Ekstraksi Metode Maserasi
Prosedur Analisa Identifikasi Flavonoid Metode Fitokimia (Harborne, 1986)
Ekstrak mangrove dari masing-masing sampel diambil sebanyak 0,1 gram dilarutkan dengan 10 ml metanol 75%, masing-masing dibagi menjadi 4 tabung reaksi. Tabung reaksi pertama sebagai kontrol, tabung reaksi kedua di tambahkan
NaOH, tabung reaksi ketiga ditambahkan H 2 SO 4 , keempat di tambahkan Mg + HCl. Perubahan dari masing-masing tabung yang ditambahkan pereaksi dibandingkan dengan kontrol, dan jika terjadi perubahan warna menunjukan bahwa positif mengandung flavonoid.
itu larutan dipindahkan kedalam labu takar 100 ml dan ditambahkan metanol 75% sampai pada garis eksa, lalu digojok hingga homogen. Encerkan larutan baku induk untuk mendapatkan larutan baku kerja dengan kosentrasi 0,1 ppm, 0,5 ppm, 1ppm, 1,5 ppm, 2 ppm dan 2,5 ppm.
2. Penentuan Total Flavonoid
dengan menggunakan spektrofotometri UV-Vis menggunakan larutan Alumunium klorida (AlCl 3 ), optimasi panjang gelombang dilakukan untuk menentukan panjang gelombang maksimum yang akan digunakan dalam pengukuran menggunakan larutan standar. Sebanyak 1,5 ml larutan ekstrak dari masing-masing sampel diambil dengan
Penentuan jumlah
flavonoid
dilakukan
kosentrasi 0,5% dan ditambahkan dengan AlCl 3 10%. setelah itu di inkubasi pada suhu kamar selama 30 menit. Absorbansi diukur pada panjang gelombang maksimum. Pembacaan absorbansi dilakukan dengan menggunakan kurva kalibrasi. Hasil dinyatakan sebagai rata-rata dari tiga kali pengukuran dan kandungan flavonoid dinyatakan dengan kesetaraan larutan standar flavonoid menggunakan pembanding baku kuersetin. Serapan diukur dengan spektrofotometri UV-Vis pada panjang gelombang 300-400 nm.
3. Perhitungan Untuk Menentukan Total Flavonoid
Kadar flavonoid, dihitung berdasarkan kurva kalibrasi hasil pembacaan dari alat spektrofotometer UV-Vis, dan persamaan regresi linear dengan menggunakan hukum Lambert-Beer seperti pada persamaan dibawah :
y = bx + a y = bx + a
2 n (∑x 2 )- (∑x)
n ∑xy - (∑x)-(∑y)
b=
2 n ∑x 2 - (∑x)
Keakuratan hasil perhitungan, sebagai penetapan kadar suatu sampel, ditentukan melalui nilai koefisien korelasi (r 2 ) yang mendekati 1 sehingga dapat
dikatakan bahwa absorbansi merupakan fungsi yang besarnya berbanding lurus dengan konsentrasi dan mengikuti persamaan regresi linear. Persamaan yang
digunakan untuk memperoleh nilai memperoleh nilai koefisien (r 2 ) (Daijan, 1986 dalam Pakaya, 2015), sebagai berikut :
n ∑xy - (∑x)(∑y)
r=
2 2 2 (n ∑x 2 - (∑x) )- (n ∑y - (∑y) )
Setelah konsentrasi pengukuran diketahui, maka kandungan flavonoid total dalam sampel ditentukan dengan menggunakan persamaan di bawah : (Halvorsen, dkk, 2002) berikut ini :
CxF M=
Keterangan : M = Kandungan flavonoid total dalam s ampel (μg/g)
C = Konsentrasi yang diperoleh dari kurva kalibrasi (mg/L)
F = Faktor pengenceran
B = Bobot sampel yang digunakan (gr).
7 jam menggunakan pengering mekanik. Sampel kulit batang mangrove S.alba lebih tebal dibanding sampel daun dan buah sehingga waktu pengeringan sedikit lebih lama dari sampel daun dan buah mangrove S.alba.
Tabel 7. Rendemen Sampel Kering Mangrove S.alba Daun (g) Buah (g) Kulit Batang (g)
Sampel Mentah
2000 Sampel Kering
Sampel kering daun dihasilkan dengan rendemen 39,65 %, buah dengan rendemen 48,20 %, dan kulit batang dengan rendemen 61,05 %, sebagaimana ditunjukan pada Tabel 7. Sampel yang telah dikeringkan kemudian dihaluskan menggunakan blender sehingga diperoleh serbuk halus kemudian diangin- anginkan.
Tabel 8. Rendemen Sampel Serbuk Mangrove S.alba Daun (g) Buah (g) Kulit Batang (g)
Sampel Mentah
2000 Sampel Serbuk
Sampel serbuk daun dihasilkan dengan rendemen 30,25 %, buah dengan rendemen 44,4 %, dan kulit batang dengan rendemen 50,58 %, sebagaimana
Daun, buah, dan kulit batang mangrove S.alba yang digunakan adalah daun, buah, dan kulit batang yang masih dalam keadaan segar, pemilihan sampel harus diperhatikan untuk menghindari kerusakan pada sampel karena sampel yang cacat telah mengalami kerusakan pada jaringan sel sehingga komposisi kimianya akan berbeda dengan sampel yang masih segar. Hal-hal yang harus diperhatikan dalam preparasi sampel adalah harus terhindar dari zat pengotor, kontak dengan senyawa lain dan tidak terkena langsung dengan cahaya matahari.
Bahan tanaman yang dapat dikeringkan dengan cara dikeringkan langsung dibawah sinar matahari adalah simplisia dari akar, rimpang, kulit, dan biji-bijian. Pengeringan bahan dengan sinar matahari langsung dalam keadaan terbuka, seringkali menyebabkan bahan mengalami pencemaran dan bila terjadi perubahan cuaca secara tiba-tiba akan merupakan suatu masalah. Pada proses pengeringan dengan matahari langsung, kemungkinan akan terjadi kontaminasi dari lingkungan seperti debu, insekta, burung, dan lain-lain (Hernani dan Nurdjanah, 2009). Menurut Pramono (2006), Sinar ultra violet dari matahari juga dapat menimbulkan kerusakan kandungan kimia pada bahan yang dikeringkan.
Hasil Ekstraksi Menggunakan Metode Maserasi
Serbuk daun, buah, dan kulit batang mangrove S.alba ditimbang masing- masing sebanyak 250 gram. Masing-masing dimaserasi dengan pelarut metanol 75% pada suhu kamar selama 1 x 24 jam dan dilakukan 2x pengulangan ditahap
perendaman. Hasil maserasi dipekatkan dengan evaporator pada suhu 40-45 o C
S.alba dapat ditunjukan pada Tabel 9.
Tabel 9. Rendemen Ekstrak Kental Metanol Mangrove S.alba Berat
Berat
Rendemen Serbuk
Ekstrak
Ekstrak
(%) Kering (g)
Kulit Batang
Ektrak kental yang dihasilkan yaitu daun dengan berat ekstrak 14,73 gram dengan rendemen 5,89%, buah dengan berat ekstrak 3,59 gram dengan rendemen 1,43%, dan kulit batang dengan berat ekstrak 9,67 gram dengan rendemen 4,83%.
Menurut Sani, dkk (2014), rendemen ekstrak dapat dihitung dengan persamaan sebagai berikut :
Pada proses ekstraksi terjadi dua fase yaitu fase pembilasan dan fase ekstraksi. Fase pembilasan merupakan fase dimana sel-sel yang rusak atau tidak utuh lagi dari simplisia bersentuhan langsung dengan pelarut sehingga komponen di dalam sel semakin mudah untuk berpindah ke dalam pelarut (Maulida dan Guntarti, 2015).
b. Sampel Serbuk
a. Ekstrak Kental
Gambar 15. Sampel Serbuk dan Ekstrak Kental Mangrove S.alba
Hasil Identifikasi Flavonoid Menggunakan Metode Fitokimia
Uji Flavonoid dapat dilakukan dengan menambahkan beberapa pereaksi diantaranya adalah H 2 SO 4 , NaOH, dan Mg + HCl. Hasil uji skrining flavonoid dari masing-masing ekstrak dapat ditunjukan pada Tabel 10.
Tabel 10. Hasil Uji Fitokimia Ekstrak Daun, Buah dan Kulit Batang Mangrove S.alba
Perubahan
Sampel Ekstrak
Kuning Daun
Hijau
Hijau
Kecoklatan Kemerahan + Mangrove
S.alba Buah
Kuning + Kulit
Kecoklatan Kemerahan Kehijauan
Kuning Batang
Keterangan : (+) = Teridentifikasi (Jika terjadi perubahan warna) (-) = Tidak teridentifikasi (tidak terjadi perubahan warna)
Berdasarkan Tabel 4, ekstrak daun, buah dan kulit batang mangrove S.alba positif mengandung senyawa flavonoid dengan indikasi beberapa perubahan warna
setelah ditambahkan pereaksi NaOH, Mg+HCl, dan H 2 SO 4 .
flavonoid ditunjukan pada Gambar 19. Berdasarkan hasil yang didapatkan maka dugaan reaksi yang terjadi antara flavonoid dan pereaksi NaOH adalah sebagai berikut :
Asetofenon (Kuning)
Gambar 16. Dugaan Reaksi Flavonoid dengan NaOH Sumber : Achmad, 1986 dalam Pakaya, 2015
Achmad (1986) dalam Pakaya (2015) menjelaskan bahwa senyawa krisin yang merupakan turunan dari seyawa-senyawa flavon pada penambahan NaOH mengalami penguraian oleh basa menjadi molekul seperti asetofenon yang berwarna kuning karena adanya pemutusan ikatan pada struktur isoprene.
b. Warna Ekstrak Mangrove Setelah Ditambahkan Pereaksi Mg+HCl Pada identifikasi flavonoid menggunakan pereaksi Mg+HCl, warna yang dihasilkan dari sampel daun mangrove S.alba yaitu hijau kecoklatan, warna yang dihasilkan dari sampel buah mangrove S.alba yaitu kuning kehijauan dan warna yang dihasilkan dari sampel kulit batang mangrove S.alba yaitu jingga. Hasil perubahan menunjukan sampel mangrove S.alba positif terdapat flavonoid ditunjukan pada Gambar 19.
Garam Flavilium Merah Tua
Gambar 17. Dugaan Reaksi Flavonoid dengan Mg+HCl
Sumber : Setyowati dkk (2014)
Setyowati dkk (2014) menjelaskan bahwa penambahan logam Mg dan HCl pekat pada uji flavonoid berfungsi untuk mereduksi inti benzopiron yang terdapat pada struktur flavonoid sehingga terbentuk perubahan warna menjadi merah atau jingga. Jika dalam suatu ekstrak tumbuhan terdapat senyawa flavonoid akan terbentuk garam flavilium saat penambahan Mg dan HCl yang berwarna merah atau jingga.
c. Warna Ekstrak Mangrove Setelah Ditambahkan Pereaksi H 2 SO 4 Pada identifikasi flavonoid menggunakan pereaksi H 2 SO 4 , warna yang dihasilkan dari sampel daun mangrove S.alba yaitu kuning kemerahan, warna yang dihasilkan dari sampel buah mangrove S.alba yaitu kuning dan warna yang dihasilkan dari sampel kulit batang mangrove S.alba yaitu kuning
Kalkon (Merah)
Sulfat
Gambar18. Dugaan Senyawa Flavonoid dengan NaOH Sumber : Achmad, 1986 dalam Pakaya, 2015
Terbentuknya warna merah karena penambahan H 2 SO 4 pekat mengakibatkan terjadinya reaksi substitusi elektrofilik dimana posisi atom OH pada flavonoid terdistribusi oleh atom H dan H 2 SO 4 (Markham dan Andersen, 2006). Menurut Usman (2003) dalam Pakaya (2015), sebagaimana senyawa aromatik, flavon juga mengalami reaksi substitusi elektrofilik, gugus hidroksi pada flavon mengarahkan reaksinya seperti senyawa fenol.
Gambar19. Hasil Uji Flavonoid Metode Fitokimia Flavonoid pada tanaman mempunyai pigmen warna dan juga berfungsi
sebagai antioksidan serta dapat berfungsi sebagai pertahanan diri terhadap organisme perusak dan lingkungan yang ekstrim (Shah dan Hossain, 2014). Menurut Prabowo (2008), adanya flavonoid pada suatu tumbuhan dilihat dengan terbentuknya warna saat direaksikan dengan senyawa yang dapat bereaksi dengan pigmen warna pada flavonoid.
Total Flavonoid Menggunakan Metode Kolorimetri AlCl 3
Kurva Kalibrasi Kuersetin Penentuan total flavonoid dilakukan dengan membuat serangkaian standar senyawa kuersetin dengan variasi 0,1 ppm, 0,5 ppm, 1 ppm, 1,5 ppm, 2 ppm, dan 2,5 ppm. Kuersetin merupakan salah satu jenis flavonoid yang umum digunakan sebagai standar dalam penentuan kadar flavonid, yang secara biologis amat kuat, memiliki aktifitas antioksidan yang sangat tinggi (Waji dan Sugrani, 2009) dan glikosidanya berada dalam jumlah sekitar 60-70% dari flavonoid (Kelly, 2011). Selanjutnya, diukur absorbansinya pada panjang gelombang 300-400 nm sehingga diperoleh serapan maksimum panjang gelombang 374 nm dan kurva kalibrasi larutan standar senyawa kuersetin.
Berdasarkan hasil penentuan absorbansi larutan standar kuersetin pada Tabel 8 dapat digambarkan kurva kalibrasi larutan standar kuersetin berupa grafik kurva kosentrasi (C) dan absorbansi (A) dengan persamaan regresi linear
y = 0,289x + 0,059 dengan koefisien korelasi (r 2 ) adalah 0.999.
Gambar 20. Kurva Kalibrasi Larutan Senyawa Kuersetin Kurva kalibrasi diperoleh dengan membuat larutan standar kuersetin, tujuan
pembuatan larutan standar untuk mengukur tingkat ketelitian data. Pengenceran dilakukan dari larutan induk kuersetin dengan teliti, agar kesalahan dalam pengenceran relatif kecil. Berdasarkan hasil penentuan absorbansi larutan standar pembuatan larutan standar untuk mengukur tingkat ketelitian data. Pengenceran dilakukan dari larutan induk kuersetin dengan teliti, agar kesalahan dalam pengenceran relatif kecil. Berdasarkan hasil penentuan absorbansi larutan standar
Perhitungan Dan Pembuatan Kurva Kalibrasi
(mg.L )
2 x 2 y x y xy
2 2 ∑xy = ∑x = 7.6 y = 2.56
∑x = 13.76 ∑y = 1.439246
(∑x) = 57.76 (∑Y) = 6.5536
Persamaan garis lurus antara kosentrasi flavonoid (x) dan absorbansi (y) dapat dituliskan melalui persamaan berikut :
y = bx + a
- Penentuan Nilai Intersep (b)
- Penentuan Nilai Intersep (a)
Kurva Sampel Kulit Batang Mangrove S.alba
Kurva sampel kulit batang diperoleh dengan membuat larutan ekstrak kulit batang dengan kosentrasi 0.1%, 0.5%, 1%, 1.5%, 2% dan 2.5%, tujuan pembuatan larutan ekstrak kulit batang untuk mengukur tingkat ketelitian data. Pengenceran dilakukan dari larutan induk ekstrak kulit batang dengan teliti, agar kesalahan dalam pengenceran relatif kecil. Berdasarkan hasil pengukuran absorbansi larutan ekstrak kulit batang tersebut dapat digambarkan kurva sampel larutan ekstrak kulit
Gambar 21. Kurva Sampel Kulit Batang Mangrove S.alba Berdasarkan kurva sampel kulit batang mangrove S.alba pada Gambar 21,
hasil absorbansi yang diukur menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada sampel kulit batang berbanding lurus dengan kosentrasi setelah dilakukan perhitungan menggunakan persamaan regresi linear y = 0.303x + 0.138 dan mengikuti persamaan regresi linear. Sehingga, dapat disimpulkan bahwa hasil penentuan total flavonoid pada sampel kulit batang sangat kecil kemungkinan terjadi kesalahan saat melakukan perhitungan kadar flavonoid kulit batang mangrove S.alba.
Kurva Sampel Daun Mangrove S.alba
Kurva sampel daun diperoleh dengan membuat larutan ekstrak daun dengan kosentrasi 0.1%, 0.5%, 1%, 1.5%, 2% dan 2.5%, tujuan pembuatan larutan ektrak daun untuk mengukur tingkat ketelitian data. Pengenceran dilakukan dari larutan induk ekstrak daun dengan teliti, agar kesalahan dalam pengenceran relatif kecil. Berdasarkan hasil pengukuran absorbansi larutan ekstrak daun tersebut dapat
Gambar 22. Kurva Sampel Daun Mangrove S.alba Berdasarkan kurva sampel daun mangrove S.alba pada Gambar 22, hasil
absorbansi yang diukur menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada sampel daun berbanding lurus dengan kosentrasi setelah dilakukan perhitungan menggunakan persamaan regresi linear y = 0.294x + 0.331 dan mengikuti persamaan regresi linear. Sehingga, dapat disimpulkan bahwa hasil perhitungan total flavonoid pada sampel daun sangat kecil kemungkinan terjadi kesalahan saat melakukan perhitungan kadar flavonoid daun mangrove S.alba.
Kurva Sampel Buah Mangrove S.alba
Kurva sampel buah diperoleh dengan membuat larutan ekstrak buah kosentrasi 0.1%, 0.5%, 1%, 1.5%, 2% dan 2.5%, tujuan pembuatan larutan ekstrak sampel buah untuk mengukur tingkat ketelitian data. Pengenceran dilakukan dari larutan induk ekstrak buah dengan teliti, agar kesalahan dalam pengenceran relatif kecil. Berdasarkan hasil pengukuran absorbansi larutan ekstrak buah tersebut dapat digambarkan kurva sampel larutan ekstrak buah berupa grafik kurva konsentrasi (X) dan absorbansi (Y) yang ditunjukkan pada Gambar 23.
Gambar 23. Kurva Sampel Buah Mangrove S.alba Berdasarkan kurva sampel buah mangrove S.alba pada Gambar 23, hasil
absorbansi yang diukur menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada sampel buah berbanding lurus dengan kosentrasi setelah dilakukan perhitungan menggunakan persamaan regresi linear y = 0.321x + 0.350 dan mengikuti persamaan regresi linear. Sehingga, dapat disimpulkan bahwa hasil perhitungan total flavonoid pada sampel buah sangat kecil kemungkinan terjadi kesalahan saat melakukan perhitungan kadar flavonoid daun mangrove S.alba.
Total Flavonoid Pada Daun, Buah, dan Kulit Batang Mangrove S.alba
Memperhitungkan Faktor Pengenceran Konsentrasi rata-rata flavonoid pada kulit batang mangrove S.alba yaitu
1.95 mg/L, konsentrasi rata-rata flavonoid pada daun mangrove S.alba yaitu 3.10 mg/L, dan konsentrasi rata-rata flavonoid pada buah mangrove S.alba yaitu 3.43 mg/L. Dari hasil pengukuran yang disajikan pada Lampiran 3 menunjukkan bahwa pada pada buah mangrove S.alba memiliki kadar flavonoid tertinggi jika diperhitungkan dengan faktor pengenceran. Menurut Rusman dan Mukhlis (2010), proses pengenceran adalah mancampurkan larutan pekat (konsentrasi tinggi)
Tabel 12.
Tabel 12. Hasil Perhitungan Kadar Flavonoid Diperhitungkan dengan Faktor Pengenceran
Sampel
Ekstrak
Rata-rata mg/L
1.95 Mangrove
Kulit Batang
3.10 S.alba
Daun
3.43 Pengukuran kadar flavonoid total dalam sampel dapat dihitung berdasarkan
Buah
kosentrasi yang dijelaskan sebagai berikut.
Kosentrasi Flavonoid Dalam Kulit Batang, Daun dan Buah Mangrove S.alba
Untuk menentukan kosentrasi pada sampel yaitu dengan menggunakan persamaan berikut :
y = bx + a
y = 0. 2897x + 0.0597
dimana y adalah absorbansi dan x adalah kosentrasi flavonoid dalam daun, kulit batang dan buah.
A. Kosentrasi Flavonoid Dalam Kulit Batang Mangrove S.alba
a. Kulit 1 y= bx + a
y = 0.307 0.307 = 0.2897x + 0.0597
0.2897x = 0.307 - 0.0597
x = 0.2473/0.2897 x = 0.2473/0.2897
x = 0.9308
c. Kulit 3 y= bx + a
y = 0.388 0.388 = 0.2897x + 0.0597
0.2897x = 0.388 - 0.0597
x = 0.3310/0.2897
x = 1.1384