fermentum, dan EPEC diberikan pada tikus percobaan secara per oral menggunakan sonde.
Tabel 3 Kelompok tikus perlakuan
Kelompok tikus Perlakuan
A
Tikus yang diberi ransum standar dan dicekok akuades mulai hari ke-1 sampai hari ke-21 kontrol negatif.
B
Tikus yang diberi ransum standar dan dicekok L. plantarum mulai dari hari ke-1 sampai hari ke-21.
C
Tikus yang diberi ransum standar Pencekokan L. fermentum mulai dari hari ke-1 sampai hari ke-21.
D
Tikus yang diberi ransum standar dan dicekok L. plantarum hari ke-1 sampai hari ke-21 diselingi dengan pencekokan EPEC pada hari ke-8
sampai ke-14.
E
Tikus yang diberi ransum standar dan dicekok L. fermentum mulai hari ke-1 sampai hari ke-21 diselingi dengan pencekokan EPEC pada
hari ke-8 sampai ke-14.
F
Tikus yang diberi ransum standar dan dicekok akuades mulai hari ke-1 sampai hari ke-21, diselingi dengan pencekokan EPEC mulai
hari ke-8 sampai hari ke-14.
4. Sampling organ usus halus
Proses terminasi pengakhiran perlakuan dan sampling organ usus halus dilakukan tiga kali yaitu pada hari ke-8 T1, hari ke-15 T2, dan hari ke-22 T3.
Saat tikus diterminasi, jaringan usus halus beserta lambungnya diambil kemudian dicuci dengan NaCl 0.9. Jaringan lalu disimpan dan difiksasi selama 24 jam
dalam larutan Bouin.
5. Pemrosesan jaringan
Potongan jaringan usus halus duodenum, jejunum, dan ileum yang telah difiksasi kemudian didehidrasi dengan alkohol bertingkat 70, 80, 90, dan
95 yang masing-masing selama 24 jam dan alkohol absolut I, II, dan III masing-masing selama 1 jam. Tahap berikutnya adalah infiltrasi parafin ke dalam
jaringan dengan memasukkan sampel jaringan ke dalam parafin cair I, II, dan III masing-masing selama 1 jam dengan suhu 60
o
C. Setelah itu dilakukan penanaman organ dalam parafin embedding, kemudian dibuat blok-blok jaringan sesuai
ukuran organ. Blok jaringan dipotong setebal 4 µm dengan mikrotom. Hasil potongan direndam dalam akuades suhu ruang, kemudian dimasukkan ke dalam
akuades yang dipanaskan dalam waterbath suhu 37
o
C. Selanjutnya jaringan diletakkan pada gelas objek dan dimasukkan ke dalam inkubator 40
o
C selama
minimal 24 jam. 6.
Pewarnaan
Sebelum tahap pewarnaan, dilakukan deparafinisasi dan rehidrasi dengan cara mencelupkan sediaan jaringan ke dalam xylol III, II, dan I masing-masing selama
5 menit dilanjutkan dengan alkohol absolut III, II, dan I, alkohol 95, 90, 80, dan 70 masing-masing selama 3 menit. Dicuci dengan air kran selama 5 menit
dilanjutkan dengan akuades.
Pewarnaan Hematoksilin-Eosin HE
Pewarnaan jaringan diawali dengan pemberian hematoksilin selama 3 menit, lalu direndam dalam air kran selama 10 menit dan akuades selama 5 menit,
dilanjutkan pewarnaan dengan Eosin selama 2 menit. Tahap pewarnaan diakhiri dengan dehidrasi pada alkohol bertingkat 70, 80, 90, 95, absolut I, II
masing-masing beberapa detik, kemudian absolut III selama 1 menit. Lalu dilanjutkan dengan clearing pada xylol I, II selama beberapa detik dan xylol III
selama satu menit, diakhiri dengan mounting penutupan sediaan dengan coverglass menggunakan entellan. Sediaan jaringan yang telah selesai diwarnai
kemudian diamati dan dipotret.
Pewarnaan Imunohistokimia terhadap IgA
Pewarnaan jaringan secara imunohistokimia dilakukan dengan penghilangan enzim peroksidase endogen dengan cara mencelupkan sediaan ke dalam substrat
metanol 30 mL yang telah ditambahkan hidrogen peroksida H
2
O
2
0.3 mL selama 15 menit. Pencucian secara berurutan menggunakan akuades dan PBS masing-
masing dua kali selama 10 menit. Sediaan jaringan kemudian diinkubasi di dalam serum normal 50-60 µl selama 60 menit pada suhu 37
o
C. Dilanjutkan pencucian dengan PBS kembali selama tiga kali selama 5 menit. Sediaan jaringan kemudian
diinkubasi di dalam antibodi primer IgA 50-60 µl pada suhu 4
o
C selama satu malam.
Setelah inkubasi, preparat dicuci dengan PBS sebanyak tiga kali masing- masing 10 menit. Selanjutkan preparat diinkubasi di dalam antibodi sekunder
Dako Envision Peroksidase System 50-60 µl selama 60 menit pada suhu 37
o
C pada kondisi gelap. Hasil reaksi antigen dengan antibodi divisualisasikan dengan
menggunakan DAB Diamino Benzidin selama 30 menit gelap yang selanjutnya diberi counterstain hematoksilin. Setelah itu dilakukan dehidrasi pada
alkohol bertingkat 70, 80, 90, 95, absolut I, II masing-masing beberapa detik, kemudian absolut III selama 1 menit. Lalu dilanjutkan dengan clearing
pada xylol I, II selama beberapa detik dan xylol III selama satu menit, diakhiri dengan mounting. Setelah itu, preparat imunohistokimia siap untuk diamati di
bawah mikroskop.
7. Analisis data
