- Hasil perhitungan tidak menunjukkan jumlah sel yang sebenarnya, karena
beberapa sel yang berdekatan mungkin membentuk koloni -
Medium dan kondisi inkubasi yang berbeda mungkin menghasilkan jumlah yang berbeda pula
- Mikroba yang ditumbuhkan harus dapat tumbuh pada medium padat dan
membentuk koloni yang kompak, jelas, tidak menyebar -
Memerlukan persiapan dan waktu inkubasi relatif lama sehingga pertumbuhan koloni dapat dihitung
Dalam metoda hitungan cawan, bahan yang diperkirakan mengandung lebih dari 300 sel mikroba per ml atau per gram atau per cm jika pengambilan sampel dilakukan
pada permukaan, memerlukan perlakuan pengenceran sebelumnya ditumbuhkan pada medium agar di dalam cawan petri. Setelah inkubasi, akan terbentuk koloni pada
cawan tersebut dalam jumlah yang dapat dihitung, di mana jumlah yang terbaik adalah di antara 30 sampai 300 koloni. Pengenceran biasanya dilakukan secara desimal, yaitu
1:10, 1:100, 1:1000, dan seterusnya. Larutan yang digunakan untuk pengenceran dapat berupa larutan buffer fosfat, 0,85 NaCl atau larutan Ringer. Metoda hitungan cawan
dibedakan atas dua cara, yakni metoda tuang pour plate dan metoda permukaan surfacespread plate Waluyo,L.,2010.
2.11 Metoda Analisa Vitamin C
Metoda analisa vitamin C dalam bahan pangan dapat dikelompakkan menjadi beberapa metoda.
1. Metoda fisika a. Metoda spektroskopi
Metoda ini berdasarkan pada kemampuan vitamin C yang terlarut dalam air untuk menyerap sinar ultraviolet, dengan panjang gelombang maksimum 265 nm. Karena
vitamin C dalam larutan mudah sekali mengalami kerusakan, maka pengukuran
Universitas Sumatera Utara
dengan cara ini harus dilakukan secepat mungkin. Untuk memperbaiki hasil pengukuran, sebaiknya ditambahkan senyawa pereduksi yang lebih kuat dari vitamin C.
Hasil terbaik diperoleh dengan menambahkan sejumlah ekuimolar kira-kira larutan KCN sebagai stabilizer ke dalam larutan vitamin.
b. Metoda polarografik Metoda ini berdasarkan pada potensial oksidasi asam askorbat dalam larutan asam atau
bahan pangan yang bersifat asam, misalnya ekstrak buah-buahan dan sayuran.
2. Metoda Kimia Metoda kimia merupakan cara pengukuran vitamin C paling banyak macamnya dan
paling sering digunakan. Sebagian besar metode kimia didasarkan pada kemampuan vitamin C karena senyawa dehidro asam askorbat memiliki aktivitas vitamin C
sebesar 80 tidak bersifat pereduksi, maka untuk mengukur vitamin C dalam bahan pangan terlebih dahulu harus dilakukan perlakuan pendahuluan menggunakan senyawa
pereduksi seperti H
2
S untuk mengubah dehidro asam askorbat menjadi asam askorbat. Di samping itu, terdapat sejumlah vitamin C yang terikat dengan komponen protein
dan bersifat non pereduksi. Bentuk terikat ini harus dibebaskan lebih dahulu dalam penentuan kandungan vitamin C dalam suatu bahan.
3. Metoda Biokimia Metoda asam askorbat oksidase Metoda ini berdasarkan kemampuan enzim asam askorbat oksidase untuk
mengoksidasi asam askorbat. Reaksi oksidasi ini ternyata tidak bersifat spesifik untuk menghasilkan hasil yang memuaskan karena enzim tersebut dapat juga mengoksidasi
komponen-komponen organik lain yang terdapat dalam ekstrak jaringan hewan, terutama senyawa organik yang dapat mereduksi biru metilen methyken blue. Lebih
lanjut dibuktikan bahwa enzim asam askorbat yang diisolasi dari labu tidak bereaksi dengan vitamin C dalam urine manusia, cairan sumsum tulang belakang dan susu sapi.
Universitas Sumatera Utara
4. Metoda Biologi Walaupun banyak diganti dengan metoda fisika dan kimia untuk menentukan vitamin
C, metoda biologi tetap merupakan metoda penentuan vitamin C yang paling realistis dan paling mendekati kebenaran
http:id.shvoong.comwriting-and-speakingmetode-analisa-vitamin .
5. Larutan 2,6-diklorofenol indofenol dalam suasana netral atau basis akan berwarna biru sedang dalam suasana asam akan berwarna merah muda. Apabila 2,6-diklorofenol
indofenol direduksi oleh asam askorbat maka akan menjadi tidak berwarna, dan bila semua asam askorbat sudah mereduksi 2,6-diklorofenol indofenol maka kelebihan
larutan 2,6-diklorofenol indofenol sedikit saja sudah akan terlihat dengan terjadinya pewarnaan. Untuk perhitungan maka perlu dilakukan standarisasi larutan dengan
vitamin C standar Sudarmadji, 1989. Dalam metoda biologi untuk mengukur vitamin C, hewan percobaan yang
digunakan hanya marmot guinea pigs. Jika mereka diberi ransum tanpa vitamin C, dalam waktu 2-3 minggu akan menderita Scurvy.
Terdapat 3 cara pengukuran biologis dengan menggunakan guinea pigs yaitu: a. Metoda preventif, untuk mengukur jumlah terkecil vitamin C yang dapat mencegah
timbulnya tanda-tanda Scurvy secara makro, misalnya penurunan berat badan. b. Metoda kuratif, untuk mengukur jumlah vitamin C terkecil untuk menyembuh
guinea pigs yang menderita Scurvy c. Metoda histology, memeriksa gigi guinea pigs, lapisan odontoblas tidak teratur,
terjadi pengapuran predentive dan terbentuk lapisan tulang yang tidak beraturan di antara odontoblast dan predentive
http:id.shvoong.comwriting-and-speakingmetode-analisa-vitamin .
Universitas Sumatera Utara
2.12 Penentuan Vitamin C secara Metoda Spektroskopi Ultraviolet-Sinar Tampak
