Variasi Haplotipe Gen Cytochrome c Oxidase 1 dan 2 (COI dan COII) DNA Mitokondria pada Penggerek Batang Padi Kuning Scirpophaga incertulas (Walker) (Lepidoptera: Crambidae).

 
 

VARIASI HAPLOTIPE GEN Cytochrome c Oxidase 1 DAN 2
(COI DAN COII) DNA MITOKONDRIA PADA PENGGEREK
BATANG PADI KUNING Scirpophaga incertulas (Walker)
(Lepidoptera: Crambidae)

RUTH MARTHA WINNIE

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011

2
 

 

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN

SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Variasi Haplotipe Gen
Cytochrome c Oxidase 1 dan 2 (COI dan COII) DNA Mitokondria pada
Penggerek Batang Padi Kuning Scirpophaga incertulas (Walker) (Lepidoptera:
Crambidae) adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan
belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada Perguruan Tinggi mana pun.
Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan
maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan
dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.

Bogor, Agustus 2011

Ruth Martha Winnie
NIM G352090101

ii
 

 

ABSTRACT
RUTH MARTHA WINNIE. Haplotype Variations of Yellow Rice Stem
Borer Scirpophaga incertulas Based on Cytochrome c Oxidase 1 and 2 (COI
and COII) Mitochondria Genes. Supervised by RIKA RAFFIUDIN and I
MADE SAMUDRA.
Scirpophaga incertulas or yellow rice stem borer (Lepidoptera:
Crambidae) is one of the main insects caused damage yields in rice in Asia,
including Indonesia. In the first instar of S. incertulas larva, the moth cannot be
discriminated with other species of rice stem borers. Hence, a molecular approach
is needed for early detection purpose. Previous study found six haplotypes of
cytochrome oxidase 1 (COI) of S. incertulas from Java and four haplotypes of
cytochrome oxidase 2 COII gene in S. incertulas from West Java. The objective of
this research was to explore further the haplotype variations of the S. incertulas of
COI and COII genes in Central Java, Special Region of Yogyakarta (DIY), East
Java, and Bali, to fulfill the haplotypes variation data in Indonesia. The study
found three new haplotypes (haplotype 7, 8, and 9) of S. incertulas COI sequences
as well as three new haplotypes (haplotype 5, 6, and 7) of COII sequences. Those
new haplotypes of S. incertulas COI gene were found in Lumajang, Sleman, and
Pemalang regions. DNA alignment analyzes result based on S. incertulas COII
gene revealed three new haplotypes i.e. haplotype 5 in Mojokerto, Tabanan,

Lumajang, Pemalang, Klaten, Jember, and Kebumen region, haplotype 6 in
Probolinggo regions, and haplotype 7 in Situbondo region. Nucleotide variations
of moth S. incertulas COII were higher compare to COI gene. Database of COI
and COII haplotype variations of yellow rice stem borer can be used as markers to
differentiate S. incertulas with other species of rice stem borers during the first
larva instar for their early detection. Phylogenetic analysis of S. incertulas COII
revealed three clusters in Java and Bali.
Keywords: moth, Crambidae, early detection, mitochondrial genome, molecular
identification

iv
 

 

RINGKASAN
RUTH MARTHA WINNIE. Variasi Haplotipe Gen Cytochrome c Oxidase 1
dan 2 (COI dan COII) DNA Mitokondria pada Penggerek Batang Padi
Kuning Scirpophaga incertulas (Walker) (Lepidoptera: Crambidae).
Dibimbing oleh RIKA RAFFIUDIN dan I MADE SAMUDRA.

Penggerek batang padi kuning, Scirpophaga incertulas merupakan salah
satu serangga utama yang menyerang tanaman padi di Indonesia. Kerusakan
tanaman padi disebabkan oleh aktivitas larva S. incertulas di dalam batang padi.
Dua gejala kerusakan tanaman padi yang disebabkan oleh larva S. incertulas yaitu
gejala sundep pada fase vegetatif dan gejala beluk pada fase generatif. Gejala
sundep disebabkan oleh titik tumbuh tanaman padi yang mati pada fase vegetatif.
Sedangkan, gejala beluk disebabkan oleh pangkal malai tanaman padi yang
dikerat oleh larva serangga ini. Aktivitas larva S. incertulas pada fase generatif
tersebut menyebabkan pangkal malai menjadi mati sehingga bulir padi menjadi
hampa.
Pengendalian dapat dilakukan dengan deteksi dini untuk menentukan
spesies penggerek. Secara morfologi, fase larva instar ke-1 sulit dibedakan antar
spesies penggerek batang padi. Aplikasi molekular dengan mempelajari variasi
genetik dapat digunakan untuk deteksi dini untuk membedakan antar spesies
penggerek batang padi. Oleh karena itu, database molekular S. incertulas di Asia
diperlukan karena penyebaran melalui manusia memungkinkan serangga tersebut
tersebar dari tempat asalnya. Apabila terjadi dominansi S. incertulas di suatu
wilayah maka informasi variasi genetik dapat digunakan untuk mempelajari asal
usul serangga tersebut.
Genom DNA mitokondria (mtDNA) merupakan salah satu metode yang

digunakan untuk mempelajari variasi genetik dan hubungan kekerabatan
intraspesies. Gen mtDNA yang banyak digunakan sebagai penanda dalam analisis
variasi genetik adalah gen cytochrome c oxidase 1 dan 2 (COI dan COII). Pada
mtDNA, daerah COI dan COII memiliki variasi genetik yang sedikit konservatif,
serta tidak ada delesi dan insersi. Oleh karena itu, gen COI dan gen COII banyak
digunakan dalam studi molekular.
Data molekular mtDNA untuk genus Scirpophaga sudah dianalisis pada
penggerek batang tebu (S. excerptalis), penggerek batang padi putih (S. innotata),
dan S. incertulas. Analisis genetik mtDNA dilakukan pada S. excerptalis asal
India dan Papua Nugini dengan menggunakan penanda gen COII. Di Indonesia,
data sekuen mtDNA telah dianalisis untuk gen COI S. innotata dan S. incertulas.
Pada gen COI S. incertulas ditemukan enam haplotipe dari beberapa daerah di
Jawa. Selanjutnya, analisis variasi genetik menggunakan gen COII S. incertulas
menunjukkan ada empat haplotipe yang menyebar di Bogor, Karawang, Cirebon,
Indramayu (Jawa Barat). Oleh karena itu, analisis lebih lanjut variasi haplotipe
gen COI dan gen COII S. incertulas perlu dilakukan untuk melengkapi database
haplotipe serangga tersebut. Analisis lanjutan tersebut juga dapat digunakan untuk
mempelajari hubungan kekerabatan antar individu S. incertulas di Indonesia.
Koleksi sampel S. incertulas dilakukan pada beberapa lokasi di Jawa
Tengah, Daerah Istimewa Yogyakarta (DIY), Jawa Timur, dan Bali. Fase

vi
 

perkembangan S. incertulas yang digunakan untuk analisis DNA adalah fase
dewasa.
Tahapan analisis DNA S. incertulas adalah (1) ekstraksi DNA dengan
metode CTAB dan presipitasi alcohol, (2) amplifikasi DNA, dan (3) penentuan
runutan DNA. Tahapan analisis data DNA S. incertulas adalah (1) analisis
homologi (alignment) DNA dan asam amino S. incertulas, (2) analisis jarak
genetik, dan (3) analisis filogeni.
Sekuen individu S. incertulas untuk masing-masing gen COI dan gen COII
dapat dikelompokkan menjadi haplotipe umum dan haplotipe-haplotipe lain yang
merupakan gabungan data sekuen penelitian ini dengan data sekuen yang sudah
ada. Haplotipe umum ditentukan berdasarkan sekuen DNA yang paling banyak
ditemukan yaitu haplotipe 5 untuk gen COI dan haplotipe 1 untuk gen COII.
Fenomena tersebut menunjukkan bahwa berdasarkan penanda gen COI dan gen
COII kemungkinan disebabkan oleh adanya aliran gen maternal dari serangga
penggerek batang padi pada semua lokasi di Jawa dan Bali.
Fenomena lain pada masing-masing gen mtDNA penelitian ini adalah

ditemukan haplotipe baru. Jumlah individu S. incertulas untuk haplotipe baru gen
COII yaitu haplotipe 5 yang tersebar di semua lokasi penelitian ini. Hal yang
berbeda, pada gen COI S. incertulas untuk haplotipe baru (haplotipe 7, 8, 9) hanya
ditemukan satu individu untuk tiap lokasi. Haplotipe baru yang ditemukan pada
gen COII (haplotipe 5, 6, dan 7) menunjukkan variasi subtitusi nukleotida lebih
tinggi dibandingkan dengan gen COI. Tiga haplotipe baru pada gen COII
memiliki jumlah variasi subtitusi tiap individu antara 3-5 nukleotida yang
menghasilkan jarak genetik berkisar antara 0.000-0.016. Jarak genetik yang lebih
kecil (0.000-0.003) terjadi dari variasi yang sedikit pada gen COI dibandingkan
gen COII pada penggerek batang padi kuning hasil penelitian ini. Jarak genetik
yang lebih besar pada gen COII S. incertulas tersebut menghasilkan pohon
filogeni COII yang lebih memberikan sinyal filogeni dibandingkan gen COI. Hal
tersebut dapat dilihat berdasarkan panjang cabang (branch length) pada pohon
filogeni. Konstruksi pohon filogeni berdasarkan penanda gen COII S. incertulas
lebih memberikan informasi kekerabatan dibandingkan penanda gen COI.
Berdasarkan gen COII terdapat tiga kluster S. incertulas di Jawa dan Bali yaitu
kluster A (haplotime umum, haplotipe 4, dan haplotipe 2), kluster B (haplotipe 3
dan S. incertulas asal Sleman), dan kluster C (haplotipe 5 dan 6). Haplotipe 7
pada pohon filogeni tersebut merupakan basal dari ketiga kluster tersebut. Variasi
haplotipe baru S. incertulas yang ditemukan pada penelitian ini (haplotipe 5, 6 dan

7) menunjukkan pengelompokan yang terpisah dengan haplotipe yang sudah ada.
Filogeni S. incertulas menggunakan gen COI dan gen COII belum
memperlihatkan haplotipe yang spesifik dari tiap lokasi. Oleh karena itu,
eksplorasi variasi haplotipe lebih lanjut perlu dilakukan di Sumatera, Kalimantan,
dan Indonesia bagian timur.
Penentuan spesies penggerek batang padi Famili Crambidae dapat
dilakukan dengan menggunakan database sekuen gen COI dan gen COII S.
incertulas di Jawa dan Bali sudah ada pada penelitian ini. Penentuan spesies
penggerek batang padi dilakukan pada fase instar ke-1, karena morfologi larva
instar ke-1 sulit dibedakan antar spesies. Berdasarkan sekuen hasil penelitian ini,
deteksi awal selanjutnya dapat menggunakan metode lebih mudah, cepat,
ekonomis yaitu Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP). Metode

 

RFLP tersebut dapat dilakukan untuk eksplorasi lanjutan database variasi
haplotipe S. incertulas di Indonesia. Berdasarkan sekuen DNA gen COII hasil
penelitian ini dapat dilanjutkan dengan metode RFLP yaitu dengan menganalis
jenis enzim restriksi yang memotong gen COII. Pola pita DNA hasil pemotongan
gen COII dengan enzim restriksi dipilih pola yang spesifik yang mencirikan

masing-masing spesies penggerek batang padi.
Pemantauan S. incertulas dengan melakukan analisis DNA digunakan
sebagai penanda genetik organisme. Penelitian ini memberikan data dasar bahwa
sekuen DNA gen COII pada ngengat S. incertulas memiliki variasi yang lebih
tinggi dibandingkan gen COI. Dengan demikian, untuk analisis atau aplikasi
selanjutnya dapat menggunakan gen COII.
 
 

 

 

viii
 

 

©Hak Cipta milik IPB, tahun 2011
Hak cipta dilindungi Undang-Undang

Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik,
atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tidak merugikan kepentingan yang
wajar IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya
tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB

x
 

 

VARIASI HAPLOTIPE GEN Cytochrome c Oxidase 1 DAN 2
(COI DAN COII) DNA MITOKONDRIA PADA PENGGEREK
BATANG PADI KUNING Scirpophaga incertulas (Walker)
(Lepidoptera: Crambidae)

RUTH MARTHA WINNIE

Tesis
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada Program Studi Biosains Hewan

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011

xii
 

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr. Ir. Idham Sakti Harahap, M. Si.

ii
 

I dedicated this Master Thesis for Mom and Dad:
Dolly Olga Tenny T. Tahalele, dr. and I Wayan Sariasa, Ir.

 

iv
 

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan YME atas segala karunia
dan berkat-Nya sehingga karya ilmiah ini dapat diselesaikan.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Ibu Dr. Ir. Rika Raffiudin,
M.Si. dan Bapak Dr. Ir. I Made Samudra, M. Sc. yang telah banyak memberikan
saran serta bimbingan. Penulis juga mengucapkan terimakasih kepada Bapak Dr.
Ir. Idham Sakti Harahap, M. Si. selaku penguji luar komisi pada ujian tesis atas
saran dan masukan untuk tesis ini. Selain itu, ucapan terimkasih penulis berikan
kepada Bapak Dr. Ir. Achmad Farajallah, M. Si. sebagai wakil dari Mayor
Biosains Hewan atas kehadirannya pada ujian tesis saya serta saran dan masukan
membangun yang diberikan untuk tesis ini. Ucapan terimakasih penulis kepada
IMHERE B2C-IPB tahun 2010/2011 yang telah mendanai penelitian ini atas nama
Dr. Ir. Rika Raffiudin, M.Si., Dr. Ir. I Made Samudra, M. Sc., dan Dr. Ir. Idham
Sakti Harahap, M. Si. dengan judul “Penggerek Batang Padi Scirpophaga
incertulas di Jawa dan Bali: Variasi DNA Mitokondria dan Karakterisasi Protein
Pengikat Feromon sebagai Dasar Biokontrol Hama Padi”. Ucapan terimakasih
penulis sampaikan kepada Dinas Pertanian Bali, Balai Pengkajian Teknologi
Pertanian (BPTP) Yogyakarta, BPTP Malang, dan BPTP Bali untuk informasi
lokasi penelitian ini. Penulis juga mengucapkan terimakasih kepada Ibu Tri
Martini, M. Si., Bapak M. Ali, M. Si., Bapak Arif Rohmatullah, S. Si., M. Si.,
Bapak Puji, Dzulfaqor, S. Si, Cahyo Nugroho, S. Si, dan Jazirotul Fitriyati, M. Si
atas bantuanya selama di lapangan untuk pengambilan sampel penelitian ini.
Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada staf pengajar Biosains
Hewan (BSH) atas semua ilmu, pengalaman, bimbingan, nasihat, dan dorongan
yang telah diberikan. Ucapan terimakasih untuk teman-teman Biosains Hewan
2009 dan Zoo Corner atas persahabatan yang indah selama ini. Ucapan terima
kasih yang tulus penulis berikan untuk Orangtua, Kakak, serta Adik atas segala
doa, kasih sayang, dan dukungannya kepada penulis.
Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat bagi pengembangan ilmu
pengetahuan.
Bogor, Agustus 2011

Ruth Martha Winnie

 

vi
 

RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 24 Juni 1986, merupakan putri
dari pasangan Bapak Ir. I Wayan Sariasa dan Ibu dr. Dolly Olga Tenny Tahalele.
Penulis adalah anak ketiga dari empat bersaudara. Setelah tamat dari SMUN 1
Pamulang pada tahun 2004, penulis diterima di Institut Pertanian Bogor (IPB)
melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI) di Program Studi Biologi.
Penulis menyelesaikan studi strata S1 tersebut pada tahun 2008.
Pada tahun 2009 penulis melanjutkan perkuliahan u n t u k s t r a t a S 2
di Sekolah Pascasarjana IPB, Mayor Biosains Hewan (BSH), Bagian Fungsi
dan Perilaku Hewan. Pada masa perkuliahan, penulis pernah menjadi asisten
praktikum mata kuliah Mikroteknik, Avertebrata, dan Fungsi Hayati Hewan untuk
mahasiswa S1 Biologi. Pada tahun 2010 penulis menjadi peserta seminar
internasional ATBC 2010 dengan judul poster “Haplotype Variations of
Scirpophaga incertulas on 16S rRNA mitochondria gene”.

 

viii
 

DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL................................................................................................... x
DAFTAR GAMBAR ............................................................................................ xii
DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................... xiv
PENDAHULUAN .................................................................................................. 1
Latar Belakang..................................................................................................... 1
Tujuan Penelitian ................................................................................................. 3
Hipotesis Penelitian ............................................................................................. 3
Manfaat Penelitian ............................................................................................... 3
TINJAUAN PUSTAKA ......................................................................................... 5
Penggerek Batang Padi di Indonesia ................................................................... 5
Biologi S. incertulas (Walker)............................................................................. 5
Siklus Hidup S. incertulas ................................................................................... 7
Genom mitokondria ............................................................................................. 8
BAHAN DAN METODE ..................................................................................... 11
Waktu dan Tempat Penelitian ........................................................................... 11
Objek Penelitian ................................................................................................ 11
Tahapan Analisis DNA S. incertulas................................................................. 11
Ekstraksi DNA ............................................................................................... 11
Amplifikasi DNA........................................................................................... 13
Elektroforesis dan visualisasi DNA ............................................................... 14
Sekuen DNA .................................................................................................. 14
Analisis Data DNA S. incertulas ....................................................................... 14
Analisis Homologi DNA S. incertulas .............................................................. 15
Gen COI ......................................................................................................... 15
Gen COII ....................................................................................................... 15
Analisis Homologi Asam Amino Putataive S. incertulas ................................. 16
Analisis Jarak Genetik ....................................................................................... 16
Analisis Filogeni................................................................................................ 17
HASIL ................................................................................................................... 19
Koleksi Penggerek Batang Padi Kuning S. incertulas ...................................... 19
Gen COI S. incertulas ....................................................................................... 21
Amplifikasi DNA gen COI S. incertulas ....................................................... 21
Sekuen DNA gen COI S. incertulas .............................................................. 22
Analisis homologi DNA gen COI S. incertulas............................................. 24
Analisis homologi asam amino putative gen COI S. incertulas .................... 27
Analisis jarak genetik dan filogeni gen COI .................................................. 27
Gen COII S. incertulas ...................................................................................... 30

 

Amplifikasi DNA gen COII S. incertulas ...................................................... 30
Sekuen gen COII S. incertulas ....................................................................... 31
Analisis homologi DNA gen COII S. incertulas ............................................ 32
Analisis homologi asam amino putative gen COII S. incertulas ................... 36
Analisis jarak genetik gen COII ..................................................................... 36
Analisis filogeni gen COII ............................................................................. 38
PEMBAHASAN.................................................................................................... 41
Variasi Gen COI dan Gen COII S. incertulas di Jawa dan Bali ........................ 41
Deteksi Dini S. incertulas .................................................................................. 43
Aplikasi dan Rencana Penelitian Selanjutnya.................................................... 45
SIMPULAN ........................................................................................................... 47
DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................ 49
LAMPIRAN .......................................................................................................... 53 

x

x
 

DAFTAR TABEL
Halaman
1 Primer yang digunakan untuk amplifikasi gen COI dan gen COII S. incertulas
dan posisi primer berdasarkan mtDNA O. furnacalis ..................................... 13
2 Database haplotipe gen COI S. incertulas yang ada di GenBank .................... 15
3 Database haplotipe gen COII S. incertulas berdasarkan penelitian Raffiudin
dan Samudra (2010) ........................................................................................ 16
4 Database gen COI Crambidae (outgroup) yang diperoleh dari GenBank untuk
analisis filogeni pada penelitian ini ................................................................. 17
5 Database gen COII Crambidae (outgroup) yang diperoleh dari GenBank untuk
analisis filogeni pada penelitian ini .................................................................. 17
6 Data lokasi koleksi S. incertulas yang dilakukan pada penelitian ini .............. 20
7 Gabungan data haplotipe gen COI S. incertulas di Jawa Barat, Jawa Tengah,
Daerah Istimewa Yogyakarta, Jawa Timur, dan Bali ....................................... 25
8 Posisi nukleotida gen COI S. incertulas penelitian ini dengan database sekuen
nukleotida berdasarkan GenBank yang menunjukkan variasi haplotipe.......... 26
9 BLAST-N gen COI S. incertulas haplotipe baru pada penelitian ini
menggunakan program BLAST-N ................................................................... 26
10 BLAST-P gen COI S. incertulas haplotipe baru penelitian ini menggunakan
program BLAST-P ........................................................................................... 27
11 Jarak genetik gen COI S. incertulas penelitian ini, data GenBank, serta S.
innotata (Si.AB495264) ................................................................................... 28
12 Gabungan data haplotipe gen COII S. incertulas di Jawa Barat, Jawa Tengah,
DIY, Jawa Timur, dan Bali .............................................................................. 34
13 Posisi sekuen DNA gen COII S. incertulas penelitian ini dengan database
sekuen gen COII S.incertulas Raffiudin & Samudra (2010)............................ 35
14 BLAST-N gen COII S. incertulas pada haplotipe baru pada penelitian ini
menggunakan program BLAST-N ................................................................... 35
15 BLAST-P gen COII S. incertulas haplotipe baru pada penelitian ini
menggunakan program BLAST-P .................................................................... 38
16 Jarak genetik gen COII S. incertulas penelitian ini dan database S. incertulas
Raffiudin dan Samudra (2010) terhadap S. excerptalis (Se.India.AY320507
dan Se.PNG.AY320508) ................................................................................ 39

 

xii

xii

 

DAFTAR GAMBAR
 

Halaman
1 Penggerek batang padi kuning S. incertulas: a) betina, b) jantan (Khan et al.
1991). .................................................................................................................. 6
2 Perkembangan S. incertulas dari telur sampai dewasa (Pathak & Khan 1994;
Taylor 1996). ...................................................................................................... 8
3 Genom DNA mitokondria lengkap O. furnacalis (Lepidoptera: Crambidae)
(Coates 2004). .................................................................................................... 8
4 Posisi primer forward Mt D4 dan primer reverse Mt D9 untuk amplifikasi gen
COI S. incertulas serta primer forward A-298 dan primer reverse Bt-LYS
untuk amplifikasi gen COII S. incertulas. ........................................................ 13
5 Gejala kerusakan padi akibat serangan S. incertulas. A) Sundep; B) Beluk. ... 19
6 Peta lokasi koleksi S. incertulas di Jawa Tengah, Daerah Istimewa Yogyakarta
(DIY), Jawa Timur, dan Bali. ........................................................................... 21
7 Amplikon gen COI S. incertulas.. ..................................................................... 22
8 Amplikon gen COI S. incertulas.. ..................................................................... 22
9 Sekuen gen COI S. incertulas asal Tabanan (Sc1TBN) dan deduksi asam amino
.......................................................................................................................... 23
10 Skema alignment sekuen DNA gen COI S. incertulas antara data hasil
penelitian ini dengan data GeneBank.. ............................................................. 25
11 Konstruksi pohon filogeni S. incertulas gen COI menggunakan metode
Neighbor Joining dengan bootstrap 1000x. ..................................................... 29
12 Amplikon gen COII S. incertulas. ................................................................... 30
13 Amplikon gen COII S. incertulas. ................................................................... 30
14 Sekuen gen COII S. incertulas asal Probolinggo (Sc1 PBL) dan deduksi asam
amino.............................................................................................................. 31
15 Skema alignment sekuen DNA gen COII S. incertulas antara data hasil
penelitian ini dengan data S. incertulas Raffiudin dan Samudra (2010). ...... 33
16 Alignment asam amino putative gen COII S. incertulas peneltian ini ............ 37
17 Konstruksi pohon filogeni S. incertulas berdasarkangen COII menggunakan
metode Neighbour Joining dengan bootstrap 1000x. .................................... 40

 

xiv

xiv

 

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman
1 Kromatogram sekuen gen COI mtDNA S. incertulas (Sc1TBN) menggunakan
primer forward Mt D4 ...................................................................................... 55
2 Kromatogram sekuen gen COI mtDNA S. incertulas (Sc1TBN) menggunakan
primer reverse Mt D9 ....................................................................................... 56
3 Alignment sekuen gen COI S. incertulas penelitian ini (Tabel 6) dengan sekuen
S. incertulas pada GenBank (Tabel 2).............................................................. 57
4 Kromatogram sekuen gen COII mtDNA S. incertulas (Sc1PBL) menggunakan
primer forward A-298 ...................................................................................... 64
5 Kromatogram sekuen gen COII mtDNA S. incertulas (Sc1PBL) menggunakan
primer forward Bt-LYS ...................................................................................... 65
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

 

 

1

PENDAHULUAN

Latar Belakang
Penggerek batang padi kuning, Scirpophaga incertulas (Walker)
(Lepidoptera: Crambidae), merupakan salah satu serangga utama yang menyerang
tanaman padi di Indonesia (Hattori & Siwi 1986). Larva S. incertulas merusak
tanaman padi pada semua fase pertumbuhan, yaitu pada masa persemaian, fase
vegetatif, dan fase generatif. Kerusakan tanaman padi disebabkan oleh aktivitas
larva S. incertulas di dalam batang padi. Dua gejala kerusakan tanaman padi yang
disebabkan oleh larva S. incertulas yaitu gejala sundep pada fase vegetatif dan
gejala beluk pada fase generatif. Gejala sundep disebabkan oleh titik tumbuh
tanaman padi yang mati pada fase vegetatif. Sedangkan, gejala beluk disebabkan
oleh pangkal malai tanaman padi yang dikerat oleh larva serangga ini. Aktivitas
larva S. incertulas pada fase generatif tersebut menyebabkan pangkal malai
menjadi mati sehingga bulir padi menjadi hampa (Pathak & Khan 1994).
Menurut penelitian Kurniati dan Hendarsih (2007), S. incertulas
merupakan penggerek batang padi yang dominan (outbreak) dibandingkan dengan
spesies penggerek batang padi lain. Larva S. incertulas menyerang tanaman padi
dan menyebabkan kerusakan sebesar 95% dari luas arael tanaman padi 300 000 ha
di beberapa daerah di pulau Jawa.
Pemantauan terhadap serangan S. incertulas yang merusak tanaman padi
perlu dilakukan untuk mengetahui tingkat serangan serangga tersebut. Tingkat
serangan S. incertulas termasuk dibawah ambang ekomoni apabila 1 anakan padi
mengalami kerusakan per 10 rumpun padi atau 1 kelompok telur per 1 m2
(Sudjianto 2010). Data hasil pemantauan S. incertulas tersebut dapat digunakan
untuk pemilihan pengendalian yang efektif.
Pengendalian yang aman terhadap serangga ini dapat dilakukan dengan
penggunaan perangkap feromon seks (Hendarsih & Usyati 1999; Cork et al. 2007)
atau pengambilan kelompok telur S. incertulas secara manual (Sudjianto 2010).
Selain itu, pengendalian dapat juga dilakukan dengan deteksi dini untuk
menentukan spesies penggerek. Secara morfologi, fase larva instar ke-1 sulit
dibedakan antar spesies penggerek batang padi. Aplikasi molekular dengan

2
 

mempelajari variasi genetik dapat digunakan untuk deteksi dini untuk
membedakan antar spesies penggerek batang padi. Deteksi dini secara molekular
telah dilakukan pada parasitoid dari larva penggerek batang jagung asal Eropa
(Ostrinia nubilalis) (Agusti et al. 2005). Selain itu, aplikasi molekular dilakukan
untuk identifikasi lima spesies kutu daun (Hemiptera: Pseudococcidae) yang
menyerang tanaman jeruk pada fase telur dan nimpa (Pieterse et al. 2010).
Distribusi S. incertulas adalah di wilayah Oriental dan Australia (Khan et
al. 1991; Pathak & Khan 1994). Database molekular S. incertulas di Asia penting
karena penyebaran melalui manusia memungkinkan serangga tersebut tersebar
dari tempat asalnya. Apabila terjadi dominansi S. incertulas di suatu wilayah
maka informasi variasi genetik dapat digunakan untuk mempelajari asal usul
serangga tersebut. Pengetahuan mengenai asal usul telah dipelajari pada
penggerek batang jagung (O. furnacalis) asal Jepang. Penelitian ini menyimpulkan bahwa terdapat dua garis asal usul yaitu kelompok A yang berasal dari
Jepang dan Cina, serta kelompok B yang berasal dari Jepang dan Filipina
(Hoshizaki et al. 2008a).
DNA mitokondria (mtDNA) merupakan salah satu metode yang
digunakan untuk mempelajari variasi genetik dan hubungan kekerabatan
intraspesies (Ridley 1996). Pada mtDNA tidak terjadi rekombinasi gen karena
pola pewarisan diturunkan secara maternal. Hal tersebut dapat menunjukkan
bahwa hubungan kekerabatan berdasarkan mtDNA antar individu S. incertulas
berasal dari aliran gen induk maternal serangga tersebut. Gen mtDNA yang
banyak digunakan sebagai penanda dalam analisis variasi genetik adalah gen
cytochrome c oxidase 1 dan 2 (COI dan COII) (King et al. 2002; Simon et al.
2006; Kourti 2006). Gen COI dan gen COII merupakan gen penyandi protein.
Pada mtDNA, daerah COI dan COII memiliki variasi genetik yang sedikit
konservatif, serta tidak ada delesi dan insersi (Hebert et al. 2003). Oleh karena itu,
gen COI dan gen COII banyak digunakan dalam studi molekular.
Data molekular mtDNA untuk genus Scirpophaga sudah dianalisis pada
penggerek batang tebu (S. excerptalis), penggerek batang padi putih (S. innotata),
dan S. incertulas. Analisis genetik mtDNA dilakukan pada S. excerptalis asal
India dan Papua Nugini dengan menggunakan penanda gen COII (Lange et al.

3

2004). Di Indonesia, data sekuen mtDNA telah dianalisis untuk gen COI S.
innotata (No. Akses GenBank: AB495264) dan S. incertulas. Pada gen COI S.
incertulas ditemukan enam haplotipe dari beberapa daerah di Jawa (No. Akses
GenBank:

AB495265-AB495274).

Selanjutnya,

analisis

variasi

genetik

menggunakan gen COII S. incertulas menunjukkan ada empat haplotipe yang
menyebar di Bogor, Karawang, Cirebon, Indramayu (Jawa Barat) (Raffiudin &
Samudra 2010). Oleh karena itu, analisis lebih lanjut variasi haplotipe gen COI
dan gen COII S. incertulas perlu dilakukan untuk melengkapi database haplotipe
serangga tersebut. Analisis lanjutan tersebut juga dapat digunakan untuk
mempelajari hubungan kekerabatan antar individu S. incertulas di Indonesia.

Tujuan Penelitian
Tujuan penelitian ini adalah (1) mengeksplorasi lebih lanjut data variasi
haplotipe intraspesies S. incertulas di Jawa Tengah, DIY, Jawa Timur, dan Bali
dengan menggunakan penanda gen COI dan gen COII mtDNA; (2) menganalisis
filogeni antar individu S. incertulas di Indonesia berdasarkan gen COI dan gen
COII.
 

Hipotesis Penelitian
Berdasarkan gen COI dan gen COII S. incertulas ditemukan variasi
haplotipe baru di Jawa Tengah, DIY, Jawa Timur, dan Bali. Selain itu, variasi
haplotipe baru S. incertulas yang ditemukan pada penelitian ini menunjukkan
pengelompokan yang terpisah dengan haplotipe yang sudah ada.

Manfaat Penelitian
Penelitian ini akan melengkapi database haplotipe gen COI dan COII pada
mtDNA S. incertulas di Indonesia. Selain itu, data haplotipe tersebut dapat
digunakan untuk deteksi awal spesies penggerek batang padi serta digunakan
untuk mengetahui asal-usul S. incertulas.

4
 

5

TINJAUAN PUSTAKA
Penggerek Batang Padi di Indonesia
Penggerek batang padi merusak tanaman padi pada semua tahap
pertumbuhan mulai dari masa persemaian, fase vegetatif, dan fase generatif. Larva
dari penggerek batang padi merupakan penyebab utama kerusakan tanaman padi
(Pathak & Khan 1994).
Berdasarkan morfologi, ada enam jenis larva penggerek batang padi di
Indonesia yaitu penggerek batang padi kuning (S. incertulas), penggerek batang
putih (S. innotata), penggerek batang padi bergaris (Chilo suppressalis),
penggerek batang padi kepala hitam (C. polychrysus), C. auricilius, dan
penggerek batang padi merah muda (Sesamia inferens) (Hattori & Siwi 1996).
Kelompok penggerek batang Scirpophaga dan Chilo termasuk kedalam Famili
Crambidae, sedangkan kelompok penggerek batang Sesamia termasuk kedalam
Famili Noctuidae (Pathak & Khan 1994).
Serangga S. incertulas dominan sebagai penggerek batang padi
dibandingkan dengan spesies penggerek batang padi lain. Serangga S. incertulas
yang menyerang tanaman padi sebesar 95% dari luas arael tanaman padi yaitu 300
000 ha di beberapa daerah di pulau Jawa (Kurniati & Hendarsih 2007). Menurut
Sudjianto (2010), tingkat serangan S. incertulas termasuk dibawah ambang
ekomoni apabila 1 anakan padi mengalami kerusakan per 10 rumpun padi atau 1
kelompok telur per 1 m2.
Biologi S. incertulas (Walker)
Distribusi geografis S. incertulas adalah Afghanistan, Nepal, India, Sri
Lanka, Bangladesh, Myanmar, Vietnam, Thailand, Malaysia, Singapura,
Indonesia, Filipina, Hongkong, Taiwan, China, Jepang (Khan et al. 1991), dan
Australia (Pathak & Khan 1994). Di Indonesia, S. incertulas diketahui menyebar
di Lampung (Sumatera Selatan), Jawa, Bali, dan Kalimantan (Hattori & Siwi
1986).
Penggerek batang padi kuning, S. incertulas, termasuk ke dalam Kelas
Insecta, Ordo Lepidoptera, Superfamili Pyraloidea, Famili Crambidae, Subfamili

6
 

Schoenobiinae, dan Genus Scirphopaga (Kristensen et al. 2007). Dalam
klasifikasi Pyraloidea, Crambidae ditempatkan sebagai subfamili dari Pyralidae
yaitu Crambinae. Namun, berdasarkan penelitian Solis (2007) yang menyatakan
bahwa Pyraloidea dibagi menjadi dua famili yaitu Crambidae dan Pyralidae.
Pembagian dua famili tersebut berdasarkan morfolologi anggota Crambidae yang
memiliki dua membran tympani yang terbuka dengan lubang anteromedial lebar
dan menyatu yang disebut praecinctorium. Sedangkan, pada anggota Pyralidae
memiliki membran tympani yang tertutup dan tidak terdapat praecintorium.
S. incertulas jantan dan betina dapat dibedakan secara morfologi dari
ukuran sayap (Gambar 1). Berdasarkan morfologi sayap S. incertulas, ukuran
sayap betina lebih besar daripada ukuran sayap jantan. Ukuran sayap betina 24-36
mm, sedangkan ukuran sayap jantan 20-33 mm. Palpus labium berwarna kuning.
Segmen terakhir pada abdomen berwarna putih. Sayap bagian depan betina
berwarna pucat kekuning-kuningan sampai gelap kekuning-kuningan dengan titik
berwarna hitam di bagian discal. Frenulum berambut tebal. Sayap belakang jantan
memiliki fuscous dibagian samping dan dorsal dengan warna coklat dan terdapat
titik-titik gelap di bagian tengah sayap (Khan et al. 1991).

Gambar 1 Penggerek batang padi kuning S. incertulas: a) betina, b) jantan (Khan
et al. 1991).

7

Siklus Hidup S. incertulas
Perkembangan S. incertulas sangat tergantung dari kondisi lingkungan
terutama suhu udara (Stevenson et al. 2005). Penggerek batang padi kuning, S.
incertulas, memiliki fase perkembangan lengkap mulai telur, larva, pupa, sampai
dengan dewasa (Gambar 2). Ngengat S. incertulas betina meletakkan kelompok
telur yang ditutupi rambut-rambut halus di ujung daun padi. Jumlah telur yang
diletakkan berkisar 50-200 telur tiap tempat dari total 150-600 telur yang
dikeluarkan. Waktu inkubasi telur 5-9 hari dengan suhu optimum yaitu 24-29 oC
(Taylor 1996). Telur akan menetas pada siang hari dengan suhu optimum yaitu
24-29 oC dan kelembaban kurang dari 70%. Arah penetasan telur bersifat
geotropik negatif, larva akan bergerak keluar dengan merayap naik ke bagian
ujung tanaman padi. Lama perkembangan larva S. incertulas 17-46 hari. Larva S.
incertulas terdiri atas 4-7 instar sebelum berkembang sempurna (Pathak & Khan
1994). Jumlah instar tergantung dari kondisi suhu. Pada kondisi suhu rendah
jumlah instar larva akan lebih banyak dibandingkan dengan kondisi suhu tinggi.
Larva S. incertulas akan melalui lima tahapan instar pada suhu 23-29 oC,
sedangkan empat tahapan instar akan dilalui larva S. incertulas apabila suhu udara
berkisar antara 29-30 oC (Pathak & Khan 1994, Stevenson et al. 2005).
Perkembangan fase pupa S. incertulas terjadi di dalam pangkal batang padi.
Perkembangan fase pupa tejadi selama 9-12 hari dengan suhu optimum 15-16 oC.
Setelah fase pupa, S. incertulas dewasa akan berkembang selama 2-5 hari (Pathak
& Khan 1994).
Penggerek batang padi kuning, S. incertulas, merupakan serangga endemik
yang setiap waktu dapat melakukan invasi. Ciri-ciri S. incertulas melakukan
invasi berupa perilaku terbang yang bertujuan untuk melakukan perilaku kawin.
Perilaku kawin tersebut terjadi pada sore hari hingga malam hari, setelah 35 hari
masa hujan.

Serangga S. incertulas melakukan perilaku terbang selama dua

minggu, yang berorientasi di daerah-daerah persemaian tanaman padi (Khan et al.
1991) .

8
 

Gambar 2

Perkembangan S. incertulas dari telur sampai dewasa (Pathak &
Khan 1994; Taylor 1996).

Genom mitokondria
Mitokondria merupakan organel di dalam sel eukariot yang berfungsi
sebagai tempat proses metabolisme aerob. Isolasi DNA mitokondria (mtDNA)
serangga mudah dilakukan karena gen-gen pada mitokondria bersifat konservatif
(Hoy 2003). Analisis genom mitokondria lengkap pada penggerek batang jagung
asal Cina, O. furnacalis, menunjukkan ukuran sebesar 14 536 pasang basa (pb).
Genom mitokondria O. furnacalis terdiri atas 13 pengkode protein (ORFs atau
Open Reading Frames), 21 tRNA, gen large ribosomal RNA (rrnL atau 16S), dan
gen small ribosomal RNA (rrnS atau 12S) (Gambar 3) (Coates et al. 2005).

Gambar 3

Genom DNA mitokondria lengkap O. furnacalis (Lepidoptera:
Crambidae) (Coates 2004).

9

Genom mitokondria banyak digunakan sebagai penanda dalam analisis
variasi genetik (Simon et al. 2006; Hoshizaki et al. 2008b; Pieterse et al. 2010).
Pada mtDNA tidak terjadi rekombinasi gen karena pola pewarisan diturunkan
secara maternal (Ridley 1996). Gen-gen pada mtDNA yang dapat digunakan
sebagai penanda dalam analisis variasi genetik adalah gen cytochrome c oxidase 1
dan 2 (COI dan COII) (Simon et al. 2006). Gen COI dan COII merupakan gen
penyandi protein. Pada mtDNA, daerah COI dan COII memiliki variasi genetik
yang sedikit konservatif, serta tidak ada delesi dan insersi. Selain itu, gen COI
dapat digunakan sebagai penanda molekular untuk DNA barcode (Hebert et al.
2003).
Analisis variasi genetik menggunakan gen COI dan gen COII pada
serangga penggerek batang kelompok Crambidae telah banyak dilakukan. Data
variasi genetik pada gen COI dan gen COII C. suppressalis diketahui berturutturut ada 27 dan 24 haplotipe di dataran tinggi dan rendah Cina. Berdasarkan data
haplotipe C. suppressalis di Cina tersebut terbagi menjadi tiga kelompok yaitu
kelompok bagian tengah, kelompok bagian utara dan timur laut, dan kelompok
bagian barat daya (Meng et al. 2008). Penelitian Hoshizaki et al. (2008) berhasil
menentukan 29 haplotipe berdasarkan gabungan data sekuen gen COII O.
funacalis (penggerek batang jagung) di Jepang, Cina, dan Filipina. Data variasi
haplotipe tersebut menunjukkan ada dua garis asal-usul O. furnacalis di Jepang
yaitu garis asal usul A yang berasal dari Jepang dan Cina, serta garis asal-usul B
yang terdiri atas Jepang dan Filipina.
Data variasi genetik pada mtDNA dapat digunakan untuk mempelajari
hubungan kekerabatan interspesies. Lange et al. (2004) melakukan penelitian
menggunakan gen COII penggerek batang tebu (S. excerptalis) asal India dan
Papua Nugini. Analisis hubungan kekerabatan dilakukan antar data gen COII S.
excerptalis penelitian Lange et al. (2004) dan data gen COII spesies penggerek
lain yang diperoleh dari GenBank. Berdasarkan penanda gen COII tersebut
menunjukkan bahwa S. excerptalis termasuk ke dalam kluster Crambidae, serta
terpisah dengan spesies penggerek lain yang termasuk ke dalam kluster Pyralidae.
 

10
 

11

BAHAN DAN METODE
 

Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Juli 2010 sampai dengan Mei 2011.
Koleksi sampel dilakukan pada beberapa lokasi di Jawa Tengah, Daerah Istimewa
Yogyakarta (DIY), Jawa Timur, dan Bali. Analisis DNA dan analisis data
dilakukan di Bagian Fungsi Hayati dan Perilaku Hewan, Departemen Biologi,
FMIPA, Institut Pertanian Bogor.

Objek Penelitian
Objek penelitian yang digunakan yaitu penggerek batang padi kuning S.
incertulas yang dikoleksi dari beberapa lokasi pengambilan sampel. Fase
perkembangan S. incertulas yang digunakan untuk analisis DNA yaitu fase
dewasa. Sampel S. incertulas dikoleksi dengan menggunakan jaring serangga dan
secara manual dengan menggunakan bantuan tabung reaksi. Sampel S. incertulas
yang diperoleh disimpan di dalam tabung 1.5 ml yang berisi etanol absolut.

Tahapan Analisis DNA S. incertulas

Ekstraksi DNA
Sebelum ekstraksi DNA, sampel S. incertulas yang disimpan di dalam
etanol absolut dipindahkan ke dalam tabung 1.5 ml yang berisi 500 µl Tris HClEDTA (TE) 0.5 mM (Tris HCl 2 M; EDTA 0.2 M; air destilata) untuk
menggantikan etanol absolut dari jaringan sampel. Metode ekstraksi DNA yang
digunakan adalah metode Cetyl Trimetil Ammonium Bromide (CTAB) dan
presipitasi alkohol (Sambrook et al. 1989) dengan modifikasi berdasarkan
Raffiudin dan Crozier (2007). Sumber DNA yang diekstraksi yaitu jaringan
bagian toraks S. incertulas. Bagian toraks S. incertulas dengan bagian tubuh lain
(kepala, abdomen, dan tungkai) dipisahkan menggunakan scalpel steril.
Kemudian, toraks dimasukkan ke dalam tabung 1.5 ml dan tabung direndam di
dalam kotak berisi nitrogen cair (15 menit). Nitrogen cair berfungsi untuk
membekukan jaringan, sehingga mempermudah proses penghancuran toraks.

12
 

Toraks di dalam tabung digerus menggunakan grinder steril. Selanjutnya, toraks
di dalam tabung ditambahkan 300 µl larutan CTAB 0.2 % (b/v) (7.5 ml 1M TrisHCl pH 8; 3 ml 0.5 M NaEDTA pH 8; 6.135 g NaCl; 1.5 g CTAB; air hingga 75
ml). Proses berikutnya, supernatan ditambahkan 10 µl Proteinase K (5mg/ml).
Fungsi Proteinase K yaitu untuk menghancurkan protein. Kemudian, sampel
diinkubasi pada suhu 55 oC (2 jam). Setelah inkubasi, campuran disentrifugasi
dengan kecepatan 13 000 rpm (10 menit). Supernatan yang berisi DNA
dipindahkan ke dalam tabung 1.5 ml baru.
Supernatan yang berisi DNA ditambahkan 300 µl larutan Phenol
Chloroform Isoamyl alcohol (PCI) di dalam ruang asam, lalu disentrifugasi
dengan kecepatan 13 000 rpm (5 menit). Larutan PCI dibagian bawah tabung
dibuang, lalu disentrifugasi dengan kecepatan 13 000 rpm (1 menit). Supernatan
yang berisi DNA dipindahkan ke dalam tabung 1.5 ml baru. Selanjutnya,
supernatan tersebut ditambahkan kembali 240 µl larutan PCI, putar perlahan lalu
disentrifugasi dengan kecepatan 13 000 rpm (3 menit). Larutan PCI dibagian
bawah tabung dibuang dan disentrifugasi dengan kecepatan 13 000 rpm (1 menit),
lalu supernatan yang berisi DNA dipindahkan ke dalam tabung 1.5 ml baru dan
disentrifugasi dengan kecepatan 13 000 rpm (1 menit) untuk memastikan tidak
ada lagi fenol. Tahap berikutnya, supernatan yang berisi DNA ditambahkan 240
µl larutan Chloroform Isoamyl Alcohol

(CIAA), lalu disentrifugasi dengan

kecepatan 13 000 rpm (3 menit). Kemudian, larutan CIAA di bagian bawah
tabung dibuang, sentrifugasi kembali dengan kecepatan 13 000 rpm (1 menit).
Supernatan yang berisi DNA di bagian atas tabung dipindahkan ke tabung 1.5 ml
baru dan ditambahkan 360 µl isopropanol murni untuk proses presipitasi DNA.
Proses presipitasi DNA dilakukan pada suhu -4

o

C (overnight).

Selanjutnya, supernatan disentrifugasi dengan kecepatan 13 000 rpm (30 menit)
pada suhu 4 oC, lalu isopropanol dibuang. Endapan DNA ditambahkan 300 µl
alkohol 70% (v/v) steril, sentrifugasi dengan kecepatan 13 000 rpm (10 menit).
Kemudian, etanol 70% steril dibuang dan endapan DNA dikeringkan dengan cara
divakum (30 menit). Endapan DNA yang diperoleh dilarutkan dalam TE 0.5 mM,
lalu disimpan pada suhu -4 0C.

13

Amplifikasi DNA
Amplifikasi DNA hasil ekstraksi dilakukan untuk dua individu S.
incertulas dari tiap lokasi pengambilan sampel. Proses amplifikasi menggunakan
mesin PCR (ESCO). Amplifikasi fragmen gen COI S. incertulas menggunakan
primer forward Mt D4 dan reverse Mt D9 (Simon et al. 1994). Sedangkan
amplifikasi fragmen gen COII S. incertulas menggunakan primer forward A-298
dan reverse Bt-LYS (Liu & Beckenbach 1992; Simon et al. 1994) (Tabel 1,
Gambar 4).
Tabel 1 Primer yang digunakan untuk amplifikasi gen COI dan gen COII S.
incertulas dan posisi primer berdasarkan mtDNA O. furnacalis

Primer

Mt D4
Mt D9

A-298
Bt-LYS
  

 

Gen COI
TACAATTTATCGCCTAAACTTCAGCC
CCCGGTAAAATTAAAATATAAACTTC
(Simon et al. 1994)
Gen COII
ATTGGACATCAATGATATTGA
GTTTAAGAGACCAGTACTTG
(Liu & Beckenbach1992, Simon et al. 1994)

1442
tRNA-Tyr

Posisi primer
pada mtDNA
O. furnacalis
(No. Akses
GenBank: NC003368)

Sekuen 5’-3’

2977

1339-1365
2131-2157

3337 - 3357
3739 - 3758

3040

3721

tRNA-Leu
Gen COI

tRNA-Lys
Gen COII
A-298

Mt D4
Mt D9

Bt-LYS

100 pb

Gambar 4

Posisi primer forward Mt D4 dan primer reverse Mt D9 untuk
amplifikasi gen COI S. incertulas serta primer forward A-298 dan
primer reverse Bt-LYS untuk amplifikasi gen COII S. incertulas.

14
 

Total volume pereaksi PCR yang digunakan adalah 20 µl. Pereaksi
tersebut terdiri atas 7.4 µl air destilata steril, 0.8 µl primer forward 10 µM, 0.8 µl
primer reverse 10 µM, 1 µl DNA cetakan, dan 10 µl 2x Ready Mix (Kapa Taq
DNA Polymerase (1 U per 20 µl), bufer Mg2+ 1.5 mM, dan dNTP 0.4 mM).
Amplifikasi DNA pada mesin PCR terdiri atas pra-denaturation pada suhu 95 oC
(2 menit), denaturation pada suhu 95 oC (1.5 menit), annealing pada suhu 50 oC
(1-1.5 menit), elongation pada suhu 72 oC (1 menit), dan elongation akhir pada
suhu 72 oC (2 menit). Tahap denaturation, annealing, dan elongation masingmasing 30 siklus.

Elektroforesis dan visualisasi DNA
Hasil amplifikasi DNA S. incertulas dimigrasikan sebanyak 1 µl pada
polyacrilamide gel electrophoresis (PAGE) 6% dengan menggunakan buffer 1x
TBE (Tris 0.5 M, Asam Borat 0.65 M, EDTA 0.02 M).

Visualisasi DNA

menggunakan pewarnaan perak nitrat (Byun et al. 2009).

Sekuen DNA
Sekuen DNA S. incertulas dilakukan pada gen COI dan gen COII mtDNA
menggunakan primer yang sama dengan primer yang digunakan pada amplifikasi
DNA. Proses sekuen DNA dilakukan untuk dua individu S. incertulas dengan
menggunakan jasa pelayanan sekuen. Selanjutnya, hasil sekuen DNA berupa
kromatogram di-edit secara manual.

Analisis Data DNA S. incertulas
Database hasil perunutan DNA gen COI dan gen COII S. incertulas
disimpan pada program Genetyx Win versi 4.0. Selanjutnya, database sekuen
DNA tersebut diedit secara manual dengan menggunakan program Genetyx Win
dan program BioEdit Versi 7.0.9.0.

15

Analisis Homologi DNA S. incertulas

Gen COI
Analisis homologi dilakukan pada sekuen gen COI S. incertulas penelitian
ini dengan data GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov). Analisis homologi tersebut
menggunakan program Basic Local Alignment Seacrh Tool-Nucleotide (BLASTN) dari website National Center for Biotechnology Information (NCBI)
(www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
Sekuen nukleotida gen COI S. incertulas pada penelitian ini di-alignment
dengan data sekuen nukleotida gen COI ngengat anggota Crambidae yang
diperoleh dari GenBank. Data sekuen nukleotida untuk gen COI S. incertulas
yang sudah ada diperoleh dari GenBank (Tabel 2). Analisis homologi sekuen
nukleotida gen COI menggunakan program Clustal X (Thompson 1997) dan
program MEGA 5 (http://www.megasoftware.net/mega.php).
Gen COII
Sekuen gen COII S. incertulas penelitian ini dilakukan analisis homologi
menggunakan program BLAST-N dari situs NCBI. Selanjutnya, sekuen gen COII
S. incertulas pada penelitian ini di-alignment terhadap data sekuen gen COII hasil
penelitian Raffiudin dan Samudra (2010) (Tabel 3). Analisis alignment
mengunakan program Clustal X (Thompson 1997) dan program MEGA 5.

Tabel 2
No

Database haplotipe gen COI S. incertulas yang ada di GenBank
(www.ncbi.nlm.nih.gov)
Sampel

Haplotipe
Sampel
Lep.12062007.H1
Lep.20032007.H1
Lep.16042007.H1
Lep.23032006.H1
Lep.10062005.H1
Lep.10042007.H2
Lep.13042007.H3
Lep.20052006.H4
Lep.10022006.H5
Lep.28052006.H6

1 Lep.12062007
2 Lep.20032007
3 Lep.16042007
4 Lep.23032006
5 Lep.10062005
6 Lep.10042007
7 Lep.13042007
8 Lep.20052006
9 Lep.10022006
10 Lep.28052006
Keterangan:
H = Haplotipe; Jabar = Jawa Barat; Jateng
Jatim = Jawa Timur

Lokasi
Dieng, Wanasaba, Jateng
Pakembinangun, Sleman, DIY
Magetan, Jatim
Karangmangu, Baturaden, Jateng
Garut, Jabar
Baluran National Park, Jatim
Alas Purwo National Park, Jatim
Ciamis, Jabar
Wates, Kulon Progo, DIY
Halimun-Salak National Park, Jabar

No. Akses
GenBank
AB495265
AB495267
AB495268
AB495272
AB495273
AB495269
AB495270
AB495271
AB495266
AB495274

= Jawa Tengah; DIY = Daerah Istimewa Yogyakarta;

16
 

Tabel 3

Database haplotipe gen COII S. incertulas berdasarkan penelitian
Raffiudin dan Samudra (2010)

Sc7Bg
Sc9Bg
Sc22Kr

Haplotipe
Sampel
Sc7Bg.H1
Sc9Bg H1
Sc22Kr.H1

Bogor, Jabar
Bogor, Jabar
Karawang, Jabar

Sc8Id
Sc10Id
Sc11Bg

Sc8Id.H1
Sc