18
BAB III METODOLOGI PENELITIAN
3.1. Desain Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental dengan metode disc diffusion secara triplo yakni dibuat tiga rangkaian pada tiap kali percobaan pada
masing-masing konsentrasi untuk melihat efek ekstrak biji jintan hitam Nigella sativa terhadap pertumbuhan Shigella dysenteriae.
3.2. Waktu dan Tempat Penelitian
Proses determinasi tanaman dilakukan oleh Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia LIPI Bogor, sedangkan proses ekstraksi biji jintan hitam Nigella
sativa dilakukan di Balai Penelitian Tanaman Rempah dan Obat BALITRO Bogor. Kemudian, penelitian ini dilakukan pada bulan Maret-Agustus 2014 di
Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.
3.3. Bahan yang Diuji
Biji jintan hitam yang didapatkan di BALITRO, yang kemudian dilakukan determinasi di LIPI Bogor, yang selanjutnya dilakukan ekstraksi di BALITRO
menggunakan pelarut Etanol 96.
3.4. Sampel Bakteri
Bakteri Shigella dysenteriae diisolasi di media Nutrient Agar, dan diinkubasi pada suhu 37
C selama 24 jam.
3.5. Identifikasi Variabel 3.5.1. Variabel Bebas
Pertumbuhan bakteri Shigella dysenteriae di media Nutrient Agar NA, diukur dengan diameter zona hambatan yang terbentuk dalam milimeter mm
19
3.5.2. Variabel Terikat
Ekstrak biji jintan hitam Nigella sativa dengan konsentrasi 1; 1,25; 1,51,75 serta kontrol positif berupa cakram antibiotik Chloramphenicol 30µg
dan kontrol negatif berupa etanol 96. 3.6. Alat dan Bahan Penelitian
3.6.1. Alat Penelitian
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah tabung reaksi, mikropipet 1000μl, mikrotip, vortex, bunsen, korek api, ose, cawan petri, penggaris, rak
tabung, timbangan digital, autoclave, baki, swab kapas steril, stopwatch, inkubator, penggaris, laminar air flow, tisu, pinset, hot plate, tabung reaksi,
tabung erlenmeyer, gelas ukur 1000 mL, stirer, plastik anti panas, dan karet gelang.
3.6.2. Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah media pertumbuhan bakteri Nutrient Agar , aquades, larutan Mc Farland 0.5, ekstrak biji jintan hitam,
pelarut etanol 96, NaCl steril, alkohol 70, biakan Shigella dysentriae , cakram antibiotik Chloramphenicol
30μg, dan cakram uji kosong blank disc.
3.7. Cara Kerja Penelitian 3.7.1. Tahap Persiapan
3.7.1.1. Tahap Steilisasi Alat dan Bahan
Seluruh alat yang digunakan disterilisasi di dalam autoclave selama 15 menit dengan mengatur tekanan 1,5 atm pada suhu 121
C setelah sebelumnya dicuci bersih, dikeringkan, dibungkus dengan kertas, dan kemudian dibungkus
dengan plastik anti panas.
20
3.7.1.2. Persiapan dan Determinasi Biji Jintan Hitam
Biji jintan hitam didapatkan dari BALITRO sebanyak 1000 gram. Kemudian biji jintan hitam tersebut dilakukan determinasi di Lembaga Ilmu
Pengetahuan Indonesia, Kebun Raya Bogor untuk memastikan kebenaran dari tanaman yang digunakan. Dengan cara mencocokkan morfologi yang ada pada
biji jintan hitam terhadap kepustakaan dan dibuktikan dibidang Botani Pusat
Penelitian Biologi LIPI Kebun Raya Bogor. 3.7.1.3. Proses Ekstraksi Biji Jintan Hitam
Biji jintan hitam dilakukan ekstraksi di Balai Penelitian Tanaman Rempah dan Obat BALITRO Bogor. Biji jintan hitam sebanyak 1000 gram dalam
keadaan kering dihaluskan dengan menggunakan mesin penggiling grinder. Kemudian, biji jintan hitam yang telah halus direndam dalam pelarut etanol 96
sebanyak 5000mL dengan perbandingan 1000gr : 5000mL pelarut etanol 96. Biji jintan hitam yang telah direndam dalam pelarut etanol 96 dikocok
menggunakan mixer selama 2-3 jam, kemudian diamkan selma 24 jam. Setelah itu, sampel disaring menggunakan penyaring. Hasil filtrat penyaringan kemudian
dirotavapor. Saat di dalam rotator evaporator, pelarut etanol 96 divakum lalu didestilasi sehingga menjadi cair. Cairan pelarut etanol 96 dari hasil destilasi
ditampung. Jika pelarut etanol 96 sudah menguap semua, akan didapatkan ekstrak kental biji jintan hitam.
3.7.1.4. Pembuatan Variabel Konsentrasi Ekstran Biji Jintan Hitam
Konsentrasi yang akan divariasikan adalah 1; 1,25; 1,5; dan 1,75. Pelarut etanol 96 digunakan sebagai kontrol negatif dan antibiotik
Chloramphenicol sebagai kontrol positif, sehingga seluruhnya berjumlah 6 variabel.
21
Volume zat terlarut konsentrasi 1 didapatkan dengan cara N Volume zat terlarut dibagi dengan jumlah dari vaolume zat terlarut dan volume pelarut, yang
pada penelitian ini dibuat menjadi 4mL kemudian dikalikan 100. Sehingga didapatkan volume zat terlarut untuk konsentrasi 1 adalah 0,04 mL.
Volume zat terlarut konsentrasi 1,25 didapatkan dengan cara N Volume zat terlarut dibagi dengan jumlah dari vaolume zat terlarut dan volume pelarut,
yang pada penelitian ini dibuat menjadi 4mL kemudian dikalikan 100. Sehingga didapatkan volume zat terlarut untuk konsentrasi 1,25 adalah 0,05 mL.
Volume zat terlarut konsentrasi 1,5 didapatkan dengan cara N Volume zat terlarut dibagi dengan jumlah dari vaolume zat terlarut dan volume pelarut,
yang pada penelitian ini dibuat menjadi 4mL kemudian dikalikan 100. Sehingga didapatkan volume zat terlarut untuk konsentrasi 1 adalah 0,06 mL.
Volume zat terlarut konsentrasi 1,75 didapatkan dengan cara N Volume zat terlarut dibagi dengan jumlah dari vaolume zat terlarut dan volume pelarut,
yang pada penelitian ini dibuat menjadi 4mL kemudian dikalikan 100. Sehingga didapatkan volume zat terlarut untuk konsentrasi 1 adalah 0,07 mL.
3.7.1.5. Pembuatan Nutrient Agar
Nutrient Agar NA dalam bentuk serbuk ditimbang 10 gram pada timbangan digital. Kemudian memasukkan NA ke dalam tabung erlenmeyer
500ml, dan menambahkan aquades sebanyak 500ml. Masukkan stirer sebagai pengaduk. Setelah itu, memanaskannya diatas hotplate dengan api sedang
hingga homogen terlihat bening. Tutup tabung dengan menggunakan buntalan kapas. Setelah homogen, media disterilkan dalam autoclave dengan
tekanan 1,5 atm pada suhu sebesar 121 C selama 15 menit. Setelah itu, tuang
NA yang telah disterlikan ke dalam cawan petri kemudian memasukkannya kedalam lemari pendingin pada suhu ± 3
C, tunggu hingga agar mengeras.
3.7.1.6. Pembuatan Kultur Bakteri
Pembuatan suspensi bakteri dilakukan untuk perbanyakan stok, dengan cara menginokulasi 1 ose biakan murni bakteri Shigella dysenteriae ke dalam
22
media agar nutrien yang telah dibuat, kemudian diinkubasi pada suhu 37 C
selama 24 jam dalam inkubator.
3.7.1.7. Proses Identifikasi Bakteri Shigella dysenteriae
Sebelum dilakukan penelitian, bakteri Shigella dysenteriae yang akan digunakan terlebih dahulu dilakukan proses identifikasi ulang. Identifikasi yang
dilakukan adalah dengan metode pewarnaan Gram. Tampak dibawah mikroskop dengan perbesaran 100x bentuk batang pendek, ramping, Gram negatif .
3.7.2. Tahap Pengujian 3.7.2.1.
Uji Efektifitas
Biji Jintan
Hitam Terhadap
Pertumbuhan Bakter Shigella dyseteriae
Bakteri diencerkan dengan mencampurkan 1 ose suspensi bakteri Shigella dysenteriae ke dalam lautan pengencer NaCl. Kemudian dikocok menggunakan
vortex dan dibandingkan kekeruhannya dengan larutan standar 0.5 mF. Suspensi bakteri Shigella dysenteriae dioleskan menggunakan swab kapas steril pada media
pertumbuhan Nutrient Agar. Cakram uji kosong blank disc yang telah direndam ke dalam variabel konsentrasi ekstrak jintan hitam tadi diletakkan diatas
permukaan agar secara steril di dalam Laminar air flow. Kemudian media diinkubasi ke dalam inkubator pada suhu 37
C selama 18-24 jam, kemudian diukur diameter zona bening clear zone dalam milimeter
mm dengan menggunakan penggaris .
23
3.8. Alur Penelitian
Kultur bakteri Shigella dysenteriae di media Agar nutrien
Pembuatan inokulum, 1 ose Shigella dysenteriae dalam larutan NaCl
Larutan inokulum NaCl dan Shigella dysenteriae divortex hingga homogen
Kekeruhan inokulum distandarisasi dengan menggunakan larutan
standarisasi konsentrasi 0,5 Mc Farland
Usapkan bakteri ke media Agar nutrien dengan swab kapas steril
Disc diletakkan di media Agar nutrien yang telah ditanami Shigella
dysenteriae
Inkubasi selama 24 jam
Hitung diameter zona bening di sekeliling cakram
Ekstrak biji jintan hitam divortex hingga homogen
Pembuatan konsentrasi ekstrak biji jintan hitam 1; 1,25; 1,5; dan 1,75
Konsentrasi ekstrak yang telah homogen dengan pelarut etanol 96 kemudian
dipindahkan ke cawan petri
Rendam blank disc ke dalam konsentrasi ekstrak homogen dalam cawan petri selama
15 menit
Kontrol positif cakram Chloramphenicol
Rendam blank disc ke dalam etanol 96 di
dalam cawan petri selama 15 menit
Pembuatan kontrol
negatif.
Bagan 3.1. Alur Penelitian
24
3.9. Analisis Data
Kategori