gambar 6) (Matthysse1986).
Gen asing dapat disisipkan ke dalam
plasmid Ti dengan menggunakan teknik
DNA rekombinan. Plasmid rekombinan
ditransformasikan ke A. tumefaciens yang
dapat digunakan untuk menginfeksi sel
tumbuhan. Plasmid rekombinan akan
menyelipkan dirinya ke dalam kromosom
tumbuhan.
Hal
ini
memungkinkan
menghasilkan tumbuhan yang mengandung
dan mengekspresikan gen asing yang dapat
diwariskan ke keturunannya. Plasmid Ti
ditemukan pada semua galur A. tumefaciens
virulen, berukuran sekitar 200-250 kb, dan
stabil pada temparatur di bawah 30oC.

6

Kemampuan T-DNA untuk mentransfer
DNA ke organisme eukariot dan gen yang
berada di T-DNA dapat digantikan dengan
gen apa saja, menjadikan A. tumefaciens
sebagai vektor yang ideal untuk mentransfer
gen ke dalam organisme eukariotik, seperti
tanaman untuk menghasilkan suatu tanaman
transgenik (Tzfira & Citovsky 2002).

Gambar 6 Koloni Agrobacterium
tumefaciens.

BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan pada
proses amplifikasi dengan kit platinum dari
Invitrogen, yaitu memerlukan bahan-bahan
seperti promotor gen LEAFY, primer
forward spesifik (promLFY F349, promLFY
F702, dan promLFY F1041), primer
promTcLFY reverse, larutan bufer, MgCl2,
dNTPs, Taq polimerase, dan molecular
water. Bahan yang digunakan pada proses
rekombinasi
dengan
sistem
Gateway®Technology yakni BP dan LR
Recombination Reaction Protocol (Kit
Invitrogen).
Proses
BP
rekombinasi
memerlukan bahan-bahan seperti bufer TE
1x pH 8, insert berupa hasil elusi,
pDONR™vektor,
dan
5X
BP
Clonase™bufer reaksi. Bahan-bahan yang
digunakan pada proses LR rekombinasi
adalah bufer TE 1x pH 8, klon entri, vektor
destinasi khusus promotor gen, dan 5X LR
Clonase™bufer reaksi.
Bahan-bahan yang digunakan dalam
elektroforesis yaitu gel agarosa (Sigma),
bufer tris-borate-EDTA (TBE) 0.5x, Etidium
bromida (EtBr) 5 µg/100ml, loading buffer
(Bromfenol biru 2.5%, sukrosa 40%), dan
marker DNA 1 kb plus ladder (Invitrogen).
Tahapan transformasi ke dalam sel
kompeten memerlukan bahan media Luria
Bertani (LB) agar yang sudah ditambahkan
kanamisin 50 ppm, 1 µL proteinase K, dan

sel kompeten Escherichia coli galur XL-1
Blue. Tahap transformasi ke dalam
Agrobacterium tumefaciens membutuhkan
media Luria Bertani (LB) agar yang sudah
ditambah kanamisin 50 ppm dan rimfapisin
50 ppm, media yeast extract pepton (YEP),
dan sel kompeten A. tumefaciens galur
AGLO. Tahap konfirmasi dengan PCR
koloni setelah reaksi BP, bahan yang
dibutuhkan adalah larutan bufer, MgCl2,
dNTPs, Taq polimerase, primer M13
Forward, primer M13 Reverse, dan
molecular water.
Alat yang digunakan untuk elektroforesis
adalah sisir dan cetakan agar, bak
elektroforesis, mikropipet, tabung mikro,
mircowave, adaptor 100 Volt, transluminator
ultraviolet (UV) T2201 (Sigma), dan gel
documenter. Selain itu alat yang digunakan
adalah mesin PCR (ESCO Swift max), DNA
speed vacum 110 savant, inkubator
bergoyang (shaker incubator), laminar air
flow cabinet, segitiga penyebar, pinset, pisau
skalpel, autoklaf, Eppendorf sentrifus
5417R, neraca analitik, dan peralatanperalatan gelas seperti cawan petri, gelas
piala, labu Erlenmeyer, labu takar, dan gelas
ukur.
Metode
Amplifikasi promotor Gen LEAFY
dengan Primer Spesifik Gateway
Amplifikasi promotor gen LEAFY
menggunakan
kit
dari
Invitrogen
(Platinum® Taq DNA Polymerase).
Amplifikasi tiga ukuran promotor gen
LEAFY menggunakan tiga pasang primer
spesifik gateway yang berbeda yaitu,
Gateway promLFY F1041 dan Gateway
promTcLFY R; Gateway promLFY F702
dan Gateway promTcLFY R; dan Gateway
promLFY F349 dan Gateway promTcLFY
R. Proses amplifikasi dimulai dengan
menyiapkan campuran reaksi yang terdiri
atas 2.5 µL bufer, 1 µL MgCl2, 1 µL dNTPs,
0.2 µL Taq polimerase, dan 14.3 µL
molecular water. DNA cetakan (template)
dimasukkan ke dalam tabung mikro
sebanyak 1 µL. Reverse primer ditambahkan
sebanyak 1 µL ke dalam tabung mikro
kemudian ditambahkan pula sebanyak 1 µL
forward primer spesifik ke dalam masingmasing tabung.
Promotor gen LEAFY diamplifikasi pada
mesin PCR sebanyak 35 siklus dengan
program PCR sebagai berikut: predenaturasi
pada suhu 94oC selama 7 menit, denaturasi
pada suhu 94oC selama 45 detik,

7

penempelan primer (annealing) pada suhu
55oC selama 45 detik, pemanjangan primer
(extension) pada suhu 72oC selama 2 menit,
dan pascapemanjangan pada suhu 72oC
selama 5 menit. Verifikasi produk PCR pada
gel agarosa 1%.
Membuat Gel Agarosa Konsentrasi 1 %
dan Elektroforesis Hasil Amplifikasi
Serbuk agarosa sebanyak 0.6 gram
dilarutkan dalam 60 ml larutan TBE 0.5x.
Larutan
agarosa
dipanaskan
dalam
microwave sampai larut selama ± 120 detik.
Larutan didiamkan sampai terasa hangat,
kemudian ditambahkan larutan EtBr
sebanyak 3 µL. Hal ini bertujuan agar EtBr
tidak rusak karena panas. Larutan dituang ke
dalam cetakan dan dibiarkan hingga
mengeras membentuk gel. Gel agarosa yang
telah
mengeras
digunakan
untuk
elektroforesis hasil amplifikasi.
Promotor gen yang telah diamplifikasi
dengan
metode
PCR
selanjutnya
dielektroforesis untuk mengetahui hasil
amplifikasi. Promotor gen hasil amplifikasi
yang akan dielektroforesis dalam gel agarosa
terlebih dahulu dicampurkan dengan loading
buffer. Setelah dicampurkan dengan loading
buffer kemudian campuran dimasukkan ke
dalam
sumur
gel
agarosa
dan
dielektroforesis dengan tegangan 75 volt
selama ± 1 jam.
Ekstraksi dan Pemurnian Promotor Gen
LEAFY
Elektroforegram positif ditunjukkan
dengan adanya pita pada gel agarosa setelah
diamati dengan transluminator UV. Proses
ekstraksi dan purifikasi promotor gen
LEAFY dari gel menggunakan kit dari
Invitrogen. Pita yang terang pada gel
agarosa dipotong di bawah transluminator
UV. Potongan gel tersebut dimasukkan ke
dalam tabung mikro dan ditambahkan 3x
volume solubilization bufer (L3). Potongan
gel diinkubasi pada suhu 50oC selama 10
menit sampai gel tersebut larut dan
diinkubasi kembali pada suhu ruang selama
5 menit. Setelah potongan gel larut
kemudian dimasukkan ke dalam kolom
(Quick Gel Extraction Column) yang berada
di atas tube pencuci (Wash Tube) dan
disentrifus 1 menit pada 12000 rpm dengan
suhu ruang. Sebanyak 500 µL bufer pencuci
(Wash buffer) ditambahkan ke dalam kolom
dan disentrifus 1 menit pada 12000 rpm,
suhu ruang. Supernatan dibuang dan
disentrifus dalam keadaan kosong pada

12000 rpm, 25oC selama 1 menit. Setelah
itu, ditambahkan bufer elusi sebanyak 30 µL
dan diinkubasi selama 2 menit pada suhu
ruang. Larutan tersebut disentrifus kembali
pada 12000 rpm, 25oC selama 2 menit. Hasil
ekstraksi dan pemurnian gel dilihat dengan
elektroforesis gel agarosa 1%.
Reaksi Rekombinasi BP dan LR
Promotor Gen LEAFY dengan Sistem
Gateway
Reaksi rekombinasi BP promotor gen
LEAFY dengan sistem gateway dimulai
dengan menyiapkan bufer TE sebanyak 5
µL, 2 µL hasil elusi, dan vektor Donor
(pDONRTM221) sebanyak 1 µL. Setelah itu,
ditambahkan sebanyak 2 µL BP ClonaseTM
II dan diinkubasi selama 2 jam pada suhu
250C. Setelah inkubasi selesai, ke dalam
larutan ditambahkan sebanyak 2 µL
Proteinase K dan diinkubasi kembali pada
suhu 370C selama 15 menit. Hasil
rekombinasi promotor gen LEAFY pada
vektor
Donor
(pDONR)
kemudian
ditransformasikan ke dalam sel kompeten
E. coli untuk perbanyakkan plasmid yang
telah membawa promotor gen LEAFY.
Koloni bakteri E. coli yang tumbuh pada
media LB agar yang mengandung antibiotik
kanamisin dikonfirmasi dengan metode PCR
koloni. Koloni bakteri rekombinan ditandai
adanya pita setelah pengujian dengan
metode PCR. Koloni bakteri rekombinan
kemudian diisolasi DNA plasmidnya untuk
direkombinasikan ke vektor destinasi
(pDEST).
Reaksi rekombinasi LR, sebanyak 5 µL
bufer TE, 2 µL hasil BP reaksi (klon entri),
dan vektor destinasi (pDEST) sebanyak 1
µL. Setelah itu, ditambahkan sebanyak 2 µL
LR ClonaseTM II dan diinkbuasi selama 2
jam pada suhu 250C. Setelah inkubasi
selesai, ke dalam larutan ditambahkan
sebanyak 2 µL Proteinase K dan diinkubasi
lagi pada suhu 370C selama 15 menit. Hasil
rekombianasi
pada
vektor
destinasi
kemudian ditransformasikan ke dalam E.
coli. Koloni bakteri yang tumbuh diisolasi
DNA plasmid dan selanjutnya dikonfirmasi
dengan metode PCR Koloni. Plasmid
rekombinan selanjutnya ditransformasikan
ke A. tumefaciens galur AGL-O.
Transformasi Promotor Gen LEAFY ke
Escherichia coli
Sebanyak 5 µL hasil rekombinasi BP dan
LR ditransformasikan ke dalam 200 µL sel
kompeten E. coli XL-1 Blue dan dikocok

8

perlahan hingga tercampur rata kemudian
diinkubasi di dalam es selama 30 menit.
Larutan hasil rekombinasi dan sel kompeten
diberi kejut panas (heat shock) pada suhu
42oC selama 50 detik yang selanjutnya
segera dimasukkan ke dalam es selama 10
menit. Ke dalam larutan hasil rekombinasi
dan sel kompeten ditambahkan 800 µL Luria
Bertani (LB) + glukosa 20 mM kemudian
diinkubasi di dalam shaker incubator selama
1.5 jam pada suhu 37oC dengan kecepatan
150 rpm. Campuran tersebut diambil
sebanyak 100 µL (1/10 volume) untuk
ditumbuhkan dalam media LB agar yang
terdiri atas tripton 10 g/l, yeast extract 5 g/l,
NaCl 5 g/l, dan bakto agar 15 g/l. Sisanya
sebanyak 9/10 volume disentrifus pada 3500
rpm, 25oC selama 5 menit. Supernatan
dibuang ± 800 µL sedangkan sisa supernatan
100 µL dan pelet diresuspensi kemudian
ditumbuhkan dalam media LB agar yang
mengandung antibiotik kanamisin 50 ppm
dan meratakannya dengan segitiga penyebar
steril. Media diinkubasi dalam kondisi 37oC
selama 16-20 jam kemudian dilihat koloni
yang tumbuh.
Konfirmasi Koloni Transforman dengan
Teknik PCR Koloni
Koloni yang tumbuh dipindahkan ke
dalam media LB agar yang baru untuk
membuat duplikat koloni. Setelah proses
duplikasi, koloni yang tumbuh juga
dipindahkan ke dalam tabung mikro yang
berisi molecular water (MW) untuk
persiapan PCR koloni. Pemindahan koloni
dilakukan secara steril dalam laminar air
flow cabinet. PCR koloni setelah reaksi
rekombinasi
BP
dilakukan
dengan
menyiapkan komponen mix yang terdiri atas,
2.75 µL molecular water (MW), 1.5 µL
buffer complete, 0.3 µL dNTP’s, 0.15 µL
M13F, 0.15 µL M13R, dan 0.15 µL taq
polymerase.
PCR koloni setelah reaksi rekombinasi
LR
dilakukan
dengan
menyiapkan
komponen mix yang terdiri atas, 2.75 µL
molecular water (MW), 1.5 µL buffer
complete, 0.3 µL dNTP’s, 0.15 µL masingmasing primer forward spesifik gateway
yang berbeda yaitu, Gateway promLFY
F1041, Gateway promLFY F702, Gateway
promLFY F349, 0.15 µL masing-masing
primer Gateway promTcLFY R, dan 0.15
µL taq polymerase. Tahap pertama PCR
adalah program lisis 96oC selama 5 menit,
50oC selama 1 menit 30 detik, 96oC selama
1 menit 30 detik, 45oC selama 1 menit 30

detik, 96oC selama 1 menit, 40oC selama 1
menit. Program dihentikan sejenak untuk
penambahan sebanyak 5 µL komponen mix
ke dalam masing-masing tabung. Kemudian
program PCR dilanjutkan kembali dengan
program PCR yakni, 94oC selama 30 detik,
45oC selama 1 menit, 72oC selama 2 menit.
Setelah perbanyakan koloni transforman
dengan teknik PCR selesai kemudian
pengujian dengan elektroforesis gel agarosa
1 %.
Isolasi DNA Plasmid Rekombinan
(Fermentas)
Isolasi
DNA
plasmid
dilakukan
berdasarkan hasil PCR koloni yang
diketahui mengandung plasmid terinsersi
fragmen yang diinginkan. Plasmid diisolasi
dengan Fermentas GeneJet Plasmid
Miniprep Kit. Sampel yang positif
mengandung plasmid terinsersi disentrifus
12000 rpm terlebih dahulu. Pelet
dihomogenisasi dengan penambahan 250 µL
resuspension
solution.
Setelah
itu,
ditambahkan 250 µL lisis solution, 350 µL
neutralization
solution,
dan
setiap
penambahan larutan dalam tabung dibolakbalik sebanyak 6x, kemudian disentrifus
selama 5 menit, 12000 rpm pada suhu ruang.
Pengikatan
DNA
dilakukan
dengan
memindahkan supernatan ke dalam kolom
dan disentrifus selama 1 menit. Kolom
dicuci dengan 500 µL wash solution dan
disentrifus selama 1 menit (dilakukan
sebanyak 2x). Kolom dalam keadaan kosong
disentrifus kembali selama 1 menit. Kolom
dipindahkan ke dalam tabung mikro baru
dan ditambahkan 30 µL elution buffer tepat
di tengah membran kolom. Setelah itu,
diinkubasi selama 2 menit dan disentrifus
kembali selama 2 menit. Hasil isolasi DNA
plasmid diverifikasi dengan visualisasi
elektroforesis gel agarosa 1%.
Transformasi ke dalam Agrobacterium
tumefaciens galur AGL-O
Sejumlah 10 µL DNA plasmid
dimasukkan ke dalam A. tumefaciens stain
AGL-O, didiamkan di dalam es selama 15
menit. Selanjutnya diinkubasi kembali di
dalam N2 cair selama 5 menit dan pada suhu
37oC selama 5 menit. Sejumlah 1 ml YEP
(Yeast Exctract Pepton) ditambahkan ke
dalamnya dan dikocok selama 3 jam pada
suhu 28oC. Larutan kemudian disentrifugasi
pada kecepatan 6000 rpm selama 3 menit.
Sejumlah
100
µL
supernatan
diresuspensi dengan pelet yang terbentuk,

9

dipipet, dan dimasukkan ke dalam media LB
yang telah diberi antibiotik kanamisin 50
ppm dan rimfapisin 50 ppm. Inkubasi
dilakukan selama 2 hari pada suhu 28oC dan
dalam kondisi gelap. Hasil yang diperoleh
dikonfirmasi dengan PCR koloni dan isolasi
plasmid. Setelah itu, promotor gen LEAFY
siap untuk dintransformasikan ke tanaman
melalui A. tumefaciens.

HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil Amplifikasi Promotor Gen LEAFY
dengan Tiga Primer Spesifik Gateway
Tahap pertama yang dilakukan dalam
percobaan untuk mengkonstruksi promotor
gen LEAFY ke dalam vektor ekspresi adalah
dengan mendesain tiga buah primer gateway
yang spesifik. Primer tersebut disusun
berdasarkan perancangan primer pada sistem
gateway yang didasarkan pada sekuen
promotor gen LEAFY yang telah berhasil
diisolasi dari daun kakao dengan metode
Genome
Walking™
pada
penelitian
sebelumnya. Ukuran promotor gen LEAFY
yang diperoleh adalah 1650 pb (Santoso
2010). Dari ukuran 1650 pb, akan dibagi
kembali ke dalam tiga ukuran yang berbeda
melalui amplifikasi promotor gen LEAFY
dengan primer gateway yang spesifik, yaitu
Gateway F1041, Gateway F702, Gateway
F349, dan satu buah primer reverse
(promTcLFY R). Primer tersebut dirancang
berdasarkan aturan perancangan sistem
gateway. Empat basa nukleotida GGGG
diikuti situs attB kemudian ditambahkan 1825 urutan basa nukleotida spesifik promotor
gen LEAFY (Invitrogen 2010). Situs attB ini
disebut sebagai tempat pengikatan lamda
(lamda attachment site) yaitu tempat
integrasi DNA lamda ke dalam kromosom
E. coli yang terletak di antara operon gal dan
operon biotin (Yuwono 2005).
Pemilihan tiga ukuran yang akan
dikonstruksi (1041 pb, 702 pb, dan 349 pb)
didasarkan pada pencarian panjang ukuran
promotor
yang
efektif
dapat
mengekspresikan gen. Pencarian tersebut
dilakukan dengan pengujian pada beberapa
ukuran promotor gen LEAFY. Pengujian
ukuran yang diharapkan adalah ½ panjang
promotor gen LEAFY (± 825 pb), ½ dari
panjang promotor 825 pb (± 415 pb), dan ½
dari panjang promotor 415 (± 210 pb).
Namun, setelah dirancang dengan ketentuan
aturan sistem gateway, diperoleh primer
yang dapat menempel pada proses

amplifikasi promotor gen LEAFY yang
berukuran 1650 pb menjadi 1041 pb, 702 pb,
dan 349 pb.
Amplifikasi promotor gen LEAFY
dengan
metode
PCR
bertujuan
menggandakan promotor gen tersebut secara
in vitro. Hasil amplifikasi tiga ukuran
promotor gen LEAFY dengan primer spesifik
gateway kemudian dielektroforesis dengan
konsentrasi gel agarosa 1%. Prinsip
elektroforesis adalah memisahkan molekul
berdasarkan
muatannya.
DNA yang
bermuatan negatif akan bergerak ke arah
kutub positif selama elektroforesis karena
adanya gugus fosfat. Fragmen DNA
mempunyai muatan negatif yang sama untuk
tiap-tiap
ukuran
panjang,
sehingga
pergerakan DNA ini akan memiliki
kecepatan yang sama untuk mencapai kutub
positif. Pergerakan yang sama antar molekul
DNA ini tidak akan dapat digunakan untuk
memisahkan DNA berdasarkan ukurannya.
Hal inilah yang menyebabkan digunakannya
gel untuk memperlambat pergerakan DNA.
Gel yang digunakan adalah agarosa yang
berasal dari ekstrak rumput laut yang telah
dimurnikan. Marka atau penanda yang
digunakan pada proses running merupakan
campuran molekul dengan ukuran berbedabeda yang digunakan untuk menentukan
ukuran molekul dalam pita sampel (Clark &
Christopher 2008). Hasil pengujian dengan
elektroforesis agarosa menunjukkan pita
berukuran sekitar 1041 pb, 702 pb, dan 349
pb (Gambar 7).

Gambar

7

Elektroforegram amplikon
promotor gen LEAFY dengan
primer
Gateway
yang
spesifik; (M) marker 1 kb
plus DNA
Lader, (a)
promotor
gen
LEAFY
berukuran 702 pb, (b) ukuran
1041 pb, (c) ukuran 349 pb.

10

Ketiga pita tersebut menunjukkan bahwa
primer gateway yang dirancang sudah benar.
Hal ini didasarkan pada hasil amplifikasi
yang sesuai dengan ukuran yang diharapkan
yaitu 1041 pb, 702 pb, dan 349 pb. Promotor
gen LEAFY yang telah teramplifikasi
selanjutnya diekstraksi dan dimurnikan.
Hasil Ekstraksi dan Pemurnian Promotor
Gen LEAFY dari Gel Agarosa
Pita yang terang pada gel agarosa
dipotong dengan pisau scalpel di bawah
transluminator UV, kemudian dilanjutkan
proses ekstraksi dan pemurnian. Ekstrasi dan
pemurnian bertujuan untuk memurnikan
DNA dari berbagai pengotor yang tidak
diinginkan seperti protein dan RNA. Ukuran
pita DNA hasil ekstraksi dan pemurnian
sama dengan ukuran pita setelah amplifikasi
karena proses esktraksi dan pemurnian
hanya menghilangkan pengotor yang ada
pada DNA. Hasil ekstraksi dan pemurnian
divisualisasi dengan elektroforesis gel
agarosa 1 % dan diperoleh pita berukuran
1041 pb, 702 pb, dan 349 pb (Gambar 8).
Ukuran pita yang diperoleh sama dengan
hasil amplifikasi, sehingga proses ekstraksi
dan pemurnian sudah berhasil dilakukan.
Hasil ekstraksi dan pemurnian ini kemudian
direkombinasikan ke dalam vektor donor
menggunakan sistem gateway.

Gambar 8 Elektroforegram ekstraksi dan
pemurnian
promotor
gen
LEAFY dari gel; (a) promotor
gen LEAFY berukuran 1041
pb, (b) ukuran 702 pb, (c)
ukuran 349 pb, (M) marker 1
kb plus DNA Ladder.
Hasil Reaksi Rekombinasi BP dan LR
Promotor Gen LEAFY dengan Sistem
Gateway
Pengklonan bertujuan memperbanyak
DNA yang tersisip pada sel kompeten
(E.coli). Tahapan pengklonan pada sistem
gateway pada dasarnya bergantung pada dua

reaksi, yaitu BP rekombinasi dan LR
rekombinasi. Hasil ekstraksi dan pemurnian
(elusi) sebanyak 2 µL dicampurkan dengan
1 µL vektor donor (pDONRTM221) melalui
reaksi BP. Reaksi BP adalah upaya
menyisipkan hasil elusi (fragmen promotor
gen LEAFY) ke dalam vektor donor.
Promotor gen LEAFY hasil amplifikasi yang
memiliki situs attB1 dan attB2 akan
direaksikan
dengan
vektor
donor
(pDONRTM221) yang memiliki situs attP1
dan situs attP2 sebagai tempat rekombinasi.
Adanya situs untuk rekombinasi ini
menyebabkan kemungkinan tidak adanya
kesalahan
orientasi
gen
yang
direkombinasikan. Reaksi ini dikatalisis oleh
enzim campuran BP klonase yang
memindahkan DNA sisipan ke dalam vektor
donor yang menghasilkan suatu klon entri
(pENTR) dan diikat oleh dua situs attL.
Reaksi BP pada sistem gateway dapat dilihat
pada lampiran 4. Setelah BP rekombinasi,
selanjutnya di transformasikan ke dalam sel
kompeten E. coli galur XL1-Blue. Sel
kompeten adalah sel ya