Uji Aktivitas Inhibisi Fraksi-Fraksi Hasil Kolom Kromatografi dari Ekstrak Biji Jintan Hitam (Nigella sativa L.) terhadap Enzim RNA Helikase Virus Hepatitis C

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

UJI AKTIVITAS INHIBISI FRAKSI-FRAKSI HASIL

KOLOM KROMATOGRAFI DARI EKSTRAK BIJI

JINTAN HITAM (Nigella sativa L.) TERHADAP ENZIM

RNA HELIKASE VIRUS HEPATITIS C

SKRIPSI

FAKHRUL UMAM

NIM.109102000049

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA

SEPTEMBER 2013

ii

Uji Aktivitas Inhibisi Fraksi-Fraksi Hasil Kolom

Kromatografi dari Ekstrak Biji Jintan Hitam (Nigella

sativa L.) terhadap Enzim RNA Helikase

Virus Hepatitis C

SKRIPSI

Diajukan Sebagai Salah Satu Syarat untuk Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Far)

FAKHRUL UMAM

NIM.109102000049

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA

SEPTEMBER 2013

iii _{UIN Syarif Hidayatullah Jakarta}

HALAMAN PERNYATAAN ORISINILITAS

Skripsi ini adalah hasil karya saya sendiri, dan semua sumber baik yang dikutip maupun dirujuk telah saya nyatakan dengan benar.

Nama : Fakhrul Umam

NIM : 109102000049

Tanda Tangan :

iv _{UIN Syarif Hidayatullah Jakarta}

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING

Nama : Fakhrul Umam

NIM : 109102000049

Program Studi : Farmasi

Judul Skripsi : Uji Aktivitas Inhibisi Fraksi-Fraksi Hasil Kolom Kromatografi dari Ekstrak Biji Jintan Hitam (Nigella sativa L.) terhadap Enzim RNA Helikase Virus Hepatitis C

Disetujui Oleh :

Pembimbing I Pembimbing II

Lina Elfita, M.Si.,Apt. Rifqiyah Nur Umami, M.S. NIP. 197312122011012002 NIP. 198205182006042003

Mengetahui,

Ketua Program Studi Farmasi FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

v _{UIN Syarif Hidayatullah Jakarta}

HALAMAN PENGESAHAN

Skripsi ini diajukan oleh :

Nama : Fakhrul Umam

NIM : 109102000049

Program Studi : Farmasi

Judul Skripsi : Uji Aktivitas Inhibisi Fraksi-Fraksi Hasil Kolom Kromatografi dari Ekstrak Biji Jintan Hitam (Nigella sativa L.) terhadap Enzim RNA Helikase Virus Hepatitis C

Telah berhasil dipertahankan di hadapan Dewan Penguji dan diterima sebagai bagian persyaratan yang diperlukan untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi pada Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan, Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta

DEWAN PENGUJI

Pembimbing I : Lina Elfita, M.Si.,Apt. ( )

Pembimbing II : Rifqiyah Nur Umami, M.S. ( )

Penguji I : Ofa Suzanti Betha, M.Si.,Apt. ( )

Penguji II : Ismiarni Komala, M.Sc.,Ph.D., Apt. ( )

Ditetapkan di : Jakarta

vi _{UIN Syarif Hidayatullah Jakarta}

ABSTRAK

Nama : Fakhrul Umam

Program Studi : Farmasi

Judul : Uji Aktivitas Inhibisi Fraksi-Fraksi Hasil Kolom Kromatografi dari Ekstrak Biji Jintan Hitam (Nigella sativa L.) terhadap Enzim RNA Helikase Virus Hepatitis C

Hepatitis C termasuk penyakit hati kronis yang menyerang organ hati yang disebabkan oleh infeksi dari virus hepatitis C (HCV) yang merupakan golongan keluarga Flaviviridae. Hingga saat ini belum ditemukan obat yang efektif untuk penanggulangan penyakit hepatitis C ini. Sebagai salah satu pendekatan adalah mencari senyawa yang merupakan inhibitor dari enzim esensial untuk replikasi virus tersebut. Enzim RNA helikase adalah salah satu diantaranya.. Enzim RNA helikase berfungsi melepaskan untai ganda RNA menjadi untai tunggal, dimana proses ini sangat penting dalam proses replikasi HCV sehingga dapat menjadi target yang potensial untuk pengembangan obat anti-HCV. Jintan hitam (Nigella sativa L.) telah lama digunakan sebagai obat herbal untuk meningkatkan kesehatan dan melawan penyakit. Menurut data pustaka jintan hitam dapat berperan sebagai antimikroba, antiparasit, antikanker, antiinflamasi, immunomodulator dan antioksidan. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas inhibisi fraksi-fraksi kolom kromatografi dari ekstrak n-heksana biji jintan hitam terhadap RNA Helikase HCV. Eluen yang digunakan pada kolom kromatografi ini adalah n-heksana:etil asetat (100:0 - 0:100). Uji aktivitas inhibisi ekstrak biji jintan hitam terhadap enzim RNA helikase HCV dilakukan dengan menggunakan metode kolorimetri ATPase. Hasil dari fraksi kolom kromatografi ekstrak biji jintan hitam dibuat dalam konsentrasi 10.000 ppm. Aktivitas inhibisi tertinggi ditunjukkan oleh fraksi kesepuluh yaitu 77,170% dengan aktivitas RNA helikase sebesar 53,5938 pmol fosfat/ ml/ menit/ pmol protein.

Kata Kunci : Ekstrak biji jintan hitam (Nigella sativa L.), kolom kromatografi, RNA helikase HCV

vii _{UIN Syarif Hidayatullah Jakarta}

ABSTRACT

Name : Fakhrul Umam

Program Study : Pharmacy

Title : Inhibition Activity Test of Fractions Result Column Chromatography of Black Cumin (Nigella sativa L.) Seed Extract to Hepatitis C Virus RNA Helicase

Hepatitis C is a chronic liver disease attacks the liver caused by infection of hepatitis C virus (HCV) that is a member of the Flaviviridae family. To date there is no effective drug for prevention of hepatitis C disease. As an approach is looking for compound that can be an inhibitor from the essential enzymes for the replication of the virus. RNA helicase enzyme is one of them. RNA helicase enzyme has a function to release the RNA double-stranded into a single strand in which this process is very important for the HCV replication process that can be a potential target for the development of anti-HCV drug. Black cumin (Nigella sativa L.) has been used as an herbal to promote health and against disease. According to the literature, black cumin can works as antimicrobial, antiparasitic, anticancer, antiinflammatory, antioxidant and immunomodulator. This study aims to know the inhibitor activity of column chromatographic fractions of n-hexane black cumin seeds extract toward HCV RNA helicase. The used eluent in the chromatography column is n-hexane-ethyl acetate (100:0 - 0:100). Inhibitory activity test of black cumin seed extract to HCV RNA helicase is calculated by using colorimetric ATPase method. The results of column chromatography fractions of black cumin seed extract are made in concentration of 11,111 ppm. The highest inhibitory activity is shown by the tenth fraction which is 77.170% and the activity of RNA helicase is 53.5938 pmol phosphate / ml / min / pmol protein.

Keywords : Extracts of black cumin seeds (Nigella sativa L.), column chromatography, HCV RNA helicase

viii _{UIN Syarif Hidayatullah Jakarta}

KATA PENGANTAR

Segala puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT karena atas segala rahmat dan karunia-Nya penulis dapat menyelesaikan skripsi ini. Penulisan skripsi ini dilakukan dalam rangka memenuhi salah satu syarat untuk menyelesaikan pendidikan guna memperoleh gelar Sarjana Farmasi di Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta

Penulis menyadari bahwa tanpa dukungan dan bimbingan dari berbagai pihak, sangatlah sulit bagi penulis untuk menyelesaikan skripsi ini. Oleh karena itu, penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada : (1) Ibu Lina Elfita, M.Si., Apt. selaku pembimbing I dan Ibu Rifqiyah Nur

Umami, M.S. selaku pembimbing II, yang memiliki peranan besar dalam proses penelitian dan penyelesaian tugas akhir saya ini. Semoga segala bantuan dan bimbingan ibu mendapat imbalan yang lebih baik dari Allah SWT.

(2) Bapak Apon Zaenal Mustopa, M.Si. selaku Kepala Laboratorium Bakteriologi dan Virologi Molekuler Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI beserta staf (Ibu Linda Sukmarini, M.Eng, Bapak Muhamad Ridwan, S.Far,) atas bantuannya dan penggunaan segala fasilitas di laboratorium selama penelitian.

(3) Bapak Prof. Dr. dr.(hc). M. K. Tadjudin, Sp.And selaku Dekan Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta.

(4) Bapak Drs. Umar Mansur, M,Sc., Apt selaku ketua Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta.

(5) Bapak dan Ibu staf pengajar dan karyawan yang telah banyak memberikan bantuan dan bimbingan selama saya menempuh pendidikan di Program

ix _{UIN Syarif Hidayatullah Jakarta}

Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta.

(6) Kedua orang tua tercinta, Ayahanda Syamsuddin Ali dan Ibunda Nazlah yang selalu mendoakan dan memberikan dukungan kepada penulis untuk menyelesaikan tugas akhir ini.

(7) Teman seperjuangan selama kuliah dan penelitian Yunita Sari.

(8) Keluarga besar Laboratorium Bakteriologi dan Virologi Molekuler LIPI, Kak Meita, Kak Hana, Mas Aris, Kang Ace, Kak Yuni, Kak Putri, Kak Ike, Kak Aksar, Kak Bugie, Uud, yang telah banyak membantu penulis dalam penelitian.

(9) Teman-teman Farmasi angkatan 2009 khususnya teman EDTA-C, dan teman-teman CSSMORA yang sudah banyak membantu dalam berbagi informasi dan pengetahuan serta memberikan dukungan semasa kuliah hingga penyelesaian tugas akhir ini.

Akhir kata, penulis berharap semoga Allah SWT berkenan membalas segala kebaikan semua pihak yang telah membantu. Penulis berharap semoga skripsi ini membawa manfaat bagi pengembangan ilmu pengetahuan.

Jakarta, September 2013 Penulis

x _{UIN Syarif Hidayatullah Jakarta}

Sebagai sivitas akademik Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta, saya yang bertanda tangan di bawah ini :

Nama : Fakhrul Umam

NIM : 109102000049

Program Studi : Farmasi

Fakultas : Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Jenis karya : Skripsi

Demi perkembangan ilmu pengetahuan, saya menyetujui skripsi/karya ilmiah saya, dengan judul :

UJI AKTIVITAS INHIBISI FRAKSI-FRAKSI HASIL KOLOM KROMATOGRAFI DARI EKSTRAK BIJI JINTAN HITAM (Nigella sativa

L.) TERHADAP ENZIM RNA HELIKASE VIRUS HEPATITIS C

Untuk dipublikasikan atau ditampilkan diinternet atau media lain yaitu Digital Library Perpustakaan Universita Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta untuk kepentingan akademik sebatas sesuai dengan Undang-Undang Hak Cipta. Demikian pernyataan persetujuan pubikasi karya ilmiah ini saya buat dengan sebenarnya.

Di buat di : Jakarta

Pada Tanggal : 27 September 2013

Yang menyatakan

xi _{UIN Syarif Hidayatullah Jakarta}

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ... ii

HALAMAN PERNYATAAN ORISINILITAS ... iii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ... iv

HALAMAN PENGESAHAN ... v

ABSTRAK ... vi

ABSTRACT ... vii

KATA PENGANTAR ... viii

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI TUGAS AKHIR UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIK ... x

DAFTAR ISI ... xi

DAFTAR TABEL ... xiii

DAFTAR GAMBAR ... xiv

DAFTAR LAMPIRAN ... xv

DAFTAR ISTILAH ... xvi

BAB 1. PENDAHULUAN ... 1

1.1 LatarBelakang ... 1

1.2 Batasan dan Rumusan Masalah ... 3

1.3 Tujuan Penelitian ... 3

1.4 Manfaat Penelitian ... 4

BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA ... 5

2.1 Botani ... 5

2.1.1 Klasifikasi Tanaman ... 5

2.1.2 Deskripsi Tanaman ... 6

2.1.3 Ekologi dan Penyebaran ... 6

2.1.4 Khasiatdan Kegunaan ... 6

2.1.5 Kandungan Kimia ... 7

2.2 Ekstra dan Ekstraksi ... 7

2.3 Virus Hepatitis C ... 7

2.4 RNA Helikase ... 8

2.5 SDS PAGE ... 10

2.6 Kolorimetri ATPase ... 11

2.7 Kromatografi ... 12

2.8 Kromatografi Kolom ... 12

BAB 3. METODE PENELITIAN ... 14

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ... 14

3.2 Alat dan Bahan ... 14

3.3 Tahapan Penelitian ... 15

3.3.1 Persiapan Simplisia ... 15

xii _{UIN Syarif Hidayatullah Jakarta}

3.3.3 Pembuatan Ekstrak N-heksana Biji Jintan Hitam (Nigella sativa

L.) ... 15

3.3.4 Rendemen Total Ekstrak N-Heksana Biji Jintan Hitam (Nigella sativa L.) ... 16

3.3.5 Skrinning Fitokimia ... 16

3.3.6 Parameter Standar ... 18

3.3.7 Pemisahan Senyawa dengan Kolom kromatografi ... 18

3.3.8 Produksi Enzim RNA Helikase HCV ... 19

3.3.9 Uji Kemurnian Enzim RNA Helikase HCV dengan SDS-PAGE ... 21

3.3.10 Uji Aktivitas ATPase RNA Helikase HCV ... 22

3.3.11 Uji Aktivitas Inhibisi Ekstrak Biji Jintan Hitam terhadap RNA Helikase HCV ... 22

3.3.12 Perhitungan Aktivitas RNA Helikase HCV ... 23

BAB 4. HASIL DAN PEMBAHASAN ... 24

4.1 Determinasi Biji Jintan Hitam ... 24

4.2 Rendemen Ekstrak ... 24

4.3 Penapisan Fitokimia ... 25

4.4 Parameter Standar ... 26

4.5 Pemisahan Senyawa Inhibitor dengan Kolom Kromatografi ... 26

4.6 Produksi Enzim RNA Helikase HCV ... 27

4.6.1 Ekspresi Enzim RNA Helikase HCV ... 27

4.6.2 Purifikasi Enzim RNA Helikase HCV ... 28

4.7 Uji Kemurnian Enzim RNA Helikase HCV dengan SDS-PAGE ... 29

4.8 Uji Aktivitas Inhibisi Fraksi Kolom Kromatografi Ekstrak Biji Jintan Hitam terhadap Enzim RNA Helikase HCV ... 31

4.9 Perhitungan Aktivitas RNA Helikase HCV ... 33

BAB 5. KESIMPULAN DAN SARAN ... 35

5.1 Kesimpulan ... 35

5.2 Saran ... 35

DAFTAR PUSTAKA ... 36

xiii _{UIN Syarif Hidayatullah Jakarta}

DAFTAR TABEL

Halaman Tabel 4.1 Penapisan Fitokimia Ekstrak Biji Jintan Hitam ... 25 Tabel 4.2 Parameter Standar Ekstrak ... 26

xiv _{UIN Syarif Hidayatullah Jakarta}

DAFTAR GAMBAR

Halaman Gambar 2.1 Biji jintan hitam (Nigella sativa L.) ... 5 Gambar 2.2 Mekanisme kerja enzim RNA helikase ... 9 Gambar 4.1 Hasil SDS-PAGE RNA Helikase HCV ... 30 Gambar 4.2 Diagram Inhibisi Fraksi Kromatografi Kolom Ekstrak Biji Jintan

Hitam (Nigella sativa L.) terhadap RNA Helikase HCV ... 32 Gambar 4.3 KLT pada Fraksi Hasil Kolom Kromatografi Ekstrak Biji Jintan

Hitam (Nigella sativa L.) ... 33 Gambar 4.4 Diagram Aktivitas Enzim RNA Helikase Virus Hepatitis C ... 34

xv _{UIN Syarif Hidayatullah Jakarta}

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Hasil Determinasi Biji jintan hitam (Nigella sativa L.) ... 40

Lampiran 2. Alur Penelitian ... 41

Lampiran 3. Skema Kerja Persiapan Ekstrak Biji Jintan Hitam (Nigella sativa L.) ... 42

Lampiran 4. Skema Kerja Produksi Enzim RNA Helikase HCV ... 43

Lampiran 5. Skema Kerja Analisis Kemurnian Enzim RNA helikase HCV dengan SDS - PAGE ... 44

Lampiran 6. Skema Kerja Uji Aktivitas Enzim RNA Helikase HCV ... 45

Lampiran 7. Skema Kerja Uji Aktivitas Inhibisi Ekstrak Biji Jintan Hitam terhadap RNA helikase ... 46

Lampiran 8. Komposisi Larutan-Larutan yang Digunakan dalam SDS-PAGE ... 47

Lampiran 9. Komposisi Reagen, Dapar, dan Medium yang Digunakan ... 48

Lampiran 10. Perhitungan Rendemen Ekstrak Biji Jintan Hitam ... 49

Lampiran 11. Perhitungan Parameter Standar Ekstrak Biji Jintan Hitam... 50

Lampiran 12. Perhitungan Pengenceran Enzim ... 51

Lampiran 13. Contoh perhitungan Pembuatan Larutan Pewarna Malachite Green ... 52

Lampiran 14. Contoh Perhitungan Uji Aktivitas Inhibisi Ekstrak Biji Jintan Hitam (Nigella sativaL.) terhadap RNA Helikase HCV ... 53

Lampiran 15. Hasil Uji Aktivitas Inhibisi Ekstrak Kental Biji Jintan Hitam (Nigella sativa L.) ... 54

Lampiran 16. Hasil Uji Aktivitas Inhibisi Fraksi Kolom Kromatografi Ekstrak Biji Jintan Hitam (Nigella sativa L.) ... 55

Lampiran 17. Contoh Perhitungan Persen Inhibisi Hasil Fraksi Ekstrak Biji Jintan Hitam (Nigella sativa L.) terhadap RNA helikase HCV .. 58

Lampiran 18. Kurva Standar Fosfat (Uji ATPase) ... 59

Lampiran 19. Contoh Perhitungan Aktivitas RNA Helikase HCV ... 60

Lampiran 20. Tabel Aktivitas Enzim RNA Helikase HCV dengan Penambahan Senyawa Inhibitor Ekstrak Biji Jintan Hitam (Nigella sativa L.) ... 61

xvi _{UIN Syarif Hidayatullah Jakarta}

ATP : Adenosin Trifosfat

IPTG : Isopropyl-β-D-Thiogalaktopiranosidase IV : Inner volum

S : Supernatan

W : Washing

E : Elution

HCV : Hepatitis C Virus LB : Media Luria - Bertani

MOPS : 4-asam morfolinopropana sulfonat OD : Optical Density

SDS-PAGE : Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis TEMED : N,N,N’,N’-tetrametiletilendiamin

1 _{UIN Syarif Hidayatullah Jakarta}

BAB I PENDAHULUAN

1.1Latar Belakang

Penyakit hepatitis merupakan penyakit hati yang disebabkan oleh lima tipe virus hepatitis yaitu hepatitis A, B, C, D dan E dan dapat menjadi penyebab utama sirosis dan kanker hati. Indonesia menempati peringkat ketiga penderita hepatitis terbanyak di dunia setelah India dan China. Penderita hepatitis B dan C di Indonesia diperkirakan mencapai 30 juta orang. Badan Kesehatan Dunia (WHO) memperkirakan sebanyak 3-4 orang juta terinfeksi dengan virus hepatitis C setiap tahun. Sekitar 150 juta orang terinfeksi secara kronis dan beresiko menjadi sirosis hati atau kanker hati. Lebih dari 350.000 orang meninggal akibat penyakit hepatitis C setiap tahun (http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs164/en/).

Hepatitis C termasuk penyakit hati kronis yang menyerang organ hati yang disebabkan oleh infeksi dari virus hepatitis C (HCV) yang merupakan golongan keluarga Flaviviridae. HCV merupakan virus beramplop RNA yang memiliki diameter sekitar 50 nm. HCV bekerja dengan cara masuk ke dalam sel hati, menggunakan mesin genetik di dalam sel untuk menduplikasi materi genetiknya, kemudian menginfeksi sel lainnya (WHO, 2002).

Virus ini dapat menyebar melalui penggunaan jarum suntik, transfusi darah, hubungan seksual, dan hemodialisis (Sy & Jamal, 2006). HCV mengalami perkembangan secara klinis selama 7 hingga 8 minggu setelah paparan virus tersebut. Namun biasanya penderita tidak menunjukkan gejala atau hanya gejala ringan. Gejala tersebut timbul setelah menjadi kronis dan dalam waktu yang sangat lama. Infeksi HCV sangat sulit untuk dideteksi. Interval antara infeksi hingga fase kronis yang menimbulkan fibrosis dan sirosis dapat meningkat setelah tiga puluh tahun (Lauer & Walker, 2001).

Hingga saat ini belum ditemukan obat yang efektif untuk penanggulangan penyakit hepatitis C ini. Sebagai salah satu pendekatan adalah mencari senyawa yang merupakan inhibitor dari enzim esensial untuk

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

replikasi virus tersebut. Enzim RNA helikase adalah salah satu diantaranya. RNA helikase mempunyai tiga aktivitas yaitu aktivitas pengikatan RNA (RNA binding), ATPase dan RNA helikase. Aktivitas RNA helikase berfungsi melepaskan untai ganda RNA menjadi untai tunggal, dimana proses ini sangat penting dalam proses replikasi HCV. Oleh karena itu, RNA helikase merupakan target yang potensial untuk pengembangan obat anti-HCV karena inhibisi RNA helikase dapat dilakukan melalui salah satu dari tiga aktivitas tersebut (Elfita et al, 2009).

Pengobatan yang berpusat pada tanaman herbal sudah sejak lama dilakukan, dan penelitian terhadap herbal tersebut semakin berkembang akhir-akhir ini. Hal ini dikarenakan bahan herbal terbukti lebih sedikit menghasilkan efek samping jika dibandingkan dengan obat sintetis. Salah satu bahan herbal yang sering digunakan adalah biji jintan hitam (Nigella sativa L.). Selama berabad-abad biji jintan hitam telah digunakan sebagai obat herbal untuk meningkatkan kesehatan dan melawan penyakit terutama di Timur Tengah dan Asia Tenggara (Gilani et al, 2004). Di zaman Rasulullah SAW, biji jintan hitam ini sudah digunakan dalam berbagai pengobatan. Sebagaimana yang pernah disabdakan oleh nabi:

ُلوُقيَمَسوَِهْيَعَُهاَىَصَِهاَُلوسرَعِ سَهنَأََرْير َيِبَأَْنع

:ِإ

ََ

ََِءادْوسلاَِ َحْاَيِف

ِاسلاََاِإٍَءادَِلُكَْنِمٌَءاَفِش

.َ

زيِنوشلاَُءادْوسلاَُ َحْاوَ، ْوَمْاَ اسلاو

ُ

َهاور

هجامَنبإ

َ

Dari Abu Hurairah bahwa dia mendengar Rasulullah saw bersabda: "Sesungguhnya di dalam al-Habbah as-Sauda’ itu ada kesembuhan (obat) bagi setiap penyakit kecuali as-Sam". Dan as-Sam itu adalah kematian dan al-Habbah as-Sauda’ itu adalah as-Syuniz (nama lain dari al-Habbah

as-Sauda’/jintan hitam) (H.R. Ibnu Majah) (Al-Albani, 1996).

Banyak penelitian yang telah dilakukan sebelumnya terhadap jintan hitam dan menunjukkan beberapa aktivitas seperti antimikroba, antiparasit, antikanker, antiinflamasi, immunomodulator, analgesik dan antioksidan (Gali et al, 2006). Namun hanya sedikit penelitian yang dilakukan untuk mendeteksi aktivitasnya sebagai antivirus. Penelitian yang

3

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

telah dilakukan sebelumnya (Ayuni, 2012) menunjukkan bahwa ekstrak jintan hitam dalam fraksi n-heksana mempunyai aktivitas sebagai inhibitor RNA helikase dari HCV. Penelitian ini sedikit banyak memberikan gambaran bahwa jintan hitam (Nigella sativa L.) dapat berpotensi sebagai kandidat senyawa baru dalam menghambat kerja HCV. Merujuk dari penelitian tersebut maka peneliti bermaksud untuk melakukan pemisahan tahap awal senyawa bioaktif sebagai inhibitor RNA helikase HCV dari ekstrak biji jintan hitam (Nigella sativa L.) dengan menggunakan kolom kromatografi.

1.2 Batasan dan Rumusan Masalah 1.2.1 Batasan Penelitian

Batasan penelitian yang dilakukan meliputi pemisahan tahap awal senyawa inhibitor RNA helikase HCV dari ekstrak biji jintan hitam (Nigella sativa L.) dengan menggunakan kolom kromatografi.

1.2.2 Rumusan Masalah

Penelitian tentang tanaman herbal untuk mengobati penyakit hepatitis C masih gencar dilakukan, hingga diperoleh suatu senyawa murni yang mampu menghambat enzim RNA helikase HCV secara efektif. Untuk memperoleh suatu senyawa yang murni dari senyawa kompleks yang terdapat pada ekstrak tanaman herbal cukup sulit, maka perlu dilakukan penelitian lebih lanjut. Oleh karena itu perumusan masalah dalam penelitian ini adalah apakah pada fraksi kolom kromatografi ekstrak biji jintan hitam (Nigella sativa L) memiliki aktivitas sebagai senyawa inhibitor RNA helikase HCV dan pada fraksi berapakah yang mempunyai aktivitas inhibisi tertinggi.

1.3Tujuan Penelitian

Mengetahui aktivitas inhibisi hasil fraksi-fraksi kolom kromatografi dari ekstrak biji jintan hitam (Nigella sativa L) terhadap enzim RNA helikase HCV.

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

1.4Manfaat Penelitian

1.4.1 Manfaat penelitian secara teoritik

Penelitian ini diharapkan mampu menambah ilmu pengetahuan serta wawasan dalam memisahkan senyawa yang berasal dari jintan hitam (Nigella sativa L.) yang berpotensi sebagai inhibitor RNA helikase HCV. 1.4.2 Manfaat penelitian secara metodologik

Mengetahui cara pemisahan tahap awal ekstrak biji jintan hitam (Nigella sativa L.) yang berpotensi sebagai inhibitor RNA helikase HCV. 1.4.3 Manfaat penelitian secara aplikatif

Penelitian ini diharapkan dapat menjadi acuan bagi penelitian selanjutnya mengenai potensi yang terkandung dalam biji jintan hitam (Nigella sativa L.) sebagai senyawa obat baru dalam pengobatan penyakit hepatitis C.

5 _{UIN Syarif Hidayatullah Jakarta}

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Botani

Tinjauan botani meliputi klasifikasi tanaman, deskripsi, ekologi, khasiat dan kegunaan serta kandungan kimia biji jintan hitam (Nigella sativa L). 2.1.1 Klasifikasi Tanaman

Klasifikasi tanaman jintan hitam adalah sebagai berikut (United State Departement of Agriculture, 2012):

Kingdom : Plantae

Subkingdom : Tracheobionta Superdivision : Spermatophyta Division : Magnoliophyta Class : Magnoliopsida Subclass : Magnoliidae Ordo : Ranunculales Family : Ranunculaceae Genus : Nigella L. Species : Nigella sativa L.

Gambar 2.1 Biji jintan hitam (Nigella sativa L.) Sumber : dokumen pribadi

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

2.1.2 Deskripsi Tanaman

Jintan hitam merupakan tanaman herba tahunan dan berbatang tegak. Batang biasanya berusuk dan berbulu kasar, rapat atau jarang-jarang dan disertai dengan adanya bulu-bulu yang berkelenjar. Bentuk daun lanset berbentuk garis panjang 1,5 cm sampai 2 cm, ujung meruncing, terdapat tiga tulang daun yang berbulu. Daun bagian bawah bertangkai dan bagian atas duduk. Daun pembalut bunga kecil. Kelopak bunga 5, bundar telur, ujungnya agak meruncing hingga tumpul, pangkal mengecil membentuk sudut yang pendek dan besar. Mahkota pada umumnya 8, agak memanjang berbentuk bunga dua, bibir bagian atas pendek, lanset, ujung memanjang berbentuk benang, ujung bibir bunga bagian bawah tumpul. Benang sari banyak dan gundul. Kepala sari jorong dan sedikit tajam, berwarna kuning. Buah bulat telur atau agak bulat. Biji hitam, jorong berbentuk sudut tiga tak beraturan dan sedikit berbentuk kerucut, panjang 3 mm dan berkelenjar (Depkes RI, 1979).

2.1.3 Ekologi dan Penyebaran

Jintan hitam tumbuh dari daerah Levant ke arah timur Samudera Indonesia sebagai gulma semusim (Depkes RI, 1979).

2.1.4 Khasiat dan kegunaan

Biji jintan hitam sudah lama digunakan dalam pengobatan tradisional, seperti diuretik, diaforetik, penyakit hati, antihipertensi, memperbaiki proses pencernaan, antidiare, stimulan nafsu makan, analgesik, antibakteri dan antihelmintik. Selain itu jintan juga dilaporkan mampu mengobati sakit kepala, migrain, keracunan merkuri dan leprosi (Gillani et al, 2004). Kajian lain menyebutkan bahwa jintan hitam juga dapat berfungsi sebagai immunostimulan, antihistamin, antikanker, hypoglycemic, choleretic, dan antiparasit (Al-Ali et al, 2008). Jintan hitam juga dapat berperan sebagai antimikroba, antiparasit, antikanker, antiinflamasi, immunomodulator dan antioksidan (Gali et al, 2006).

7

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

2.1.5 Kandungan Kimia

Biji jintan hitam mengandung minyak atsiri (0,5-1,6%), asam lemak (35,6-41,6%), protein (22,7%) yang meliputi asam amino meliputi albumin, globulin, lisin, leusin, isoleusin, valin, glisin, alanin, fenilalanin, arginin, asparagin, sistin, asam glutamat, asam aspartat, prolin, serin, treonin, triptopan dan triosin. Biji jintan hitam juga mengandung berbagai mineral seperti Fe, Na, Cu, Zn, P, Ca dan vitamin (asam askorbat, tiamin, niasin, piridoksin dan asam folat). Asam lemak yang terkandung dalam biji jintan hitam antara lain asam palmitat, asam linoleat, asam oleat, asam dehidrostearat. Kandungan aktif dalam biji jintan hitam biasanya berada dalam minyak atsiri seperti carvone, α-pipene, d-limoene, dan p-cymene, thymoquinon, thymohydroquinon, dithymoquinon, thymol dan nigellone (Gillani et al, 2004).

2.2Ekstraksi dan Ekstrak

Ekstraksi suatu tanaman obat adalah pemisahan secara kimia atau fisika suatu bahan padat atau bahan cair dari suatu padatan, yaitu tanaman obat (Depkes RI, 2000). Ekstrak adalah sediaan kental yang diperoleh dengan mengekstraksi senyawa aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dan massa atau serbuk yang tersisa diperlakukan sedemikian hingga memenuhi baku yang ditetapkan (Depkes RI, 1995).

Maserasi adalah proses ekstraksi simplisia dengan menggunakan pelarut beberapa kali pengocokan atau pengadukan pada temperatur ruangan. Secara teknologi termasuk ekstraksi dengan prinsip pencapaian konsentrasi pada keseimbangan.

2.3Hepatitis C

HCV termasuk golongan Flaviviridae dan merupakan satu-satunya anggota dari genus Hepacivirus. Infeksi HCV adalah penyebab utama dari hepatitis kronis, sirosis hati, dan karsinoma hepatoseluler (Brass et al, 2006). HCV menyerang sel hati atau limfosit B. Virus ini menyebabkan penyakit hepatitis C yang dalam jangka panjang mengakibatkan peradangan hati,

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

sirosis, dan kanker hati. Penyakit ini sulit dideteksi karena gejala yang ditimbulkan mirip dengan penyakit yang lain, seperti mual, nafsu makan berkurang, mudah lelah, timbul kekuningan (mata, kulit), dan urin berwarna gelap. Umumnya penyakit ini terdeteksi apabila sudah mencapai tingkat kronis, sekitar 30-80% infeksi (Sy & Jamal, 2006).

Genom HCV terdiri dari open reading frame (ORF) tunggal yang mengkodekan poliprotein tunggal. Poliprotein tersebut merupakan prekusor bagi 3000 jenis asam amino. Poliprotein ini akan diubah menjadi sekitar 10 jenis protein yang berbeda dan terbagi dalam dua kelompok besar protein virus, yaitu protein struktural (protein inti, E1, E2, dan p7) dan protein nonstruktural (NS) (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, dan NS5B) (Lauer & Walker, 2001).

Replikasi virus bersifat kuat dan dapat diperkirakan lebih dari sepuluh milyar partikel virion diproduksi perhari bahkan pada fase kronis dari infeksi. HCV mengkode poliprotein tunggal yang terdiri atas 3011 asam amino dan memproses menjadi 10 protein struktural dan regulator. Komponen struktural terdiri atas inti dan dua protein amplop. Selain inti dari virus terdapat juga dua daerah dari protein amplop E2 didesain sebagai daerah hipervariabel 1 dan 2 yang memiliki laju yang tinggi terhadap mutasi dan dipercaya sebagai hasil dari tekanan selektif oleh antibodi spesifik terhadap virus (Lauer & Walker, 2001).

2.4RNA Helikase

Helikase adalah enzim yang berperan dalam membuka untai ganda nukleotida (DNA atau RNA) menjadi untai tunggal. RNA helikase merupakan enzim yang membuka ikatan dupleks RNA menjadi untai tunggal. (Kadare & Haenni, 1997). Fungsi dasar enzim helikase untuk membuka utas ganda DNA atau RNA melalui coupling hidrolisis NTP dengan translokasi sepanjang satu utas DNA atau RNA. Seluruh helikase virus memiliki aktivitas NTP/ATPase yang tergantung pada keberadaan NTP dan kation divalen berupa Mg2+. Produk hidrolisis NTP pada helikase adalah NDP/ADP dan Pi (Fan et al, 2008).

9

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Enzim helikase diperlukan untuk proses replikasi genom organisme tersebut. Enzim helikase dapat dibagi menjadi DNA helikase dan RNA helikase, sesuai dengan genom yang dimiliki organisme tersebut. HCV yang merupakan virus RNA memiliki RNA helikase. Helikase bekerja secara katalitik memisahkan untai ganda DNA atau RNA menggunakan energi yang dihasilkan dari hidrolisis nukleosida trifosfat dan merupakan target pencarian obat karena dibutuhkan dalam replikasi virus (Utama et al, 2000).

Gambar 2.2 Mekanisme kerja enzim RNA helikase Sumber Utama et al, 2000

Aktivitas NTP/ATP helikase secara umum distimulasikan oleh keberadaan asam nukleat untai tunggal. Hal ini memungkinkan enzim berikatan dengan untai RNA dengan energi yang dihasilkan dari hidrolisis ATP untuk memisahkan ikatan hidrogen pasangan basa dari struktur dupleks (Utama et al, 2000).

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Ikatan asam nukleat dapat menginduksikan formasi protein yang terkarakterisasi dengan pengembangan situs aktif dari domain NTP/ATPase dari NTP/ATP. Aktivitas NTP/ATPase tidak dapat distimulasi pada kadar garam tinggi. Hal ini disebabkan kondisi kekuatan ionik kuat asam nukleat tidak dapat terikat dengan enzim dan enzim membentuk konformasi untuk pelepasan untaian. Mekanisme kerja enzim RNA atau DNA helikase adalah pertama-tama helikase akan mengikat untai RNA atau DNA utas ganda pada

ujung 3’, selanjutnya ATP akan berikatan pada suatu sisi aktif dari RNA atau DNA helikase tersebut. Gugus ATP akan dihidrolisis oleh enzim RNA atau DNA helikase menjadi ADP dan fosfat inorganik. Proses hidrolisis ini akan terlepas energi yang kemudian digunakan oleh enzim RNA atau DNA helikase untuk menguraikan utas ganda RNA atau DNA menjadi utas tunggal RNA atau DNA (Utama et al, 2000).

2.5SDS PAGE

Elektroforesis adalah suatu teknik pemisahan yang memisahkan analit berdasarkan kemampuan bergerak dalam medium konduksi yang biasanya berupa larutan bufer dan akan memberikan respons setelah ditambahkan medan listrik (Harvey, 2000). Sodium Dodecyl Sulphate Poly Acrylamide Gel Electrophoresis (SDS PAGE) adalah metode pemisahan protein dalam sampel untuk dianalisa dan menentukan berat molekulnya. Protein-protein akan terdenaturasi dan melepas monomernya karena pemanasan yang ditunjukkan dengan adanya agen-agen pereduksi (2-merkaptoetanol atau ditiotheitol) dan surfaktan bermuatan negatif.

Elektroforesis gel Sodium Dodesil Sulfat (SDS) poliakrilamid adalah teknik yang sering digunakan dalam bidang biokimia, forensik, genetika, dan biologi molekuler untuk memisahkan protein sesuai dengan mobilitas elektroforesis (fungsi dari panjang rantai polipeptida atau molekul). Sampel elektroforesis gel SDS tersebut dipisahkan berdasarkan ukuran berat molekul (Gam & Latiff, 2005).

Polimerisasi dapat terjadi dengan cepat pada suhu kamar dengan adanya katalis dan inisiator. Katalis dan inisiator yang umum digunakan ialah

11

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta N,N’,N’,N’–tetrametilenadiamina (TEMED) dan amonium persulfat (APS) sebagai sumber radikal bebas yang akan menginisiasi pembentukan polimer (Caprette, 2005).

Medan listrik diterapkan di seluruh gel yang menyebabkan protein bermuatan negatif bermigrasi menuju anoda. Setiap protein akan bergerak berbeda melalui matriks gel. Protein yang berbobot molekul kecil akan lebih mudah melalui pori-pori pada gel, sedangkan protein yang berbobot molekul lebih besar akan memiliki lebih banyak kesulitan untuk melewati pori-pori tersebut. Setelah waktu yang telah ditentukan protein akan bermigrasi berdasarkan ukuran; protein yang lebih kecil akan bermigrasi jauh di bawah gel, sedangkan yang lebih besar akan tetap lebih dekat ke titik asal. Protein dapat dipisahkan berdasarkan ukuran atau bobot molekul (Gam & Latiff, 2005).

Pewarna yang digunakan dalam teknik ini terdiri atas dua macam yaitu Coomassie Brilliant Blue atau pewarna perak. Pewarna Coomassie Brilliant Blue biasanya dapat mendeteksi sebuah band hingga 50 µg protein. Pewarnaan perak meningkatkan sensitivitas pewarnaan sampai 50 kali. Banyak variabel yang dapat mempengaruhi intensitas warna. Setiap protein memiliki karakteristik pewarnaan sendiri (Jovanovic et al, 2007).

2.6 Kolorimetri ATPase

Uji kolorimetrik digunakan untuk menganalisis bahan yang umumnya tidak berwarna, misalnya untuk mengukur konsentrasi protein dalam suatu sampel yang tidak menyerap cahaya. Adapun pereaksi yang digunakan adalah pereaksi yang bewarna seperti malakit hijau dan amonium molibdat. Uji ATPase dilakukan dengan mengukur konsentrasi fosfat yang terurai dari ATP menjadi ADP dan P, yang dihasilkan dari reaksi enzim ATPase. Prinsip uji kolorimetrik adalah perubahan warna yang terjadi dari suatu zat yang tidak bewarna dengan suatu pereaksi warna (Utama et al, 2000).

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

2.7 Kromatografi

Kromatografi adalah cara pemisahan zat yang berkhasiat dan zat lain yang ada dalam sediaan, dengan jalan penyarian berfraksi, atau penyerapan, atau penukaran ion pada zat padat berpori, menggunakan cairan atau gas yang mengalir. Zat yang diperoleh dapat digunakan untuk percobaan identifikasi atau penetapan kadar. Kromatografi yang sering digunakan ialah kromatografi kolom, kromatografi kertas, kromatografi lapis tipis dan kromatografi gas. Sebagai bahan penyerap selain kertas, digunakan juga zat penyerap berpori misalnya aluminium oksida yang diaktifkan, asam silikat, atau silika gel, kiselgur dan harsa sintetik (Depkes RI, 1979).

2.7.1 Kromatografi Kolom

Kromatografi kolom merupakan salah satu metode kromatografi yang dapat digunakan untuk fraksinasi ini merupakan cara yang terbaik untuk pemisahan campuran dalam jumlah besar (lebih dari 1 g). Campuran yang akan dipisahkan pada kromatografi kolom adalah berupa pita pada bagian atas kolom penjerap yang berada dalam tabung kaca, tabung logam, atau bahkan tabung plastik. Pelarut eluen dibiarkan mengalir melalui kolom karena aliran yang disebabkan oleh gaya berat atau didorong dengan tekanan (Rouessac & Rouessac, 2007). Kolom kromatografi atau tabung untuk pengaliran karena gaya gravitasi atau sistem bertekanan rendah biasanya terbuat dari kaca yang dilengkapi keran jenis tertentu pada bagian bawahnya untuk mengatur aliran pelarut (Gritter et al, 1991).

Zat penyerap (misalnya aluminium oksida yang telah diaktifkan, silika gel, kiselgur terkalsinasi, dan kiselgur kromatografi murni) dalam keadaan kering atau setelah dicampur dengan sejumlah cairan, dimampatkan kedalam tabung kaca atau tabung kwarsa dengan ukuran tertentu dan mempunyai lubang pengalir keluar dengan ukuran tertentu. Sejumlah sediaan yang diperiksa dilarutkan dalam sedikit pelarut ditambahkan pada puncak kolom dan dibiarkan mengalir kedalam zat penyerap. Zat berkhasiat diserap dari larutan oleh bahan penyerap secara sempurna berupa pita sempit pada puncak kolom. Dengan mengalirkan pelarut lebih lanjut,

13

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

dengan atau tanpa tekanan udara, masing-masing zat bergerak turun dengan kecepatan khas hingga terjadi pemisahan dalam kolom yang disebut kromatogram. Kecepatan bergerak zat dipengaruhi beberapa faktor misalnya daya serap zat penyerap, sifat pelarut, dan suhu dari sistem kromatografi (Depkes RI, 1979).

14 _{UIN Syarif Hidayatullah Jakarta}

BAB 3

METODE PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian 3.1.1 Waktu Penelitian

Penelitian ini dilakukan pada bulan Maret 2013 sampai bulan September 2013.

3.1.2 Tempat Penelitian

Penelitian ini dilakukan di laboratorium Farmakognosi dan Fitokimia, laboratorium Kimia Obat Jurusan Farmasi FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta, Laboratorium Bakteriologi dan Virologi Molekuler Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI Cibinong Bogor dan Herbarium Bogoriense Bidang Botani Pusat Penelitian Biologi LIPI Cibinong Bogor. 3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah erlenmeyer, batang pengaduk, gelas ukur, kertas saring, kapas, lumpang alu, tabung reaksi, corong, cawan penguap, timbangan analitik, alat penggiling simplisia, inkubator goyang, vortex, tube 50 ml, erlenmeyer, 96-well microtiter, pipet mikro, neraca analitik, peralatan gelas, microplate reader Multiscan EX, vial, Laminar Air Flow (LAF), lemari pendingin, sonikator, autoklaf, kolom kromatografi, erlenmeyer, gelas beaker, lempeng KLT, chamber.

3.2.2 Bahan

Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah biji jintan hitam (Nigella sativa L.). Biji jintan hitam ini diperoleh dari PT Lantabura, Depok. Bahabahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah pelarut n-heksana, aquadest, natrium hidroksida, dragendroff’s, mayer’s, asam hidroklorit, ferri klorida, asam sulfat, kloroform, pereaksi Liebermann-Buchard (2 tetes asam asetat anhidrat dan 1 tetes H2SO4 pekat), bakteri

15

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Escerichia coli BL21 (DE3) pLysS yang membawa gen NS3 RNA helikase HCV dalam plasmid pET21b (koleksi Andi Utama, Puslit Bioteknologi LIPI), media Luria Bertani (LB), aquades, ampisilin, IPTG (isopropil β -D-thiogalaktopiranoside), buffer B (10 mM Tris HCl pH 8.5, 100 mM NaCl, dan 0,25% Tween 20), resin Talon, dan buffer elusi (400 mM imidazole dalam buffer B), 0.1 mM ATP (Adenosin trifosfat), 0.1 mM MOPS (asam 4-morfolinopropana sulfonat), 1 mM MgCl2, larutan hijau malachite, 2.3 % polivinil alkohol, amonium molibdat, natrium sitrat, sukrosa, TEMED, akrilamid, amonium persulfat, coomassie brilliant blue, marker protein 250 kDa BIORAD®, silika gel, etil asetat, kapas dan alumunium foil.

3.3 Tahapan Penelitian 3.3.1 Persiapan Simplisia

Biji jintan hitam diperoleh dari PT Lantabura Depok. Selanjutnya dilakukan proses penggilingan dan pengayakan menggunakan ayakan 40 mesh untuk diperoleh serbuk halus simplisia biji jintan hitam.

3.3.2 Determinasi Biji Jintan Hitam

Proses determinasi dilakukan di Herbarium Bogoriense Bidang Botani Pusat Penelitian Biologi LIPI Cibinong, Bogor.

3.3.3 Pembuatan Ekstrak N-heksana Biji Jintan Hitam (Nigella sativa L.)

Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 300 g dan dimasukkan kedalam erlenmeyer. Lalu dimaserasi dengan menggunakan pelarut n-heksana sebanyak 900 ml. Proses maserasi didiamkan selama 24 jam, sambil sesekali dilakukan pengadukan. Setelah 24 jam maserat ditampung di dalam erlenmeyer lain dengan cara disaring menggunakan kertas saring. Kemudian serbuk simplisia tadi dimaserasi kembali dengan pelarut n-heksana dan didiamkan selama 24 jam sambil sesekali dilakukan pengadukan. Setelah 24 jam maserat ditampung kembali dengan cara disaring menggunakan kertas saring. Serbuk simplisia tadi dimaserasi kembali dengan pelarut n-heksana dan didiamkan selama 24 jam sambil sesekali dilakukan pengadukan. Setelah 24 jam maserat ditampung

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

kembali dengan cara disaring dengan menggunakan kertas saring. Seluruh hasil penampungan maserasi dikumpulkan untuk dilakukan pemekatan ekstrak dengan menggunakan rotary evaporator suhu 45⁰C hingga diperoleh ekstrak kental n-heksana biji jintan hitam (Nigella sativa L.). 3.3.4 Rendemen Total Ekstrak N-Heksana Biji Jintan Hitam (Nigella sativa L.)

Rendemen ekstrak n-heksana biji jintan hitam total dihitung dengan membandingkan berat awal serbuk simplisia dengan berat akhir ekstrak n-heksana biji jintan hitam total yang diperoleh.

% _{Rendemen =}

3.3.5 Penapisan Fitokimia

Penapisan fitokimia dilakukan untuk mengetahui golongan senyawa-senyawa yang terkandung dalam ekstrak n-heksana biji jintan hitam (Nigella sativa L.).

a. Alkaloid

Ekstrak dilarutkan dalam pelarut asam hidroklorit dan kemudian disaring. Dilakukan uji pada beberapa pereaksi (Tiwari et al, 2011):

1. Uji Mayer: filtrat ditambahkan dengan pereaksi Mayer (kalium merkuri iodida). Maka akan terbentuk endapan berwarna kuning yang menunjukkan adanya senyawa alkaloid.

2. Uji Dragendroff: filtrat ditambahkan pereaksi Dragendroff (larutan potassium iodida). Maka akan membentuk endapan merah yang menunjukkan adanya senyawa alkaloid.

b. Saponin

Ekstrak sebanyak 0,5 mg dikocok dalam 2 ml aquades. Jika terbentuk busa yang cukup lama sekitar 10 menit, menunjukkan adanya senyawa saponin (Tiwari et al, 2011).

17

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

c. Fenol

Ekstrak ditambahkan 3-4 tetes larutan ferri klorida. Jika terbentuk warna hitam kebiru-biruan menunjukkan adanya senyawa fenol (Tiwari et al, 2011).

d. Tannin

Ekstrak sebanyak 0,5 gram dididihkan dalam 10 ml aquadest dalam tabung reaksi, lalu disaring. Kemudian kedalam filtrat ditambahkan beberapa tetes ferri klorida 0,1 %. Terbentuk warna hijau kecoklatan atau biru kehitaman menunjukkan keberadaan tannin (Ayoola, G.A. et al., 2008).

e. Flavonoid

Larutan ammonia sebanyak 5 ml ditambahkan kedalam filtrat air dari ekstrak, lalu ditambahkan 1 ml asam sulfat. Terbentuk warna kuning menunjukkan adanya flavonoid (Ayoola, G.A. et al, 2008).

f. Triterpenoid dan Steroid

Ekstrak sebanyak 0,15 gram dicampurkan ke dalam 2 ml asam asetat anhidrat (CH3CO)2O, kemudian ditambahkan 2 ml H2SO4 1N. Adanya

cincin kecoklatan atau violet pada perbatasan dua pelarut menunjukkan adanya triterpenoid sedangkan munculnya warna hijau kebiruan menunjukkan adanya steroid (Indrayani, Soetjipto & Sihasale, 2006). g. Terpenoid

Ekstrak sebanyak 5 gram dimasukkan ke dalam 2 ml kloroform, kemudian ditambahkan H2SO4 sebanyak 3 ml. Adanya warna coklat

kemerahan menunjukkan adanya terpenoid (Ayoola et al, 2008). h. Minyak atsiri

Ekstrak kental yang berbau enak ditambahkan etanol, selanjutnya larutan alkoholik tersebut diuapkan kembali sampai kering. Jika residu tetap berbau enak, menunjukkan ekstrak positif mengandung minyak atsiri (Indrayani, Soetjipto & Sihasale, 2006)

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

3.3.6 Parameter Standar a. Susut Pengeringan

Ekstrak ditimbang sebanyak 1 g dan dimasukkan kedalam botol timbang dangkal bertutup yang sebelumnya telah dipanaskan pada suhu 105⁰C _{selama 30 menit dan ditara. Sebelum ditimbang ekstrak diratakan}

dalam botol timbang, dengan cara menggoyangkan botol, hingga membentuk lapisan setebal lebih kurang 5 mm sampai 10 mm. Jika berupa ekstrak kental diratakan dengan batang pengaduk. Kemudian dimasukkan kedalam ruang pengering, buka tutupnya, keringkan pada suhu 105⁰C hingga bobot tetap. Sebelum setiap pengeringan, biarkan botol dalam keadaan tertutup mendingin dalam eksikator hingga suhu kamar (Depkes RI, 2000).

b. Kadar Abu

Ekstrak ditimbang sebanyak 1 g dan dipanaskan pada temperatur 625⁰C dimana senyawa organik dan turunannya terdestruksi dan menguap sehingga hanya tersisa unsur mineral dan anorganik. Tujuannya adalah untuk memberikan gambaran tentang kandungan mineral internal dan eksternal yang berasal dari proses awal sampai terbentuknya ekstrak. Nilai untuk kadar abu sesuai dengan yang tertera dalam monografi (Depkes RI, 2000).

3.3.7 Pemisahan Senyawa dengan Kolom Kromatografi

Pemisahan senyawa yang terkandung di dalam ekstrak kental biji jintan hitam (Nigella sativa L.) menggunakan kolom kromatografi. Kolom yang digunakan berdiameter 2,54 cm dan panjang 65 cm. Kolom dibersihkan dan disiapkan dengan memberi kapas pada ujung kolom untuk menahan silika gel agar tidak keluar, lalu dipasang tegak lurus pada statif. Kemudian silika gel ditimbang seberat 100 gram dan dilarutkan dengan pelarut organik nonpolar yaitu n-heksana, diaduk hingga terbentuk suspensi (Yazid, 2005).

Selanjutnya silika dimasukkan kedalam kolom sambil diketuk-ketuk agar silika dapat memadat didalam kolom. Pelarut dimasukkan ke

19

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

dalam kolom dan ditampung, lalu dimasukkan kembali ke dalam kolom. Proses ini dilakukan secara berulang-ulang hingga silika gel menjadi padat. Ekstrak kental biji jintan hitam seberat 4 gram dilarutkan ke dalam pelarut n-heksana sebanyak 4 ml. Kemudian dimasukkan secara hati-hati kedalam kolom pada bagian atas dengan cara dialirkan melalui dinding kolom.

Pemisahan ekstrak kental biji jintan hitam dengan menggunakan elusi pelarut bergradien n-heksana:etil asetat dengan perbandingan 100:0-0:100 Eluat ini kemudian ditampung di dalam vial. Masing-masing fraksi elusi diuji aktivitas inhibisi RNA helikase HCV dengan menggunakan uji ATPase kolorimetri.

3.3.8 Produksi Enzim RNA Helikase HCV

Produksi enzim RNA helikase HCV diawali dengan pembuatan media terlebih dahulu. Media yang dibuat adalah LB (Luria Bertani) cair untuk Escherichia coli BL21 (DE3)pLysS. Media LB ini dibuat sebanyak 10 ml untuk prekultur dan 400 ml untuk kultur. Pembuatan media LB dengan cara mencampurkan Tryptone:NaCl:Yeast ekstrak (2:2:1). Selanjutnya media ini disterilisasi pada suhu 121⁰C selama 15 menit.

Tahap pertama dalam purifikasi RNA helikase HCV adalah prekultur, yaitu media LB cair 10 ml diberi ampisilin 100 µg/ml dan dimasukkan ke dalamnya bakteri E.coli BL21 (DE3)pLysS yang membawa gen RNA helikase. Lalu diinkubasi dalam inkubator goyang dengan suhu 37⁰C, kecepatan 150 rpm dan dibiarkan semalam.

Tahap selanjutnya adalah kultur, yaitu hasil prekultur diinolukasikan kedalam media LB 400 ml yang sebelumnya telah diberi ampisilin 100 µg/ml dan diinkubasi dalam inkubator goyang suhu 37⁰C, 150 rpm selama satu jam. Setelahnya ditambahkan IPTG (isopropil β -D-tiogalakto-piranoside) 0,3 mM dan diinkubasi kembali selama 3 jam pada suhu 37⁰C dan kecepatan 150 rpm.

Selanjutnya hasil kultur dipindahkan dalam tube 50 ml, divortex terlebih dahulu kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 3500 rpm

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

selama 10 menit untuk mendapatkan pelet. Supernatan dibuang dan pelet yang diperoleh disimpan pada suhu -20⁰C. Untuk tahap berikutnya, terlebih dahulu dibuat larutan buffer B yang terdiri dari campuran Tris-HCl 10 mM pH 8,5, Tween 20 0.25% dan NaCl 100 mM. Selanjutnya dibuat buffer elusi dengan cara mencampurkan imidazol 400 mM kedalam buffer B.

Pelet yang diperoleh dilakukan pengeringbekuan sebanyak tiga kali. Kemudian dilanjutkan dengan sonikasi (pemecahan sel dengan menggunakan sonikator dengan amplitudo 40 cycle 0,5 selama 15 detik) dilakukan tiga kali dengan interval 1 menit. Selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 7000 rpm selama 2 menit. Supernatan diambil dan dimasukkan ke dalam tube 50 ml, sedangkan pelet disimpan pada suhu -20⁰C untuk pengujian SDS PAGE. Supernatan tersebut ditambahkan resin TALON 200 µl dan diletakkan pada rotary cold room selama 3 jam.

Setelahnya, supernatan disentrifugasi selama 7 menit dengan kecepatan 3500 rpm. Supernatan (inner volume) yang diperoleh dipindahkan untuk pengujian SDS PAGE, sedangkan pelet ditambahkan buffer B sebanyak 10 ml dan diaduk secara perlahan. Kemudian disentrifugasi kembali selama 5 menit dengan kecepatan 3500 rpm. Supernatan yang diperoleh dipindahkan (washing 1) dan peletnya ditambahkan buffer B sebanyak 10 ml, lalu disentrifugasi kembali selama 3 menit dengan kecepatan 3500 rpm. Supernatan yang diperoleh (washing 2) dipisahkan dari peletnya. Pelet ini dimasukkan ke dalam tube 1,5 ml dan disentrifugasi selama 1 menit dengan kecepatan 3500 rpm. Kemudian ditambahkan 400 µl buffer elusi dan diletakkan pada rotary cold room selama satu malam. Kemudian pelet tersebut disentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 3500 rpm. Supernatan (E1/Elution 1) yang diperoleh dipindahkan, sedangkan endapannya dicuci dengan 100 µl larutan buffer elusi dan disentrifugasi kembali selama 1 menit dengan kecepatan 3500 rpm. Supernatan (E2/Elution 2) dan resin yang diperoleh dipisahkan dan disimpan pada suhu 4⁰C.

21

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

3.3.9 Uji Kemurnian Enzim RNA Helikase HCV dengan SDS-PAGE 8%

Enzim RNA helikase dianalisa kemurniannya menggunakan metode SDS-PAGE. Plat kaca yang terdiri atas short plate dan spacer plate dibersihkan terlebih dahulu dengan alkohol 70%. Short plate ditempatkan pada bagian depan kaca spacer yang sebelumnya diberi casting frame pada bagian tengah dan dikunci menggunakan casting stand. Selanjutnya dibuat larutan separating gel yang terdiri dari 1,5 Tris pH 8.8, 30% Akrilamid, 10% Amonium persulfat dan TEMED. Larutan tersebut dimasukkan diantara celah short plate dan spacer plate sampai terisi dua pertiga bagian, kemudian sepertiganya diisi dengan aquades hingga penuh dan ditunggu hingga terbentuk gel selama ± 30 menit.

Setelah terbentuk separating gel, larutan gel stacking dibuat sesuai dengan bahan-bahan yang terdiri dari 0,5 Tris pH 6.8, 30% Akrilamid, 10% Amonium persulfat dan TEMED. Sebelum larutan gel stacking dimasukkan, aquades pada gel separating dibuang. Kemudian larutan gel stacking dimasukkan sampai batas atas kaca, lalu comb dipasangkan dan ditunggu selama ± 30 menit hingga gel memadat. Gel dipindahkan dari casting frame, gel cassette sandwich ditempatkan pada electrode assembly dengan posisi short plate menghadap kedalam, lalu ditempatkan ke dalam clamping frame, dan ditutup kedua camp levers pada clamping frame. Lower inner chamber dimasukkan ke dalam tank elektroforesis lalu diisi dengan working solution (buffer elektroforesis SDS 1x pH 8,3).

Masing-masing sampel yang akan diuji dengan SDS PAGE 8% yaitu pelet, supernatan, inner volume, washing 1, washing 2, elution 1, elution 2 dan resin diambil 4 µl dan ditambahkan loading dye 10 µl, kemudian didenaturasi dengan cara dipanaskan di dalam waterbath pada suhu 90⁰C selama 15 menit. Sampel tersebut dimasukkan ke dalam well sebanyak 5 µl. Kemudian gel dielektroforesis pada 40 mA selama 90 menit. Kemudian gel diangkat dan direndam dalam larutan staining comassie blue G-250 selama 1 jam sambil digoyang diatas rocker. Gel dibilas dengan larutan Commassie Blue G-250 Destaining ± 30 menit

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

dengan 2 kali pengulangan. Setelahnya dibilas dengan aquades hingga bau asam hilang (Utama et al, 2000).

3.3.10 Uji Aktivitas ATPase RNA Helikase HCV

Pengujian aktivitas ATPase RNA helikase HCV ini berdasarkan metode ATPase kolorimetri. Enzim RNA helikase dibuat pengencerannya terlebih dahulu yaitu 5x, 10x, 20x, 40x, dan 80x. Pengenceran yang dilakukan menggunakan MOPS 10 mM. Kemudian pembuatan larutan master mix yang terdiri dari ddH2O, MOPS 0.1 M, MgCl2 0.1 mM, dan

ATP 0.1 mM. Selanjutnya dilakukan pengujian dengan cara mengisi tiap microtiter plate 96-well dengan 5 µl pengenceran enzim dan 45 µl master mix. Blanko dibuat dengan komposisi 5 µl aquades dan 45 µl master mix. Pengujian ini dilakukan secara triplo. Campuran reaksi tersebut diinkubasi selama 45 menit pada suhu ruang. Hasil reaksi divisualisasikan dengan penambahan larutan pewarna yang terdiri dari 0.081 % malachite green, H2O, 5.7 % amonium molibdat dalam HCl 6 M dan 2.3 % polivinil alkohol

dengan perbandingan 2:2:1:1. Setelah selesai masa inkubasi, larutan pewarna dimasukkan ke dalam masing-masing well sebanyak 100 µl dan diinkubasi kembali selama 5 menit pada suhu ruang. Kemudian ditambahkan Na sitrat sebanyak 25 µl untuk menghentikan reaksi pewarnaan. Asorbansi hasil reaksi diukur pada panjang gelombang 405 nm dan 620 nm (Utama et al, 2000).

3.3.11 Uji Aktivitas Inhibisi Ekstrak Biji Jintan Hitam terhadap RNA Helikase HCV

Pengujian aktivitas inhibisi ekstrak biji jintan hitam (Nigella sativa L) terhadap enzim RNA Helikase dilakukan berdasarkan metode ATPase kolorimetri (Utama et al, 2000). Ekstrak biji jintan hitam dimasukkan sebanyak 5 µl ke dalam setiap well, lalu ditambahkan 45 µl larutan master mix yang sudah ditambahkan dengan pengenceran enzim. Blanko dibuat dengan komposisi 5 µl aquades dan 45 µl larutan master mix. Untuk kontrol aktivitas enzim berupa campuran larutan master mix yang sudah ditambahkan dengan pengenceran enzim, sedangkan kontrol negatif

23

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

berupa campuran 5 µl metanol dan 45 µl campuran master mix yang sudah ditambahkan dengan pengenceran enzim. Semua pengujian dilakukan secara triplo. Campuran reaksi tersebut diinkubasi selama 45 menit pada suhu ruang. Hasil reaksi divisualisasikan dengan penambahan larutan pewarna yang terdiri dari 0.081 % malachite green, H2O, 5.7 % amonium

molibdat dalam HCl 6 M dan 2.3 % polivinil alkohol dengan perbandingan 2:2:1:1. Setelah selesai masa inkubasi, larutan pewarna dimasukkan ke dalam masing-masing well sebanyak 100 µl dan diinkubasi kembali selama 5 menit pada suhu ruang. Kemudian ditambahkan Na sitrat sebanyak 25 µl untuk menghentikan reaksi pewarnaan. Absorbansi diukur pada panjang gelombang 405 nm dan 620 nm menggunakan microplate reader (Utama et al, 2000).

Nilai absorbansi yang diperoleh akan digunakan untuk menghitung persentase aktivitas inhibisi ekstrak biji jintan hitam (Nigella sativa L) terhadap RNA Helikase HCV. Persentase inhibisi ekstrak biji jintan hitam terhadap RNA helikase dapat dihitung dengan rumus :

% Inhibisi = x 100% Keterangan :

A = absorbansi enzim RNA helikase tanpa penambahan sampel. I = absorbansi enzim RNA helikase dengan penambahan sampel 3.3.12 Perhitungan Aktivitas RNA Helikase HCV

Fraksi-fraksi yang diperoleh dari kolom kromatografi yang telah diuji aktivitas inhibisi terhadap enzim RNA helikase HCV, kemudian dihitung aktivitas RNA helikase dengan menghitung kadar fosfat yang dilepaskan. Fosfat tersebut terbentuk dari hasil reaksi antara RNA helikase dengan ATP yang menghasilkan ADP dan Pi (fosfat bebas). Perhitungan aktivitas RNA helikase dilakukan dengan memasukkan nilai absorbansi λ 620nm–405nm ke dalam persamaan kurva standar fosfat (Lampiran 18).

24 _{UIN Syarif Hidayatullah Jakarta}

BAB 4

HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Determinasi Biji Jintan Hitam

Determinasi dilakukan untuk mengidentifikasi sampel yang digunakan dalam penelitian ini. Determinasi dilakukan di Herbarium Bogoriense Bidang Botani, Pusat Penelitian Biologi, LIPI Cibinong. Hasil determinasi menyatakan bahwa sampel merupakan jenis Nigella sativa L dari suku Ranuculaceae (Lampiran 1).

4.2 Rendemen Ekstrak

Ekstraksi biji jintan hitam ini dilakukan dengan metode maserasi. Maserasi adalah proses pengekstrakan simplisia dengan menggunakan pelarut dengan beberapa kali pengocokan atau pengadukan pada temperatur ruang (Depkes, 2000). Metode maserasi ini biasanya digunakan untuk senyawa-senyawa yang tidak tahan pemanasan (Tiwari, P et al, 2011). Prinsip ekstraksi dengan metode maserasi didasarkan pada kelarutan komponen didalam pelarutnya. Kelarutan suatu komponen tergantung pada derajat kepolarannya. Hukum “like dissolved like” menyatakan bahwa senyawa yang bersifat polar hanya dapat larut dalam pelarut polar dan semipolar, begitupun sebaliknya senyawa yang bersifat nonpolar hanya dapat larut dalam pelarut nonpolar dan semipolar (Yuliani, 2010)

Simplisia serbuk biji jintan hitam sebanyak 300 gram dimaserasi dengan menggunakan pelarut n-heksana yang bersifat non polar. Hal ini bertujuan agar senyawa-senyawa yang bersifat non polar yang terkandung di dalamnya dapat tertarik oleh pelarut n-heksana tersebut. Proses maserasi ini dilakukan selama 3 x 24 jam. Hasil maserasi disaring dan diperoleh filtrat yang kemudian dikentalkan dengan rotary evaporator pada suhu 40⁰C hingga diperoleh ekstrak kental. Prinsip penggunaan rotary evaporator adalah pemekatan filtrat dengan penguapan pada tekanan rendah dan temperatur sesuai dengan pelarutnya. Pelarut pada sampel akan teruapkan dan melewati kondensor sehingga berubah kembali menjadi larutan dan

25

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

tertampung pada receiving part sedangkan untuk ekstrak jintan hitam terbentuk pada evaporation part. Pemekatan dihentikan ketika pelarut tidak menetes pada receiving part dengan asumsi bahwa sudah tidak ada pelarut yang terkandung didalam sampel (Yuliani, 2010). Rendemen ekstrak yang diperoleh yaitu sebesar 20,54%. Nilai rendemen memperlihatkan bahwa ekstrak yang diperoleh dengan metode maserasi menggunakan pelarut n-heksana cukup banyak. Hal ini dapat dijelaskan dengan adanya kemungkinan bahwa biji jintan hitam didominasi oleh senyawa-senyawa non polar.

4.3 Penapisan Fitokimia

Tujuan dilakukannya penapisan fitokimia ini adalah mengetahui golongan metabolit sekunder yang terdapat didalam ekstrak biji jintan hitam (Nigella sativa L.) yang diekstraksi dengan n-heksana.

Tabel 4.1 Hasil Penapisan Fitokimia Ekstrak Biji Jintan Hitam

Metabolit sekunder Hasil

Alkaloid -

Flavonoid -

Saponin -

Tannin -

Fenol -

Terpenoid +

Triterpenoid +

Minyak Atsiri +

Hasil uji fitokimia menunjukkan bahwa ekstrak biji jintan hitam dalam n-heksana positif mengandung metabolit terpenoid, triterpenoid dan minyak atsiri. Golongan terpenoid teridentifikasi dengan terbentuknya lapisan berwarna kuning setelah penambahan kloroform dan asam sulfat pekat. Golongan triterpenoid ditunjukkan dengan terbentuknya cincin

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

kecoklatan pada perbatasan dua pelarut. Sedangkan kandungan minyak atsiri ditandai dengan residu yang tetap beraroma khas.

4.4 Parameter Standar.

Parameter standar yang dilakukan terhadap ekstrak kental biji jintan hitam dapat dilihat pada tabel 4.2

Tabel 4.2 Parameter Standar Ekstrak

Parameter Ekstrak

Susut pengeringan 2,639 %

Kadar abu 0,297 %

Pemeriksaan kadar abu dilakukan dengan memanaskan bahan pada temperatur dimana senyawa organik dan turunannya akan terdekstruksi dan menguap, sehingga yang tertinggal hanya unsur mineral dan anorganik. Tujuan penetapan kadar abu adalah untuk memberikan gambaran kandungan mineral internal dan eksternal yang berasal pada proses awal sampai terbentuknya ekstrak. Batas kadar abu total jintan hitam yang diperbolehkan yaitu tidak lebih dari 8,00% seperti yang telah dijelaskan dalam Materi Medika jilid III. Dari tabel diatas maka diketahui bahwa ekstrak kental jintan hitam masuk dalam persyaratan yang dianjurkan. Sementara, nilai pada susut pengeringan menyatakan jumlah maksimal senyawa yang mudah menguap atau hilang pada proses pengeringan.

4.5 Pemisahan Senyawa Inhibitor Dengan Kromatografi Kolom

Kromatografi kolom digunakan sebagai pemisahan tahap awal terhadap senyawa yang terkandung dalam ekstrak biji jintan hitam (Nigella sativa L.). Kromatografi kolom bekerja sama seperti kromatografi lapis tipis dimana molekul senyawa yang terikat lemah dengan fase diamnya akan keluar lebih dahulu dibandingkan dengan senyawa yang terikat kuat dengan fase diamnya.

Kromatografi kolom dalam penelitian ini menggunakan fase diam silika gel F254 (Merck). Sedangkan eluen yang digunakan sebagai fase

27

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

geraknya adalah eluen bergradien, yaitu n-heksana:etil asetat dengan berbagai perbandingan (100:0–0:100). Sampel ekstrak biji jintan hitam yang dimasukkan ke dalam kolom sebanyak 4 ml dengan konsentrasi 1 g/ml, lalu dilanjutkan dengan memasukkan eluen n-heksana:etil asetat tersebut.

Senyawa yang keluar ditampung sebanyak 4 ml untuk masing masing fraksi. Seluruh fraksi yang diperoleh kemudian diuapkan dan dilarutkan kembali dengan metanol absolut sehingga konsntrasinya menjadi 100.000 ppm. Fraksi-fraksi ini kemudian diuji aktivitas inhibisinya terhadap enzim RNA helikase HCV dengan metode uji kolorimetri ATPase.

4.6 Produksi Enzim RNA Helikase HCV 4.6.1 Ekspresi Enzim RNA Helikase HCV

Tahap pertama dimulai dengan prekultur yang dilakukan dalam media cair Luria Bertani (LB) 10 ml. Media LB ini merupakan media yang cocok untuk pertumbuhan bakteri karena terdiri dari komponen yang kompleks yaitu tripton, ekstrak khamir, dan natrium klorida. Dalam tahap prekultur ini ditambahkan antibiotik ampisilin pada media LB yang berfungsi sebagai selection marker terhadap pertumbuhan E.coli BL21(DE3) pLysS-RNA helikase HCV rekombinan yang juga mengandung gen resisten ampisilin. Oleh karena itu, dengan penambahan ampisilin ini diharapkan dapat menghambat pertumbuhan bakteri lain sehingga hanya bakteri E.coli yang membawa gen RNA HCV tersebut yang dapat tumbuh. Media yang sudah dimasukkan bakteri E.coli tersebut dikultur dalam shaker incubator pada suhu 37⁰C dengan kecepatan 150 rpm selama satu malam (Pelzar & Chan, 1986).

Tahap kedua adalah kultur bakteri E.coli BL21(DE3) pLysS-RNA helikase HCV rekombinan yaitu dengan memindahkan hasil prekultur ke medium LB 400 ml yang sebelumnya telah ditambahkan ampisilin. Kemudian diinkubasi kembali pada suhu 37⁰C dengan kecepatan 150 rpm

dan Isopropil β-D-thiogalaktopiranosida (IPTG) ditambahkan pada saat nilai OD600 (Optical Density) kultur sel E.coli mencapai 0,3, karena pada

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

fase awal dimana bakteri E.coli tumbuh. Penambahan IPTG tersebut bertujuan untuk menginduksi gen RNA helikase HCV agar terjadi ekspresi yang berlebih hingga fase awal stasioner dimana nilai OD600 mencapai 1

(Utama et al, 2000).

Kemudian bakteri E.coli yang membawa gen RNA helikase HCV tersebut dipanen dengan sentrifugasi bertingkat. Sentrifugasi bertingkat ini bertujuan untuk memisahkan E.coli dari media LB. Proses sentrifugasi dilakukan pada suhu 4⁰C dengan kecepatan 3500 rpm selama 10 menit. Bakteri E.coli akan mengendap sebagai pelet sedangkan media LB terpisah sebagai supernatan. Pelet yang telah terkumpulkan disimpan pada suhu -200C untuk menghindari kerusakan pada sel dan menjaga stabilitas enzim RNA Helikase HCV.

4.6.2 Purifikasi Enzim RNA Helikase HCV

Purifikasi enzim RNA HCV bertujuan untuk memurnikan hasil ekspresi enzim RNA helikase HCV yang telah disisipkan dalam bakteri E. coli BL 21 (DE3) pLysS. Proses purifikasi ini diawali dengan pemecahan sel terlebih dahulu. Pemecahan sel dilakukan dengan dua tahap yaitu pengeringbekuan (freeze thawing) dan sonikasi. Pengeringbekuan dilakukan dengan menempatkan sel secara bergantian pada suhu -20⁰C dan suhu ruang, masing-masing selama 30 menit sebanyak tiga kali pengulangan. Pengeringbekuan menyebabkan pembentukan kristal es pada sel E.coli yang membawa gen RNA helikase HCV. Kristal es terbentuk akibat dilakukannya pengeringbekuan yang berulang terhadap cairan intraselular dan cairan ekstraselular. Proses inilah yang memudahkan pemecahan sel (Schwen & Melling, 1985).

Pemecahan sel tahap kedua yaitu sonikasi yang bertujuan untuk memecah dinding sel. Metode sonikasi ini akan merusak organel dalam sel namun tidak merusak integritas (kemampuan) fungsionalnya. Sebelum dilakukan sonikasi, pelet HCV ditambahkan terlebih dahulu dengan dapar B (10 mM Tris HCl pH 8,5, 100 mM NaCl dan 0,25% Tween 20). Tris HCl berfungsi sebagai dapar untuk mempertahankan pH enzim RNA

29

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

helikase selama proses purifikasi. Tween 20 digunakan untuk merusak lipid bipolar pada membran sel. Natrium Klorida berperan untuk menghilangkan kontaminan dan asam nukleat yang berikatan tidak spesifik dengan RNA helikase (Vanz et al, 2008).

Setelah proses sonikasi, selanjutnya dilakukan sentrifugasi untuk mengambil supernatannya. Supernatan ini berupa metabolit intraseluler yang perlu dimurnikan. Proses pemurnian menggunakan resin TALON dan dibiarkan selama 3 jam didalam cold rotary room. Resin TALON bekerja dengan cara mengikat RNA helikase yang telah dilabel dengan 6xHis-Tag pada N terminalnya. Pengikatan ini dilakukan oleh logam Co2+ yang terdapat dalam resin TALON. RNA helikase yang telah diikat oleh resin TALON dipisahkan dari metabolit intraseluler lainnya dengan sentrifugasi pada temperatur 4°C kecepatan 3500 rpm selama 7 menit. Resin yang telah berikatan dengan RNA helikase dicuci dengan menggunakan dapar B dengan maksud untuk menghilangkan protein non target. Pencucian selanjutnya menggunakan dapar elusi (imidazol dalam dapar B), dimana imidazol yang terdapat dalam dapar elusi ini akan memutus ikatan antara RNA helikase dengan resin TALON. Setiap proses pencucian dilanjutkan dengan sentrifugasi pada temperatur 4°C kecepatan 3500 rpm selama 5 menit untuk memisahkan resin dan supernatannya. Setiap hasil sentifugasi pada tahap pemurnian enzim dikoleksi untuk dianalisis dengan menggunakan metode SDS-PAGE. Penggunaan kecepatan tersebut untuk menghindari kerusakan enzim dan mencegah penurunan aktivitasnya (Sambrook & Russel, 2001).

4.7 Uji Kemurnian Enzim RNA Helikase HCV dengan SDS-PAGE

Uji kemurnian enzim RNA helikase HCV dengan menggunakan SDS PAGE. Adapun prinsip kerjanya adalah pemisahan berdasarkan migrasi protein pada media penyangga. Komposisi SDS PAGE adalah akrilamid, Tris HCL, H2O, tetramethylethylendiamine dan amonium persulfat.

Akrilamid berguna sebagai pembentuk gel, Tris HCl berguna sebagai dapar atau pengatur keseimbangan pH. Amonium persulfat sebagai inisiator dalam

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

proses polimerasi akrilamid menjadi poliakrilamid, sedangkan tetramethyl-ethylendiamine berguna sebagai katalisator reaksi polimerasi akrilamid menjadi akrilamid sedangkan H2O sebagai pencuci pada proses pembuatan

gel akrilamid. Untuk pewarnaan hasil SDS-PAGE digunakan pereaksi warna commasie blue dan destain for commasie sebagai pembilasnya sehingga dapat menampakkan pita protein sesuai ukuranya.

Gambar 4.1. Hasil SDS PAGE RNA helikase HCV

(S: Supernatan, W1: Washing 1, IV: Inner Volume, M: Marker, E1: Elusi 1) Dari hasil SDS PAGE pada gambar 4.1 menunjukkan enzim RNA helikase HCV memiliki bobot molekul 54 kDa. Enzim RNA helikase yang dipurifikasi dapat dikatakan telah murni karena menunjukkan pita tunggal dan sesuai dengan marker (BIORAD®). Pada lajur pelet tidak terlihat adanya pita protein dikarenakan metabolit intraseluler telah berada dalam supernatan (S). Pada lajur inner volume (IV) dan supernatan (S) masih terlihat banyak pita protein dikarenakan masih banyak metabolit intraseluler yang belum termurnikan melalui tahap purifikasi. Lajur washing (W) yang merupakan hasil tahap pencucian dengan resin TALON tidak menunjukkan adanya pita protein yang berarti pada proses pencucian ini tidak terbawa protein RNA helikase. Namun hasil SDS PAGE ini yang belum terlalu bagus dikarenakan proses destaining commassie blue yang terlalu cepat

Pelet S W1 IV M E1

37 kDa 50 kDa 85 kDa 120 kDa

31

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

sehingga larutan commassie blue yang memberikan warna biru masih terlihat sangat pekat pada gel SDS PAGE.

4.8 Uji Aktivitas Inhibisi Fraksi Kolom Kromatografi Ekstrak Biji Jintan Hitam terhadap Enzim RNA Helikase HCV

Uji aktivitas inhibisi fraksi kolom kromatografi ekstrak biji jintan hitam terhadap enzim RNA helikase HCV menggunakan metode kolorimetri ATPase. Uji kolorimetri ATPase memerlukan larutan master mix. Larutan ini terdiri dari air suling, asam 4-morfolinopropana sulfonat (MOPS), MgCl2, adenosin trifosfat (ATP) dan enzim RNA helikase yang

telah diencerkan dengan aquades. MOPS berperan sebagai dapar dalam larutan master mix. Buffer ini bertujuan untuk menjaga stabilitas enzim. ATP yang ditambahkan berperan sebagai substrat pada pengujian ATPase kolorimetri. Mg2+ diperlukan sebagai kofaktor RNA helikase sehingga MgCl2 berfungsi sebagai donor kofaktor dalam master mix. (Utama et al,

2000). Pada saat pengujian kolorimetri ATPase, fraksi kolom kromatografi ekstrak biji jintan hitam yang sudah dilarutkan dalam metanol ditambahkan sebanyak 5 µl ke dalam satu well yang sudah terdapat 45 µl master mix. Sehingga konsentrasi fraksi yang diujikan menjadi 10.000 ppm.

Uji kolorimetri ATPase ini melibatkan pengukuran serapan senyawa organik yang dilepaskan ATP oleh enzim RNA helikase. Aktivitas enzim RNA helikase bergantung pada ATP sebagai donor energi. Prinsip ujinya adalah pengukuran fosfat bebas yang terbentuk dari hasil reaksi antara RNA helikase dengan ATP yang menghasilkan ADP dan Pi (fosfat anorganik). Pi bebas akan membentuk kompleks warna dengan pereaksi ammonium molibdat membentuk fosfomolibdat. Fosfomolibdat dapat bereaksi dengan enzim RNA helikase dan enzim akan mengendap dan menimbulkan kekeruhan. Polivinil alkohol akan melarutkan kembali enzim yang terendapkan sehingga tidak menimbulkan kekeruhan. Warna yang terbentuk sebanding dengan konsentrasi Pi yang dihasilkan dari reaksi RNA helikase dan ATP (Chan et al, 1986). Na sitrat digunakan untuk menghentikan reaksi enzimatik yang mengakibatkan terjadinya warna yang berlebih.

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Selajutnya absorbansi diukur dengan menggunakan multiscan EX pada panjang gelombang 620 nm dan 405 nm. Panjang gelombang 620 nm adalah serapan optimum dari kompleks fosfomolibdat malachite green hasil reaksi larutan pewarna dengan fosfat bebas hasil hidrolisis ATP yang menghasilkan warna hijau kebiruan. Sedangkan warna kuning merupakan warna yang dihasilkan oleh larutan pewarna yang tidak berikatan dengan Pi. Penggunaan dua panjang gelombang bertujuan agar perhitungan reaksi antara enzim dengan substrat lebih akurat. Perhitungan konsentrasi Pi dihasilkan dengan membandingkan nilai absorbansi dari pembacaan kedua panjang gelombang tersebut (Chan et al, 1986).

Gambar 4.2 Diagram Inhibisi Fraksi Kromatografi Kolom Ekstrak Biji Jintan Hitam (Nigella sativa L.) terhadap RNA Helikase HCV

Dari diagram hasil uji kolorimetri ATPase menunjukkan fraksi kolom kromatografi dari ekstrak biji jintan hitam menunjukkan adanya aktivitas untuk menghambat enzim RNA helikase HCV. Fraksi tertinggi dalam menghambat RNA helikase HCV dari ekstrak biji jintan hitam ditunjukkan oleh fraksi 10, 11 dan 12 yaitu dengan persen inhibisi masing-masing 77,170%, 76,381% dan 73,709%. Perbedaan aktivitas inhibisi diantara fraksi-fraksi tersebut tidak jauh dikarenakan masih berada pada gradien

33

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

yang sama yaitu dielusi dengan menggunakan eluen n-heksana:etil asetat 9:1.

Terlihat adanya perbedaan dari hasil uji aktivitas inhibisi RNA helikase HCV dari fraksi kolom dengan ekstrak kental yang belum dipisahkan dimana persentase inhibisi ekstrak kental biji jintan hitam dengan konsentrasi yang sama yaitu 66,935% dengan konsentrasi 10.000 ppm (lampiran 15). Hasil fraksi kolom kromatografi memberikan aktivitas yang lebih tinggi, dikarenakan senyawa yang memberikan aktivitas pada ekstrak biji jintan hitam telah berhasil dipisahkan dari komponen senyawa lain.

Sebaiknya untuk pengerjaan yang lebih efisien, tidak perlu dilakukan pengujian aktivitas inhibisi pada semua fraksi, namun terlebih dahulu melakukan uji kromatografi lapis tipis (KLT) terhadap fraksi-fraksi yang diperoleh. Kemudian fraksi yang memiliki spot yang sama digabung, lalu dilakukan uji aktivitas inhibisi enzim RNA helikase. Dari gambar 4.3 terlihat bahwa fraksi 10 hingga 17 menunjukkan spot yang sama, sehingga dapat digabung dalam pengujian aktivitas inhibisinya.

Gambar 4.3 KLT pada Fraksi Hasil Kolom Kromatografi Ekstrak Biji Jintan Hitam (Nigella sativa L.)

4.9 Perhitungan Aktivitas Enzim RNA Helikase HCV

Prinsip dari perhitungan aktivitas enzim RNA helikase HCV ini adalah dengan menghitung fosfat bebas yang terbentuk dari hasil reaksi antara RNA helikase dengan ATP yang menghasilkan ADP dan Pi (fosfat anorganik). Aktivitas enzim RNA helikase dapat dilihat pada gambar 4.5.

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Gambar 4.4 Diagram Aktivitas Enzim RNA Helikase Virus Hepatitis C Aktivitas enzim RNA helikase sebelum penambahan senyawa inhibitor adalah 517,548 pmol fosfat/ml/menit/pmol protein. Aktivitas inhibitor enzim RNA helikase HCV yang berada pada fraksi kesepuluh menunjukkan aktivitas enzim RNA helikase yang berkurang menjadi 53,5938 pmol fosfat/ml/menit/pmol protein.

Dari gambar diatas, menunjukkan bahwa terjadi penurunan aktivitas enzim RNA helikase setelah penambahan senyawa inhibitor. Aktivitas enzim RNA helikase ini berbanding terbalik dengan persentase inhibisi, dimana semakin tinggi persen inhibisi maka semakin rendah aktivitas enzim RNA helikase dan sebaliknya semakin rendah persen inhibisi maka semakin tinggi aktivitas enzim RNA helikase.

Pada penelitian Kacem dan Meraihi (2006), telah melaporkan bahwa ekstrak minyak atsiri dari biji jintan hitam mampu menghambat enzim elastase neutrofil (HNE) yang dapat merusak jaringan elastin sehingga merusak saluran napas dan alveoli. Jumlah enzim elastase ini akan meningkat pada perokok. Konsentrasi inhibisi tertinggi dari ekstrak minyak atsiri jintan hitam tersebut dalam menghambat aktivitas enzim HNE adalah 5.8 mg/ml. Merujuk dari penelitian tersebut diketahui bahwa konsentrasi fraksi hasil kolom kromatografi yang digunakan pada uji aktivitas inhibisi RNA helikase ini masih tinggi yaitu 10.000 ppm, sehingga perlu dilakukan pengujian lebih lanjut dengan konsentrasi yang lebih rendah yang tetap mampu menghasilkan aktivitas inhibisi yang optimal.

35 _{UIN Syarif Hidayatullah Jakarta}

BAB 5

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

1. Adanya aktivitas inhibisi terhadap enzim RNA helikase virus hepatitis C pada fraksi kolom kromatografi ekstrak biji jintan hitam (Nigella sativa L.).

2. Aktivitas tertinggi dalam menghambat RNA helikase HCV dari ekstrak biji jintan hitam ditunjukkan oleh fraksi 10 yaitu dengan persen inhibisi 77,170% pada konsentrasi 10.000 ppm dan aktivitas enzim RNA helikase sebesar 53,5938 pmol fosfat/ml/menit/pmol protein

5.2 Saran

1. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai pemisahan senyawa bioaktif dari ekstrak biji jintan hitam (Nigella sativa L.) untuk mengetahui senyawa yang lebih spesifik yang berpotensi sebagai inhibitor RNA helikase HCV.

2. Perlu dilakukan penelitian lanjutan dengan metode in vivo untuk mengetahui apakah ekstrak benar-benar mampu menghambat aktivitas dari RNA helikase HCV.

3. Untuk penelitian yang menggunakan metode kromatografi kolom, sebaiknya fraksi yang diperoleh dilakukan uji kromatografi lapis tipis (KLT) terlebih dahulu agar pengerjaan yang dilakukan lebih efisien.

36 _{UIN Syarif Hidayatullah Jakarta}

DAFTAR PUSTAKA

Al-Albani, Muhammad Nashiruddin. 1996. Shahih Sunan Ibnu Majah. Jakarta: Pustaka Azzam

Al-Ali, A., Abdul, A.A., Mohammad, A.R., dan Nisar, A.S. 2008.Oral and Intraperitoneal LD50 of Thymoquinone, An Active Principle of Nigella sativa, in Mice and Rats. Journal Ayub Medical College Abbottabad, Vol. 20

Ayoola, G.A et al.2008. Phytochemical Screening and Antioxidant Activities of Some Selected Medicinal Plants Used for Malaria Therapy in Southwestern Nigeria. Tropical Journal of Pharmaceutical Research, September 2008; 7 (3): 1019-1024

Brass V, Moradpour D, Blum HE. 2006. Molecular virology hepatitis C virus (HCV): 2006 update. International Journal of Medicine Science. 3:29-34 Caprette DR. 2005. Preparing SDS-Gels. Experimental Biosciences. Introductory

Laboratory-Bios 211. Rice University

Chan KM, Delfert D dan Junger KD. 1986. A direct Colorimetric Assay for Ca2+ Stimulated ATPase Activity. Anal Biochem 157:375 – 380

Departemen Kesehatan RI., 1979. Materia Medika Indonesia jilid III. Jakarta: Departemen Kesehatan RI.

Departemen Kesehatan RI., 2000. Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan. Jakarta: Departemen Kesehatan RI.

Elfita, L et al.. 2009. Purifikasi Inhibitor ATPase/RNA Helikase Virus Japanese Encephalitis dari Streptomyces Chartreusis. Majalah Ilmu Kefarmasian, Vol. VI, No. 2, 88 – 96

Fan L et al.. 2008. XPD helicase structures and activities: insight into the cancer and aging phenotypes from XPD mutations. Cell 133: 789-800

37

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Gam LH and Latiff A. 2005. SDS-PAGE electrophoretic property of human chorionic gonadotropin (hCG) and its β-subunit. Int.J.Biol.Sci 1(3): 103-109.

Gilani, A.H.,Qaiser, J. dan Muhammad, A.U.K. 2004. A Review of Medicinal and Pharmacological activities of Nigella sativa. Pakistan Journal of Biological Science, Vol. 7

Gritter RJ, Bobbitt JM, and Schw AE. 1991. Pengantar Kromatografi, Edisi II. Diterjemahkan oleh Padmawinata K. Bandung : ITB Bandung.

Hairany, Ainun. 2010. Pemurnian dan Karakterisasi Protein Inhibitor RNA Helikase Virus Hepatitis C dari Streptomyces chartreusis 5-095 [Tesis]. Bogor: Institut Pertanian Bogor.

Harvey D. 2000. Modern Analytical Chemistry. Ed ke-1. New York: McGraw Hill Heinrich et al. 2009. Farmakognosi dan Fitoterapi. Jakarta: EGC

http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs164/en/

Indrayani L, Soetjipto H dan Sihasale L. 2006. Skrining Fitokimia dan Uji Toksisitas Ekstrak Daun Pecut Kuda (Stachytarpheta jamaicensis L. Vahl) terhadap Larva Udang Artemia salina Leach. Berk Penel Hayati : 12 (57-61) Jovanovic S, Barac M, Macej O, Vucic T, and Lacnjevac C. 2007. SDS-PAGE analysis of soluble proteins in reconstituted milk expose to different heat treatments. Sensors 7: 371-383

Kacem, Rachid and Meraihi Zahia. 2006. Effects of essential oil extracted from Nigella sativa (L.) seeds and its main components on human neutrophil elastase activity. The pharmaceutical society of Japan: 301-305.

Kadare G, Haenni A. 1997. Virus encoded RNA helicases. Journal of Virology 71: 2583-2590

Lampiran 18. Kurva Standar Fosfat (Uji ATPase) Data :

Grafik :

Konsentrasi K2HPO4 (mM)

Absorbasi 620 nm dengan referensi

405 nm 0.0

0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

0.000 0.102 0.239 0.417 0.622 0.834 1.022

y = 1.020x + 0.010 R2 = 0.9989

Lampiran 19. Contoh Perhitungan Aktivitas RNA Helikase HCV

Diketahui : y = 1,020x + 0,010 (kurva standar dilihat di lampiran 18)

Sampel didilusi 40x

Absorbansi enzim = 1,098

Masa inkubasi 45 menit

1 well terdapat 5 µ L enzim RNA helikase

Konsentrasi enzim RNA helikase = 18,32 µg/ µL

1 pmol = 0,05

Ditanya : Aktivitas enzim RNA helikase

Jawab : y = 1,020x + 0,010

1,098 = (1,020x) + 0,010

x = 1,0667 mM fosfat

Banyaknya fosfat yang dilepaskan dari sampel = 1,0667 mM fosfat x 40

= 4,27 x 10-5 mol fosfat/mL

Fosfat yang dilepaskan dalam 45 menit =

= 9,48 x 10-7 mol fosfat/mL/menit

Banyaknya enzim dalam 1 well = 18,32 µg/µ L x 5 µL

= 91,6 µg = 1832 pmol protein

Aktivitas enzim RNA helikase =

Lampiran 20. Tabel Aktivitas Enzim RNA Helikase HCV dengan Penambahan Senyawa Inhibitor Ekstrak Biji Jintan Hitam (Nigella sativa L.)

Ket % inhibisi Aktivitas RNA

helikase blanko

enzim 40x _517,548

kontrol (-) _456,6599

fraksi 4 56,740 160,3066

fraksi 5 55,707 165,6977

fraksi 6 55,282 167,9176

fraksi 7 51,184 189,3235

fraksi 8 58,774 149,6829

fraksi 9 61,506 135,4122

fraksi 10 77,171 53,59398

fraksi 11 76,381 57,7166

fraksi 12 73,710 71,67011

fraksi 13 70,036 90,85617

fraksi 14 66,910 107,1881

fraksi 15 71,554 82,92805

fraksi 16 64,268 120,9831

fraksi 17 68,154 100,6871

fraksi 18 62,417 130,6554

fraksi 19 65,695 113,5306

fraksi 20 50,152 194,7146

fraksi 21 43,260 230,7083

fraksi 22 40,741 243,869

fraksi 23 35,610 270,6661

fraksi 24 40,498 245,1375

fraksi 25 30,753 296,0361

fraksi 27 33,849 279,8627

fraksi 28 23,133 335,8353

fraksi 29 27,019 315,5393

fraksi 30 32,696 285,8881

fraksi 31 32,119 288,9008

fraksi 32 30,480 297,4632

fraksi 33 20,128 351,533

fraksi 34 27,140 314,9052

fraksi 35 28,749 319,6621

fraksi 36 33,090 296,9876

fraksi 37 29,296 316,8079

fraksi 38 22,374 352,9602

fraksi 39 15,289 386,4169

fraksi 40 18,517 369,1336

fraksi 41 28,408 316,1737

fraksi 42 29,562 309,9898

fraksi 43 28,970 313,161

fraksi 44 32,464 294,4506

fraksi 45 35,100 280,3386

fraksi 46 30,125 306,9771

fraksi 47 32,701 293,1821

fraksi 48 28,526 315,5394

fraksi 49 29,651 309,5141

fraksi 50 35,248 279,5458

fraksi 51 39,453 257,0299

fraksi 52 36,699 271,7762

fraksi 53 29,474 310,4654

fraksi 54 30,184 306,6599

fraksi 55 28,230 317,1251

fraksi 56 29,799 308,7213

fraksi 58 33,323 289,8523

fraksi 59 34,508 283,5098

fraksi 60 40,933 249,1017

fraksi 61 32,346 295,0849

fraksi 62 34,004 286,2054

fraksi 63 25,979 329,1758

fraksi 64 29,296 311,4168

fraksi 65 27,726 319,8206

fraksi 66 32,494 294,2921

fraksi 67 35,870 276,2159

Lampiran 21. Gambar Alat Penelitian

Shaker incubator Mikropipet

Microplate reader Laminar Air Flow

Sentrifuge Neraca analitik