Dina Karina Islami, 2015 ANALISIS KEKERABATAN ANGGOTA FAMILIA SOLANACEAE
BERDASARKAN SIKUEN DNA DAERAH ITS Universitas Pendidikan Indonesia
| repository.upi.edu
| perpustakaan.upi.edu
Daftar alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian secara rinci terdapat dalam lampiran III.
3.5 Prosedur Kerja 3.5.1. Sampling
Sampel tumbuhan didapatkan dari beberapa daerah di Bandung, diantaranya Ujung Berung, Dago, Cihideung, dan Setiabudhi, serta Kota
Cimahi. Secara
garis besar
morfologi tumbuhan
diamati dan
didokumentasikan. Sampel yang diambil dari tiap-tiap tumbuhan yaitu daun muda, disimpan di dalam kantung plastik, diberi label, dan disimpan di
dalam box berisi es. Selanjutnya di laboratorium, sampel tumbuhan disimpan di dalam freezer pada suhu -20°C. Penyimpanan sampel tumbuhan
pada suhu dibawah 0°C ini dimaksudkan untuk menjaga DNA sampel agar tidak rusak.
3.5.2. Isolasi DNA Genom
DNA tumbuhan anggota suku Solanaceae diisolasi menggunakan kit dari Thermo Scientific. Tahapan isolasi DNA menggunakan protokol dari
kit tersebut dengan sedikit modifikasi Gambar 3.1. Sebanyak 100 mg daun muda dihaluskan di dalam lumpang dan alu yang berisi nitrogen cair hingga
daun muda tersebut berbentuk serbuk. Selanjutnya, serbuk daun muda dimasukkan ke dalam tabung mikro berisi 350 µl lysis buffer A, kemudian
sampel dihomogenkan menggunakan vorteks selama lima belas detik. Sampel yang telah homogen ditambahkan lysis buffer B dan RNAse,
masing-masing sebanyak 50 µl dan 5 µl. Sampel diinkubasi di dalam penangas air bersuhu 65°C selama sepuluh menit. Selama inkubasi, sampel
dihomogenkan menggunakan shaker dalam penangas. Setelah diinkubasi, sampel diangkat, kemudian ditambahkan
precipitation solution sebanyak 130 µl. Larutan tersebut dihomogenkan dengan cara membolak-balikkan tabung mikro sebanyak 2-3 kali.
Selanjutnya, sampel dimasukkan ke dalam kotak berisi es selama lima menit. Setelah itu, sampel disentrifugasi selama lima menit dengan
Dina Karina Islami, 2015 ANALISIS KEKERABATAN ANGGOTA FAMILIA SOLANACEAE
BERDASARKAN SIKUEN DNA DAERAH ITS Universitas Pendidikan Indonesia
| repository.upi.edu
| perpustakaan.upi.edu
kecepatan 14.000 rpm. Supernatan yang diperoleh dari hasil sentrifugasi dipindahkan kedalam tabung mikro baru kemudian diberi larutan plant
gDNA binding solution dan etanol 96, masing-masing sebanyak 400 µl, selanjutnya dihomogenkan dengan cara membolak-balikkan tabung mikro.
Sebanyak setengah volume sampel 600-700 µl dimasukkan ke dalam spin column with collection tube dan disentrifugasi selama satu menit
dengan kecepatan 8.000 rpm. Cairan yang terdapat pada bagain bawah dari collection tube dibuang. Hal yang sama dilakukan untuk sisa volume sampel
lainnya. Setelah semua sampel disaring pada spin column, ditambahkan wash buffer I sebanyak 500 µl dan disentrifugasi selama satu menit dengan
kecepatan 8.000 rpm. Setelah disentrifugasi, cairan yang berada dibawah collection tube dibuang. Ditambahkan wash buffer II sebanyak 500 µl
kedalam spin column, kemudian disentrifugasi selama tiga menit dengan kecepatan 14.000 rpm. Setelah itu, tabung dikosongkan dan dispin kembali
selama satu menit dengan kecepatan 14.000 rpm. Spin column dipindahkan ke dalam tabung mikro baru, ditambahkan
50 µl elution buffer ke tengah column membrane, kemudian diinkubasi selama lima menit pada suhu ruangan. Setelah selesai inkubasi, spin column
dan tabung mikro tersebut disentrifugasi selama satu menit dengan kecepatan 10.000 rpm. Ditambahkan kembali 50 µl elution buffer ke tengah
column membrane, dan disentrifugasi selama satu menit dengan kecepatan 10.000 rpm. Untuk penyimpanan jangka panjang, DNA hasil isolasi
disimpan dalam freezer bersuhu -20°C.
Dina Karina Islami, 2015 ANALISIS KEKERABATAN ANGGOTA FAMILIA SOLANACEAE
BERDASARKAN SIKUEN DNA DAERAH ITS Universitas Pendidikan Indonesia
| repository.upi.edu
| perpustakaan.upi.edu
1 Nitrogen Cair 2 100mg daun muda
dihaluskan 3 350µl Lysis
Buffer A
Vorteks ” 6 50µl Lysis Buffer B
7 5µl RNase
4 Serbuk daun 8 Inkubasi 65°C shake
’ 9 130µl Precipitation Solution
10 Dihomogenkan dengan cara membolak-balik tabung
11 Disimpan dalam box berisi es sela a ’
12 Disentrifugasi kec. 14.000rpm sela a ’
13 Supernatan dipindahkan ke microtube
baru 14 400µl Plant gDNA Binding Solution
15 400µl Etanol 96
16 Dihomogenkan dengan cara membolak-balik tabung
17, 20 600-700µl larutan dipindahkan ke dalam spin column
18, 21 Disentrifugasi kec. 8.000rpm sela a ’
19, 22 Cairan dibuang
23 500µl Wash Buffer I
24 Disentrifugasi kec. 8.000rpm sela a ’
25 Cairan dibuang
26 500µl Wash Buffer II
7 Dise trifugasi . rp , ’
29 Re- spi .
rp , ’ 28 Tube
dikosongkan 30 50µl Elution Buffer
31 Inkubasi di suhu ruangan sela a ’
32 Disentrifugasi kec. 10.000rpm sela a ’
33 50µl Elution Buffer
Sampel siap untuk digunakan
Gambar 3.1 Skema Isolasi DNA
31
Dina Karina Islami, 2015 ANALISIS KEKERABATAN ANGGOTA FAMILIA SOLANACEAE
BERDASARKAN SIKUEN DNA DAERAH ITS Universitas Pendidikan Indonesia
| repository.upi.edu
| perpustakaan.upi.edu
3.5.3 Pengukuran Konsentrasi dan Kemurnian DNA
