Dina Karina Islami, 2015 ANALISIS KEKERABATAN ANGGOTA FAMILIA SOLANACEAE
BERDASARKAN SIKUEN DNA DAERAH ITS Universitas Pendidikan Indonesia
| repository.upi.edu
| perpustakaan.upi.edu
3.5.3 Pengukuran Konsentrasi dan Kemurnian DNA
Sebanyak 1 µl DNA hasil isolasi ditambahkan 499 µl ddH
2
O, kemudian dihomogenkan. Konsentrasi dan kemurnian DNA genom diukur
dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 260 dan 280Å. Konsentrasi dan kemurnian DNA yang diperoleh dihitung
menggunakan rumus : [DNA]
= A x 50 x faktor pengenceran Kemurnian DNA
= A
260
x A
280
Keterangan : A = Nilai absorbansi pada panjang gelombang tertentu
3.5.4 Elektroforesis
Gel agarose dibuat dengan konsentrasi 1 dalam buffer TAE, dididihkan dalam microwave hingga campuran terlihat bening. Gel agarose
dituangkan ke dalam cetakan gel lengkap dengan sisir yang dipasang dengan posisi tegak dan berjarak 0,5-1 mm dari dasar cetakan. Selanjutnya,
gel dibiarkan mengeras pada suhu ruang. Sampel DNA disiapkan dan ditambahkan loading dye dengan
perbandingan 3:2, kemudian dimasukkan kedalam sumur gel yang berada di dalam alat elektroforesis berisi buffer TAE 1x. Proses elektroforesis
dilakukan selama 120 menit dengan daya 100 volt. Gel agarose kemudian direndam dalam EtBr selama 5 menit dan H
2
O selama 2 menit. Hasil elektroforesis diamati dibawah lampu UV dan didokumentasikan Hidayat,
2014, hlm. 5.
3.5.5 Amplifikasi DNA daerah ITS
Amplifikasi DNA daerah ITS mengacu pada Hidayat Pancoro 2001 dalam Muchtar, 2008, hlm. 27 dengan beberapa modifikasi.
Komposisi larutan untuk amplifikasi DNA daerah ITS yaitu 25µl PCR master mix dengan konsentrasi akhir 1x, primer ITS-5 dan ITS-4 masing-
masing sebanyak 1,25 µl dengan konsentrasi akhir 0,25 µM, DNA genom sebanyak 5 µl, dan ditambahkan ddH
2
O hingga volume akhir larutan PCR mencapai 50µl.
Dina Karina Islami, 2015 ANALISIS KEKERABATAN ANGGOTA FAMILIA SOLANACEAE
BERDASARKAN SIKUEN DNA DAERAH ITS Universitas Pendidikan Indonesia
| repository.upi.edu
| perpustakaan.upi.edu
Tabung Eppendorf dimasukkan kedalam mesin PCR dengan program mengacu pada Hidayat et al. 2008, hlm. 17. Amplifikasi dimulai dengan
denaturasi awal pada suhu 95°C selama 2 menit 1 siklus, selanjutnya 35 siklus yang terdiri dari denaturasi pada suhu 95°C selama 30 detik,
annealing pada suhu 57°C selama 2 menit, dan ekstensi pada suhu 71°C selama 2 menit. Tahapan amplifikasi diakhiri oleh 1 siklus final extension
pada suhu 71°C selama 10 menit. Hasil amplifikasi dielektroforesis pada gel agarosa 1 yang dilarutkan dalam buffer TAE 1x Muchtar, 2008, hlm. 27.
3.5.6 Sikuensing DNA
