Dina Karina Islami, 2015 ANALISIS KEKERABATAN ANGGOTA FAMILIA SOLANACEAE
BERDASARKAN SIKUEN DNA DAERAH ITS Universitas Pendidikan Indonesia
| repository.upi.edu
| perpustakaan.upi.edu
Tabung Eppendorf dimasukkan kedalam mesin PCR dengan program mengacu pada Hidayat et al. 2008, hlm. 17. Amplifikasi dimulai dengan
denaturasi awal pada suhu 95°C selama 2 menit 1 siklus, selanjutnya 35 siklus yang terdiri dari denaturasi pada suhu 95°C selama 30 detik,
annealing pada suhu 57°C selama 2 menit, dan ekstensi pada suhu 71°C selama 2 menit. Tahapan amplifikasi diakhiri oleh 1 siklus final extension
pada suhu 71°C selama 10 menit. Hasil amplifikasi dielektroforesis pada gel agarosa 1 yang dilarutkan dalam buffer TAE 1x Muchtar, 2008, hlm. 27.
3.5.6 Sikuensing DNA
Sebanyak 21 produk amplifikasi disikuensing di Macrogen Inc., Korea Selatan menggunakan primer ITS-
4 5’-CCCGCCTGACCTGGGGTCGC- 3’ dan ITS-5 5’-TAGAGGAAGGAGAAGTCGTAACAA-3’ dengan
menggunakan mesin ABI377A dan pewarnaan dengan kit ABI PRISMTM Dye Terminator.
3.5.7 Analisis Data 3.5.7.1 Contig
Terdapat dua set data urutan basa nukleotida yang diperoleh dari hasil sikuensing untuk setiap sampel hasil isolasi DNA daerah ITS. Satu set data
berasal dari sikuensing menggunakan primer ITS-5 dan satu set data lainnya berasal dari hasil sikuensing menggunakan primer ITS-4. Dilakukan contig
menggunakan software CodonCode Aligner untuk kedua data tersebut. Pada saat proses contig, terdapat daerah overlap dari masing-masing data. Hasil
yang diperoleh adalah urutan DNA daerah ITS secara lengkap. Penggunaan kedua primer tersebut adalah untuk meminimalisir kesalahan baca yang
dilakukan mesin sequencer.
3.5.7.2 Verifikasi Data Hasil Sikuensing
Sikuen-sikuen DNA disejajarkan dengan sikuen DNA daerah ITS yang terdapat di genbank dengan alamat
http:ncbi.nlm.nih.gov untuk
memastikan bahwa sikuen DNA daerah ITS yang teramplifikasi merupakan DNA tumbuhan. Untuk melihat homologinya, digunakan program BLAST
Basic Local Alignment Sequence Tool. Dari hasil BLAST, untuk setiap
Dina Karina Islami, 2015 ANALISIS KEKERABATAN ANGGOTA FAMILIA SOLANACEAE
BERDASARKAN SIKUEN DNA DAERAH ITS Universitas Pendidikan Indonesia
| repository.upi.edu
| perpustakaan.upi.edu
genus diambil satu sikuen DNA daerah ITS dari genbank untuk dijadikan sebagai sikuen DNA pembanding.
3.5.7.3 Pencarian Daerah ITS
Pencarian daerah ITS yang terdiri dari ITS-1; 5,8S; dan ITS-2 dilakukan
menggunakan program
BLAST dengan
alamat http:blast.ncbi.nlm.nih.govBlast.cgi
. Pencarian
dilakukan dengan
penjajaran DNA sampel yang telah dicontig dengan DNA pembanding dari genbank. Hasil yang didapatkan adalah letak urutan basa dimana daerah
ITS-1; 5,8S; dan ITS-2 sampel berada. Selanjutnya, urutan tersebut dicatat rangenya dan dihitung jumlahnya sehingga didapatkan urutan basa beserta
jumlah dari daerah ITS sampel.
3.5.7.4 Editing Data
Editing data dilakukan sebelum pembentukan pohon filogeni dengan tujuan untuk membuat setiap data urutan basa nukleotida berada pada awal
dan akhir yang bersamaan sehingga diperoleh data yang informatif. Dilakukan alignment terhadap semua sampel DNA menggunakan software
clustalX. Editing data dilakukan setelah proses alignment selesai dilakukan. Data yang diedit adalah data dengan format .aln hasil dari alignment
clustalX. Contoh data alignment hasil editing terdapat pada Gambar 3.2.
Gambar 3.2 Data yang dihasilkan pada proses alignment setelah melalui proses editing
Dina Karina Islami, 2015 ANALISIS KEKERABATAN ANGGOTA FAMILIA SOLANACEAE
BERDASARKAN SIKUEN DNA DAERAH ITS Universitas Pendidikan Indonesia
| repository.upi.edu
| perpustakaan.upi.edu
3.5.7.5 Pembentukan Pohon Filogeni
